Summary
Detta arbete beskriver utvecklingen av flexibla interdigiterade elektroder för implementering i 3D-hjärntumörmodeller, nämligen in vitro-odling, in ovo-modell och in vivo murin modell. Den föreslagna metoden kan användas för att utvärdera effekterna av pulserande elektriska fält på tumörer vid olika nivåer av komplexitet.
Abstract
Glioblastom är svårt att utrota med vanliga onkologibehandlingar på grund av dess höga grad av invasivitet. Bioelektriska behandlingar baserade på pulserande elektriska fält (PEF) är lovande för att förbättra behandlingseffektiviteten. De är dock beroende av styva elektroder som orsakar akut och kronisk skada, särskilt i mjuka vävnader som hjärnan. I detta arbete användes flexibel elektronik för att leverera SUF till tumörer och det biologiska svaret utvärderades med fluorescerande mikroskopi. Interdigiterade guldelektroder på ett tunt, transparent parylen-C-substrat belades med den ledande polymeren PEDOT: PSS, vilket resulterade i en formbar och biokompatibel enhet. Effekterna av SUF på tumörer och deras mikromiljö undersöktes med hjälp av olika biologiska modeller. Först odlades monolager av glioblastomceller ovanpå elektroderna för att undersöka fenomen in vitro. Som ett mellansteg utvecklades en in ovo-modell där konstruerade tumörsfäroider ympades i det embryonala membranet hos en vaktel. På grund av frånvaron av ett immunförsvar ledde detta till mycket vaskulariserade tumörer. I detta tidiga utvecklingsstadium har embryon inget immunförsvar, och tumörer erkänns inte som främmande kroppar. Således kan de utvecklas snabbt samtidigt som de utvecklar sina egna kärl från det befintliga embryokärlsystemet, vilket representerar en värdefull 3D-cancermodell. Slutligen utvärderades flexibel elektrodtillförsel av SUF:er i en komplett organism med ett funktionellt immunsystem, med hjälp av en syngen, ortograft (intrakraniell) musmodell. Tumörsfäroider ympades in i hjärnan hos transgena multifluorescerande möss före implantation av flexibla organiska elektrodanordningar. Ett förseglat kranialfönster möjliggjorde multifotonavbildning av tumören och dess mikromiljö under behandling med SUF under flera veckors tid.
Introduction
Glioblastoma multiforme (GBM) är en mycket invasiv tumör och därför svår att utrota med standardbehandlingar som resektion, strålbehandling och kemoterapi. Trots multimodala behandlingar är prognosen fortfarande mycket dålig och de flesta av patienterna upplever sjukdomsprogression inom 1 år efter diagnos 1,2. Nyligen har utvecklingen av bioelektriska behandlingar visat stor potential att förbättra befintliga terapier. Dessa terapier använder leverans av pulserade elektriska fält (PEF), vanligtvis i en enda behandlingssession, för att störa cellmembranintegriteten och mikromiljön hos tumörer. Denna cellmembranstörning, även känd som elektroporering, kan vara reversibel eller irreversibel beroende på den elektriska fältintensiteten och antalet pulser. Irreversibel elektroporering (IRE) tillämpas som en icke-termisk vävnadsablationsteknik där elektriska pulser orsakar dödlig skada på cellmembran som leder till celldöd3. Reversibel elektroporering tillämpas i elektrokemoterapi (ECT), en etablerad teknik som består av tillförsel av SUF i kombination med kemoterapiläkemedel för att förbättra läkemedelsupptaget i cancerceller4. Dessutom visade nyligen genomförda studier kalciumelektroporering som ett alternativ till ECT med hög effektivitet för cancerbehandling, vilket också är billigt och inducerar färre biverkningar5. Trots dessa lovande framsteg används PEF i allmänhet med hjälp av styva metallelektroder som är kända för att skada mjukvävnad6. Hjärnan är särskilt känslig för sådana invasiva enheter där den mekaniska obalansen inducerar inflammation och astroglial ärrbildning7.
I detta sammanhang presenteras ett flexibelt PEF-leveranssystem i kombination med 3D-modeller av glioblastomtumörer, från mikrofabrikation till en murin modell. Konforma elektroder tillverkas med vanliga tunnfilmsmikrofabrikationsprocesser, inklusive användning av mjuka och biokompatibla material såsom parylen-C, guld och PEDOT: PSS 8,9. En interdigiterad elektroddesign används för att täcka en stor yta samtidigt som tillräcklig transparens bibehålls för avbildning mellan elektrodfingrarna10. För tumörmodellen produceras 3D-sfäroider av glioblastomceller som uttrycker en genetiskt kodad fluorescensreporter med användning av en variant av vätskeöverläggets 96-brunnsplattmetod11. Sfäroiderna ympas in i korioallantoiska membranet hos ett vaktelembryo, vilket resulterar i en in ovo-modell som i stor utsträckning har använts för att studera angiogenes eller läkemedelstoxikologi12,13. Tumörer kan ympas och vaskulariseras av embryots vaskulatur i frånvaro av ett immunsystem vid detta stadium av embryonal utveckling12. Flexibla elektroder placeras sedan ovanpå den vaskulariserade tumören för att studera effekten av PEF-leverans på sfäroiden och dess vaskulatur. Slutligen undersöks dessa effekter på en komplett levande organism, inklusive tumörmikromiljö och immunsystem, genom att implantera konstruerade sfäroider i hjärnparenkymet hos murina modeller14. Flexibla elektroder placeras ovanpå införingsstället och kraniotomin förseglas med ett glasfönster, vilket möjliggör upprepad tvåfotonavbildning under flera veckor.
Dessa metoder kommer att vara användbara för personer som är intresserade av olika domäner, allt från mikroelektronikteknik till onkologiapplikationer. Mikrofabrikationsprotokollet kan användas och anpassas för alla applikationer som kräver tunnfilmsmetallelektroder belagda med PEDOT:PSS. Vidare kommer de biologiska modeller som utvecklats för utvärdering av antitumörbehandling att vara av allmänt intresse för undersökningen av differentieringen av cellulärt, vaskulärt och immunsvar mot implanterade material.
Protocol
Alla försöksförsök utfördes i enlighet med den franska lagstiftningen och i enlighet med Europeiska gemenskapens rådsdirektiv av den 24 november 1986 (86/609 / EEG) för vård och användning av försöksdjur. Forskningen på djur godkändes av Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône och godkändes av den etiska kommittén i Provence Côte d'Azur (Apafis # 22689-2019100414103054).
1. Mikrofabrikation av flexibel utrustning (figur 1)
- Rengöring av glasskivorna
- Sonicate glas glas i 2% tvållösning för 15 min. Skölj dem med vatten.
- Sonicate igen i en blandning av 80% ren aceton och 20% ren isopropanol för 15 min.
VARNING: Dessa lösningsmedel är skadliga och brandfarliga. Använd personlig skyddsutrustning (PPE) och hantera dem under dragskåp. - Skölj glasen med isopropanol och torka med en luftpistol.
