Summary
Dette arbejde beskriver udviklingen af fleksible interdigiterede elektroder til implementering i 3D hjernetumormodeller, nemlig in vitro kultur, in ovo model og in vivo murin model. Den foreslåede metode kan anvendes til at evaluere virkningerne af pulserende elektriske felter på tumorer på forskellige niveauer af kompleksitet.
Abstract
Glioblastom er vanskeligt at udrydde med standard onkologiske terapier på grund af dets høje grad af invasivitet. Bioelektriske behandlinger baseret på pulserende elektriske felter (PEF'er) er lovende for forbedring af behandlingseffektiviteten. De er dog afhængige af stive elektroder, der forårsager akut og kronisk skade, især i blødt væv som hjernen. I dette arbejde blev fleksibel elektronik brugt til at levere PEF'er til tumorer, og det biologiske respons blev evalueret med fluorescerende mikroskopi. Interdigiterede guldelektroder på et tyndt, gennemsigtigt parylen-C-substrat blev belagt med den ledende polymer PEDOT: PSS, hvilket resulterede i en konform og biokompatibel enhed. Virkningerne af PEF'er på tumorer og deres mikromiljø blev undersøgt ved hjælp af forskellige biologiske modeller. Først blev monolag af glioblastomceller dyrket oven på elektroderne for at undersøge fænomener in vitro. Som et mellemliggende trin blev der udviklet en in ovo-model , hvor konstruerede tumorsfæroider blev podet i den embryonale membran i en vagtel. På grund af fraværet af et immunsystem førte dette til stærkt vaskulariserede tumorer. På dette tidlige udviklingsstadium har embryoner intet immunsystem, og tumorer anerkendes ikke som fremmedlegemer. Således kan de udvikle sig hurtigt, mens de udvikler deres egne kar fra det eksisterende embryovaskulære system, hvilket repræsenterer en værdifuld 3D-kræftmodel. Endelig blev fleksibel elektrodeafgivelse af PEF'er evalueret i en komplet organisme med et funktionelt immunsystem ved hjælp af en syngenic, ortograft (intrakraniel) musemodel. Tumorsfæroider blev podet ind i hjernen hos transgene multifluorescerende mus før implantation af fleksible organiske elektrodeindretninger. Et forseglet kranievindue muliggjorde multifotonbilleddannelse af tumoren og dens mikromiljø under behandling med PEF'er over en periode på flere uger.
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM) er en meget invasiv tumor og derfor vanskelig at udrydde med standardbehandlinger såsom resektion, strålebehandling og kemoterapi. På trods af multimodale behandlinger er prognosen fortsat meget dårlig, og de fleste patienter oplever sygdomsprogression inden for 1 år efter diagnose 1,2. For nylig har udviklingen af bioelektriske behandlinger vist stort potentiale for at forbedre eksisterende terapier. Disse terapier bruger levering af pulserende elektriske felter (PEF), typisk i en enkelt behandlingssession, for at forstyrre cellulær membranintegritet og mikromiljøet af tumorer. Denne cellemembranforstyrrelse, også kendt som elektroporation, kan være reversibel eller irreversibel afhængigt af den elektriske feltintensitet og antallet af impulser. Irreversibel elektroporation (IRE) anvendes som en ikke-termisk vævsablationsteknik, hvor elektriske impulser forårsager dødelig skade på cellemembraner, der fører til celledød3. Reversibel elektroporation anvendes i elektrokemoterapi (ECT), en etableret teknik, der består af levering af PEF'er i kombination med kemoterapilægemidler for at forbedre lægemiddeloptagelsen i kræftceller4. Desuden viste nylige undersøgelser calciumelektroporation som et alternativ til ECT med høj effektivitet til kræftbehandling, hvilket også er billigt og fremkalder færre bivirkninger5. På trods af disse lovende fremskridt anvendes PEF'er generelt ved hjælp af stive, metalliske elektroder, som vides at forårsage skade på blødt væv6. Hjernen er særlig følsom over for sådanne invasive enheder, hvor det mekaniske mismatch fremkalder betændelse og astroglial ardannelse7.
I denne sammenhæng præsenteres et fleksibelt PEF-leveringssystem i kombination med 3D-modeller af glioblastomtumorer, fra mikrofabrikation til en murinmodel. Konforme elektroder fremstilles med standard tyndfilmsmikrofabrikationsprocesser, herunder brugen af bløde og biokompatible materialer såsom parylen-C, guld og PEDOT:PSS 8,9. Et interdigiteret elektrodedesign bruges til at dække et stort overfladeareal, samtidig med at der opretholdes tilstrækkelig gennemsigtighed til billeddannelse mellem elektrodefingrene10. Til tumormodellen fremstilles 3D-sfæroider af glioblastomceller, der udtrykker en genetisk kodet fluorescensreporter, ved anvendelse af en variation af væske-overlay 96-brøndplademetoden11. Sfæroiderne podes ind i chorioallantoic membranen i et vagtelembryo, hvilket resulterer i en in ovo-model, der i vid udstrækning er blevet brugt til at studere angiogenese eller lægemiddeltoksikologi12,13. Tumorer kan podes og vaskulariseres af embryoets vaskulatur i fravær af et immunsystem på dette stadium af embryonal udvikling12. Fleksible elektroder placeres derefter oven på den vaskulariserede tumor for at studere effekten af PEF-levering på sfæroiden og dens vaskulatur. Endelig undersøges disse virkninger på en komplet levende organisme, herunder tumormikromiljø og immunsystem, ved at implantere konstruerede sfæroider i hjernens parenchyma af murine modeller14. Fleksible elektroder placeres oven på indsættelsesstedet, og kraniotomien forsegles med et glasvindue, hvilket muliggør gentagen to-fotonbilleddannelse over flere uger.
Disse metoder vil være nyttige for folk, der er interesseret i forskellige domæner lige fra mikroelektronikteknik til onkologiske applikationer. Mikrofabrikationsprotokollen kan bruges og tilpasses til enhver applikation, der kræver tyndfilmsmetalelektroder belagt med PEDOT: PSS. Endvidere vil de biologiske modeller, der er udviklet til evaluering af antitumorelektriske behandlinger, være af almen interesse for undersøgelsen af differentieringen af cellulært, vaskulært og immunrespons på implanterede materialer.
