Summary
DNA-ridå, en avbildningsteknik med hög kapacitet för enskilda molekyler, ger en plattform för realtidsvisualisering av olika protein-DNA-interaktioner. Det aktuella protokollet använder DNA-ridåtekniken för att undersöka den biologiska rollen och den molekylära mekanismen för Abo1, ett Schizosaccharomyces pombe-bromodomäninnehållande AAA+ ATPas.
Abstract
Kromatin är en högre ordningens struktur som paketerar eukaryot DNA. Kromatin genomgår dynamiska förändringar beroende på cellcykelfasen och som svar på miljöstimuli. Dessa förändringar är viktiga för genomisk integritet, epigenetisk reglering och DNA-metaboliska reaktioner såsom replikation, transkription och reparation. Kromatinsammansättningen är avgörande för kromatindynamiken och katalyseras av histonchaperoner. Trots omfattande studier är mekanismerna genom vilka histonchaperoner möjliggör kromatinmontering fortfarande svårfångade. Dessutom är de globala egenskaperna hos nukleosomer organiserade av histonchaperoner dåligt förstådda. För att ta itu med dessa problem beskriver detta arbete en unik avbildningsteknik för enskilda molekyler som kallas DNA-ridå, som underlättar undersökningen av de molekylära detaljerna i nukleosomsammansättningen av histonchaperoner. DNA-ridå är en hybridteknik som kombinerar lipidfluiditet, mikrofluidik och total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) för att tillhandahålla en universell plattform för realtidsavbildning av olika protein-DNA-interaktioner. Med hjälp av DNA-ridå undersöks histonchaperonfunktionen hos Abo1, Schizosaccharomyces pombe bromodomain-innehållande AAA+ ATPas, och den molekylära mekanismen bakom histonsammansättningen av Abo1 avslöjas. DNA-ridå ger ett unikt tillvägagångssätt för att studera kromatindynamik.
Introduction
Eukaryot DNA är förpackat i en högre ordningsstruktur som kallas kromatin 1,2. Nukleosomen är den grundläggande enheten för kromatin, som består av cirka 147 bp DNA lindat runt de oktameriska kärnhistonerna 3,4. Kromatin spelar en avgörande roll i eukaryota celler; till exempel skyddar den kompakta strukturen DNA från endogena faktorer och exogena hot5. Kromatinstrukturen förändras dynamiskt beroende på cellcykelfasen och miljöstimuli, och dessa förändringar styr proteinåtkomsten under DNA-transaktioner såsom replikation, transkription och reparation6. Kromatindynamik är också viktigt för genomisk stabilitet och epigenetisk information.
Kromatin regleras dynamiskt av olika faktorer, inklusive histonsvansmodifieringar och kromatinorganisatörer såsom kromatinombyggare, polycombgruppproteiner och histonchaperoner7. Histonchaperoner koordinerar montering och demontering av nukleosomer via deponering eller avskiljning av kärnhistoner 8,9. Defekter i histonchaperoner inducerar genominstabilitet och orsakar utvecklingsstörningar och cancer 9,10. Olika histonchaperoner behöver inte kemisk energiförbrukning som ATP-hydrolys för att montera eller demontera nukleosomer 9,11,12,13. Nyligen rapporterade forskare att bromodomäninnehållande AAA+ (ATPas associerat med olika cellulära aktiviteter) ATPaser spelar en roll i kromatindynamiken som histonchaperoner 14,15,16,17. Humant ATAD2 (ATPas-familjen AAA-domäninnehållande protein 2) främjar kromatintillgängligheten för att förbättra genuttrycket18. Som en transkriptionell samregulator reglerar ATAD2 kromatinet av onkogena transkriptionsfaktorer14, och överuttrycket av ATAD2 är relaterat till dålig prognos i många typer av cancer19. Yta7, homologen för Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) av ATAD2, minskar nukleosomtätheten i kromatin15. Däremot ökar Abo1, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homologen av ATAD2, nukleosomtätheten16. Med hjälp av en unik avbildningsteknik för enskilda molekyler, DNA-ridå, undersöks om Abo1 bidrar till nukleosommontering eller demontering17,20.
