Summary
עבודה זו מתארת את הפיתוח של אלקטרודות בין-ספרתיות גמישות ליישום במודלים תלת-ממדיים של גידולי מוח, כלומר בתרבית חוץ גופית , במודל ovo ובמודל in vivo murine. השיטה המוצעת יכולה לשמש להערכת ההשפעות של פולסים חשמליים על גידולים ברמות שונות של מורכבות.
Abstract
גליובלסטומה קשה למיגור עם טיפולים אונקולוגיים סטנדרטיים בשל רמת הפולשנות הגבוהה שלה. טיפולים ביואלקטריים המבוססים על פולסים חשמליים (PEFs) מבטיחים לשיפור יעילות הטיפול. עם זאת, הם מסתמכים על אלקטרודות קשיחות הגורמות נזק חריף וכרוני, במיוחד ברקמות רכות כגון המוח. בעבודה זו, נעשה שימוש באלקטרוניקה גמישה כדי להעביר PEFs לגידולים והתגובה הביולוגית הוערכה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. אלקטרודות זהב משולבות על מצע פרילן-C דק ושקוף צופו בפולימר המוליך PEDOT:PSS, והתוצאה הייתה התקן תואם ותואם ביולוגית. ההשפעות של PEFs על גידולים ועל המיקרו-סביבה שלהם נבדקו באמצעות מודלים ביולוגיים שונים. ראשית, מונושכבות של תאי גליובלסטומה גודלו בתרבית על גבי האלקטרודות כדי לחקור תופעות במבחנה. כשלב ביניים, פותח מודל in ovo שבו הושתלו ספרואידים גידוליים מהונדסים בקרום העוברי של שליו. בשל היעדר מערכת חיסונית, זה הוביל לגידולים מאוד וסקולריים. בשלב מוקדם זה של ההתפתחות, לעוברים אין מערכת חיסונית, וגידולים אינם מוכרים כגופים זרים. לכן, הם יכולים להתפתח במהירות תוך פיתוח כלי הדם שלהם ממערכת כלי הדם העוברית הקיימת, המייצגת מודל סרטן תלת ממדי בעל ערך. לבסוף, אספקת אלקטרודות גמישה של PEFs הוערכה באורגניזם שלם עם מערכת חיסון פונקציונלית, באמצעות מודל עכבר סינגני, אורתוגרפט (תוך גולגולתי). ספרואידים סרטניים הושתלו במוחם של עכברים רב-פלואורסצנטיים טרנסגניים לפני השתלת מכשירי אלקטרודות אורגניים גמישים. חלון גולגולתי אטום איפשר הדמיה מולטיפוטונית של הגידול והמיקרו-סביבה שלו במהלך הטיפול ב-PEFs במשך תקופה של מספר שבועות.
Introduction
גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM) הוא גידול פולשני ביותר ולכן קשה למגר אותו באמצעות טיפולים סטנדרטיים כגון כריתה, הקרנות וכימותרפיה. למרות טיפולים רב-מודאליים, הפרוגנוזה נותרה גרועה מאוד ורוב החולים חווים התקדמות מחלה תוך שנה מהאבחנה 1,2. לאחרונה, פיתוח טיפולים ביואלקטריים הראה פוטנציאל גדול לשיפור הטיפולים הקיימים. טיפולים אלה משתמשים בהעברת פולסים חשמליים (PEF), בדרך כלל בפגישת טיפול אחת, כדי לשבש את שלמות קרום התא ואת המיקרו-סביבה של גידולים. הפרעה זו בקרום התא, הידועה גם בשם אלקטרופורציה, יכולה להיות הפיכה או בלתי הפיכה בהתאם לעוצמת השדה החשמלי ומספר הפולסים. אלקטרופורציה בלתי הפיכה (IRE) מיושמת כטכניקת אבלציה לא תרמית של רקמות שבה פולסים חשמליים גורמים נזק קטלני לקרומי התאים המוביל למוות תאי3. אלקטרופורציה הפיכה מיושמת באלקטרוכימותרפיה (ECT), טכניקה מבוססת הכוללת מתן PEFs בשילוב עם תרופות כימותרפיות כדי לשפר את ספיגת התרופות בתאים סרטניים4. יתר על כן, מחקרים אחרונים הדגימו אלקטרופורציה של סידן כחלופה לנזעי חשמל עם יעילות גבוהה לטיפול בסרטן, שהיא גם זולה וגורמת לפחות תופעות לוואי5. למרות ההתקדמות המבטיחה הזו, PEFs מיושמים בדרך כלל באמצעות אלקטרודות מתכתיות קשיחות אשר ידועות כגורמות נזק לרקמות רכות6. המוח רגיש במיוחד למכשירים פולשניים כאלה שבהם חוסר ההתאמה המכנית גורם לדלקת ולהצטלקות אסטרוגליאלית7.
בהקשר זה, מוצגת מערכת אספקת PEF גמישה בשילוב עם מודלים תלת ממדיים של גידולי גליובלסטומה, החל ממיקרו-פבריקציה ועד מודל מורין. אלקטרודות קונפורמיות מיוצרות בתהליכי מיקרו-ייצור סטנדרטיים של סרט דק, כולל שימוש בחומרים רכים ובעלי תאימות ביולוגית כגון parylene-C, זהב ו-PEDOT:PSS 8,9. עיצוב אלקטרודה בין-ספרתית משמש לכיסוי שטח פנים גדול תוך שמירה על שקיפות נאותה להדמיה בין אצבעות האלקטרודה10. עבור מודל הגידול, ספרואידים תלת-ממדיים של תאי גליובלסטומה המבטאים כתב פלואורסצנטי מקודד גנטית מיוצרים באמצעות וריאציה של שיטת צלחת 96 בארות כיסוי נוזלי11. הספרואידים מושתלים בקרום הכוריאואלנטואי של עובר שליו, וכתוצאה מכך מודל in ovo שנעשה בו שימוש נרחב לחקר אנגיוגנזה או טוקסיקולוגיה של תרופות12,13. גידולים יכולים להיות מושתלים וכלי דם על ידי כלי הדם של העובר בהיעדר מערכת חיסונית בשלב זה של התפתחות העובר12. אלקטרודות גמישות ממוקמות לאחר מכן על גבי הגידול הווסקולרי כדי לחקור את ההשפעה של העברת PEF על הספרואיד וכלי הדם שלו. לבסוף, השפעות אלה נחקרות על אורגניזם חי שלם, כולל מיקרו-סביבה של הגידול ומערכת החיסון, על ידי השתלת ספרואידים מהונדסים בפרנכימת המוח של מודלים מורינים14. אלקטרודות גמישות מונחות על גבי אתר ההחדרה והקרניוטומיה אטומה באמצעות חלון זכוכית, המאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של שני פוטונים במשך מספר שבועות.
שיטות אלה יהיו שימושיות עבור אנשים המעוניינים בתחומים שונים, החל הנדסת מיקרואלקטרוניקה ליישומים אונקולוגיים. ניתן להשתמש בפרוטוקול המיקרו-פבריקציה ולהתאים אותו לכל יישום הדורש אלקטרודות מתכת דקות מצופות PEDOT:PSS. יתר על כן, המודלים הביולוגיים שפותחו להערכת טיפולים חשמליים נגד גידולים יהיו בעלי עניין כללי לחקר ההתמיינות של תגובה תאית, וסקולרית וחיסונית לחומרים מושתלים.