Protocol
Alle forsøgsforsøg blev udført i overensstemmelse med fransk lovgivning og i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs rådsdirektiv af 24. november 1986 (86/609/EØF) om pasning og anvendelse af forsøgsdyr. Dyreforskningen blev godkendt af Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône og godkendt af det etiske udvalg i Provence Côte D'Azur (Apafis # 22689-2019100414103054).
1. Fleksibel enhedsmikrofabrikation (figur 1)
- Rengøring af glasrutsjebanerne
- Sonikere glas glider i 2% sæbeopløsning i 15 min. Skyl dem med vand.
- Sonikere igen i en blanding af 80% ren acetone og 20% ren isopropanol i 15 min.
FORSIGTIG: Disse opløsningsmidler er skadelige og brandfarlige. Brug personlige værnemidler (PPE) og håndter dem under en stinkhætte. - Skyl diasene med isopropanol og tør med en luftpistol.
BEMÆRK: Sørg for, at acetone ikke tørrer på underlagene under hele processen.
- Guldelektrodemønster (Figur 1A)
- Et 3 μm lag parylen-C (PaC) aflejres med et parylenaflejringssystem (figur 1Aa).
- Anbring de rensede glasglas i deponeringskammeret. Sprøjt sæbe på køleren, lad den tørre, og indsæt den i den udpegede kolde fælde i deponeringssystemet. Dette antiklæbemiddel letter let fjernelse af PaC fra køleren efter aflejringen.
FORSIGTIG: PaC er irriterende og udgør en sundhedsfare. Brug handsker, mens du håndterer det. - Væg 6 g PaC i en aluminiumsbåd og læg den i ovnen. Evakuer maskinen (P = 10 mTorr), og start deponeringen med følgende parametre:T-køler = -100 °C,T-ovn = 690 °C,T-fordamper = 175 °C ogT-kammer = 135 °C.
- Når aflejringen er færdig, og fordamperens temperatur er under 40 °C, skal du slukke for køleren, fordamperen og ovnen. Udluftning af maskinen og indsamling af prøverne.
- Anbring de rensede glasglas i deponeringskammeret. Sprøjt sæbe på køleren, lad den tørre, og indsæt den i den udpegede kolde fælde i deponeringssystemet. Dette antiklæbemiddel letter let fjernelse af PaC fra køleren efter aflejringen.
- Prøvernes overflade aktiveres ved oxygenplasmabehandling i 30 s (100 W, 50 sccm).
- De plasmabehandlede prøver spindes med en negativ fotoresist ved 1.000 x g i 40 sekunder. Prøverne anbringes på en kogeplade ved 110 °C i 2 minutter (figur 1Ab).
FORSIGTIG: Photoresist-opløsningen er brandfarlig og forårsager irritation; bære PPE og håndtere det under en stinkhætte. - Placer et i-line filter i strålelinjen på UV-bredbåndskontaktjusteringen, og udsæt fotoresisten gennem en maske, der har det interdigiterede elektrodedesign (figur 1Ac).
BEMÆRK: Interdigiterede elektroder med et mellemrum på 50 eller 250 μm blev designet ved hjælp af en layouteditor, og fotomasker blev bestilt fra et firma, der producerer polyesterfotomasker ved laserfotoplotning. - Bag ovenstående prøver ved 110 °C på en kogeplade i 3 min og lad dem køle af til stuetemperatur i 5 min. Dyp prøver i en metal-ion-fri udvikler i 3 minutter for at fjerne den ikke-eksponerede fotoresist. Skyl prøverne med vand og tør dem med en luftpistol (figur 1Ad).
FORSIGTIG: Udviklerløsningen er irriterende; bære PPE og håndtag under en stinkhætte. - Prøvernes overflade aktiveres ved oxygenplasmabehandling i 60 s (100 W, 50 sccm).
- Et 20 nm vedhæftningslag af chrom og et 300 nm lag guld aflejres med en termisk fordamper som følger (figur 1Ae).
- Udluft fordampermaskinen, og klip prøverne (nedad) på den øverste runde plade med metalskruer. Fyld de dedikerede digler med henholdsvis krom og guld. Forsegl og evakuer maskinen for at nå et tryk under 5·10-6 Torr. Start rotationen af prøveholderen.
- Vælg digelen, der indeholder krom, og øg langsomt strømmen, der går gennem den, indtil en aflejringshastighed på 0,2 Å·s-1 er nået. Åbn lukkeren, og vent, indtil 20 nm krom er deponeret. Luk lukkeren, og skru langsomt strømmen ned indtil 0 mA.
- Vælg diglen, der indeholder guld, og øg langsomt strømmen, der går gennem den, indtil en aflejringshastighed på 0,2 Å·s-1 er nået. Åbn lukkeren for at fordampe guld, vent til 10 nm guld er deponeret, og øg derefter aflejringshastigheden til 1,5 Å·s-1 , indtil ca. 300 nm er deponeret. Luk lukkeren, og skru langsomt strømmen ned til 0 mA.
- Lad prøverne køle af til stuetemperatur i 15 minutter efter deponering. Stop rotationen af prøveholderen, udluftning af maskinen, og opsaml prøverne.
- Prøverne nedsænkes i et bægerglas med acetone. Bægerglasset anbringes på en rysteplade, der er indstillet til 110 o/min i 15 minutter for at løfte fotoresisten af. Prøverne skylles med isopropanol og tørres med en luftpistol (figur 1Af).
- Prøvernes overflade aktiveres ved oxygenplasmabehandling i 30 s (100 W, 50 sccm).
- Et 3 μm isoleringslag af PaC aflejres med et parylenaflejringssystem (se trin 1.2.1) (figur 1Ag).
- Et 3 μm lag parylen-C (PaC) aflejres med et parylenaflejringssystem (figur 1Aa).
- Åbning af disposition (figur 1B)
- Prøverne spindes med en positiv fotoresist ved 600 x g i 35 sekunder. Anbring den på en kogeplade ved 110 °C i 2 minutter (figur 1Ba).
FORSIGTIG: Photoresist-opløsningen er brandfarlig og forårsager irritation; bære PPE og håndtag under en stinkhætte. - Sørg for, at der ikke er noget i-linjefilter i strålelinjen på UV-bredbåndskontaktjusteringen, og udsæt fotoresisten gennem en maske, der indeholder enhedens omrids med en UV-bredbåndskontaktaligner (figur 1Bb).