Traditionellt har de biokemiska egenskaperna hos biomolekyler undersökts genom bulkexperiment såsom elektroforetisk rörlighetsskiftanalys (EMSA) eller co-immunoprecipitation (co-IP), där ett stort antal molekyler undersöks, och deras genomsnittliga egenskaper karakteriseras21,22. I bulkexperiment döljs molekylära deltillstånd av ensemble-medelvärdeseffekten, och sondering av biomolekylära interaktioner är begränsad. Däremot kringgår enmolekylstekniker begränsningarna för bulkexperiment och möjliggör detaljerad karakterisering av biomolekylära interaktioner. I synnerhet har avbildningstekniker för enskilda molekyler använts i stor utsträckning för att studera DNA-protein och protein-proteininteraktioner23. En sådan teknik är DNA-ridå, en unik avbildningsteknik baserad på mikrofluidik och total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM)24,25. I en DNA-ridå är hundratals enskilda DNA-molekyler förankrade i lipiddubbelskiktet, vilket möjliggör tvådimensionell rörelse av DNA-molekyler på grund av lipidfluiditet. När hydrodynamiskt flöde appliceras rör sig DNA-molekyler längs flödet på dubbellagret och fastnar vid en diffusionsbarriär, där de riktas in och sträcks. Medan DNA färgas med interkalerande medel, injiceras fluorescerande märkta proteiner, och TIRFM används för att visualisera protein-DNA-interaktioner i realtid på en enda molekylnivå23. DNA-gardinplattformen underlättar observationen av proteinrörelser såsom diffusion, translokation och kollision 26,27,28. Dessutom kan DNA-ridå användas för proteinkartläggning på DNA med definierade positioner, orienteringar och topologier eller tillämpas på studier av fasseparation av protein och nukleinsyror 29,30,31.
I detta arbete används DNA-ridåtekniken för att ge bevis för chaperoners funktion genom direkt visualisering av specifika proteiner. Dessutom, eftersom DNA-ridån är en plattform med hög kapacitet, underlättar den en omfattande datainsamling som är tillräcklig för statistisk tillförlitlighet. Här beskrivs hur man genomför DNA-gardinanalysen i detalj för att undersöka den molekylära rollen av S. pombe bromodomäninnehållande AAA+ ATPas Abo1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av flödescellen
- Förbered ett rengjort smält kiseldioxidglas som innehåller nanodikesmönster enligt tidigare publicerad rapport25.
- Borra två hål med en diameter på 1 mm i en rengjord smält kiseldioxid (Figur 1A) med en diamantbelagd borr (se materialförteckning).
- Deponera 250 nm tjockt aluminium (Al) på objektglaset med DC-sputter32 (se materialtabell) med 10 mTorr argongas.
- Centrifugera ett 310 nm tjockt skikt av 4 % 950K poly(metylmetakrylat) (PMMA) (se materialtabell) vid 4 000 varv per minut i 1 minut och grädda på en värmeplatta vid 180 °C i 3 minuter.
- Rita nano-dikesmönstren på PMMA-skiktet mellan de två hålen med hjälp av elektronstrålelitografi (ebeam)33 med 0,724 nA ström vid 80 kV.
OBS: Arkitekturen och dimensionerna för nano-diken-mönstren visas i figur 1A. - Avlägsna den ebeam-exponerade PMMA genom att blötlägga objektglasen i framkallningslösningen (förhållandet 1:3 mellan metylisobutylketon och isopropanol, se materialtabell) i 2 minuter.
- Etsning Al-skikt med induktivt kopplad plasmareaktiv jonetsning (ICP-RIE) med klor (Cl2) och bortriklorid (BCl 3) gaser.
OBS: Dessa två gaser kan ta bort Al från ebeam-exponerade områden. - Skär nanogravar på objektglasen med svaveltetrafluorid (SF4), tetrafluormetan (CF4) och syre (O2) gaser (se materialförteckning).
- Ta bort det återstående Al-lagret genom att blötlägga objektglasen i Al-etsmedel (AZ 300 MIF-framkallare, se Materialförteckning) i 10 min.
- Efter tillverkning, skölj objektglasen med avjoniserat vatten och sonikera i aceton i 30 minuter med hjälp av en bad-typ sonikator.