OBS: Se till att aceton inte torkar på underlagen under hela processen.
- Mönstring av guldelektroder (Figur 1A)
- Deponera ett 3 μm lager av parylen-C (PaC) med ett parylendeponeringssystem (figur 1Aa).
- Placera de rengjorda glasskivorna i avsättningskammaren. Spraya tvål på kylaggregatet, låt det torka och sätt in det i den avsedda kylfällan i avsättningssystemet. Detta antilim underlättar enkelt avlägsnande av PaC från kylaggregatet efter deponeringen.
VARNING: PaC är irriterande och utgör en hälsorisk. Använd handskar när du hanterar den. - Väg upp 6 g PaC i en aluminiumbåt och placera den i ugnen. Evakuera maskinen (P = 10 mTorr) och starta avsättningen med följande parametrar: T-kylare = -100 °C,T-ugn = 690 °C,T-förångare = 175 °C och T-kammare = 135 °C.
- När avsättningen är klar och förångarens temperatur är under 40 °C, stäng av kylaren, förångaren och ugnen. Ventilera maskinen och samla proverna.
- Placera de rengjorda glasskivorna i avsättningskammaren. Spraya tvål på kylaggregatet, låt det torka och sätt in det i den avsedda kylfällan i avsättningssystemet. Detta antilim underlättar enkelt avlägsnande av PaC från kylaggregatet efter deponeringen.
- Aktivera provernas yta genom syrgasplasmabehandling i 30 s (100 W, 50 sccm).
- Spin-belägg de plasmabehandlade proverna med en negativ fotoresist vid 1 000 x g i 40 sekunder. Placera provexemplaren på en värmeplatta vid 110 °C i 2 minuter (figur 1Ab).
VARNING: Fotoresistlösningen är brandfarlig och orsakar irritation; bära personlig skyddsutrustning och hantera den under dragskåp. - Placera ett i-line-filter i strålröret på UV-bredbandskontaktjusteraren och exponera fotoresisten genom en mask som har den interdigiterade elektroddesignen (figur 1Ac).
OBS: Interdigiterade elektroder med ett mellanrum på 50 eller 250 μm designades med hjälp av en layoutredigerare och fotomasker beställdes från ett företag som tillverkar polyesterfotomasker genom laserfotoplottning. - Grädda ovanstående prover vid 110 °C på en värmeplatta i 3 minuter och låt dem svalna till rumstemperatur i 5 minuter. Fördjupa proverna i en metalljonfri framkallare i 3 minuter för att ta bort den icke-exponerade fotoresisten. Skölj proverna med vatten och torka dem med en blåspistol (figur 1Ad).
VARNING: Utvecklarlösningen är irriterande; bära personlig skyddsutrustning och handtag under dragskåp. - Aktivera provernas yta genom syrgasplasmabehandling i 60 s (100 W, 50 sccm).
- Avsätt ett 20 nm vidhäftningsskikt av krom och ett 300 nm lager guld med en termisk indunstare enligt följande (figur 1Ae).
- Ventilera förångarmaskinen och kläm proverna (nedåt) på den övre runda plattan med metallskruvar. Fyll de avsedda deglarna med krom respektive guld. Täta och evakuera maskinen för att nå ett tryck under 5·10-6 Torr. Starta rotationen av provhållaren.
- Välj degeln som innehåller krom och öka långsamt strömmen som går igenom den tills en deponeringshastighet på 0,2 Å·s-1 uppnås. Öppna slutaren och vänta tills 20 nm krom har deponerats. Stäng slutaren och rampa långsamt ner strömmen tills 0 mA.
- Välj degeln som innehåller guld och öka långsamt strömmen som går igenom den tills en deponeringshastighet på 0,2 Å·s-1 uppnås. Öppna slutaren för att avdunsta guld, vänta tills 10 nm guld har deponerats och öka sedan avsättningshastigheten till 1,5 Å·s-1 tills cirka 300 nm har deponerats. Stäng slutaren och sänk långsamt strömmen till 0 mA.
- Låt proverna svalna till rumstemperatur i 15 minuter efter deponering. Stoppa provhållarens rotation, ventilera maskinen och samla proverna.
- Sänk ner proverna i en bägare med aceton. Placera bägaren på en skakplatta inställd på 110 rpm i 15 min för att lyfta av fotoresisten. Skölj proverna med isopropanol och torka dem med en blåspistol (figur 1Af).
- Aktivera provernas yta genom syrgasplasmabehandling i 30 s (100 W, 50 sccm).
- Avsätt ett 3 μm isolerande skikt av PaC med ett parylendeponeringssystem (se steg 1.2.1) (figur 1Ag).
- Deponera ett 3 μm lager av parylen-C (PaC) med ett parylendeponeringssystem (figur 1Aa).
- Konturens öppning (figur 1B)
- Spinnbelägg proverna med en positiv fotoresist vid 600 x g i 35 sekunder. Placera den på en värmeplatta vid 110 °C i 2 minuter (bild 1Ba).
VARNING: Fotoresistlösningen är brandfarlig och orsakar irritation; bära personlig skyddsutrustning och handtag under dragskåp. - Se till att det inte finns något i-line-filter i strålröret på UV-bredbandskontaktjusteraren och exponera fotoresisten genom en mask som har enhetens kontur med en UV-bredbandskontaktjusterare (figur 1Bb).
- Sänk ner proverna i en metalljonfri framkallare i 4 minuter för att avlägsna den exponerade fotoresisten. Skölj proverna med vatten och torka dem med en blåspistol (figur 1Bc).
- Etsa konturen genom de två skikten av PaC med en reaktiv jonetsare (160 W, 22 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm) (figur 1Bd).
- Ta bort återstående fotoresist med aceton, skölj med isopropanol och torka proverna med en luftpistol.
- Spinnbelägg proverna med en positiv fotoresist vid 600 x g i 35 sekunder. Placera den på en värmeplatta vid 110 °C i 2 minuter (bild 1Ba).
- PEDOT:PSS-beläggning (figur 1C)
- Spin-coat en 2% tvållösning vid 70 x g i 35 s (figur 1Ca).
- Deponera ett 3 μm offerskikt PaC med ett parylendeponeringssystem (se steg 1.2.1) (figur 1Cb).
- Spin-coat positiv fotoresist vid 600 x g i 35 s. Placera provexemplaren på en värmeplatta vid 110 °C i 2 minuter (bild 1 Cc).
- Se till att det inte finns något i-line-filter i strålröret på UV-bredbandskontaktinriktaren och exponera fotoresisten genom en mask som har elektrodernas aktiva yta (figur 1Cd).
- Sänk ner proverna i en metalljonfri framkallare i 4 minuter för att avlägsna den exponerade fotoresisten. Skölj proverna med vatten och torka dem med en blåspistol (figur 1Ce).