- Dyp prøverne i en metal-ion-fri udvikler i 4 minutter for at fjerne den eksponerede fotoresist. Prøverne skylles med vand og tørres med en luftpistol (figur 1Bc).
- Æts omridset gennem de to lag PaC med en reaktiv ionætser (160 W, 22 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (figur 1Bd).
- Fjern den resterende fotoresist med acetone, skyl med isopropanol, og tør prøverne med en luftpistol.
- Prøverne spindes med en positiv fotoresist ved 600 x g i 35 sekunder. Anbring den på en kogeplade ved 110 °C i 2 minutter (figur 1Ba).
- PEDOT:PSS-belægning (figur 1C)
- Spin-coat en 2% sæbeopløsning ved 70 x g i 35 s (figur 1Ca).
- Et 3 μm offerlag PaC aflejres med et parylenaflejringssystem (se trin 1.2.1) (figur 1Cb).
- Spin-coat positiv fotoresist ved 600 x g i 35 s. Prøverne anbringes på en kogeplade ved 110 °C i 2 minutter (figur 1Cc).
- Sørg for, at der ikke er noget i-line-filter i strålelinjen på UV-bredbåndskontaktkontaktjusteringen, og udsæt fotoresisten gennem en maske, der indeholder elektrodernes aktive overflade (figur 1Cd).
- Dyp prøverne i en metal-ion-fri udvikler i 4 minutter for at fjerne den eksponerede fotoresist. Prøverne skylles med vand og tørres med en luftpistol (figur 1Ce).
- Æts PaC med en reaktiv ionætser for at åbne elektrodernes aktive overflade (160 W, 24 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Kontroller med et mikroskop, at der ikke er nogen resterende PaC på den aktive overflade (figur 1Cf).
- Fjern den resterende fotoresist med acetone, skyl med isopropanol og tør prøverne med en luftpistol.
- Overfladen af prøverne aktiveres ved hjælp af oxygenplasmabehandling i 90 s (100 W, 50 sccm).
- Bland en kommerciel dispersion af kemisk polymeriseret PEDOT: PSS med 5 vol% ethylenglycol (EG) og 0,1 vol% dodecylbenzensulfonsyre (DBSA). Sonikere i 15 min. Tilsæt 1 vægt% (3-glycydyloxypropyl) trimethylsiloxan (GOPS) og sonikat i 5 minutter. Opløsningen filtreres gennem et 1,2 μm filter.
FORSIGTIG: EG er irriterende og udgør en sundhedsfare. DBSA er irriterende og ætsende. GOPS er ætsende. Brug passende personlige værnemidler og håndter disse kemikalier under en stinkhætte.
BEMÆRK: Det samlede volumen afhænger af antallet af prøver. For 10 standardglasglas fremstilles mindst 20 ml, der svarer til følgende mængder: 18,78 ml PEDOT:PSS, 1 ml EG, 20 μL DBSA og 200 μL GOPS. - Spin-coat fire lag PEDOT: PSS-opløsning ved 150 x g i 35 s. Efter aflejring af hvert lag bages prøverne ved 110 °C i 60 s på en varm plade og afkøles til stuetemperatur i 5 minutter, før de centrifugeres det næste lag (figur 1Cg).
- Det saficielle PaC-lag fjernes ved at nedsænke prøverne i vand (figur 1Ch).
- Prøverne bages ved 140 °C i 1 time.
- Dyp prøverne i deioniseret vand i 30 minutter for at fjerne den resterende sæbe og lavmolekylære forbindelser i PEDOT: PSS-filmen og løsne prøver fra glassubstratet (figur 1Ci).
- Tilslutninger og emballage (figur 1D)
- Afsæt et tyndt lag akrylmaling på en polyimidfilm, der er belagt med kobber (figur 1Da). Brug en aerosol til at opnå et homogent lag maling (figur 1Db).
- Mønster akrylmalingen med en laser (75 kHz, 7 W, 1 lasergennemløb, 400 mm·s-1) for at opnå to rektangulære kontaktpuder (5 mm x 15 mm; 1,5 mm mellemrum) (figur 1Dc).
- Vådæts kobberet med mættet 30% (w/v) jernchlorid (FeCl3) i vand i 15 minutter ved 40 °C (figur 1Dd).
FORSIGTIG:FeCl3 er irriterende og ætsende; Håndter det med handsker under en stinkhætte. - Strip akrylmalingen med acetone ved let at gnide den med en klud (figur 1De).
- Den mønstrede polyimidfilm skæres i rektangulære former (15 mm x 30 mm) med en laser (15 kHz, 10 W, 30 lasergennemløb, 130 mm·s-1) (figur 1Df).
- Dispenser sølvpasta med en treakset dispenseringsmaskine ved et tryk på tre bar med en nål med en diameter på 330 μm (5 m·min-1) (figur 1Dg).
FORSIGTIG: Sølvpasta er irriterende; Håndter med handsker. - Juster og fastgør PaC-sonden med polyimidfilmen under et kikkertmikroskop ved hjælp af pincet (figur 1Dh).
BEMÆRK: Justeringsmærker kan mønstres i trin 1.5.2 for at lette sondens placering på kontaktpuderne. - Bages ved 140 °C i 2 timer i ovnen.
- Anbring en 1 cm2 polyimidbeskyttelsestape på kontaktpuderne (figur 1Di).
- Dyp grænsefladen, hvor PaC-sonden og polyimidfilmen er forbundet i PDMS (figur 1Dj).
- Bages i 2 timer ved 50 °C.
- Fjern beskyttelsestapen for at åbne kontaktpuderne (figur 1Dk).
BEMÆRK: Mikrofabrikation af in vitro-udstyr er ens, men trin 1.2.1, 1.3 og 1.5 skal springes over.
2. Generering af glioblastom GCaMP6f stabil cellelinje
- Lentivirus produktion
- I en 75 cm² kolbe dyrkes en HEK 293T-afledt cellelinje, der er optimeret til lentivirusproduktion i 10 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) indeholdende 4,5 g· L-1 glucose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbicarbonat og suppleret med 10% tetracyklinfrit føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder · ml-1 penicillin og 100 μg ml-1 streptomycin i mindst 3 dage indtil 80% sammenløb.
- Fjern mediet fra kolben. Skyl forsigtigt cellerne med 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS).