- Rengör objektglasen i 2 % Hellmanex III-lösning (se materialtabell) i minst 1 dag med magnetisk omrörning.
- Ultraljudsbehandla objektglasen i aceton i 30 min och 1 M NaOH i 30 min i följd.
- Skölj objektglasen med avjoniserat vatten och torka med en kvävgas (N2).
- Lägg ett rent papper (5 mm x 35 mm) i mitten av den dubbelhäftande tejpen. Fäst tejpen över objektglaset för att täcka de två hålen och nanomönstren med pappret.
- Skär papperet med ett rent blad (Figur 1A).
- Lägg ett täckglas ovanpå den dubbelhäftande tejpen och gnugga täckglaset med en pipettspets för att bilda en mikrofluidisk kammare (Figur 1A).
- Placera den monterade flödescellen mellan två objektglas och kläm fast dem.
- Grädda flödescellen i en 120 °C vakuumugn i 45 min.
- Fäst vätskeanslutningen (Nanoport) för de chipbaserade analyserna (se materialtabell) till varje öppet hål med en limpistol och anslut de två linjerna med Luer lock-slangen.
- Anslut en Luer lock-spruta som innehåller 3 ml avjoniserat vatten och tvätta kammaren.
- Tvätta kammaren med 3 ml lipidbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 och 100 mM NaCl) via dropp-för-dropp-anslutningen.
OBS: Drop-by-drop-anslutning länkar alla sprutor till flödescellen för att undvika att luftbubblor injiceras i kammaren. - Injicera 1 ml 0,04 x biotinylerad lipid i lipidbufferten i kammaren i två sprutor med 5 minuters inkubation per injektion.
OBS: Beredning av 1x biotinylerat lipidlager beskrivs i en tidigare publicerad rapport34. - Tvätta kammaren med 3 ml lipidbuffert och inkubera i 20 minuter för att lipiddubbelskiktet ska mogna på objektglasets yta.
- Tillsätt 1 ml BSA-buffert (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2 och 0,2 mg/ml BSA) och inkubera i 5 minuter för att passivera objektglasytan.
OBS: Detta steg kan minska den ospecifika bindningen av proteiner till objektglasytan. - Injicera 0,025 mg/ml streptavidin i 1 ml BSA-buffert med två injektioner och 10 minuters inkubation per injektion.
- Skölj bort resterna av streptavidin med 3 ml BSA-buffert.
- Injicera ~300 pM (30 μL) biotinylerat lambdafag-DNA i 1 ml BSA-buffert i kammaren med två sprutor och 10 minuters inkubation per skott.
OBS: Beredning av biotinylerat lambda-DNA beskrivs i en tidigare publicerad rapport34.
2. Anslutning av flödescell till mikrofluidiksystemet och laddning av den på mikroskopet
- Förbered Abo1 avbildningsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1,6 % glukos och 0,1 x gloxy, se materialtabell).
OBS: Gloxy är ett syreavskiljningssystem som minskar fotoblekning av fluorescerande färgämnen. Beredning av 100x gloxybuljong med glukosoxidas och katalas beskrivs i referens35. - Anslut en spruta som innehåller 10 ml bildbuffert till en sprutpump och ta bort bubblor i alla slangledningar i mikrofluidiksystemet.
- Koppla ihop den förberedda flödescellen med mikrofluidiksystemet via drop-to-drop-anslutning för att undvika bubbelinjektion i flödescellen (Figur 1B).
- Montera flödescellen och flödescellshållarna och montera enheten på ett specialbyggt TIRF-mikroskop (Figur 1C).
VARNING: När flödescellen sätts under mikroskopet, ställ försiktigt in höjden på objektivlinsen. Flödescellen får inte vidröra objektivlinsen. Detta kan skada linsen. - Droppa indexmatchande olja på mitten av flödescellen och sätt ett skräddarsytt duvprisma (se materialtabell) på oljedroppen.
3. Histonmontering av Abo1 med hjälp av DNA-gardin
- Blanda 5 nM Abo1 och 12,5 nM Cy5-märkt H3-H4-histondimer (Cy5-H3-H4) (se materialtabell) i 150 μL bildbuffert. Alla proteiner har preparerats enligt tidigare publicerad rapport17.