- Etsa PaC med en reaktiv jonetsare för att öppna elektrodernas aktiva yta (160 W, 24 min, O2: 50 sccm, CF4: 10 sccm). Kontrollera med ett mikroskop att det inte finns någon kvarvarande PaC på den aktiva ytan (figur 1Cf).
- Ta bort återstående fotoresist med aceton, skölj med isopropanol och torka proverna med en luftpistol.
- Aktivera ytan på proverna med syrgasplasmabehandling i 90 s (100 W, 50 sccm).
- Blanda en kommersiell dispersion av kemiskt polymeriserad PEDOT:PSS med 5 vol% etylenglykol (EG) och 0,1 vol% dodecylbensensulfonsyra (DBSA). Sonicate i 15 min. Tillsätt 1 vikt% (3-glycydyloxipropyl) trimetylsiloxan (GOPS) och sonikat i 5 min. Filtrera lösningen genom ett 1,2 μm filter.
VARNING: EG är irriterande och utgör en hälsorisk. DBSA är irriterande och frätande. GOPS är frätande. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och hantera dessa kemikalier under en dragskåp.
OBS: Den totala volymen beror på antalet prover. För 10 standardglasskivor, förbered minst 20 ml som motsvarar följande mängder: 18,78 ml PEDOT: PSS, 1 ml EG, 20 μL DBSA och 200 μL GOPS. - Spin-coat fyra lager PEDOT:PSS lösning vid 150 x g i 35 s. Efter deponering av varje lager, grädda proverna vid 110 °C i 60 s på en värmeplatta och kyl ner dem till rumstemperatur i 5 minuter innan du snurrar nästa lager (figur 1Cg).
- Avlägsna offerskiktet PaC genom att sänka ned proverna i vatten (figur 1Ch).
- Grädda proverna vid 140 °C i 1 timme.
- Sänk ned proverna i avjoniserat vatten i 30 minuter för att avlägsna återstående tvål och föreningar med låg molekylvikt i PEDOT:PSS-filmen och för att avlägsna prover från glassubstratet (figur 1Ci).
- Anslutningar och förpackningar (bild 1D)
- Avsätt ett tunt lager akrylfärg på en polyimidfilm som är belagd med koppar (figur 1Da). Använd en aerosol för att få ett homogent färgskikt (figur 1Db).
- Mönstra akrylfärgen med en laser (75 kHz, 7 W, 1 laserpass, 400 mm·s-1) för att erhålla två rektangulära kontaktplattor (5 mm x 15 mm; 1,5 mm mellanrum) (figur 1Dc).
- Våtetsa kopparn med mättad 30 % (vikt/volym) järnklorid (FeCl3) i vatten i 15 minuter vid 40 °C (figur 1Dd).
VARNING: FeCl3 är irriterande och frätande; Hantera den med handskar under en dragskåp. - Remsa akrylfärgen med aceton genom att gnugga den något med en trasa (figur 1De).
- Skär den mönstrade polyimidfilmen i rektangulära former (15 mm x 30 mm) med en laser (15 kHz, 10 W, 30 laserpass, 130 mm·s-1) (figur 1Df).
- Dosera silverpasta med en treaxlig doseringsmaskin vid ett tryck på tre bar med en nål med en diameter på 330 μm (5 m·min-1) (figur 1Dg).
VARNING: Silverpasta är irriterande; handtag med handskar. - Rikta in och fäst PaC-sonden med polyimidfilmen under ett binokulärt mikroskop med pincett (figur 1Dh).
OBS: Justeringsmärken kan mönstras i steg 1.5.2 för att underlätta placeringen av sonden på kontaktkuddarna. - Grädda vid 140 °C i 2 timmar i ugnen.
- Placera en 1 cm2 polyimidskyddstejp på kontaktkuddarna (bild 1Di).
- Doppa gränssnittet där PaC-sonden och polyimidfilmen är anslutna i PDMS (figur 1Dj).
- Grädda den i 2 timmar vid 50 °C.
- Ta bort skyddstejpen för att öppna kontaktkuddarna (bild 1Dk).
OBS: Mikrofabrikation av in vitro-enheter är liknande men steg 1.2.1, 1.3 och 1.5 måste hoppas över.
2. Generering av Glioblastom GCaMP6f stabil cellinje
- Lentivirus produktion
- I en 75 cm² kolv odlas en HEK 293T-härledd cellinje optimerad för lentivirusproduktion i 10 ml Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) innehållande 4,5 g · L-1 glukos, L-glutamin, natriumpyruvat och natriumbikarbonat och kompletterat med 10% tetracyklinfritt fetalt bovint serum (FBS), 100 enheter · ml-1 penicillin och 100 μg · ml-1 streptomycin i minst 3 dagar tills 80% sammanflöde.
- Ta bort mediet från kolven. Skölj försiktigt cellerna med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin/EDTA-lösning och inkubera kolven i 5 minuter vid 37 °C.
VARNING: Trypsin / EDTA-lösning utgör en hälsorisk; bära personlig skyddsutrustning och handtag under dragskåp. - Tillsätt 8 ml odlingsmedium. Spola försiktigt cellsuspensionen.
- Räkna cellerna och plattan 4 x 106 celler i en petriskål i 8 ml odlingsmedium.
- Nästa dag späds 25 μg av plasmiden innehållande genen GCaMP6f och en selektionsmarkör som ger resistens mot puromycin i en total volym av 600 μl vatten. Tillsätt det till ett rör transfektionsreagens. Virvel i 10 s vid 3 000 rpm och inkubera röret vid rumstemperatur i 10 minuter för att möjliggöra produktion av nanopartiklar.
- Tillsätt innehållet i röret droppvis på kulturen av HEK 293 T-celler och vagga försiktigt för hand. Inkubera cellerna vid 37 °C i minst 4 timmar.
- Ersätt media som innehåller nanopartikelkomplex med färska medier och returnera cellerna vid 37 °C.
- Tre dagar senare, samla supernatanten och centrifugera vid 500 x g i 10 minuter för att avlägsna cellulärt skräp. Samla vätskefasen innehållande viruspartiklar.
OBS: Virusproduktionen i supernatanten kan bekräftas med ett kvantitativt lentiviralt titertest och kan förvaras vid -80 °C i minst 2 år.
- Transduktion av glioblastomceller
- I en 75 cm² kolv, odlingsglioblastomceller i 10 ml DMEM innehållande 1 g· L-1 glukos, L-glutamin, natriumpyruvat och natriumbikarbonat och kompletterat med 10% tetracyklinfri FBS, 100 enheter · ml-1 penicillin och 100 μg · ml-1 streptomycin i minst 4 dagar.
- Kassera mediet och tillsätt supernatanten som erhölls i steg 2.1.9 på målcellerna.
- Tillsätt 5 μg·ml-1 hexadimetrinbromid i mediet för att förbättra transduktionen. Inkubera i 6 timmar vid 37 °C. Byt ut mediet med 10 ml färskt medium.