- Der tilsættes 1 ml 0,25% trypsin/EDTA-opløsning og inkuberes kolben i 5 minutter ved 37 °C.
FORSIGTIG: Trypsin / EDTA-opløsning udgør en sundhedsfare; bære PPE og håndtag under en stinkhætte. - Tilsæt 8 ml dyrkningsmedium. Skyl forsigtigt cellesuspensionen.
- Tæl cellerne og plade 4 x 106 celler i en petriskål i 8 ml dyrkningsmedium.
- Den næste dag fortyndes 25 μg plasmidet indeholdende genet GCaMP6f og en selektionsmarkør, der giver resistens over for puromycin i et samlet volumen på 600 μL vand. Tilsæt det til et rør af transfektionsreagens. Vortex i 10 s ved 3.000 rpm og inkuber røret ved stuetemperatur i 10 min for at tillade produktion af nanopartikler.
- Tilsæt indholdet af røret dråbevis på kulturen af HEK 293 T-celler og rock forsigtigt i hånden. Cellerne inkuberes ved 37 °C i mindst 4 timer.
- Mediet med nanopartikelkomplekser erstattes med friske medier, og cellerne returneres ved 37 °C.
- Tre dage senere opsamles supernatanten og centrifugeres ved 500 x g i 10 minutter for at fjerne celleaffald. Opsaml den flydende fase indeholdende virale partikler.
BEMÆRK: Virusproduktionen i supernatanten kan bekræftes ved hjælp af en kvantitativ lentiviral titertest og kan opbevares ved -80 °C i mindst 2 år.
- Transduktion af glioblastomceller
- I en 75 cm² kolbe dyrkes glioblastomceller i 10 ml DMEM indeholdende 1 g· L-1 glucose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbicarbonat og suppleret med 10% tetracyklinfri FBS, 100 enheder · ml-1 penicillin og 100 μg · ml-1 streptomycin i mindst 4 dage.
- Substratet kasseres, og supernatanten fra trin 2.1.9 tilsættes til målcellerne.
- Tilsæt 5 μg·ml-1 hexadimetrinbromid i mediet for at forbedre transduktionen. Der inkuberes i 6 timer ved 37 °C. Udskift mediet med 10 ml frisk medium.
FORSIGTIG: Hexadimetrinbromid er irriterende. Håndter det med handsker.
- Generering af en stabil cellelinje
- To til tre dage efter transduktion tilsættes 10 ml DMEM indeholdende 1 g· L-1 glucose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbicarbonat, 10% FBS, 100 enheder·ml-1 penicillin, 100 μg·ml-1 streptomycin og suppleret med puromycin for at dræbe de ikke-transducerede celler. Kulturceller i dette medie i mindst 3 dage.
FORSIGTIG: Puromycin er irriterende; Håndter det med handsker.
BEMÆRK: Cellernes følsomhed over for puromycin skal testes før transduktion ved dyrkning af celler i deres anbefalede medium, der indeholder forskellige koncentrationer af puromycin. En dag senere skal du kontrollere cellerne med et mikroskop. Vælg den passende koncentration, hvor størstedelen af cellerne er døde, men få stadig er i live, for at sikre, at antibiotika ikke er for giftigt og også kan dræbe de transfekterede celler. - Fjern mediet og skyl cellerne med 10 ml PBS.
- Der tilsættes 1 ml 0,25% trypsin/EDTA-opløsning og inkuberes kolben i 5 minutter ved 37 °C.
- Tilsæt 8 ml dyrkningsmedium. Skyl forsigtigt cellesuspensionen.
- Der opsamles 100 μL cellesuspension, og cellekoncentrationen måles med en celletæller. Opsug 50 μL cellesuspension i en håndholdt automatiseret celletæller med en 60 μm sensor.
- Frø 1 celle / brønd i en 96-brønd plade. For eksempel tilsættes 1 / (1 x 103 celler pr. Ml) for en koncentration på 1 x 103, dvs. 0,001 ml cellesuspension pr. Brønd. Frø hver brønd for at øge chancerne for succes. Komplet med dyrkningsmedium for at nå et samlet volumen på 200 μL pr. Brønd.
- En dag senere finder du hver brønd, der indeholder en celle, og kontroller dens fluorescens (λexc = 490 nm og λem = 530 nm). Marker brøndene, der kun indeholder en transfekteret celle. Fortsæt væksten i et par dage, indtil brønden er næsten sammenflydende.
- Kassér mediet og skyl cellerne med 200 μL PBS. Der tilsættes 100 μL 0,25% trypsin/EDTA-opløsning, og 96-brøndpladen inkuberes i 5 minutter ved 37 °C.
- Der tilsættes 100 μL medium og skylles forsigtigt cellesuspensionen. Overfør cellesuspensionen i en petriskål. Tilsæt 5 ml medium og lad cellerne vokse i et par dage, indtil petriskålen næsten er sammenflydende.
- Kassér mediet og skyl cellerne med 5 ml PBS. Tilsæt 1 ml 0,25% trypsin/EDTA-opløsning og inkuber petriskålen i 5 minutter ved 37 °C.
- Tilsæt 6 ml medium og skyl forsigtigt cellesuspensionen. Cellesuspensionen overføres til en T25-kolbe. Fortsæt væksten i et par dage, indtil kolben næsten er sammenflydende.
- Kassér mediet og skyl cellerne med 5 ml PBS. Der tilsættes 1 ml 0,25% trypsin/EDTA-opløsning og inkuberes T25-kolben i 5 minutter ved 37 °C. Der tilsættes 7 ml DMEM indeholdende 1 g· L-1 af glucose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbicarbonat og suppleret med 10% FBS, 100 enheder · ml-1 penicillin og 100 μg · ml-1 streptomycin. Skyl forsigtigt cellesuspensionen.
- Cellesuspensionen deles i fire T25-kolber (2 ml pr. kolbe), og der tilsættes 5 ml substrat til hver kolbe. Lad cellerne vokse i et par dage, indtil kolberne næsten er sammenflydende.
- Trin 2.3.12 gentages for tre kolber, og den sidste kolbe opbevares i trin 3.1.3. Cellesuspensionen overføres i et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 150 x g i 5 min. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 900 μl. Bland forsigtigt cellerne for at opretholde en homogen cellesuspension.