- Inkubera blandningen på is i 15 minuter.
OBS: För att undvika fotoblekning av Cy5 måste inkubationen göras i mörker. - Injicera ~20 pM (2 μL) YOYO-1-färgämne i bildbuffert genom en 100 μL provslinga för att färga lambda DNA-molekyler.
- Kör bildbehandlingsprogram (se materialförteckning) och slå på 488 nm-lasern för att kontrollera om DNA-gardinerna är välformade.
OBS: Om DNA-gardinerna är välformade, visas DNA-molekylerna, som är färgade med YOYO-1, som linjerade linjer vid en barriär i närvaro av flöde. De sträckta linjerna rekylerar och diffunderar bort från barriären när flödet stängs av. - Injicera 2 ml hög saltbuffert (200 mM NaCl och 40 mM MgCl2) för att eliminera YOYO-1-färgämne från DNA.
- Efter att YOYO-1-färgämnet har avlägsnats, injicera det förinkuberade proteinprovet.
- När proteinerna når DNA-ridån, stäng av sprutpumpen, stäng av avstängningsventilen och inkubera 15 minuter för histonladdning med Abo1.
- Skölj ur de obundna Abo1- och histonproteinerna i 5 min.
- Slå på avstängningsventilen och återuppta flödesinsprutningen.
- Slå på 637 nm-lasern och avbilda de fluorescerande proteinerna medan buffertflödet är på.
- Stäng tillfälligt av buffertflödet för att kontrollera om histonproteiner laddas på DNA (figur 2C).
- Samla in DNA-ridåbilder med ett bildinsamlingsprogram (se materialförteckning).
OBS: När buffertflödet tillfälligt stannar, drar sig DNA tillbaka från det flyktiga fältet av total intern reflektion, och fluorescerande märkta proteiner bundna till DNA försvinner.
4. Analys av data
- Omvandla bilderna som tagits av bildinsamlingsprogrammet till TIFF-format som bildsekvenser.
OBS: All data analyserades med hjälp av bild J (NIH) enligt beskrivningen i referens20. - Välj en enda DNA-molekyl från bildsekvenserna och rita en kymograf.
OBS: Kymografen kan visa förändringen i fluorescensintensitet för varje histonprotein bundet till en enda DNA-molekyl som en funktion av tiden. - Skapa fluorescensintensitetsprofilen från kymografen och utrusta den med flera Gaussiska funktioner.
- Samla in topparnas mittkoordinater från fluorescensintensitetsprofilen. I detta steg kan den minsta intensiteten av histonfluorescens erhållas.
- Dividera alla toppintensiteter som samlats in från profilerna med minimiintensiteten. Antalet H3-H4-dimerer bundna till DNA uppskattas i detta steg.
- Utför steg 4.2-4.5 för andra DNA-molekyler.
- Skapa ett histogram för bindningsfördelningen av H3-H4-dimerer med 1 kbp fackstorlek. Antalet analyserade molekyler är minst 300.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta arbete beskriver proceduren för flödescellsförberedelse för DNA-ridåanalysen (Figur 1A). DNA-ridintygsanalysen underlättade studien av histon H3-H4 dimermontering på DNA av Abo1. Först kontrollerades DNA-ridåbildningen genom att färga DNA-molekyler med YOYO-1, ett interkalerande färgämne. Gröna linjer visades i parallella matriser, vilket indikerar att YOYO-1 interkalerade till DNA-molekyler, som var väl inriktade och sträckta vid en