VARNING: Hexadimetrinbromid är irriterande. Hantera den med handskar.
- Generering av en stabil cellinje
- Två till tre dagar efter transduktion, tillsätt 10 ml DMEM innehållande 1 g· L-1 glukos, L-glutamin, natriumpyruvat och natriumbikarbonat, 10% FBS, 100 enheter · ml-1 penicillin, 100 μg · ml-1 streptomycin och kompletterat med puromycin för att döda de icke-transducerade cellerna. Odlingsceller i detta medium i minst 3 dagar.
VARNING: Puromycin är irriterande; Hantera den med handskar.
OBS: Cellernas känslighet för puromycin måste testas före transduktion genom odling av celler i deras rekommenderade medium som innehåller olika koncentrationer av puromycin. En dag senare, kontrollera cellerna med ett mikroskop. Välj den lämpliga koncentrationen där majoriteten av cellerna är döda men få fortfarande lever, för att säkerställa att antibiotikumet inte är för giftigt och kan döda de transfekterade cellerna också. - Ta bort mediet och skölj cellerna med 10 ml PBS.
- Tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin/EDTA-lösning och inkubera kolven i 5 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 8 ml odlingsmedium. Spola försiktigt cellsuspensionen.
- Samla 100 μL cellsuspension och mät cellkoncentrationen med en cellräknare. Aspirera 50 μL cellsuspension i en handhållen automatiserad cellräknare med en 60 μm sensor.
- Frö 1 cell / brunn i en 96-brunnsplatta. Till exempel, för en koncentration av 1 x 10 3 celler per ml, tillsätt 1 / (1 x 103), dvs 0,001 ml cellsuspension per brunn. Frö varje brunn för att öka chanserna för framgång. Komplett med odlingsmedium för att nå en total volym på 200 μL per brunn.
- En dag senare, hitta varje brunn som innehåller en cell och kontrollera dess fluorescens (λexc = 490 nm och λem = 530 nm). Markera brunnarna som endast innehåller en transfekterad cell. Fortsätt tillväxten i några dagar tills brunnen är nästan sammanflytande.
- Kassera mediet och skölj cellerna med 200 μL PBS. Tillsätt 100 μL 0,25% trypsin / EDTA-lösning och inkubera 96-brunnsplattan i 5 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 100 μL medium och spola försiktigt cellsuspensionen. Överför cellsuspensionen i en petriskål. Tillsätt 5 ml medium och låt cellerna växa i några dagar tills petriskålen är nästan sammanflytande.
- Kassera mediet och skölj cellerna med 5 ml PBS. Tillsätt 1 ml 0,25% trypsin / EDTA-lösning och inkubera petriskålen i 5 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 6 ml medium och spola försiktigt cellsuspensionen. Överför cellsuspensionen till en T25-kolv. Fortsätt tillväxten i några dagar tills kolven är nästan sammanflytande.
- Kassera mediet och skölj cellerna med 5 ml PBS. Tillsätt 1 ml 0,25 % trypsin/EDTA-lösning och inkubera T25-kolven i 5 minuter vid 37 °C. Tillsätt 7 ml DMEM innehållande 1 g· L-1 glukos, L-glutamin, natriumpyruvat och natriumbikarbonat, och kompletterat med 10% FBS, 100 enheter · ml-1 penicillin och 100 μg · ml-1 streptomycin. Spola försiktigt cellsuspensionen.
- Dela cellsuspensionen i fyra T25-kolvar (2 ml per kolv) och tillsätt 5 ml medium till varje kolv. Låt cellerna växa i några dagar tills kolvarna är nästan sammanflytande.
- Upprepa steg 2.3.12 för tre kolvar och behåll den sista kolven för steg 3.1.3. Överför cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 150 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 900 μl. Blanda försiktigt cellerna för att bibehålla en homogen cellsuspension.
- Överför cellsuspensionen till kryogena förvaringsflaskor. Tillsätt 100 μL dimetylsulfoxid. Placera kryovialerna vid -80 °C över natten. Överför frysta celler till flytande kväve för ytterligare experiment.
Anmärkning: Transfektionens effektivitet kan bedömas genom tillsats av 5 μM jonomycinkalciumsalt i mediet och kontroll av den inducerade ökningen av fluorescens under ett fluorescensmikroskop (λexc = 490 nm och λem = 530 nm).
- Två till tre dagar efter transduktion, tillsätt 10 ml DMEM innehållande 1 g· L-1 glukos, L-glutamin, natriumpyruvat och natriumbikarbonat, 10% FBS, 100 enheter · ml-1 penicillin, 100 μg · ml-1 streptomycin och kompletterat med puromycin för att döda de icke-transducerade cellerna. Odlingsceller i detta medium i minst 3 dagar.
3.3D modeller
- Sfäroid kultur
- Bered en lösning av 1% (w/v) agaros i avjoniserat (DI) vatten.
- Tillsätt 100 g agarospulver i 100 ml DI-vatten och värm lösningen i en mikrovågsugn tills allt pulver är upplöst. Rör om lösningen regelbundet för att undvika klumpar. Autoklavera lösningen i 20 min vid 120 °C.
- När 75 μL agaroslösning per brunn har hämtats från autoklaven tillsätts den försiktigt i en 96-brunnsplatta. Sätt den på sidan av brunnen för att bilda en menisk, vilket resulterar i en icke-vidhäftande rund botten. Låt stelna i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Lossa cellerna (steg 2.3.12) från kolven i steg 2.3.14.
- Tillsätt 10 000 celler per brunn glioblastomceller och slutför för att nå en total volym på 150 μL per brunn med DMEM innehållande 1 g· L-1 glukos, L-glutamin, natriumpyruvat och natriumbikarbonat, och kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 enheter·ml-1 penicillin och 100 μg·ml-1 streptomycin.
- Inkubera cellerna vid 37 °C utan att flytta plattan under 3 dagar. Byt sedan ut hälften av mediet med färskt media var 2: e dag med en flerkanalig pipett tills ytterligare experiment. Håll pipettspetsen i brunnens övre del för att undvika skador på agarosen eller själva sfäroiden.
OBS: Storleken på sfäroiderna beror på antalet celler som sås och cellinjen, så det måste anpassas beroende på experimenten.
- Bered en lösning av 1% (w/v) agaros i avjoniserat (DI) vatten.
- In ovo-modellen
- Placera befruktade ägg av japansk vaktel (C. japonica) i en inkubator (37 °C och 57% luftfuktighet) på brickor med en automatisk rotator som vänder ägg var 2: e timme. Denna dag anses vara embryonal dag (ED) 0.
- Tvätta plastvägningsbåtar genom att placera dem i 70% (w/v) etanol. Ta ut vågbåtarna och torka dem under ett dragskåp.