- Overfør cellesuspensionen til kryogene opbevaringshætteglas. Der tilsættes 100 μL dimethylsulfoxid. Kryoialerne anbringes ved -80 °C natten over. Overfør frosne celler til flydende nitrogen til yderligere forsøg.
BEMÆRK: Transfektionens effektivitet kan vurderes ved at tilsætte 5 μM ionomycincalciumsalt i mediet og kontrollere den inducerede stigning i fluorescens under et fluorescensmikroskop (λexc = 490 nm og λem = 530 nm).
- To til tre dage efter transduktion tilsættes 10 ml DMEM indeholdende 1 g· L-1 glucose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbicarbonat, 10% FBS, 100 enheder·ml-1 penicillin, 100 μg·ml-1 streptomycin og suppleret med puromycin for at dræbe de ikke-transducerede celler. Kulturceller i dette medie i mindst 3 dage.
3.3D modeller
- Sfærisk kultur
- Forbered en opløsning af 1% (w / v) agarose i deioniseret (DI) vand.
- Tilsæt 100 g agarosepulver i 100 ml DI-vand og opvarm opløsningen i en mikrobølgeovn, indtil alt pulveret er opløst. Rør opløsningen regelmæssigt for at undgå klumper. Autoklave opløsningen i 20 minutter ved 120 °C.
- Når den er hentet fra autoklaven, tilsættes 75 μL agaroseopløsning pr. hul i en plade med 96 brønde omhyggeligt. Indsæt det på siden af brønden for at danne en meniskus, hvilket resulterer i en ikke-klæbende rund bund. Lad det størkne i 15 min ved stuetemperatur.
- Cellerne (trin 2.3.12) løsnes fra kolben i trin 2.3.14.
- Der tilsættes 10.000 celler pr. hul glioblastomceller og fuldføres for at nå et samlet volumen på 150 μL pr. brønd med DMEM indeholdende 1 g· L-1 glucose, L-glutamin, natriumpyruvat og natriumbicarbonat og suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder · ml-1 penicillin og 100 μg · ml-1 streptomycin.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C uden at flytte pladen i 3 dage. Udskift derefter halvdelen af mediet med friske medier hver 2. dag med en flerkanalpipette indtil yderligere eksperimenter. Hold pipettespidsen i den øverste del af brønden for at undgå beskadigelse af agarose eller selve kugleformen.
BEMÆRK: Størrelsen af sfæroiderne afhænger af antallet af podede celler og cellelinjen, så det skal tilpasses afhængigt af forsøgene.
- Forbered en opløsning af 1% (w / v) agarose i deioniseret (DI) vand.
- In ovo-modellen
- Placer befrugtede æg af japansk vagtel (C. japonica) i en inkubator (37 ° C og 57% fugtighed) på bakker med en automatisk rotator, der vender æg hver 2. time. Denne dag betragtes som embryonisk dag (ED) 0.
- Vask plastvejebåde ved at placere dem i 70% (w/v) ethanol. Tag vejebådene ud og tør dem under en stinkhætte.
BEMÆRK: Fra dette tidspunkt udføres eksperimenter ikke under sterile forhold. Der kræves dog rene forhold for at undgå udvikling af skimmelsvamp på embryonerne. - På ED3 åbnes æggene forsigtigt ved hjælp af en pincet med tynde spidser, der er forvasket med 70% (w / v) ethanol. Hæld embryoet i en plastvejebåd, dæk det med en anden vejebåd og læg det i en standard befugtet inkubator ved 37 °C i 3 dage.
- På ED6 laves et lille snit i chorioallantoic membranen (CAM) med en 23 G nål.
- Brug en pipette til at placere en 7-dages sfærisk på snittet og returner embryoet til inkubatoren i 3 dage indtil yderligere forsøg.
BEMÆRK: Et fluorescerende farvestof kan injiceres i embryoets øje for at visualisere blodkarrene. - På forsøgsdagen placeres den fleksible sonde oven på den vaskulariserede tumor ved hjælp af en mikromanipulator.
- Den in vivo model
BEMÆRK: Denne del af protokollen er tilpasset fra den, der tidligere er offentliggjort som reference14. Voksne flerfarvede fluorescerende AMU-neuroinflammus (B6.Cg-Tg (Thy1-CFP) 23Jrs (Ly6a-EGFP) G5Dzk (Itgax-EYFP) 1Mnz / FD) blev brugt; disse mus præsenterer mærkning af en delpopulation af Thy1+ neuroner ved transgen ekspression af ECFP, mærkning af perifer LyzM+ inflammatoriske celler ved transgen ekspression af EGFP og mærkning af en undertype af mikroglia, der udtrykker EYFP under kontrol af Cd11c+. Kort fortalt bedøves dyrene let med 1,5% isofluran i 2 minutter før enhver behandling eller injektion. Før operationen bedøves dyrene med ketamin (120 mg / kg; IP) og xylazin (12 mg/kg; IP). Derefter påføres 3% Lidocaine gel lokalt for at lindre smerter i ørerne forbundet med fiksering af stereotaktisk støtte. Derefter administreres 0,25% Bupivacain-opløsning til det kirurgiske sted for at lindre smerter på grund af kraniotomi. Når musen var klar til operation, blev der udført en kraniotomi med en diameter på 4 mm i henhold til reference14. Med en 26 G nål blev der lavet et hul i dura-materen midt i kraniotomien, og tumorsfæroiden blev injiceret med injektionssystemet beskrevet i reference14. Derudover blev derudover, som beskrevet her, placeret en fleksibel elektrode på GCamp6 eller DsRed, der udtrykte tumorsfæroid, før kraniotomien blev forseglet med et glasvindue.- Placer en dråbe Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS), så den dækker kraniotomien. Placer den fleksible elektrode på dråben af DPBS, og placer forsigtigt bagsiden af sonden med kontaktpuder på musens ryg (figur 4B).
BEMÆRK: Brug sterile handsker og en "tip only" teknik. Skift handskerne, hvis en ikke-steril overflade kommer i berøring. Giv termisk støtte under denne procedure. - Berør DPBS-dråben med et lille stykke papir for at absorbere DPBS, indtil sonden kan ligge fladt på dura og følge hjernens krumning. Sørg for, at et lille lag DPBS forbliver under elektroderne uden at slippe ud fra elektrodens side. Dette sikrer en barriere mod limafsmitning under de næste trin.