diffusionsbarriär under hydrodynamiskt flöde (Figur 2A). För att utesluta möjligheten att YOYO-1 hindrar interaktionen mellan DNA och histonproteiner, avlägsnades YOYO-1 från DNA med en hög saltbuffert innan histonproteiner tillsattes. När Cy5-H3-H4-dimerer injicerades i DNA-ridån i frånvaro av Abo1, band Cy5-H3-H4 inte till DNA, vilket tyder på en brist på spontan bindning av H3-H4-dimerer till DNA (Figur 2B). När Cy5-H3-H4 injicerades med Abo1 sågs röda fluorescerande puncta på DNA-molekyler, vilket tyder på att Abo1 laddar H3-H4-dimerer på DNA (Figur 2C). Buffertflödet stängdes tillfälligt av för att säkerställa att Cy5-H3-H4-dimerer inte band till objektglasytan samtidigt som de band till DNA. När flödet stängdes av försvann fluorescerande märkta proteiner bundna till DNA eftersom DNA-molekyler drog sig tillbaka från det flyktiga fältet. Proteiner som adsorberas till ytan förblev däremot desamma. De fluorescerande signalerna försvann i frånvaro av flöde och dök upp igen när flödet återupptogs, vilket tyder på att H3-H4-dimerer binder till DNA (Figur 2C). Bindningen av H3-H4-dimerer till DNA bekräftades också av kymografen, där fluorescenssignalerna försvann när flödet stängdes av (Figur 2D). Eftersom Abo1 är ett AAA+ ATPas undersöktes effekten av ATP-hydrolys på histonladdningsaktiviteten hos Abo116. Få fluorescerande puncta dök upp i DNA-ridån varken i frånvaro av nukleotid (Apo) eller i närvaro av ADP (Figur 2E), vilket indikerar att H3-H4-dimerer sällan binder till DNA vare sig i Apo-tillståndet eller i närvaro av ADP. Figur 2F visar kvantitativa analyser av figur 2B, C och figur 2E, som visar att antalet H3-H4-dimerer bundna till DNA ökar i närvaro av ATP. Resultaten tyder på att ATP-hydrolys är avgörande för att H3-H4 ska kunna laddas på DNA av Abo1 (Figur 2E,F).
Därefter testades om Abo1 företrädesvis laddar histoner till Widom 601-sekvensen, som har en tio gånger högre bindningsaffinitet till histoner än slumpmässiga sekvenser in vitro, även om nukleosomer inte har någon specificitet för Widom 601-sekvensen in vivo 36,37,38,39,40. DNA-ridån bildades med lambda-DNA som innehåller Widom 601-upprepningar i ena änden eller internt (Figur 3A,B). Bindningslandskapet för H3-H4-dimerer på varje DNA-konstruktion erhölls (Figur 3C,D). Bindningsplatsen för Cy5-H3-H4 uppskattades från mittpositionen för 2D Gaussisk anpassning för varje fluorescerande punctum17,41. Om H3-H4-laddningsaktiviteten för Abo1 beror på DNA-sekvensen, skulle bindningsfördelningen vara skev mot Widom 601-sekvensen. Figur 3C,D visar bindningsfördelningshistogrammen för H3-H4-dimerer av Abo1 på lambda-DNA innehållande Widom 601-upprepningar i slutet (tio upprepningar) respektive internt (fem upprepningar). Det fanns ingen preferentiell bindning till de multipla Widom 601-repetitionerna, och bindningsfördelningen var slumpmässig, vilket tyder på att Abo1 inte har någon preferens för Widom 601-sekvensen utan istället laddar H3-H4 på DNA på ett sekvensoberoende sätt (Figur 3C,D).