OBS: Från denna punkt utförs experiment inte under sterila förhållanden. Rena förhållanden krävs dock för att undvika utveckling av mögel på embryonerna. - På ED3, öppna försiktigt äggen med en pincett med tunna spetsar förtvättade med 70% (w / v) etanol. Häll embryot i en plastvägningsbåt, täck den med en annan vågbåt och placera den i en vanlig fuktad inkubator vid 37 °C i 3 dagar.
- På ED6, gör ett litet snitt i chorioallantoic membranet (CAM) med en 23 G nål.
- Använd en pipett, placera en 7-dagars sfäroid på snittet och sätt tillbaka embryot till inkubatorn i 3 dagar tills ytterligare experiment.
OBS: Ett fluorescerande färgämne kan injiceras i embryots öga för att visualisera blodkärlen. - På experimentets dag placerar du den flexibla sonden ovanpå den vaskulariserade tumören med hjälp av en mikromanipulator.
- Den in vivo modell
OBS: Denna del av protokollet är anpassad från den som tidigare publicerats i referens14. Vuxna flerfärgade fluorescerande AMU-Neuroinflam-möss (B6.Cg-Tg(Thy1-CFP)23Jrs(Ly6a-EGFP)G5Dzk(Itgax-EYFP)1Mnz/FD) användes; dessa möss presenterar märkning av en subpopulation av Thy1+ neuroner genom transgent uttryck av ECFP, märkning av perifer LyzM+ inflammatoriska celler genom transgent uttryck av EGFP och märkning av en subtyp av mikroglia som uttrycker EYFP under kontroll av Cd11c+. I korthet är djuren lätt sederade med 1,5% isofluran i 2 minuter innan någon behandling eller injektion. Före operationen bedövas djuren med ketamin (120 mg/kg; IP) och xylazin (12 mg/kg; IP). Därefter appliceras 3% lidokaingel lokalt för att lindra smärta i öronen i samband med fixering av stereotaktiskt stöd. Därefter administreras 0,25% bupivakainlösning till operationsområdet för att lindra smärta på grund av kraniotomi. När musen var förberedd för operation utfördes en kraniotomi med 4 mm diameter enligt referens14. Med en 26 G nål gjordes ett hål i dura-mater i mitten av kraniotomi och tumörsfäroiden injicerades med det injektionssystem som beskrivs i referens14. Dessutom, som beskrivits här, placerades en flexibel elektrod på GCamp6 eller DsRed som uttrycker tumörsfäroid innan kraniotomin förseglas med ett glasfönster.- Placera en droppe Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) så att den täcker kraniotomin. Placera den flexibla elektroden på droppen av DPBS och placera försiktigt sondens baksida med kontaktkuddar på musens baksida (figur 4B).
OBS: Använd sterila handskar och en "endast spets" -teknik. Byt handskar om en icke-steril yta kommer i kontakt. Ge termiskt stöd under denna procedur. - Tryck på DPBS-droppen med ett litet papper för att absorbera DPBS tills sonden kan ligga platt på dura och följa hjärnans krökning. Se till att ett litet lager DPBS förblir under elektroderna utan att fly från elektrodens sida. Detta säkerställer en barriär mot limspill under nästa steg.
OBS: Sterilisera all utrustning före användning. - Placera en liten droppe silikonlim på sonden och täck den med ett 5 mm runt täckglas. Tryck ner täckglaset tills silikonet är jämnt fördelat och avståndet mellan täckglaset och sonden är minimalt. Tryck ner täckglaset i ytterligare 30 s så att silikon kan stelna.
- För att säkra täckglaset, applicera snabbt superlim på sidorna och tryck ner det tills limet härdar till fast.
- Använd en tandpetare och applicera superlim vid sondens hals och se till att superlimet dras under nacken för att ge stabilt stöd för det.
- Täck skallen med tandcement för att bygga ett kroniskt lock. Var särskilt försiktig så att du endast täcker kanterna på täckglaset.
- Lyft sondens baksida och applicera cement under sondens hals. Vila sonden på cementet innan den härdar. Tryck försiktigt ner sondens hals med trubbiga pincett så att dess yta är på samma nivå som täckglaset och inte i vägen för mikroskopmålet under experimentet.
- Täck toppen av sondhalsen med högst 1,5 mm tandcementskikt för att uppnå ett fast grepp om sonden. Bygg en cementbrunn med en 1,5 mm ås på ett avstånd av 1-2 mm runt täckglaset för att skapa ett handfat för nedsänkningsvätskan för tvåfotonavbildning (figur 4C).
- Efter att cementet har härdat, applicera buprenorfin postkirurgiska analgetika (0,05 mg / kg, 0,1 ml per 10 g kroppsvikt subkutant) och håll djuret i en varm atmosfär tills det vaknar. Detta inkluderar närhet till en infraröd glödlampa samt inslagning av djuret i en pappershandduk.
OBS: Placera en termometer på musens nivå för att övervaka temperaturen. - Karakterisera impedans i intervallet 1-10 kHz med hjälp av en potentiostat.
- Låt djuret återhämta sig från operationen i minst 10 dagar. Administrera antiinflammatoriska läkemedel omedelbart efter operationen och fortsätt övervaka djurets tillstånd för att ge lämplig postoperativ analgesi.
- Placera en droppe Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) så att den täcker kraniotomin. Placera den flexibla elektroden på droppen av DPBS och placera försiktigt sondens baksida med kontaktkuddar på musens baksida (figur 4B).
4. Pulserande elektriskt fält (PEF) leverans och avbildning
- Placera proverna under ett fluorescensmikroskop. När det gäller 3D-modeller kan tumörer endast observeras från toppen.
OBS: För in ovo-modellen utfördes experiment under ett epifluorescensmikroskop (men är också möjligt med ett tvåfotonmikroskop), medan experiment på in vivo-modellen utfördes under ett tvåfotonmikroskop (figur 6). - Anslut en pulsgenerator till enheternas kontaktplattor med hjälp av pogo-stiftkontakter (in vitro) eller krokodilklämmor (in ovo och in vivo) (figur 4A). Ställ in önskade parametrar (antal pulser, spänning, pulslängd, frekvens) och använd PEF genom att köra generatorn (figur 4A). Mät fluorescens samtidigt för att observera effekterna av SUF i realtid.
Representative Results
Detta protokoll möjliggör tillämpning på två glioblastommodeller där ett flexibelt PEF-leveranssystem är integrerat. Efter mikrofabrikation och förpackningssteg karakteriseras flexibla elektroder i saltlösning genom elektroimpedansspektroskopi (EIS) för att bedöma och validera deras prestanda. PEDOT:PSS-belagda elektroder visar de typiska kapacitiva och resistivt dominerade områdena åtskilda av en cut-off-frekvens, medan de obelagda elektroderna endast uppvisar kapacitivt beteende (figur 2).
