Summary
この研究は、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼベースのホモ接合型ローカスト変異体の構築の体系的に最適化された手順と、イナゴ卵の凍結保存と蘇生のための詳細な方法を提供します。
Abstract
渡りバッタである Locusta migratoriaは、人類に莫大な経済的損失をもたらした世界的なペストバッタの1つであるだけでなく、昆虫の変態の重要な研究モデルでもあります。CRISPR/Cas9システムは、特定のDNA遺伝子座を正確に特定し、標的部位内で切断し、二本鎖切断を効率的に導入して標的遺伝子ノックアウトを誘導したり、新しい遺伝子断片を特定の遺伝子座に組み込んだりすることができます。CRISPR/Cas9を介したゲノム編集は、イナゴの研究で遭遇する問題に対処するための強力なツールであり、バッタ防除のための有望な技術です。この研究は、移動性バッタにおけるCas9タンパク質とシングルガイドRNA(sgRNA)の複合体を使用したCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウトの系統的プロトコルを提供します。標的部位の選択とsgRNAの設計について詳細に説明し、その後、 in vitro 合成とsgRNAの検証を行います。その後の手順には、卵いかだの収集と日焼け卵の分離が含まれ、死亡率の低いマイクロインジェクションの成功、卵の培養、突然変異率の予備推定、イナゴの繁殖、および編集されたイナゴの個体群の安定性を確保するための突然変異体の検出、保存、および通過が含まれます。この方法は、渡りバッタや他の昆虫におけるCRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集アプリケーションのリファレンスとして使用できます。
Introduction
遺伝子編集技術を使用して、特定のゲノム遺伝子座に挿入または欠失を導入し、目的1で標的遺伝子を人為的に改変することができます。過去数年間で、CRISPR / Cas9技術は急速に発展し、ライフサイエンスのさまざまな分野での適用範囲を拡大しています2,3,4,5,6。CRISPR / Cas9システムは1987年に発見され7、細菌や古細菌に広く見られます。さらなる研究は、ファージ8と戦うためにRNA誘導ヌクレアーゼCas9に依存する原核生物の適応免疫系であることを示しました。人工的に改変されたCRISPR/Cas9システムは、主に単一のガイドRNA(sgRNA)とCas9タンパク質の2つのコンポーネントで構成されています。sgRNAは、標的配列に相補的なCRISPR RNA(crRNA)と、比較的保存されている補助トランス活性化crRNA(tracrRNA)で構成されています。CRISPR/Cas9システムが活性化されると、sgRNAはCas9タンパク質とリボ核タンパク質(RNP)を形成し、RNA-DNA相互作用の塩基対を介してCas9を標的部位に誘導します。次に、二本鎖DNAはCas9タンパク質によって切断され、その結果、標的部位9,10,11,12のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の近くに二本鎖切断(DSB)が出現する。DSBによって引き起こされる損傷を軽減するために、細胞は包括的なDNA損傷応答を活性化して、ゲノム損傷を効率的に検出し、修復手順を開始します。細胞には、非相同末端結合(NHEJ)と相同性指向修復(HDR)の2つの異なる修復メカニズムがあります。NHEJは、DNA二本鎖切断を迅速に修復し、細胞のアポトーシスを防ぐことができる最も一般的な修復経路です。ただし、DSBの近くに挿入と欠失(インデル)の小さな断片が残るため、エラーが発生しやすく、通常は読み取りフレームがオープンになり、遺伝子ノックアウトにつながる可能性があります。対照的に、相同修復は非常にまれなイベントです。DSBのコンテキストに相同な配列を有する修復テンプレートが存在することを条件として、細胞は時折、近くのテンプレートに従ってゲノム切断を修復するであろう。HDRの結果、DSBは正確に修復されます。特に、テンプレート内の相同配列間に付加配列がある場合、それらはHDRを介してゲノムに組み込まれ、このようにして、特定の遺伝子挿入を実現することができた13。