Figur 1: Förberedelse av flödescell. (A) Scheman över flödescellmontering och DNA-ridåsystem. Den mikrofluidiska kammaren kan bildas mellan ett smält kiseldioxidglas och ett glastäcke som sitter ihop med dubbelhäftande tejp. Under det hydrodynamiska flödet i kammaren är en stor mängd lambda-DNA-molekyler inriktade vid en diffusionsbarriär (en nano-trench här) på grund av lipiddubbelskiktets fluiditet och sträcks ut som en gardin. I den förstorade bilden av diffusionsspärren har nanodiket sågtandsmönster med 1,5 μm stigning, 350 nm bredd och 1,4 μm djup. (B) Fotografi av mikrofluidiksystemet bestående av en sprutpump, en avstängningsventil och en 6-vägs provinjektionsventil med en provslinga. (C) Bilder av objektglashållarkomponenter (vänster), monteringen av hållare och flödescell (mitten) och den färdigmonterade flödescellen monterad på ett specialtillverkat TIRF-mikroskop (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Visualisering av histonbelastning av Abo1 med hjälp av DNA-ridå med en enda molekyl. (A) Bild av DNA-ridå, där DNA-molekyler färgade med YOYO-1 (grön) är väl inriktade vid en diffusionsbarriär. (B) Bilder av Cy5-H3-H4 (röd) utan Abo1. (C) Bilder av Cy5-H3-H4 (röd) laddad av Abo1 i närvaro (överst) och frånvaro (nederst) av buffertflöde. (D) Kymograf extraherad från en enda DNA-molekyl från (C). När flödet tillfälligt stängs av försvinner Cy5-fluorescenssignalerna, vilket indikerar att Cy5-H3-H4 binder till DNA men inte till objektglasytan. (E) Bild av Cy5-H3-H4 laddad av Abo1 utan nukleotid (Apo) (överst). Bild av Cy5-H3-H4 laddad av Abo1 i närvaro av ADP (nederst). (F) Kvantifiering av Cy5-H3-H4 laddad av Abo1 enligt nukleotider. Felstaplar visar standardavvikelsen i tre exemplar. Varje experiment involverade analys av 100-200 molekyler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Sekvensoberoende inläsning av H3-H4 av Abo1. (A) Ena änden av lambda-DNA:t är förankrad till biotinylerad lipid via streptavidin, och den andra änden innehåller tio upprepningar av Widom 601-sekvensen (överst). Det andra lambda-DNA:t innehåller fem upprepningar av Widom 601-sekvensen inuti lambda-DNA (nederst). (B) Schematisk analys av DNA-ridåanalys med lambda-DNA innehållande Widom 601-upprepningar. (C,D) Bindningsfördelningshistogram av Cy5-H3-H4 på lambda-DNA innehållande Widom 601 upprepas i slutet (C) och internt (D). Det finns ingen sekvensspecificitet för DNA när H3-H4 sätts ihop av Abo1. Felstaplar erhålls genom att starta42 med ett konfidensintervall på 70 %. Det totala antalet händelser är 312 och 252 för (C) respektive (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som en avbildningsteknik för enskilda molekyler har DNA-ridå använts i stor utsträckning för att undersöka DNA-metaboliska reaktioner43. DNA-ridå är ett hybridsystem som sammanfogar lipidfluiditet, mikrofluidik och TIRFM. Till skillnad från andra tekniker med en enda molekyl möjliggör DNA-ridå visualisering i realtid av protein-DNA-interaktioner. Därför är DNA-ridåtekniken lämplig för att undersöka mekanismen bakom molekylära interaktioner, inklusive sekvensspecifik association, proteinrörelse tillsammans med DNA och protein-proteinkollision på DNA 17,20,26. Dessutom gör DNA-ridåns höga genomströmning det möjligt att samla in tillräckligt med data för att säkerställa statistisk tillförlitlighet. DNA-ridå underlättar undersökningen av proteiners biofysikalisk-kemiska egenskaper, inklusive kinetiska parametrar, diffusionskoefficient, hastighet och processivitet 17,26,27,30. Det är viktigt att DNA-ridån kan användas för att bestämma bindningslandskapet för nukleosomavlagring, vilket indikerar den inneboende sekvenspreferensen för nukleosomer30.
Flera punkter måste beaktas för att få högkvalitativa data från DNA-testet. Först måste lipiddubbelskiktet formas på lämpligt sätt på objektglasets yta. Lipiddubbelskiktets fluiditet gör det möjligt för DNA-molekyler att röra sig på objektglaset och riktas in vid en diffusionsbarriär i närvaro av hydrodynamiskt flöde. Lipiddubbelskiktet passiverar också ytan på mikrofluidkammaren för att förhindra ospecifik adsorption av proteiner till ytan. Eftersom passiveringen av lipiddubbelskiktet inte är fullständig, adsorberas fluorescerande märkta proteiner icke-specifikt till ytan, vilket leder till felaktig tolkning av resultaten. De ytfastnade proteinerna kan dock skiljas från DNA-bundna genom att slå på och av det transienta flödet eftersom DNA-bundna proteiner försvinner när flödet stannar. För det andra måste fotoblekning av fluoroforer undertryckas. Många fluorescensavbildningsmetoder med en enda molekyl använder ett syrereningssystem för att minska fotoblekning. Flera syrereningssystem har utvecklats, varav det mest populära är gloxy. Gloxy, som består av glukosoxidas och katalas, reducerar enzymatiskt molekylära syrehalter i lösning men sänker pH 44,45,46. Lågt pH är inte förenligt med fysiologiska förhållanden och minskar lipidfluiditeten. För att fördröja sänkningen av pH måste (1) bildbufferten beredas med avgasat avjoniserat vatten, (2) bufferten måste användas omedelbart och (3) bufferten måste förseglas och förvaras på is tills den används.