Protocol
כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם לחקיקה הצרפתית ובהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילה האירופית מיום 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC) לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. המחקר על בעלי חיים אושר על ידי Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône ואושר על ידי הוועדה האתית של Provence Cote D'Azur (Apafis # 22689-2019100414103054).
1. מיקרו-ייצור גמיש של מכשירים (איור 1)
- ניקוי מגלשות הזכוכית
- מחליקות זכוכית סוניקט בתמיסת סבון 2% למשך 15 דקות. שטפו אותם במים.
- יש להוסיף שוב תערובת של 80% אצטון טהור ו-20% איזופרופנול טהור למשך 15 דקות.
אזהרה: ממיסים אלה מזיקים ודליקים. יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) ולטפל בהם מתחת למכסה מנוע. - שוטפים את המגלשות עם איזופרופנול ומייבשים עם אקדח אוויר.
הערה: ודאו שהאצטון לא מתייבש על המצע במהלך כל התהליך.
- דפוס אלקטרודות זהב (איור 1A)
- הפקדת שכבה של 3 מיקרומטר של פארילן-C (PaC) עם מערכת שקיעת פארילן (איור 1Aa).
- הניחו את מגלשות הזכוכית המנוקות בתא התצהיר. רססו סבון על הצ'ילר, תנו לו להתייבש והכניסו אותו למלכודת הקרה הייעודית של מערכת השיקוע. חומר נוגד הדבקה זה מאפשר הסרה קלה של PaC מהצ'ילר לאחר התצהיר.
אזהרה: PaC הוא חומר מגרה ומהווה סכנה בריאותית. יש ללבוש כפפות בזמן הטיפול בו. - שוקלים 6 גרם של PaC בסירת אלומיניום ומניחים אותו בכבשן. פנה את המכונה (P = 10 mTorr) והתחל את התצהיר עם הפרמטרים הבאים:T Chiller = -100 °C,תנור T = 690 °C,וופורייזר T = 175 °Cותא T = 135 °C.
- כאשר התצהיר מסתיים וטמפרטורת הוופורייזר נמוכה מ-40°C, כבו את הצ'ילר, הוופורייזר והתנור. אווררו את המכונה ואספו את הדגימות.
- הניחו את מגלשות הזכוכית המנוקות בתא התצהיר. רססו סבון על הצ'ילר, תנו לו להתייבש והכניסו אותו למלכודת הקרה הייעודית של מערכת השיקוע. חומר נוגד הדבקה זה מאפשר הסרה קלה של PaC מהצ'ילר לאחר התצהיר.
- הפעל את פני השטח של הדגימות על ידי טיפול פלזמה חמצן במשך 30 s (100 W, 50 sccm).
- ציפו את הדגימות שטופלו בפלזמה בהתנגדות אור שלילית ב-1,000 x גרם למשך 40 שניות. הניחו את הדגימות על צלחת חמה בטמפרטורה של 110°C למשך 2 דקות (איור 1Ab).
זהירות: תמיסת photoresist דליקה וגורמת לגירוי; לבשו PPE וטפלו בו מתחת למכסה מנוע. - מקמו מסנן i-line בקו האלומה של מיישר המגע בפס רחב UV וחשפו את התנגדות האור דרך מסיכה הכוללת את עיצוב האלקטרודה הבין-ספרתית (איור 1Ac).
הערה: אלקטרודות אינטרדיגיטציה עם רווח של 50 או 250 מיקרומטר תוכננו באמצעות עורך פריסה ומסכות פוטו הוזמנו מחברה המייצרת מסכות פוטו פוליאסטר על ידי צילום לייזר. - אפו את הדגימות הנ"ל בטמפרטורה של 110°C על צלחת חמה במשך 3 דקות ותנו להן להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. טבלו דגימות במפתח ללא יוני מתכת למשך 3 דקות כדי להסיר את התנגדות האור שאינה חשופה. שטפו דגימות במים וייבשו אותן באקדח אוויר (איור 1Ad).
זהירות: הפתרון למפתחים הוא מטרד; יש ללבוש PPE וידית מתחת למכסה מנוע. - הפעל את פני השטח של הדגימות על ידי טיפול פלזמה חמצן במשך 60 s (100 W, 50 sccm).
- הפקידו שכבת הדבקה של 20 ננומטר של כרום ושכבת זהב של 300 ננומטר עם מאייד תרמי כדלקמן (איור 1Ae).
- אווררו את מכונת המאייד וחתכו את הדגימות (הפונות כלפי מטה) על הצלחת העגולה העליונה בעזרת ברגי מתכת. מלאו את כורי ההיתוך הימורים, בהתאמה, בכרום ובזהב. אטמו ופנו את המכונה כדי להגיע ללחץ מתחת ל-5·10-6 Torr. התחל את הסיבוב של מחזיק הדגימה.
- בחר את כור ההיתוך המכיל כרום והגדל לאט את הזרם העובר דרכו עד שתגיע לקצב שיקוע של 0.2 Å·s-1 . פתח את התריס והמתן עד 20 ננומטר של כרום מופקד. סגור את התריס והגביר באיטיות את הזרם עד 0 mA.
- בחר את כור ההיתוך המכיל זהב והגדל לאט את הזרם העובר דרכו עד שתגיע לשיעור שיקוע של 0.2 Å·s-1 . פתח את התריס כדי לאדות זהב, המתן עד להפקדת 10 ננומטר של זהב, ולאחר מכן הגדל את שיעור התצהיר ל -1.5 Å·s-1 עד להפקדה של כ -300 ננומטר. סגור את התריס והגביר באיטיות את הזרם ל- 0 mA.
- תנו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאחר התצהיר. עצור את הסיבוב של מחזיק הדגימה, אוורר את המכונה ואסוף את הדגימות.
- לטבול את הדגימות בכוס עם אצטון. הניחו את הכד על צלחת ניעור שנקבעה במהירות 110 סל"ד למשך 15 דקות כדי להרים את התנגדות הצילום. שטפו את הדגימות עם איזופרופנול וייבשו אותן עם אקדח אוויר (איור 1Af).
- הפעל את פני השטח של הדגימות על ידי טיפול פלזמה חמצן במשך 30 s (100 W, 50 sccm).
- הפקדת שכבת בידוד של 3 מיקרומטר של PaC עם מערכת שיקוע פארילן (ראה שלב 1.2.1) (איור 1Ag).
- הפקדת שכבה של 3 מיקרומטר של פארילן-C (PaC) עם מערכת שקיעת פארילן (איור 1Aa).
- פתיחת מיתאר (איור 1B)
- סובב לצפות את הדגימות עם photoresist חיובי ב 600 x גרם במשך 35 שניות. הניחו אותו על צלחת חמה בטמפרטורה של 110°C למשך 2 דקות (איור 1Ba).