BEMÆRK: Steriliser alt udstyr før brug. - Placer en lille dråbe silikoneklæbemiddel på sonden og dæk den med et 5 mm rundt dækglas. Skub dækglasset ned, indtil silikonen er jævnt fordelt, og afstanden mellem dækglasset og sonden er minimal. Skub dækglasset ned i yderligere 30 sekunder, så silikonen kan størkne.
- For at fastgøre dækglasset skal du hurtigt påføre superlim på siderne og skubbe det ned, indtil limen hærder til fast.
- Brug en tandstikker til at påføre superlim ved sondens hals, og pas på, at superlimen trækkes under nakken for at give stabil støtte til den.
- Dæk kraniet med tandcement for at opbygge en kronisk hætte. Vær særlig omhyggelig med kun at dække kanterne på dækglasset.
- Løft bagsiden af sonden og påfør cement under sondens hals. Hvil sonden på cementen, før den hærder. Skub forsigtigt sondens hals ned med stump tang, så dens overflade er på samme niveau som dækglassets og ikke i vejen for mikroskopets mål under eksperimentet.
- Dæk toppen af sondehalsen med højst 1,5 mm tandcementlag for at opnå et fast greb om sonden. Byg en cementbrønd, der præsenterer en 1,5 mm højderyg i en afstand af 1-2 mm omkring dækglasset for at skabe et bassin til nedsænkningsvæsken til to-fotonbilleddannelse (figur 4C).
- Når cementen er hærdet, skal du anvende buprenorphin postkirurgiske analgetika (0,05 mg / kg, 0,1 ml pr. 10 g legemsvægt subkutant) og opretholde dyret i en varm atmosfære, indtil det vågner op. Dette omfatter nærhed til en infrarød pære samt indpakning af dyret i et papirhåndklæde.
BEMÆRK: Placer et termometer på musens niveau for at overvåge temperaturen. - Karakteriser impedans i området 1-10 kHz ved hjælp af en potentiostat.
- Lad dyret komme sig efter operationen i mindst 10 dage. Administrer antiinflammatoriske lægemidler umiddelbart efter operationen og fortsæt med at overvåge dyrets tilstand for at tilvejebringe passende postoperativ analgesi.
- Placer en dråbe Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS), så den dækker kraniotomien. Placer den fleksible elektrode på dråben af DPBS, og placer forsigtigt bagsiden af sonden med kontaktpuder på musens ryg (figur 4B).
4. Pulserende elektrisk felt (PEF) levering og billeddannelse
- Anbring prøverne under et fluorescensmikroskop. I tilfælde af 3D-modeller kan tumorer kun observeres fra toppen.
BEMÆRK: For in ovo-modellen blev eksperimenter udført under et epifluorescensmikroskop (men er også muligt med et to-fotonmikroskop), mens eksperimenter på in vivo-modellen blev udført under et to-fotonmikroskop (figur 6). - Tilslut en pulsgenerator til enhedernes kontaktpuder ved hjælp af pogo pin-stik (in vitro) eller krokodilleklemmer (in ovo og in vivo) (figur 4A). Indstil de ønskede parametre (antal impulser, spænding, pulsvarighed, frekvens), og anvend PEF'er ved at køre generatoren (figur 4A). Mål fluorescens samtidigt for at observere virkningerne af miljøaftryksfaktorerne i realtid.
Representative Results
Denne protokol gør det muligt at anvende to glioblastommodeller, hvori et fleksibelt PEF-leveringssystem er integreret. Efter mikrofabrikations- og emballeringstrin karakteriseres fleksible elektroder i saltopløsning ved elektrokemisk impedansspektroskopi (EIS) for at vurdere og validere deres ydeevne. PEDOT:PSS-coatede elektroder viser de typiske kapacitive og resistive dominerede områder adskilt af en afskæringsfrekvens, mens de ubelagte elektroder kun udviser kapacitiv adfærd (figur 2).
En variation af væske-overlay 96-brønd plademetoden bruges til at dyrke 3D-tumorer lavet af transfekterede glioblastomceller, der stabilt udtrykker en fluorescerende intracellulær calciumreporter. Væksten af sfæroiderne kan observeres med et lysfeltmikroskop (figur 3; ED 0). Mindst 2 eller 3 dage er nødvendige for at opnå sfæriske og tætte sfæroider afhængigt af cellelinjen og antallet af celler, der er podet.
I in ovo-modellen podes sfæroider i chorioallantoic membranen i et vagtelembryo (figur 3; ED 6). Transplantatets succes kan vurderes ved fluorescensmikroskopi et par dage senere, da levende celler har intracellulært calcium og dermed er fluorescerende (figur 3; ED 9). Vaskulariseringen af tumoren kan observeres under et fluorescensmikroskop ved at injicere et fluorescerende farvestof i blodkarrene (figur 3; ED9). Det kan dog ikke altid være muligt at visualisere blodkarrene inde i tumoren, da sfæroiden er meget tæt. De fleksible interdigiterede elektroder placeres oven på den vaskulariserede tumor (figur 3; ED 9) og tilsluttet en pulsgenerator. Sonden skal placeres forsigtigt for at undgå blødning af embryoet; Ellers kan det fluorescerende farvestof sprede sig, hvilket forhindrer enhver observation ved billeddannelse. Korrekt levering af pulsen til det biologiske miljø kan verificeres ved at måle strømmen, der går gennem kredsløbet. Billeddannelse af disse i ovo-modeller muliggør realtidsovervågning af effekten af PEF'er på det intracellulære calcium i en 3D-glioblastomtumor samt vasokonstriktionen induceret på tumorens vaskulatur, idet man undgår enhver indflydelse fra andre celletyper, herunder immunsystemet15.