En unik plattform utvecklades för att förbättra DNA-ridåsystemet där uthuggna nanogravar fungerar som diffusionsbarriärer istället för kromnanomönster25. Eftersom dessa nanodiken är mer robusta under tuffa rengöringsförhållanden med starka lösningsmedel möjliggör de repeterbar, tydligare avbildning. DNA-ridåtekniken har dock flera begränsningar. Under kontinuerlig laserbelysning är fluoroforerna som märker proteiner fotoblekta, vilket gör långtidsmätningar utmanande. DNA-ridåen fungerar inte vid lågt pH (lägre än ~6) eftersom lipiddubbelskiktet inte är flytande. Dessutom stör fluorescensbakgrunden och den ospecifika bindningen av proteiner till objektglasets yta avbildning av enskilda molekyler när proteinkoncentrationen är hög. En annan nackdel med DNA-ridån är att den rumsliga upplösningen av DNA-ridån är ~1 kbp/pixel, så rörelsen av proteiner på mindre än 1 kbp kan inte observeras. Dessutom applicerar DNA-ridåen kontinuerligt hydrodynamisk kraft på proteiner på DNA. Men strömningskraften är svag (mindre än 1 pN), och därför är det utmanande att histoner eller nukleosomer rör sig längs DNA i ridån. Det rapporterades också att nukleosomer sällan glider längs DNA utan kromatinomvandlare47. Om histoner eller nukleosomer glider längs DNA kommer de flesta av dem att stanna i slutet av DNA-området i gardinen. Vi såg dock inte den partiska fördelningen. Å andra sidan, om histoner eller nukleosomer rinner av från DNA-änden, skulle de utarmas i slutet av DNA. Vi har inte heller observerat detta.
Detta arbete visar att DNA-ridåanalysen är en avbildningsplattform för enskilda molekyler som är idealisk för att undersöka kromatindynamik. DNA-ridå kan användas för att studera processen genom vilken histonchaperoner såsom bromodomäninnehållande AAA+ ATPaser sätter ihop kromatin. Den biologiska funktionen hos bromodomäninnehållande AAA+ ATPaser är kontroversiell. Brist på humant ATAD2 eller S. cerevisiae Yta7 nedreglerar genuttryck via kromatinkondensation18. Däremot ökar S. pombe Abo1 nukleosomtätheten16. Studierna med en enda molekyl visar att Abo1 katalyserar histon H3-H4 som laddas på DNA. Det visas att histonladdningsaktiviteten för Abo1 är beroende av ATP-hydrolys (Figur 2C,E,F). Dessutom visar bindningsfördelningen av H3-H4-dimerer att H3-H4-dimerer laddas på DNA av Abo1 på ett sekvensoberoende sätt (figur 3). Sammanfattningsvis kan DNA-ridån användas för att reda ut den biologiska rollen hos Abo1 som en histonchaperon i histonmonteringen. Med hjälp av DNA-ridåtekniken kommer nukleosombildning av Abo1 och andra histonchaperoner som CAF-1 och FACT att studeras i framtiden.
Baserat på detta protokoll kan DNA-ridåanalys användas för att observera kromatinomorganisation genom att omforma komplex som translokerar och omarrangerar nukleosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna uppskattar det vänliga stödet för Abo1 och Cy5-H3-H4 från professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., och Juwon Jang, Ph.D., i KAIST, Sydkorea. Detta arbete stöds av National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), intramural forskningsfond (1.210115.01) vid Ulsan National Institute of Science and Technology och Institute for Basic Science (IBS-R022-D1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P.
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- McGhee, J. D., Felsenfeld, G.
- Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
- Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
- Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
- Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
- Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
- Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
- Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
- Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
- Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
- Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
- Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
- Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
- Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
- Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
- Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
- Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
- Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
- Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
- Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
- Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
- Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).