En variant av vätskeöverläggsmetoden med 96 brunnar används för att odla 3D-tumörer gjorda av transfekterade glioblastomceller som stabilt uttrycker en fluorescerande intracellulär kalciumrapportör. Tillväxten av sfäroiderna kan observeras med ett ljusfältmikroskop (figur 3; ED 0). Minst 2 eller 3 dagar behövs för att erhålla sfäriska och täta sfäroider, beroende på cellinjen och antalet celler som utsädes.
I in ovo-modellen ympas sfäroider i det korioallantoiska membranet hos ett vaktelembryo (figur 3; ED 6). Transplantatets framgång kan bedömas med fluorescensmikroskopi några dagar senare, eftersom levande celler har intracellulärt kalcium och därmed fluorescerande (Figur 3; ED 9). Vaskulariseringen av tumören kan observeras under ett fluorescensmikroskop genom att injicera ett fluorescerande färgämne i blodkärlen (Figur 3; ED9). Det kan dock inte alltid vara möjligt att visualisera blodkärlen inuti tumören eftersom sfäroiden är mycket tät. De flexibla interdigiterade elektroderna placeras ovanpå den vaskulariserade tumören (Figur 3; ED 9) och ansluten till en pulsgenerator. Sonden måste placeras försiktigt för att undvika blödning av embryot. Annars kan det fluorescerande färgämnet spridas, vilket hindrar någon observation genom avbildning. Korrekt leverans av pulsen till den biologiska miljön kan verifieras genom att mäta strömmen som går genom kretsen. Avbildning av dessa i ovo-modeller möjliggör realtidsövervakning av effekten av SUFS på det intracellulära kalciumet i en 3D-glioblastomtumör, liksom den vasokonstriktion som induceras på tumörens vaskulatur, vilket undviker påverkan av andra celltyper inklusive immunsystemet15.
Studien av PEF-effekten på glioblastom kan också utföras i en mer komplett och prediktiv modell. Faktum är att in vivo-modellen som beskrivs ovan14 består av ympning av en 3D-glioblastomtumör i hjärnparenkymet hos en mus (figur 4). Tumörens injektionsställe är pluggat av en tvärbunden dextrangelhemi-pärla för att rekapitulera de fysiologiska biofysiska begränsningarna under tumörens tillväxt. Även om det beskrivs i referens14 är det värt att åter betona att det är kritiskt viktigt att dextranhemi-pärlan är exakt superlimmad på dura mater; Annars kan tumören fly genom den öppna dura och helt täcka hjärnan, vilket gör avbildningen omöjlig. För alla kroniska avbildningar utgör vävnadsinväxt som äger rum när kranialfönstret läker ett allvarligt hinder, eftersom den nya vävnaden är icke-transparent och gör bilderna dimmiga eller oanvändbara. Därför, efter att ha satt in och limmat halvpärlan, måste sidoväggarna på det öppnade kranialfönstret förseglas med ett tunt lager superlim noggrant placerat runt kavitetsväggen, utan att låta superlimet glida eller strömma på dura. När den flexibla sonden placeras ovanpå tumörinjektionsstället kan inga bubblor stanna under sonden, av två skäl. För det första kan avbildning inte fortsätta när bubblor är närvarande. För det andra fungerar bubblor som isolatorer, vilket förändrar de elektriska stimuleringsegenskaperna. Efter att ha vidtagit de försiktighetsåtgärder som beskrivs ovan förseglas kraniotomin med ett glasfönster cementerat till skallen för att möjliggöra kronisk avbildning under veckor. Eftersom tumören består av GCaMP eller DsRed uttryckande celler kan injektionen bekräftas med ett fluorescensmikroskop. Elektrodernas elektrokemiska impedans måste mätas för att validera prestandan efter implantation. Jämfört med impedansen i saltlösning förväntas en ökning av impedansen in vivo vid frekvenser över 100 Hz på grund av närvaron av en biologisk miljö (figur 5). Vaskulariserad neural parenkym och tumörinfiltration kan observeras och karakteriseras genom det transparenta substratet under veckor med tvåfotonmikroskopi (figur 6). Användningen av transgena djur som uttrycker fluorescerande proteiner i celler av intresse (immunceller och neuroner) kan till exempel möjliggöra demonstration av den minimala inflammatoriska process som induceras av enbart elektrodimplantation (figur 6A) eller visa närvaron av mikroglia och monocyter 26 dagar efter implantation av en PEF-stimulerad elektrod implanterad ovanpå en växande GBM-tumör (figur 6B1 ). I det senare fallet hittades både perifera monocyt-härledda celler och hjärnresidenta mikrogliaceller runt och inuti tumören (figur 6B2). På dagen för PEF-leverans kan kontaktplattor på de flexibla elektroderna anslutas till pulsgeneratorn, direkt under tvåfotonmikroskopet. Sammantaget kan denna modell användas för att undersöka effekten av bioelektriska behandlingar över tid med hjälp av olika typer av celler som är involverade i hjärntumörutveckling, upp till ett djup av cirka 500 μm.
Figur 1: Mikrofabrikation av flexibla elektroder . (A) Guldelektrodmönstring och parylen C-substrat. (B) Disposition av öppning. (C) PEDOT:PSS-beläggning. (D) Anslutningar och förpackning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Elektroimpedansspektroskopi av flexibla guldelektroder och PEDOT:PSS-belagda kalla elektroder i en saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: In ovo-modellen av glioblastom. ED 0: Sfäroid observerad med ett ljusfältmikroskop. ED 3: Skal mindre kultur av ett vaktelembryo 3 dagar efter öppnandet. ED 6: Tumör implanterad i CAM observerad med ett ljusfältmikroskop. ED 9: Flexibel anordning placerad på den vaskulariserade tumören (tumör i grönt och blodkärl i rött). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: In vivo-applikationen. a) Schema för in vivo-experiment. b) Sondens placering före applicering av täckglas och akrylharts. (C) Avslutad sondimplantation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Elektroimpedansspektroskopi av flexibla guldelektroder i en saltlösning jämfört med en implanterad sond. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Intravital multispektral tvåfotonavbildning genom elektroder . (A) Kaklad bild av den friska hjärnytan i en kontroll multifluorescerande AMU-Neuroinflam mus 3 dagar efter elektrodimplantation. Cyan visar dendritisk arborisering av lager 5 pyramidala neuroner, grönt visar rekryterade granulocyter och monocyter och gult visar aktiverade mikroglia och dendritiska celler. Rosa visar infraröd diffusion på grund av värmeackumulering. (B1) Liknande bild som i A men 26 dagar efter tumörsfäroidimplantation 200 μm djupt inne i cortex omedelbart följt av elektrodimplantation. Observera ackumuleringen av gröna och gula immunceller. (B2) Liknande bild som i B1 men 100 μm under elektrodernas yta. Observera närvaron av blå neuronal dendritisk arborisering i periferin av den röda tumörmassan själv infiltrerad av gula mikroglia och dendritiska celler. Djupblå visar en andra harmonisk signal från peritumoralt kollagen. (B3) Zoomad vy av B2 som visar närvaron av interneuron somas (indikerad med pilar) i närheten av tumören. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Tillvägagångssättet som beskrivs i detta arbete gör det möjligt för hjärntumörmodeller med ett integrerat PEF-leveranssystem att studera effekten av SUF på olika nivåer av biologisk organisation. Mikrofabrikationsprotokollet består av standardtunnfilmsprocesser, som ger en stor grad av frihet i elektroddesign som kan anpassas till den specifika applikationen. Ibland kan ett ytterligare termiskt glödgningssteg vara användbart i slutet av tillverkningen för att minska böjningen av elektroderna som inträffade under tillverkningen.