זהירות: תמיסת photoresist דליקה וגורמת לגירוי; יש ללבוש PPE וידית מתחת למכסה מנוע. - ודא שאין מסנן i-line בקו הקורה של יישור המגע בפס רחב UV וחשוף את photoresist דרך מסיכה הכוללת את קווי המתאר של ההתקן עם יישור מגע UV בפס רחב (איור 1Bb).
- טבלו את הדגימות במפתח ללא יוני מתכת למשך 4 דקות כדי להסיר את ההתנגדות לאור שנחשפה. שטפו את הדגימות במים וייבשו אותן באקדח אוויר (איור 1Bc).
- חרטו את קווי המתאר דרך שתי השכבות של PaC עם חריטת יונים תגובתית (160 W, 22 דקות, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (איור 1Bd).
- הסר את photoresist הנותרים עם אצטון, לשטוף עם isopropanol, ולייבש את הדגימות עם אקדח אוויר.
- סובב לצפות את הדגימות עם photoresist חיובי ב 600 x גרם במשך 35 שניות. הניחו אותו על צלחת חמה בטמפרטורה של 110°C למשך 2 דקות (איור 1Ba).
- PEDOT:ציפוי PSS (איור 1C)
- ציפו תמיסת סבון 2% ב-70 x גרם במשך 35 שניות (איור 1Ca).
- הפקדת שכבת הקרבה של 3 מיקרומטר של PaC עם מערכת שיקוע פארילן (ראה שלב 1.2.1) (איור 1Cb).
- התנגדות פוטו חיובית למעיל מסתובב במהירות של 600 x גרם למשך 35 שניות. הניחו את הדגימות על צלחת חמה בטמפרטורה של 110°C למשך 2 דקות (איור 1Cc).
- ודא שאין מסנן קו i בקו הקורה של יישור המגע בפס רחב UV וחשוף את התנגדות האור דרך מסיכה הכוללת את פני השטח הפעילים של האלקטרודות (איור 1Cd).
- טבלו את הדגימות במפתח ללא יוני מתכת למשך 4 דקות כדי להסיר את ההתנגדות לאור שנחשפה. שטפו את הדגימות במים וייבשו אותן באקדח אוויר (איור 1Ce).
- חרט את ה- PaC עם חריטת יונים תגובתית כדי לפתוח את פני השטח הפעילים של האלקטרודות (160 W, 24 דקות, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). בדקו במיקרוסקופ שאין שאריות PaC על פני השטח הפעילים (איור 1Cf).
- הסר את photoresist הנותרים עם אצטון, לשטוף עם isopropanol ולייבש את הדגימות עם אקדח אוויר.
- הפעל את פני השטח של הדגימות באמצעות טיפול פלזמה חמצן במשך 90 s (100 W, 50 sccm).
- ערבבו פיזור מסחרי של PEDOT:PSS שעבר פולימור כימי עם 5% אתילן גליקול (EG), ו-0.1% נפח של חומצה סולפונית דודצילבנזן (DBSA). סוניק למשך 15 דקות. מוסיפים 1 wt% של (3-glycydyloxypropyl) trimethylsiloxane (GOPS) ו sonicate במשך 5 דקות. סנן את התמיסה דרך מסנן 1.2 מיקרומטר.
אזהרה: EG הוא חומר מגרה ומהווה סכנה בריאותית. DBSA הוא מגרה וקורוזיבי. GOPS הוא מאכל. יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים ולטפל בכימיקלים אלה מתחת למכסה מנוע.
הערה: אמצעי האחסון הכולל תלוי במספר הדגימות. עבור 10 שקופיות זכוכית סטנדרטיות, להכין לפחות 20 מ"ל כי יהיה להתאים את הכמויות הבאות: 18.78 מ"ל של PEDOT:PSS, 1 מ"ל של EG, 20 μL של DBSA, ו 200 μL של GOPS. - ציפוי ספין ארבע שכבות של תמיסת PEDOT:PSS במהירות של 150 x גרם למשך 35 שניות. לאחר שקיעת כל שכבה, אפו את הדגימות בטמפרטורה של 110°C במשך 60 שניות על צלחת חמה וקררו אותן לטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפני שתסובבו את השכבה הבאה (איור 1Cg).
- הסירו את שכבת ה-PaC המקריבה על-ידי טבילת הדגימות במים (איור 1Ch).
- אופים את הדגימות ב 140 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.
- טבלו את הדגימות במים שעברו דה-יוניזציה במשך 30 דקות כדי להסיר את שאריות הסבון והתרכובות בעלות המשקל המולקולרי הנמוך בסרט PEDOT:PSS ולנתק דגימות ממצע הזכוכית (איור 1Ci).
- חיבורים ואריזות (איור 1D)
- הניחו שכבה דקה של צבע אקרילי על סרט פולימיד המצופה נחושת (איור 1Da). השתמשו בתרסיס כדי לקבל שכבת צבע הומוגנית (איור 1Db).
- עצבו את הצבע האקרילי בלייזר (75 קילוהרץ, 7 ואט, מעבר לייזר אחד, 400 מ"מ·s-1) לקבלת שני רפידות מגע מלבניות (5 מ"מ x 15 מ"מ; מרווח של 1.5 מ"מ) (איור 1Dc).
- יש להרטיב את הנחושת עם ברזל כלוריד רווי של 30% (FeCl3) במים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 40°C (איור 1Dd).
זהירות: FeCl3 הוא חומר מגרה וקורוזיבי; טפלו בו עם כפפות מתחת למכסה מנוע. - הפשיטו את צבע האקריליק עם אצטון על-ידי שפשוף קל שלו עם מטלית (איור 1De).
- חתכו את סרט הפולימיד המעוצב לצורות מלבניות (15 מ"מ x 30 מ"מ) באמצעות לייזר (15 קילוהרץ, 10 ואט, 30 מעברי לייזר, 130 מ"מ·s-1) (איור 1Df).
- הוציאו משחת כסף עם מכונת ניפוק תלת-צירית בלחץ של שלושה ברים עם מחט בקוטר 330 מיקרומטר (5 מ"ק-1) (איור 1Dg).
זהירות: משחת כסף היא חומר מגרה; ידית עם כפפות. - ישרו וחברו את הגשושית PaC עם סרט הפולימיד תחת מיקרוסקופ דו-עיני באמצעות פינצטה (איור 1Dh).
הערה: ניתן לעצב סימני יישור בשלב 1.5.2 כדי להקל על מיקום הבדיקה על משטחי המגע. - אופים בחום של 140 מעלות במשך שעתיים בתנור.
- הניחו סרט הגנה פולימידבגודל 1 ס"מ 2 על רפידות המגע (איור 1Di).
- טבלו את הממשק שבו הגשושית PaC וסרט הפולימיד מחוברים ב-PDMS (איור 1Dj).
- אופים אותו במשך 2 שעות ב 50 מעלות צלזיוס.
- הסירו את סרט ההגנה כדי לפתוח את רפידות המגע (איור 1Dk).
הערה: מיקרו-ייצור של התקנים במבחנה דומה, אך יש לדלג על שלבים 1.2.1, 1.3 ו-1.5.