sgRNA構造とCas9タンパク質変異体の最適化と開発により、CRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集システムは、ショウジョウバエメラノガスター、ネッタイシマカ、ボンビクスモリ、ヘリカバーパアルミゲラ、プルテラキシロステラ、イナゴの渡り鳥などの昆虫の研究にもうまく適用されています14,15,16,17,18 、19。著者らの知る限り、Cas9タンパク質とin vitro転写sgRNAからなるRNPはイナゴゲノム編集に使用されていますが20,21,22、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼを介した移動性イナゴのホモ接合変異体の構築のための体系的かつ詳細なプロトコルはまだ不足しています。
渡りバッタは、世界的に分布し、食料生産に大きな脅威をもたらす重要な農業害虫であり、小麦、トウモロコシ、米、キビなどのイネ科植物に特に有害です23。ゲノム編集技術に基づく遺伝子機能解析は、渡りバッタの新たな標的と新たな戦略を提供する可能性があります。本研究では、標的部位の選択とsgRNAの設計、sgRNAのin vitro合成と検証、卵のマイクロインジェクションと培養、胚期における突然変異率の推定、変異体の検出、変異体の継代と保存など、CRISPR/Cas9システムを介して渡りバッタ遺伝子をノックアウトするための詳細な方法を提案します。このプロトコルは、バッタ遺伝子の大部分を操作するための基礎参照として使用でき、他の昆虫のゲノム編集に貴重な参照を提供できます。
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Protocol
1. ターゲット部位の選択とsgRNAの設計
- NCBIおよびイナゴデータベース24で文献調査および/または遺伝子のmRNAまたはコーディングDNA配列(CDS)の検索を通じて、目的の遺伝子について可能な限り多くの配列情報を収集します。
- 関心のある遺伝子の配列をそのゲノムDNA配列と比較して、エクソン領域とイントロン領域を区別します。
- 研究目的に応じて、対象地設計の候補地域を選定します。プライマーペアを設計して候補領域フラグメントを増幅し、PCR産物のシーケンシング解析によってその野生型配列を検証します。
注:候補ターゲットリージョンの選択にはさまざまな戦略があります。例えば、ほとんどの遺伝子/タンパク質機能研究では、ゲノム編集(すなわち、遺伝子ノックアウト)後にタンパク質/RNA機能全体が失われるように、開始コドンに近いエクソン断片を候補領域として使用します。特定のドメインの関数解析では、ドメインの先頭(または両端)の候補領域を選択します。 - E-CRISP Design25 などのオンラインリソースを使用して、ターゲット候補地域の潜在的なターゲットサイトを検索します。
- 参照ゲノムのドロップダウンリストで「ショウジョウバエメラノガスターBDGP6」(またはその他の昆虫)を選択し、「入力はFASTA配列」を選択し、ターゲット領域の配列をテキストボックス(FASTA形式)に貼り付けます。
- 「培地」と「単一デザイン」で「sgRNA検索を開始」を押してアプリケーションを起動し、可能なターゲット部位を取得します。予測スコアに基づいて結果から1〜3個の潜在的なターゲットを選択し、それに応じて対応するsgRNAを設計します。
注:CRISPR設計には、CRISPOR、CHOPCHOP、CRISPRdirect、ZiFiTなど、他にも多くのオンラインプラットフォームがあります( 材料表を参照)。それらのいくつかは、ゲノム配列データがデータベースにある種の特異性チェックの機能を持っています。ただし、イナゴのゲノム配列はオンラインWebサイトでは見つかりませんでした。イナゴのCRISPR設計には、複数のオンラインツールを使用することをお勧めします。包括的に、さまざまなWebサイトからの結果を考慮し、最高の特異性、最高の効率、および最小のミスマッチ率の原則に基づいて、結果からsgRNAを選択します(図1A、B)。
2. インビトロでのsgRNAの合成と検証
- sgRNA合成キットを使用して、製造元のマニュアル(材料表)に従ってsgRNAを合成します。この手順には通常、DNAテンプレート増幅、 インビトロ 転写、およびsgRNA精製の3つのステップが含まれます21。合成したsgRNAをヌクレアーゼフリー水で希釈して保存濃度300 ng/μLにし、さらに使用します。
- CRISPR/Cas9システムの in vitro 切断アッセイの基質として機能する標的遺伝子断片を増幅および精製します。製造元の指示に従って、次の手順を実行します。