Undersøgelsen af PEF-effekten på glioblastom kan også udføres i en mere komplet og prædiktiv model. Faktisk består in vivo-modellen beskrevet ovenfor14 af podning af en 3D glioblastomtumor i hjernens parenchyma hos en mus (figur 4). Injektionsstedet for tumoren er tilsluttet af en tværbundet dextrangel hemi-perle for at rekapitulere de fysiologiske biofysiske begrænsninger under tumorens vækst. Selvom det er beskrevet i reference14, er det værd at understrege, at det er kritisk vigtigt, at dextran hemi-perlen er nøjagtigt superlimet til dura mater; Ellers kan tumoren undslippe gennem den åbne dura og helt dække hjernen, hvilket gør billeddannelsen umulig. For enhver kronisk billeddannelse udgør vævsindvækst, der finder sted, når kranievinduet heler, en alvorlig barriere, da det nye væv er uigennemsigtigt og gør billederne tågede eller ikke-anvendelige. Derfor, efter indsættelse og limning af hemi-perlen, skal sidevæggene i det åbne kranievindue forsegles med et tyndt lag superlim, der omhyggeligt placeres rundt om hulrumsvæggen uden at lade superlimen glide eller strømme på duraen. Når den fleksible sonde placeres oven på tumorinjektionsstedet, kan ingen bobler forblive under sonden af to grunde. For det første kan billeddannelse ikke fortsætte, når bobler er til stede. For det andet tjener bobler som isolatorer og ændrer dermed de elektriske stimuleringsegenskaber. Efter at have taget de ovenfor beskrevne forholdsregler forsegles kraniotomien med et glasvindue cementeret til kraniet for at muliggøre kronisk billeddannelse over uger. Da tumoren består af GCaMP eller DsRed, der udtrykker celler, kan injektionen bekræftes med et fluorescensmikroskop. Elektrodernes elektrokemiske impedans skal måles for at validere ydeevnen efter implantation. Sammenlignet med impedansen i saltopløsning forventes en stigning i impedansen in vivo ved frekvenser over 100 Hz på grund af tilstedeværelsen af et biologisk miljø (figur 5). Vaskulariseret neuralt parenkym og tumorinfiltration kan observeres og karakteriseres gennem det gennemsigtige substrat over uger ved to-fotonmikroskopi (figur 6). Anvendelsen af transgene dyr, der udtrykker fluorescerende proteiner i celler af interesse (immunceller og neuroner), kan f.eks. muliggøre påvisning af den minimale inflammatoriske proces, der induceres ved elektrodeimplantation alene (figur 6A), eller vise tilstedeværelsen af mikroglia og monocytter 26 dage efter implantation af en PEF-stimuleret elektrode implanteret oven på en voksende GBM-tumor (figur 6B1 ). I sidstnævnte tilfælde blev både perifere-monocytafledte celler og hjerneresidente mikrogliale celler fundet omkring og inde i tumoren (figur 6B2). På dagen for levering af PEF kan kontaktpuder af de fleksible elektroder tilsluttes pulsgeneratoren direkte under to-fotonmikroskopet. Samlet set kan denne model bruges til at undersøge effekten af bioelektriske behandlinger over tid ved hjælp af forskellige typer celler, der er involveret i hjernetumorudvikling, op til en dybde på omkring 500 μm.
Figur 1: Mikrofabrikation af fleksible elektroder . (A) Guldelektrodemønster og Parylen C-substrat. (B) Skitseåbning. (C) PEDOT:PSS-belægning. (D) Tilslutninger og emballage. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Elektrokemisk impedansspektroskopi af fleksible guldelektroder og PEDOT:PSS-belagte kolde elektroder i en saltopløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: In ovo-modellen af glioblastom. ED 0: Sfæroid observeret med et lysfeltmikroskop. ED 3: Shell mindre kultur af et vagtelembryo 3 dage efter åbning. ED 6: Tumor implanteret i CAM observeret med et lysfeltmikroskop. ED 9: Fleksibel enhed placeret på den vaskulariserede tumor (tumor i grønt og blodkar i rødt). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: In vivo-anvendelsen . (A) Skema for in vivo-forsøg . (B) Sondeplacering inden påføring af dækglas og akrylharpiks. C) Afsluttet implantation af sonde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Elektrokemisk impedansspektroskopi af fleksible guldelektroder i en saltopløsning sammenlignet med en implanteret sonde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Intravital multispektral to-foton-billeddannelse gennem elektroder . (A) Flisebelagt billede af den sunde hjerneoverflade i en kontrol multifluorescerende AMU-Neuroinflam mus 3 dage efter elektrodeimplantation. Cyan viser dendritisk arborisering af lag 5 pyramidale neuroner, grøn viser rekrutterede granulocytter og monocytter, og gul viser aktiverede mikroglia og dendritiske celler. Pink viser infrarød diffusion på grund af varmeakkumulering. (B1) Lignende billede som i A , men 26 dage efter tumorsfæroidimplantation 200 μm dybt inde i cortex umiddelbart efterfulgt af elektrodeimplantation. Bemærk akkumuleringen af grønne og gule immunceller. (B2) Lignende billede som i B1 , men 100 μm under elektrodernes overflade. Bemærk tilstedeværelsen af blå neuronal dendritisk arborisering i periferien af selve den røde tumormasse infiltreret af gule mikroglia og dendritiske celler. Dyb blå viser et andet harmonisk signal fra det peritumorale kollagen. (B3) Zoomet billede af B2 , der viser tilstedeværelsen af interneuron somas (angivet med pile) i nærheden af tumoren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Den tilgang, der beskrives i dette arbejde, gør det muligt for hjernetumormodeller med et integreret PEF-leveringssystem at studere effekten af PEF'er på forskellige niveauer af biologisk organisation. Mikrofabrikationsprotokollen består af standard tyndfilmsprocesser, som giver en stor grad af frihed i elektrodedesign, der kan tilpasses den specifikke applikation. Nogle gange kan et ekstra termisk udglødningstrin være nyttigt i slutningen af fremstillingen for at reducere bøjning af elektroderne, der opstod under fremstillingen.
Anvendelsen af en stabil glioblastomcellelinje, der udtrykker en fluorescerende calciumindikator, undgår alle komplikationer forbundet med farvestofafgivelse og tilbageholdelse, især i 3D-tumorer, der er meget tætte16. Faktisk observeres et højt ekspressionsniveau over en lang periode sammenlignet med standard kemiske fluorescerende calciumindikatorer17. Denne protokol kan anvendes på forskellige cellelinjer, da den almindeligvis bruges til billeddannelse af neural aktivitet11. Her blev humane og murine cellelinjer anvendt (U87 og Gl261 til implantation i henholdsvis immundeficiente eller immunkompetente mus). Faktisk viste nylige undersøgelser, at U87-cellelinjen er forskellig fra de oprindelige celler, da mange mutationer blev erhvervet over mange års cellekultur, hvilket påvirker eksperimentel reproducerbarhed18. Metoden, der anvendes til fremstilling af 3D-tumorer, er høj gennemstrømning, reproducerbar og tillader generering af sfæroider af en bestemt størrelse afhængigt af cellelinjen, antallet af celler ved såning og væksttidspunktet19. Imidlertid er disse sfæroider tætte, hvilket giver en ulempe ved billeddannelse i kernen af tumoren.