Användningen av en stabil glioblastomcellinje som uttrycker en fluorescerande kalciumindikator undviker alla komplikationer i samband med färgleverans och retention, särskilt i 3D-tumörer som är mycket täta16. Faktum är att en hög uttrycksnivå observeras under en lång period jämfört med vanliga kemiska fluorescerande kalciumindikatorer17. Detta protokoll kan tillämpas på olika cellinjer, eftersom det vanligtvis används för att avbilda neural aktivitet11. Här användes humana och murina cellinjer (U87 och Gl261 för implantation i immunbristfälliga respektive immunkompetenta möss). Faktum är att nyligen genomförda studier visade att U87-cellinjen skiljer sig från de ursprungliga cellerna eftersom många mutationer förvärvades under år av cellodling, vilket påverkar experimentell reproducerbarhet18. Metoden som används för framställning av 3D-tumörer är hög genomströmning, reproducerbar och möjliggör generering av sfäroider av en specifik storlek beroende på cellinjen, antalet celler vid sådd och tillväxttiden19. Dessa sfäroider är emellertid täta, vilket ger en nackdel vid avbildning vid tumörens kärna.
In ovo-modellen är användbar som ett första tillvägagångssätt för att studera effekten av PEF på 3D-tumörer och deras vaskulatur, utan interaktioner med andra celltyper som finns i hjärnan. Denna modell är billig, snabb, hög genomströmning och väcker färre etiska problem än djurmodeller. Det är viktigt att bibehålla embryonets integritet under hela experimentet, eftersom det kan påverka dess överlevnad och kvaliteten på avbildningen. Särskild försiktighet måste vidtas när vaktelägget öppnas för att undvika skador på det embryonala membranet. Transplantatet och placeringen av de flexibla elektroderna måste också utföras noggrant för att undvika blödning som kan döda embryot. Injektion av fluorescerande färgämne i blodkärlen möjliggör samtidig visualisering av tumörcellerna och vaskularisering med fluorescensmikroskopi. Den intraokulära injektionen måste utföras försiktigt för att undvika att färgämne läcker in i den embryonala vätskan, vilket kan orsaka en kvarvarande fluorescens i bakgrunden som försämrar bildkvaliteten. Denna modell kan också användas för att följa läkemedelsupptag, eftersom den ger tillgång till cirkulationssystemet. Experimenten begränsas emellertid av embryots 12-dagars överlevnadstid, vilket möjliggör 7 dagars observation, vilket är betydligt kortare än in vivo-modellen 21.
In vivo-hjärntumörmodellen kan övervakas i 4 till 5 veckor innan djuren når ett etiskt experimentellt effektmått som bestäms av en plötslig viktminskning på 20 %. Det tolereras väl och förblir på plats om elektrodens anslutande svans inte är för lång. Annars tenderar djur att repa vändkontakten, som i slutändan kan rivas, vilket förhindrar efterföljande anslutning till stimulatorn. Denna 4-veckorsperiod är ändå värdefull för att täcka de olika stadierna av glioblastomutveckling. Vid jämförelse av tumörcelldensiteterna i samma volym av intresse vid olika tidsintervall kan utvecklingen av tumörtillväxtkinetiken observeras. I synnerhet observerades förbättrad tumörtillväxt vid tidpunkten för immunomkopplaren22. En liknande studie i närvaro av en stimulerande elektrod skulle informera om effekten av PEF på tumörproliferationshastighet och tumörkänslighet för immuneliminering. I jämförelse med in ovo-modellen kan in vivo-modellen ses som en värdefull preklinisk modell för att studera immuncellers påverkan på tumörprogression och deras bidrag till den terapeutiska effekten av PEF. Detta protokoll är anpassat från en tidigare artikel med tillsats av en flexibel elektrodanordning på tumören innan ett kranialfönster14 placeras. Både akuta och kroniska bioelektriska behandlingar av tumörer kan karakteriseras av direkta och efterföljande observationer med tvåfotonmikroskopi givet att initial stimulering förväntas inducera celldöd och utlösa varaktig dysreglering av immunsvaret.
Anslutningarna till den flexibla sonden är lättillgängliga under tvåfotonmikroskopet. Elektriska stimuleringsparametrar kan således justeras i realtid baserat på den observerade effekten på nervvävnaden och / eller de riktade cellerna, liknande hur en läkare skulle utföra interventionella procedurer medan han observerade MR- eller CT-bilder av sin patient. En sista övervägande är vikten av noggrann tätning av elektroden på hjärnan med superlim och silikonlim för att förhindra vävnadsåterväxt.