2. דור של קו תאים יציבים Glioblastoma GCaMP6f
- ייצור Lentivirus
- בצלוחית בגודל 75 סמ"ר, תרבית קו תאים הנגזר מ-HEK 293T המותאם לייצור לנטי-וירוס ב-10 מ"ל של מדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו המכיל 4.5 גרם· L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט בתוספת 10% סרום בקר עוברי ללא טטרציקלין (FBS), 100 יחידות·mL-1 של פניצילין ו-100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין למשך 3 ימים לפחות עד למפגש של 80%.
- מוציאים את המדיום מהצלוחית. שטפו בעדינות את התאים עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
- הוסף 1 מ"ל של 0.25% תמיסת טריפסין/EDTA ודגר על הבקבוק במשך 5 דקות ב 37 ° C.
זהירות: תמיסת טריפסין/EDTA מהווה סכנה בריאותית; יש ללבוש PPE וידית מתחת למכסה מנוע. - הוסף 8 מ"ל של מדיום תרבות. שטפו בעדינות את מתלה התא.
- לספור את התאים צלחת 4 x 106 תאים בצלחת פטרי ב 8 מ"ל של מדיום תרבית.
- למחרת, לדלל 25 מיקרוגרם של פלסמיד המכיל את הגן GCaMP6f וסמן בחירה המקנה עמידות לפורומיצין בנפח כולל של 600 מיקרוליטר מים. הוסף אותו לצינור של מגיב טרנספקציה. מערבלים במשך 10 שניות ב-3,000 סל"ד ודוגרים על הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר ייצור ננו-חלקיקים.
- מוסיפים את תכולת הצינור טיפתית על תרבית תאי HEK 293 T ומתנדנדים בעדינות ביד. לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 4 שעות לפחות.
- החלף את המדיה המכילה קומפלקסים של ננו-חלקיקים במדיה טרייה והחזיר את התאים בטמפרטורה של 37°C.
- שלושה ימים לאחר מכן, לאסוף את supernatant ואת הצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 10 דקות כדי להסיר פסולת סלולרית. אספו את השלב הנוזלי המכיל חלקיקים נגיפיים.
הערה: ניתן לאשר את ייצור הנגיף בסופרנאטנט באמצעות בדיקת טיטר לנטיויראלי כמותי וניתן לאחסן אותו ב -80 ° C למשך שנתיים לפחות.
- התמרה של תאי גליובלסטומה
- בצלוחית בגודל 75 סמ"ר, תרבית תאי גליובלסטומה ב-10 מ"ל DMEM המכילים 1 גרם· L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט בתוספת 10% FBS ללא טטרציקלין, 100 יחידות·mL-1 של פניצילין, ו-100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין למשך 4 ימים לפחות.
- השליכו את התווך והוסיפו את הסופרנאטנט שהתקבל בשלב 2.1.9 על תאי היעד.
- הוסף 5 מיקרוגרם·מ"ל-1 של הקסדימתרין ברומיד בתווך כדי לשפר את ההתמרה. לדגור במשך 6 שעות ב 37 ° C. החלף את המדיום עם 10 מ"ל של מדיום טרי.
זהירות: הקסדימתרין ברומיד הוא חומר מגרה. טפל בזה עם כפפות.
- יצירת קו תאים יציב
- יומיים עד שלושה לאחר הטרנסדוקציה, להוסיף 10 מ"ל של DMEM המכיל 1 גרם · L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט, 10% FBS, 100 יחידות·mL-1 של פניצילין, 100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין בתוספת פורומיצין כדי להרוג את התאים שאינם מותמרים. תאי תרבית במדיה זו לפחות 3 ימים.
זהירות: פורומיצין הוא חומר מגרה; טפל בו עם כפפות.
הערה: רגישות של תאים לפורומיצין חייבת להיבדק לפני התמרה על ידי תרבית תאים בתווך המומלץ שלהם המכיל ריכוזים שונים של פורומיצין. יום לאחר מכן, בדוק את התאים עם מיקרוסקופ. בחר את הריכוז המתאים שבו רוב התאים מתים אך מעטים עדיין חיים, כדי להבטיח שהאנטיביוטיקה אינה רעילה מדי ועלולה להרוג גם את התאים הנגועים. - הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS.
- הוסיפו 1 מ"ל של 0.25% מתמיסת טריפסין/EDTA ודגרו על הבקבוק במשך 5 דקות ב-37°C.
- הוסף 8 מ"ל של מדיום תרבות. שטפו בעדינות את מתלה התא.
- אספו 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים ומדדו את ריכוז התאים באמצעות מונה תאים. שאפו 50 μL של מתלה תאים במונה תאים אוטומטי ידני עם חיישן 60 מיקרומטר.
- זרעו תא אחד / באר בצלחת של 96 בארות. לדוגמה, עבור ריכוז של 1 x 10 3 תאים לכל מ"ל, להוסיף 1 / (1 x 103), כלומר, 0.001 מ"ל של השעיית תאים לכל באר. זרעו כל באר כדי להגדיל את סיכויי ההצלחה. להשלים עם מדיום תרבית כדי להגיע לנפח כולל של 200 μL לכל באר.
- יום לאחר מכן, מצא כל באר המכילה תא אחד ובדוק את הפלואורסצנטיות שלה (λexc = 490 ננומטר ו- λem = 530 ננומטר). סמן את הבארות המכילות תא נגוע אחד בלבד. ממשיכים את הצמיחה במשך כמה ימים עד שהבאר כמעט מתמזגת.
- השליכו את המדיום ושטפו את התאים עם 200 מיקרוליטר של PBS. הוסף 100 μL של תמיסת 0.25% טריפסין/EDTA ודגר על צלחת 96 בארות במשך 5 דקות ב 37 ° C.
- מוסיפים 100 μL של מדיום ושוטפים בעדינות את מתלה התא. מעבירים את תרחיף התא בצלחת פטרי. מוסיפים 5 מ"ל של מדיום ונותנים לתאים לגדול במשך כמה ימים עד צלחת פטרי הוא כמעט confluent.
- השליכו את המדיום ושטפו את התאים עם 5 מ"ל PBS. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA 0.25% ודגרו על צלחת הפטרי למשך 5 דקות ב-37°C.
- מוסיפים 6 מ"ל בינוני ושוטפים בעדינות את מתלה התא. העבר את מתלה התא לצלוחית T25. ממשיכים את הצמיחה במשך כמה ימים עד שהבקבוק כמעט מתמזג.
- השליכו את המדיום ושטפו את התאים עם 5 מ"ל PBS. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA 0.25% ודגר על בקבוק T25 למשך 5 דקות ב-37°C. הוסף 7 מ"ל DMEM המכיל 1 גרם· L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט, בתוספת 10% FBS, 100 יחידות·mL-1 של פניצילין, ו-100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין. שטפו בעדינות את מתלה התא.
- פצלו את מתלה התא לארבע צלוחיות T25 (2 מ"ל לכל צלוחיות) והוסיפו 5 מ"ל בינוני לכל בקבוק. תן לתאים לגדול במשך כמה ימים עד צלוחיות כמעט נפגשים.
- חזור על שלב 2.3.12 עבור שלוש צלוחיות ושמור את הבקבוק האחרון לשלב 3.1.3. העבר את מתלה התא בצינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא ב-900 μL. ערבבו בעדינות את התאים כדי לשמור על תרחיף תאים הומוגני.