In ovo-modellen er nyttig som en første tilgang til at studere effekten af PEF på 3D-tumorer og deres vaskulatur uden interaktioner med andre celletyper, der er til stede i hjernen. Denne model er billig, hurtig, høj gennemstrømning og rejser færre etiske spørgsmål end dyremodeller. Det er vigtigt at bevare embryonets integritet under hele forsøget, da det kan påvirke dets overlevelse og billeddannelsens kvalitet. Der skal udvises særlig forsigtighed ved åbning af vagtelæget for at undgå skader på embryonmembranen. Transplantatet og placeringen af de fleksible elektroder skal også udføres omhyggeligt for at undgå blødning, der kan dræbe embryoet. Injektion af fluorescerende farvestof i blodkarrene muliggør samtidig visualisering af tumorcellerne og vaskularisering med fluorescensmikroskopi. Den intraokulære injektion skal udføres omhyggeligt for at undgå, at farvestof lækker ind i den embryonale væske, hvilket kan forårsage en resterende fluorescens i baggrunden, der forringer billeddannelsens kvalitet. Denne model kan også bruges til at følge lægemiddeloptagelse, da den giver adgang til kredsløbssystemet. Forsøgene er imidlertid begrænset af embryoets 12-dages overlevelsestid, hvilket giver mulighed for 7 dages observation, hvilket er betydeligt kortere end in vivo-modellen 21.
In vivo hjernetumormodellen kan overvåges i 4 til 5 uger, før dyr når et etisk eksperimentelt endepunkt bestemt af et pludseligt vægttab på 20%. Det tolereres godt og forbliver på plads, hvis elektrodens forbindelseshale ikke er for lang. Ellers har dyr en tendens til at ridse flipping-stikket, som i sidste ende kan blive revet og dermed forhindre efterfølgende forbindelse til stimulatoren. Denne 4-ugers periode er ikke desto mindre værdifuld for at dække de forskellige stadier af glioblastomudvikling. Ved sammenligning af tumorcelletæthederne i samme interessevolumen ved forskellige tidsintervaller kan udviklingen af tumorvækstkinetikken observeres. Især blev forbedret tumorvækst observeret på tidspunktet for immunkontakten22. En lignende undersøgelse i nærvær af en stimulerende elektrode ville informere om virkningen af PEF på tumorproliferation hastighed og tumorfølsomhed over for immunelimination. I sammenligning med in ovo-modellen kan in vivo-modellen ses som en værdifuld præklinisk model til at studere immuncellers indvirkning på tumorprogression og deres bidrag til den terapeutiske effekt af PEF. Denne protokol er tilpasset fra en tidligere artikel med tilsætning af en fleksibel elektrodeanordning på tumoren, inden der placeres et kranievindue14. Både de akutte og kroniske bioelektriske behandlinger af tumorer kan karakteriseres ved direkte og efterfølgende observationer med to-fotonmikroskopi, da indledende stimulering forventes at fremkalde celledød og udløse varig dysregulering af immunresponset.
Forbindelserne af den fleksible sonde er let tilgængelige under to-fotonmikroskopet. Elektriske stimuleringsparametre kan således justeres i realtid baseret på den observerede effekt på det neurale væv og / eller de målrettede celler, svarende til hvordan en læge ville udføre interventionelle procedurer, mens han observerede MR- eller CT-billeder af sin patient. En sidste overvejelse er vigtigheden af omhyggelig forsegling af elektroden på hjernen med superlim og silikonelim for at forhindre vævsgenvækst.
Afslutningsvis repræsenterer protokollen beskrevet her en innovativ model til undersøgelse af effekten af PEF-terapi med fleksible organiske polymerelektroder til glioblastomtumormodeller. De to modeller udviser forskellige niveauer af kompleksitet, således at cellulære, vaskulære eller immuneffekter kan adskilles for en bedre forståelse af virkningsmekanismerne. Konforme, overfladiske elektroder reducerer iatrogen skade, samtidig med at de muliggør forstyrrelse af tumormikromiljøet, hvilket udløser vasokonstriktion eller dysregulering af intracellulært calcium15.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Det arbejde, der rapporteres her, blev støttet af det franske nationale forskningsagentur (ANR-18-CE19-0029). Forfatterne takker varmt S.M. Bardet for hendes bidrag til genereringen af en stabil GCaMP6f-cellelinje og D. O'Connor for hendes hjælp med in ovo-modellen .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
| 96-well plate | Falcon | 353075 | |
| Acetone | Technic | 530 | |
| Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
| agarose | Sigma | A9539 | |
| autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
| AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
| AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
| AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
| AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
| Buprenorphine | Axience | ||
| Carprofen | Rimadyl | ||
| Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
| CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
| CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
| DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
| Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
| Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
| Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
| Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
| Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
| Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
| Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
| Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
| Flask | Greiner | 658170 | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
| Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
| Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
| Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
| Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
| Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
| hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
| Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
| Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
| Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
| Lab made pulse generator | |||
| Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
| Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
| Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
| Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
| Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
| Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
| PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
| parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
| PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
| PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
| penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
| Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
| Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
| PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
| Plastic mask | Selba | ||
| Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
| Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
| Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
| Propan-2-ol | Technic | 574 | |
| Protolaser S | LPKF | ||
| puromycin | Gibco | A11103 | |
| Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
| Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
| Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
| spin coater | Süss Microtec | ||
| Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
| Super glue | Office depot | ||
| tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
| Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
| U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
| Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
References
- Koshy, M., et al. Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries. Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).
- Davis, M. E. Glioblastoma: Overview of disease and treatment. Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 5 Suppl 2-8 (2016).
- Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation. IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).
- Breton, M., Mir, L. M. Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments. Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).
- Frandsen, S. K., et al. Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis. Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).
- Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -H. Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation. Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).
- Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).
- Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces. Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).
- Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).
- Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization. Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).
- Chen, T. -W., et al. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ribatti, D. Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
- Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).
- Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).
- Lefevre, M. C. Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model. npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).
- Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells. Methods. 90, 28-38 (2015).
- Blömer, U., et al. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).
- Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications. Biology. 10 (4), 301 (2021).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).