Sammanfattningsvis representerar protokollet som beskrivs här en innovativ modell för att studera effekten av PEF-terapi med flexibla organiska polymerelektroder för glioblastomtumörmodeller. De två modellerna uppvisar olika nivåer av komplexitet så att cellulära, vaskulära eller immuneffekter kan separeras för en bättre förståelse av verkningsmekanismerna. Konformella, ytliga elektroder minskar den iatrogena skadan samtidigt som de möjliggör störning av tumörmikromiljön, vilket utlöser vasokonstriktion eller dysregulering av intracellulärt kalcium15.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Det arbete som redovisas här stöddes av den franska nationella forskningsbyrån (ANR-18-CE19-0029). Författarna tackar varmt S.M. Bardet för hennes bidrag till genereringen av en stabil GCaMP6f-cellinje och D. O'Connor för hennes hjälp med in ovo-modellen .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane | Sigma | 440167 | GOPS |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 4-Dodecylbenzenesulfonic acid | Sigma | 44198 | DBSA |
| 96-well plate | Falcon | 353075 | |
| Acetone | Technic | 530 | |
| Acrylic resin | Fischer scientific | NC1455685 | |
| agarose | Sigma | A9539 | |
| autoclave | Tuttnauer | 3150 EL | |
| AZ 10XT | Microchemicals | Positive photoresist | |
| AZ 826 MIF Developer | Merck | 10056124960 | Metal-ion-free developer for the negative photoresist |
| AZ Developer | Merck | 10054224960 | Metal-ion-free developer for the positive photoresist |
| AZ nLof 2070 | Microchemicals | Negative photoresist | |
| Buprenorphine | Axience | ||
| Carprofen | Rimadyl | ||
| Centrifuge Sorvall Legend X1R | Thermo Scientific | 75004260 | |
| CMOS camera Prime 95B | Photometrics | ||
| CO2 incubator HERAcell 150i | Thermo scientific | ||
| DAC board | National Instruments | USB 6259 | |
| Déco spray Pébéo | Cultura | 3167860937307 | Black acrylic paint |
| Dextran Texas Red 70.000 | Thermofisher | D1830 | |
| Die bonding paste "Epinal" | Hitachi | EN-4900GC | Silver paste |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | |
| Dispensing machine | Tianhao | TH-2004C | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + GlutaMAX™-I | Gibco | 10567-014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | |
| Egg incubator COUVAD'OR 160 | lafermedemanon.com | ||
| Ethylene glycol | Carl Roth | 6881.1 | |
| Fertilized eggs of Japanese quail | Japocaille | ||
| Fetal Bovine Serum | VWR | S181BH | |
| Flask | Greiner | 658170 | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII | ||
| Gl261 | DSMZ | ACC 802 | |
| Gold pellets - Dia 3 mm x 6 mm th | Neyco | ||
| Handheld automated cell counter | Millipore | PHCC00000 | |
| Heating and drying oven | Memmert | UF110 | |
| Hexadimethrine Bromide Sequa-brene | Sigma | S2667 | |
| hot plate Delta 6 HP 350 | Süss Microtec | ||
| Illumination system pE-4000 | CoolLed | ||
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | ||
| Ionomycin calcium salt | Sigma | I3909 | |
| Kapton tape SCOTCH 92 33x19 | 3M | Polyimide protection tape | |
| Lab made pulse generator | |||
| Labcoter 2 Parylene Deposition system PDS 2010 | SCS | ||
| Lenti-X 293 T cell line | Takara Bio | 63218 | HEK 293T-derived cell line optimized for lentivirus production |
| Lenti-X GoStix Plus | Takara Bio | 631280 | Quantitative lentiviral titer test |
| Mask aligner MJB4 | Süss Microtec | ||
| Micro-90 Concentrated cleaning solution | International Products | M9050-12 | |
| Microscope slides 76 x 52 x 1 mm | Marienfeld | 1100420 | |
| Needles 30G | BD Microlance 3 | 304000 | |
| PalmSens4 potentiostat | PalmSens | ||
| parylene-c : dichloro-p-cyclophane | SCS | 300073 | |
| PCB Processing Tanks | Mega Electronics | PA104 | |
| PEDOT:PSS Clevios PH 1000 | Heraeus | ||
| penicillin / streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| pGP-CMV-GCaMP6f | Addgene | 40755 | plasmid |
| Phosphate Buffer Saline solution | Thermofisher | D8537 | |
| Plasma treatment system PE-100 | Plasma Etch | ||
| PlasmaLab 80 Reactive Ion Etcher | Oxford Instruments | ||
| Plastic mask | Selba | ||
| Plastic weigh boat 64 x 51 x 19 mm | VWR | 10770-454 | |
| Poly-dimethylsiloxane: SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow chemicals | 1673921 | |
| Polyimide copper film 60 µm (Kapton) | Goodfellow | IM301522 | |
| Propan-2-ol | Technic | 574 | |
| Protolaser S | LPKF | ||
| puromycin | Gibco | A11103 | |
| Round cover glass 5 mm diameter | Fischer scientific | 50-949-439 | |
| Scepter Sensors - 60 µm | Millipore | PHCC60050 | |
| Silicone adhesive Kwik-Sil | World Precision Instruments | ||
| spin coater | Süss Microtec | ||
| Spin Coater | Laurell | WS-650 | |
| Super glue | Office depot | ||
| tetracycline-free fœtal bovine Serum | Takara Bio | 631105 | |
| Thermal evaporator Auto 500 | Boc Edwards | ||
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP | ||
| U87-MG | ATCC | HTB-14 | Human glioblastoma cells |
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Vortex VTX-3000L | LMS | VTX100323410 | |
| Xfect single shots reagent | Takara Bio | 631447 | Transfection reagent |
References
- Koshy, M., et al. Improved survival time trends for glioblastoma using the SEER 17 population-based registries. Journal of Neuro-Oncology. 107 (1), 207-212 (2012).
- Davis, M. E. Glioblastoma: Overview of disease and treatment. Clinical Journal of Oncology Nursing. 20, 5 Suppl 2-8 (2016).
- Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation. IEEE transactions on Bio-Medical Engineering. 53 (7), 1409-1415 (2006).
- Breton, M., Mir, L. M. Microsecond and nanosecond electric pulses in cancer treatments. Bioelectromagnetics. 33 (2), 106-123 (2012).
- Frandsen, S. K., et al. Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis. Cancer Research. 72 (6), 1336-1341 (2012).
- Lee, J. H., Kim, H., Kim, J. H., Lee, S. -H. Soft implantable microelectrodes for future medicine: prosthetics, neural signal recording and neuromodulation. Lab on a Chip. 16 (6), 959-976 (2016).
- Lee, H., Bellamkonda, R. V., Sun, W., Levenston, M. E. Biomechanical analysis of silicon microelectrode-induced strain in the brain. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 81-89 (2005).
- Fattahi, P., Yang, G., Kim, G., Abidian, M. R. A review of organic and inorganic biomaterials for neural interfaces. Advanced Materials. 26 (12), 1846-1885 (2014).
- Lecomte, A., Degache, A., Descamps, E., Dahan, L., Bergaud, C. In vitro and in vivo biostability assessment of chronically-implanted Parylene C neural sensors. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 1001-1008 (2017).
- Dijk, G., Ruigrok, H. J., O'Connor, R. P. PEDOT:PSS-coated stimulation electrodes attenuate irreversible electrochemical events and reduce cell electropermeabilization. Advanced Materials Interfaces. 8 (19), 2100214 (2021).
- Chen, T. -W., et al. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ribatti, D. Chapter 5 Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
- Valdes, T. I., Kreutzer, D., Moussy, F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (2), 273-282 (2002).
- Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51108 (2014).
- Lefevre, M. C. Integrating flexible electronics for pulsed electric field delivery in a vascularized 3D glioblastoma model. npj Flexible Electronics. 5, 19 (2021).
- Perry, J. L., Ramachandran, N. K., Utama, B., Hyser, J. M. Use of genetically-encoded calcium indicators for live cell calcium imaging and localization in virus-infected cells. Methods. 90, 28-38 (2015).
- Blömer, U., et al. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. Journal of Virology. 71 (9), 6641-6649 (1997).
- Lenting, K., Verhaak, R., ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Tay, S. L. M., Heng, P. W. S., Chan, L. W. The CAM-LDPI method: a novel platform for the assessment of drug absorption. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 64 (4), 517-529 (2012).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic Membrane Models of Various Avian Species: Differences and Applications. Biology. 10 (4), 301 (2021).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Scientific Reports. 6 (1), 26381 (2016).