- העבירו את תרחיף התא לבקבוקוני אחסון קריוגניים. הוסף 100 μL של dimethyl sulfoxide. מניחים את cryovials על -80 °C למשך הלילה. העברת תאים קפואים לחנקן נוזלי לניסויים נוספים.
הערה: ניתן להעריך את יעילות הטרנספקציה על ידי הוספת מלח סידן יונומיצין 5 מיקרומטר בתווך ובדיקת העלייה המושרה של פלואורסצנטיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (λexc = 490 ננומטר ו- λem = 530 ננומטר).
- יומיים עד שלושה לאחר הטרנסדוקציה, להוסיף 10 מ"ל של DMEM המכיל 1 גרם · L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט, 10% FBS, 100 יחידות·mL-1 של פניצילין, 100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין בתוספת פורומיצין כדי להרוג את התאים שאינם מותמרים. תאי תרבית במדיה זו לפחות 3 ימים.
3.3D דגמים
- תרבית ספרואידים
- הכינו תמיסה של 1% (w/v) אגרוז במים שעברו דה-יוניזציה (DI).
- מוסיפים 100 גרם אבקת אגרוז ב 100 מ"ל מים DI ומחממים את התמיסה בתנור מיקרוגל עד שכל האבקה מומסת. ערבבו את התמיסה באופן קבוע כדי למנוע גושים. Autoclave הפתרון במשך 20 דקות ב 120 ° C.
- לאחר שנלקח מן autoclave, להוסיף 75 μL של תמיסת agarose לכל באר צלחת 96 באר בזהירות. הפקידו אותו בצד הבאר כדי ליצור מניסקוס, וכתוצאה מכך תחתית עגולה לא דבקה. תן לו להתמצק במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- נתק את התאים (שלב 2.3.12) מהבקבוק שהתקבל בשלב 2.3.14.
- הוסף 10,000 תאים לכל באר של תאי גליובלסטומה והשלם כדי להגיע לנפח כולל של 150 μL לכל באר עם DMEM המכיל 1 גרם · L-1 של גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט וסודיום ביקרבונט, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 יחידות·mL-1 של פניצילין ו-100 מיקרוגרם·mL-1 של סטרפטומיצין.
- לדגור על תאים ב 37 ° C מבלי להזיז את הצלחת במשך 3 ימים. לאחר מכן, החליפו מחצית מהמדיה במדיה טרייה כל יומיים בפיפט רב ערוצי עד לניסויים נוספים. שמור את קצה פיפטה בחלק העליון של הבאר כדי למנוע נזק agarose או spheroid עצמו.
הערה: גודל הספרואידים תלוי במספר התאים שנזרעו ובקו התא, ולכן יש להתאים אותו בהתאם לניסויים.
- הכינו תמיסה של 1% (w/v) אגרוז במים שעברו דה-יוניזציה (DI).
- מודל in ovo
- מניחים ביצים מופרות של שליו יפני (C. japonica) באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו-57% לחות) על מגשים עם מסובב אוטומטי שמסובב ביצים כל שעתיים. יום זה נחשב ליום העובר (ED) 0.
- שטפו סירות שקילה מפלסטיק על ידי הכנסתן לאתנול 70% (w/v). הוציאו את סירות השקילה וייבשו אותן תחת מכסה אדים.
הערה: מנקודה זו, ניסויים אינם מבוצעים בתנאים סטריליים. עם זאת, תנאים נקיים נדרשים כדי למנוע התפתחות של עובש על העוברים. - ב-ED3, פתחו בעדינות את הביצים באמצעות פינצטה עם קצוות דקים שטופים מראש עם אתנול 70% (w/v). יוצקים את העובר לסירת שקילה מפלסטיק, מכסים אותו בסירת שקילה נוספת ומניחים אותו באינקובטור לח סטנדרטי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
- על ED6, לעשות חתך קטן בקרום chorioallantoic (CAM) עם מחט 23 גרם.
- בעזרת פיפטה מניחים ספרואיד 7 ימים על החתך, ומחזירים את העובר לאינקובטור למשך 3 ימים, עד לניסויים נוספים.
הערה: ניתן להזריק צבע פלואורסצנטי לעין העובר כדי להמחיש כלי דם. - ביום הניסוי, הניחו את הגשושית הגמישה על גבי הגידול הווסקולרי באמצעות מיקרומניפולטור.
- ה in vivo מודל
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מותאם מזה שפורסם בעבר בהפניה14. נעשה שימוש בעכברי AMU-Neuroinflam פלואורסצנטיים צבעוניים בוגרים (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD); עכברים אלה מציגים תיוג של תת-אוכלוסייה של Thy1+ נוירונים על ידי ביטוי מהונדס של ECFP, תיוג של LyzM היקפי+ תאים דלקתיים על ידי ביטוי מהונדס של EGFP ותיוג של תת-סוג של מיקרוגליה המבטא EYFP תחת שליטה של Cd11c+. בקצרה, בעלי החיים מורדמים קלות עם 1.5% איזופלורן למשך 2 דקות לפני כל טיפול או הזרקה. לפני הניתוח מרדימים את בעלי החיים בקטמין (120 מ"ג/ק"ג; IP) וקסילזין (12 מ"ג/ק"ג; IP). לאחר מכן, 3% לידוקאין ג'ל מוחל באופן מקומי כדי להקל על כל כאב באוזניים הקשורים קיבוע של תמיכה סטריאוטקטית. לאחר מכן, 0.25% פתרון Bupivacaine מנוהל לאתר הניתוח כדי להקל על כל כאב עקב craniotomy. לאחר הכנת העכבר לניתוח, בוצעה קרניוטומיה בקוטר 4 מ"מ על פי הפניה14. עם מחט 26 גרם, חור נעשה dura-mater באמצע craniotomy ואת spheroid הגידול הוזרק עם מערכת ההזרקה המתוארת בהתייחסות14. בנוסף, כפי שמתואר כאן, אלקטרודה גמישה הונחה על GCamp6 או DsRed המבטא ספרואיד גידול לפני אטימת הקרניוטומיה עם חלון זכוכית.- מניחים טיפה של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) כך שהוא מכסה את craniotomy. הניחו את האלקטרודה הגמישה על טיפת DPBS, והניחו בעדינות את החלק האחורי של הגשושית עם רפידות מגע על גב העכבר (איור 4B).
הערה: השתמש בכפפות סטריליות ובטכניקת "טיפ בלבד". החליפו את הכפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי. ספק תמיכה תרמית במהלך הליך זה. - גע בצניחת DPBS עם פיסת נייר קטנה כדי לספוג DPBS עד שהגשושית יכולה לשכב שטוחה על הדורה ולעקוב אחר העקמומיות של המוח. ודא ששכבה קטנה של DPBS נשארת מתחת לאלקטרודות מבלי לברוח מהצד של האלקטרודה. זה מבטיח מחסום מפני זליגת דבק במהלך השלבים הבאים.
הערה: יש לעקר את כל הציוד לפני השימוש. - הניחו טיפה קטנה של דבק סיליקון על הגשושית וכסו אותה בזכוכית כיסוי עגולה בקוטר 5 מ"מ. דחפו את זכוכית הכיסוי כלפי מטה עד שהסיליקון מפוזר באופן שווה והמרחק בין זכוכית הכיסוי לבדיקה הוא מינימלי. דחפו את זכוכית הכיסוי כלפי מטה למשך 30 שניות נוספות כדי שהסיליקון יוכל להתמצק.
- כדי לאבטח את זכוכית הכיסוי, מרחו במהירות דבק-על על צדדיה ודחפו אותה כלפי מטה עד שהדבק יתאחז למוצק.
- בעזרת קיסם, מרחו דבק-על על צוואר הגשושית ודאגו שדבק-העל יישאב מתחת לצוואר כדי לספק תמיכה יציבה עבורו.
- כסו את הגולגולת במלט דנטלי כדי לבנות כובע כרוני. יש להקפיד במיוחד לכסות את שולי זכוכית הכיסוי בלבד.
- הרימו את החלק האחורי של הגשושית ומרחו מלט מתחת לצוואר הבדיקה. הניחו את הגשושית על המלט לפני שהוא נרפא. דחפו את צוואר הגשושית בעדינות עם מלקחיים קהים כך שפני השטח שלה יהיו באותה רמה כמו זו של זכוכית הכיסוי ולא בדרך של מטרת המיקרוסקופ במהלך הניסוי.
- כסו את החלק העליון של צוואר הבדיקה בלא יותר מ-1.5 מ"מ של שכבת מלט דנטלי כדי להשיג אחיזה איתנה בבדיקה. בנו באר צמנט המציגה רכס של 1.5 מ"מ במרחק של 1-2 מ"מ סביב זכוכית הכיסוי כדי ליצור אגן עבור נוזל הטבילה עבור הדמיה של שני פוטונים (איור 4C).
- לאחר שהמלט נרפא, החל משככי כאבים לאחר ניתוח buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג, 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף תת עורית) ולשמור על החיה באווירה חמה עד שהוא מתעורר. זה כולל קרבה לנורת אינפרא אדום, כמו גם לעטוף את החיה במגבת נייר.
הערה: מקם מדחום בגובה העכבר כדי לפקח על הטמפרטורה. - אפיין עכבה בטווח של 1-10 קילוהרץ באמצעות פוטנציוסטט.
- תן לחיה להתאושש מהניתוח לפחות 10 ימים. לתת תרופות אנטי דלקתיות מיד לאחר הניתוח ולהמשיך לעקוב אחר מצב החיה כדי לספק משככי כאבים מתאימים לאחר הניתוח.
- מניחים טיפה של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) כך שהוא מכסה את craniotomy. הניחו את האלקטרודה הגמישה על טיפת DPBS, והניחו בעדינות את החלק האחורי של הגשושית עם רפידות מגע על גב העכבר (איור 4B).
4. העברה והדמיה של שדה חשמלי פועם (PEF)
- הניחו את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במקרה של מודלים תלת ממדיים, גידולים ניתן לראות רק מלמעלה.
הערה: עבור מודל in ovo , ניסויים בוצעו תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי (אך אפשרי גם במיקרוסקופ של שני פוטונים), בעוד שהניסויים במודל in vivo בוצעו תחת מיקרוסקופ של שני פוטונים (איור 6). - חברו מחולל פולסים לכריות המגע של המכשירים באמצעות מחברי פין פוגו (in vitro) או קליפסים של תנינים (in ovo ו-in vivo) (איור 4A). הגדר את הפרמטרים הרצויים (מספר פולסים, מתח, משך פולס, תדר) והפעל PEFs על-ידי הפעלת הגנרטור (איור 4A). מדוד פלואורסצנטיות בו זמנית כדי לבחון את ההשפעות של PEFs בזמן אמת.
Representative Results
פרוטוקול זה מאפשר יישום לשני מודלים של גליובלסטומה בהם משולבת מערכת אספקת PEF גמישה. לאחר שלבי מיקרו-ייצור ואריזה, אלקטרודות גמישות מאופיינות בתמיסת מלח על ידי ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית (EIS) כדי להעריך ולאמת את ביצועיהן. האלקטרודות מצופות PEDOT:PSS מראות את האזורים הנשלטים הקיבוליים וההתנגדותיים האופייניים המופרדים על-ידי תדר חיתוך, בעוד שהאלקטרודות הלא מצופות מציגות התנהגות קיבולית בלבד (איור 2).
וריאציה של שיטת צלחת 96 בארות כיסוי נוזלי משמשת לגידול גידולים תלת-ממדיים העשויים מתאי גליובלסטומה נגועים המבטאים ביציבות כתב סידן תוך תאי פלואורסצנטי. ניתן לצפות בצמיחת הספרואידים באמצעות מיקרוסקופ בעל שדה בהיר (איור 3; אד 0). לפחות 2 או 3 ימים נדרשים כדי לקבל spheroids כדורי צפוף, בהתאם לקו התא ואת מספר התאים זרע.
במודל in ovo , ספרואידים מושתלים בקרום הכוריאואלנטואי של עובר שליו (איור 3; אד 6). את הצלחת השתל ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמה ימים לאחר מכן, מאחר שבתאים חיים יש סידן תוך-תאי, ולכן הם פלואורסצנטיים (איור 3; אד 9). ניתן לצפות בכלי הדם של הגידול תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על-ידי הזרקת צבע פלואורסצנטי לכלי הדם (איור 3; ED9). עם זאת, לא תמיד ניתן לדמיין את כלי הדם בתוך הגידול מכיוון שהספרואיד צפוף מאוד. האלקטרודות הבין-ספרתיות הגמישות ממוקמות על גבי הגידול הווסקולרי (איור 3; ED 9) ומחובר למחולל פולסים. הבדיקה חייבת להיות ממוקמת בעדינות כדי למנוע דימום של העובר; אחרת, הצבע הפלואורסצנטי יכול להתפשט, מה שחוסם כל תצפית על ידי הדמיה. ניתן לאמת העברה נכונה של הדופק לסביבה הביולוגית על ידי מדידת הזרם העובר במעגל. הדמיה של אלה במודלים של אובו מאפשרת ניטור בזמן אמת של השפעת PEFs על הסידן התוך-תאי בגידול גליובלסטומה תלת-ממדי, כמו גם את התכווצות כלי הדם הנגרמת על כלי הדם של הגידול, תוך הימנעות מכל השפעה של סוגי תאים אחרים כולל מערכת החיסון15.
המחקר של השפעת PEF על גליובלסטומה יכול להתבצע גם במודל מלא יותר ומנבא. ואכן, מודל in vivo שתואר לעיל14 מורכב מהשתלת גידול גליובלסטומה תלת-ממדי בפרנכימת המוח של עכבר (איור 4). אתר ההזרקה של הגידול מחובר על ידי חרוז ג'ל דקסטרן צולב, כדי לשחזר את האילוצים הביופיזיים הפיזיולוגיים במהלך צמיחת הגידול. למרות המתואר בהערה14, ראוי להדגיש שוב כי חשוב באופן קריטי כי חרוז חצי הדקסטרן יהיה מודבק במדויק לדורה מאטר; אחרת, הגידול יכול לברוח דרך הדורה הפתוחה ולכסות לחלוטין את המוח, מה שהופך את ההדמיה לבלתי אפשרית. עבור כל הדמיה כרונית, צמיחת רקמות המתרחשת כאשר חלון הגולגולת מחלים מהווה מחסום רציני, שכן הרקמה החדשה אינה שקופה והופכת את התמונות למעורפלות או לא שמישות. לכן, לאחר החדרה והדבקה של חצי החרוז, יש לאטום את דפנות חלון הגולגולת הפתוח בשכבה דקה של דבק-על המונחת בקפידה סביב קיר החלל, מבלי לתת לדבק-העל להחליק או לזרום על הדורה. כאשר הבדיקה הגמישה ממוקמת על גבי אתר הזרקת הגידול, שום בועות לא יכולות להישאר מתחת לבדיקה, משתי סיבות. ראשית, הדמיה אינה יכולה להתקדם כאשר קיימות בועות. שנית, בועות משמשות כמבודדות, ובכך משנות את תכונות הגירוי החשמלי. לאחר נקיטת אמצעי הזהירות המתוארים לעיל, הקרניוטומיה נאטמת באמצעות חלון זכוכית המוצמד לגולגולת כדי לאפשר הדמיה כרונית במשך שבועות. מכיוון שהגידול מורכב מתאים המבטאים GCaMP או DsRed, ניתן לאשר את ההזרקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יש למדוד את העכבה האלקטרוכימית של האלקטרודות כדי לאמת את הביצועים לאחר ההשתלה. בהשוואה לעכבה בתמיסת מלח, צפויה עלייה של העכבה in vivo בתדרים מעל 100 הרץ עקב נוכחות של סביבה ביולוגית (איור 5). ניתן לצפות ולהתאפיין בפרנכימה עצבית וסקולרית ובהסננה של הגידול דרך המצע השקוף במשך שבועות באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים (איור 6). השימוש בחיות טרנסגניות המבטאות חלבונים פלואורסצנטיים בתאים מעניינים (תאי חיסון ונוירונים) יכול, למשל, לאפשר הדגמה של התהליך הדלקתי המינימלי המושרה על-ידי השתלת אלקטרודות בלבד (איור 6A) או להראות נוכחות של מיקרוגליה ומונוציטים 26 יום לאחר ההשתלה של אלקטרודה מגורה PEF שהושתלה על גבי גידול גדל של GBM (איור 6B1 ). במקרה האחרון, גם תאים היקפיים-מונוציטים וגם תאי מיקרוגליאה שוכני מוח נמצאו סביב הגידול ובתוכו (איור 6B2). ביום מסירת PEF ניתן לחבר רפידות מגע של האלקטרודות הגמישות למחולל הדופק, ישירות תחת מיקרוסקופ שני פוטונים. בסך הכל, מודל זה יכול לשמש לחקר ההשפעה של טיפולים ביואלקטריים לאורך זמן באמצעות סוגים שונים של תאים המעורבים בהתפתחות גידולי מוח, עד לעומק של כ -500 מיקרומטר.
איור 1: מיקרו-ייצור של אלקטרודות גמישות . (A) תבנית אלקטרודות זהב ומצע פארילן C. (ב) פתיחת מתאר. (C) PEDOT:ציפוי PSS. (ד) חיבורים ואריזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית של אלקטרודות זהב גמישות ואלקטרודות קרות מצופות PEDOT:PSS בתמיסת מלח. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מודל in ovo של גליובלסטומה. ED 0: ספרואיד שנצפה במיקרוסקופ שדה בהיר. ED 3: תרבית פחות קליפה של עובר שליו 3 ימים לאחר הפתיחה. ED 6: גידול שהושתל ב- CAM שנצפה במיקרוסקופ שדה בהיר. ED 9: מכשיר גמיש המונח על הגידול הווסקולרי (גידול בירוק וכלי דם באדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: היישום in vivo. (A) תוכנית לניסויים in vivo. (ב) יש לבצע בדיקה לפני מריחת זכוכית כיסוי ושרף אקרילי. (ג) השתלת בדיקה שהושלמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית של אלקטרודות זהב גמישות בתמיסת מלח בהשוואה לגשושית מושתלת. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הדמיה תוך-ספקטרלית מולטיספקטרלית של שני פוטונים באמצעות אלקטרודות . (A) תמונה מרוצפת של פני השטח הבריאים של המוח בעכבר AMU-Neuroinflam רב-פלואורסצנטי 3 ימים לאחר השתלת האלקטרודה. ציאן מראה ארבוריזציה דנדריטית של נוירונים פירמידליים בשכבה 5, ירוק מראה גרנולוציטים ומונוציטים מגויסים, וצהוב מראה תאי מיקרוגליה ודנדריטים פעילים. ורוד מראה דיפוזיה אינפרא אדום עקב הצטברות חום. (ב1) תמונה דומה כמו ב-A אך 26 ימים לאחר השתלת ספרואיד הגידול 200 מיקרומטר עמוק בתוך קליפת המוח מיד לאחר מכן השתלת אלקטרודות. שימו לב להצטברות של תאי חיסון ירוקים וצהובים. (ב2) תמונה דומה לזו של B1 אך 100 מיקרומטר מתחת לפני השטח של האלקטרודות. שימו לב לנוכחות של ארבוריזציה דנדריטית עצבית כחולה בפריפריה של מסת הגידול האדומה עצמה שחדרה על ידי מיקרוגליה צהובה ותאים דנדריטיים. כחול עמוק מראה אות הרמוני שני מהקולגן הפריטומורלי. (ב3) תצוגה מוגדלת של B2 המראה נוכחות של סומות בין נוירונים (מסומנות על ידי חצים) בקרבת הגידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הגישה המתוארת בעבודה זו מאפשרת מודלים של גידולי מוח עם מערכת העברת PEF משולבת לחקור את ההשפעה של PEFs ברמות שונות של ארגון ביולוגי. פרוטוקול המיקרו-פבריקציה מורכב מתהליכים סטנדרטיים של סרט דק, המספקים מידה רבה של חופש בתכנון אלקטרודות שניתן להתאים ליישום הספציפי. לפעמים, שלב חישול תרמי נוסף יכול להיות שימושי בסוף הייצור, כדי להפחית את כיפוף האלקטרודות שהתרחש במהלך הייצור.
השימוש בקו תאי גליובלסטומה יציב המבטא אינדיקטור סידן פלואורסצנטי מונע את כל הסיבוכים הקשורים להעברת צבע ושמירתו, במיוחד בגידולים תלת ממדיים צפופים מאוד16. ואכן, רמת ביטוי גבוהה נצפתה לאורך תקופה ארוכה בהשוואה למדדי סידן פלואורסצנטיים כימיים סטנדרטיים17. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על קווי תאים שונים, כפי שהוא משמש בדרך כלל עבור דימות פעילות עצבית11. כאן נעשה שימוש בקווי תאים אנושיים ומורין (U87 ו-Gl261 להשתלה בעכברים מדוכאי חיסון או מדוכאי חיסון, בהתאמה). ואכן, מחקרים אחרונים הראו כי קו התאים U87 שונה מזה של התאים המקוריים, שכן מוטציות רבות נרכשו במשך שנים של תרבית תאים, והשפיעו על שחזור ניסיוני18. השיטה המשמשת להכנת גידולים תלת ממדיים היא תפוקה גבוהה, ניתנת לשחזור, ומאפשרת יצירת ספרואידים בגודל מסוים בהתאם לקו התא, מספר התאים בעת הזריעה וזמן הצמיחה19. עם זאת, ספרואידים אלה צפופים, אשר מציג חסרון בעת הדמיה בליבת הגידול.
מודל in ovo שימושי כגישה ראשונה לחקר ההשפעה של PEF על גידולים תלת-ממדיים וכלי הדם שלהם, ללא אינטראקציות עם סוגי תאים אחרים הנמצאים במוח. מודל זה זול, מהיר, בעל תפוקה גבוהה ומעלה פחות סוגיות אתיות מאשר מודלים של בעלי חיים. חשוב לשמור על שלמות העובר לאורך כל הניסוי, שכן הדבר עלול להשפיע על הישרדותו ועל איכות ההדמיה. יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת פתיחת ביצת השליו, כדי למנוע נזקים לקרום העוברי. השתל ומיקום האלקטרודות הגמישות חייבים להתבצע גם הם בזהירות, כדי למנוע דימום שעלול להרוג את העובר. הזרקת צבע פלואורסצנטי בכלי הדם מאפשרת הדמיה בו זמנית של תאי הגידול וכלי הדם במיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההזרקה התוך עינית חייבת להתבצע בזהירות כדי למנוע דליפת צבע לנוזל העוברי, מה שעלול לגרום לפלואורסצנטיות שיורית ברקע הפוגעת באיכות ההדמיה. מודל זה יכול לשמש גם למעקב אחר ספיגת סמים, שכן הוא מאפשר גישה למערכת הדם. עם זאת, הניסויים מוגבלים על ידי זמן ההישרדות של 12 ימים של העובר, ובכך מאפשרים 7 ימי תצפית, שהוא קצר משמעותית ממודל in vivo 21.
מודל גידול המוח in vivo יכול להיות מנוטר במשך 4 עד 5 שבועות לפני שבעלי חיים מגיעים לנקודת סיום ניסויית אתית שנקבעת על ידי ירידה פתאומית של 20% במשקל. זה נסבל היטב ונשאר במקום אם זנב החיבור של האלקטרודה אינו ארוך מדי. אחרת, בעלי חיים נוטים לשרוט את המחבר המתהפך, אשר עלול בסופו של דבר להיקרע, ובכך למנוע חיבור לאחר מכן למגרה. תקופה זו של 4 שבועות היא בכל זאת בעלת ערך כדי לכסות את השלבים השונים של התפתחות גליובלסטומה. כאשר משווים את צפיפות תאי הגידול באותו נפח של עניין במרווחי זמן שונים, ניתן לראות את האבולוציה של קינטיקה צמיחת הגידול. בפרט, צמיחה מוגברת של הגידול נצפתה בזמן המתג החיסוני22. מחקר דומה בנוכחות אלקטרודה מעוררת יידע על ההשפעה של PEF על קצב התפשטות הגידול ורגישות הגידול לסילוק מערכת החיסון. בהשוואה למודל in ovo , ניתן לראות את מודל in vivo כמודל פרה-קליני רב ערך לחקר ההשפעה של תאי מערכת החיסון על התקדמות הגידול ותרומתם להשפעה הטיפולית של PEF. פרוטוקול זה מותאם ממאמר קודם עם תוספת של מכשיר אלקטרודה גמיש על הגידול לפני הנחת חלון גולגולת14. הן הטיפולים הביואלקטריים החריפים והן הכרוניים של גידולים יכולים להיות מאופיינים בתצפיות ישירות ועוקבות במיקרוסקופ של שני פוטונים, בהתחשב בכך שהגירוי הראשוני צפוי לגרום למוות תאי ולעורר דיסרגולציה מתמשכת של התגובה החיסונית.
החיבורים של הגשושית הגמישה נגישים בקלות תחת מיקרוסקופ שני פוטונים. לפיכך, ניתן להתאים פרמטרים של גירוי חשמלי בזמן אמת בהתבסס על ההשפעה הנצפית על הרקמה העצבית ו / או תאי המטרה, בדומה לאופן שבו רופא היה מבצע הליכים התערבותיים תוך צפייה בתמונות MRI או CT של המטופל שלו. שיקול אחרון הוא החשיבות של איטום זהיר של האלקטרודה במוח עם דבק-על ודבק סיליקון כדי למנוע צמיחה מחודשת של רקמות.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג מודל חדשני לחקר ההשפעה של טיפול PEF עם אלקטרודות פולימר אורגני גמישות עבור מודלים של גידולי גליובלסטומה. שני המודלים מציגים רמות שונות של מורכבות, כך שניתן להפריד בין השפעות תאיות, וסקולריות או חיסוניות להבנה טובה יותר של מנגנוני הפעולה. אלקטרודות קונפורמיות ושטחיות מפחיתות את הנזק היאטרוגני תוך שהן מאפשרות שיבוש של המיקרו-סביבה של הגידול, מה שגורם להתכווצות כלי דם או חוסר ויסות של סידןתוך-תאי 15.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
העבודה המדווחת כאן נתמכה על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-18-CE19-0029). המחברים מודים בחום ל- S.M. Bardet על תרומתה ליצירת קו תאים יציב GCaMP6f ו- D. O'Connor על עזרתה במודל in ovo .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
| 96-well plate | Falcon | 353075 | |
| Acetone | Technic | 530 | |
| Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
| agarose | Sigma | A9539 | |
| autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
| AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
| AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
| AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
| AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
| Buprenorphine | Axience | ||
| Carprofen | Rimadyl | ||
| Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
| CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
| CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
| DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
| Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
| Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
| Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
| Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
| Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
| Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
| Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
| Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
| Flask | Greiner | 658170 | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
| Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
| Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
| Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
| Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
| Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
| hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
| Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
| Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
| Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
| Lab made pulse generator | |||
| Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
| Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
| Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
| Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
| Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
| Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
| PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
| parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
| PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
| PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
| penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
| Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
| Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
| PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
| Plastic mask | Selba | ||
| Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
| Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
| Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
| Propan-2-ol | Technic | 574 | |
| Protolaser S | LPKF | ||
| puromycin | Gibco | A11103 | |
| Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
| Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
| Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
| spin coater | Süss Microtec | ||
| Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
| Super glue | Office depot | ||
| tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
| Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
| U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
| Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
References
- Koshy, M., et al. Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries. Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).
- Davis, M. E. Glioblastoma: Overview of disease and treatment. Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 5 Suppl 2-8 (2016).
- Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation. IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).
- Breton, M., Mir, L. M. Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments. Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).
- Frandsen, S. K., et al. Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis. Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).
- Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -H. Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation. Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).
- Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).
- Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces. Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).
- Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).
- Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization. Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).
- Chen, T. -W., et al. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ribatti, D. Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
- Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).
- Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).
- Lefevre, M. C. Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model. npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).
- Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells. Methods. 90, 28-38 (2015).
- Blömer, U., et al. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).
- Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications. Biology. 10 (4), 301 (2021).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).