- 購入したCas9タンパク質をヌクレアーゼフリー水で300 ng/μLに希釈します。1 μLのsgRNA(300 ng/μL)および1 μLのCas9タンパク質(300 ng/μL)を200 ngの精製ターゲットフラグメントとともに切断バッファー中で37°Cで1時間インキュベートします(総容量10 μL; 表1を参照)。アガロースゲル電気泳動によるsgRNA誘導Cas9切断の効率を推定する(図1C)。以下のマイクロインジェクションに対して活性の高いsgRNAを選択します。
注:アガロースゲル電気泳動の結果は、画像処理ソフトウェアを使用してグレースケール画像に変換でき、切断効率は、推測されたサイズのバンドのグレースケールに従って推定されます。
3.卵のマイクロインジェクションと培養
- マイクロピペットプラーでガラス毛細血管を引っ張って注射針を準備します(材料表)。パラメーターを次のように設定します:加熱を588に、プルを90に、速度を60に、時間を40に設定します。注射針の先端をマイクログラインダーで粉砕します(材料表)。
注意: 理想的な針先は開いていて鋭利です(図2A)。注射中に針が詰まったり、誤って折れたりすることがあるため、実験用に追加の針を準備することを強くお勧めします。 - 1 μLのCas9タンパク質(300 ng/μL)と1 μLの検証済みsgRNA(300 ng/μL)を混合して、注射用のRNPを取得します。8 μLのRNaseフリー滅菌水を加えて、混合物の最終容量を10 μLにします。 溶液を完全に混合し、氷の上に置いておきます。
注:Cas9タンパク質とsgRNAの最終濃度は、編集結果に応じて最適化することができます。調製したRNP溶液の繰り返し凍結融解を避け、すぐに使用することをお勧めします。 - オスとメスの成虫を30°Cで16(明):8(暗)の日長で飼育し、十分な新鮮なコムギの苗を餌として供給します。これらのイナゴを毎日観察し、産卵ポット(湿った滅菌砂で満たされたプラスチック製の植木鉢またはカップ)を飼育ケージに入れて、イナゴが交尾したら産卵します。
注:通常、飼育ケージ(40 cm x 40 cm x 40 cm)で飼育された100ペアの成虫バッタは、単一の遺伝子をノックアウトするための卵を生成するのに十分です。より多くの卵が必要な場合は、追加のイナゴペアを培養します。 - 産卵ポットから産みたての卵のさやを回収し、卵の日焼けを約30分間待ちます。細かいブラシを使用して卵のさやから卵を水中でそっと隔離し、滅菌水で3回洗います。卵をペトリ皿に入れ、滅菌水を加えて湿らせます。
注:新しく産まれた卵の日焼けは、突然変異体の効率を大幅に改善することができます21。 - 調製したRNP溶液を注射針に充填し、マイクロマニピュレーターにロードします(材料表)。
- マイクロインジェクションパラメータを、射出圧力(π)の300hPa、射出時間(ti)の0.5秒、補償圧力(pc)の25hPaに設定します。
- ペダルを押して、注入された溶液の量を評価します。射出圧力と射出時間を調整して、射出量が約50〜100nLになるようにします。
注意: 注射液を可能な限り連続的かつ制御可能にするために、針内の残留空気を排出します。針とマイクロマニピュレーターの接続はしっかりとする必要があります。
- 滅菌卵を注射パッドに定期的に配置し(図2B、C)、顕微鏡のオブジェクトテーブルにパッドを置きます(図3A)。卵が観察されるまで顕微鏡の倍率を調整します。注射の先端が見えるまで顕微鏡下でマイクロ注射針を調整し、注入する卵の近くに配置します。
- 適切な高さと30〜45度の角度で注射を開始します。卵のマイクロパイルの近くで先端を卵に注意深く挿入し(図3B)、ペダルを押して注射を行います。針をすばやく引っ込め、次の卵を注射するために注射パッドを動かします。
注:マイクロインジェクション中の卵のわずかな膨張が観察されるべきです。ピンホールでの少量の細胞質漏出は許容されます。注入針を新しいものと交換するか、液体の流出が多すぎる場合は射出角度を調整します。 - 注入した卵を培養皿(湿ったろ紙を入れたシャーレ)に移し、30°Cのインキュベーターに入れます。
注:これらの注入された卵からニンフが孵化するまでに約13〜14日かかります(標的遺伝子の突然変異が胚の発生に影響を与えないことを条件として)(図3C)。特定の遺伝子をノックアウトするのに十分な孵化と閉鎖量を確保するために、少なくとも100個の卵を注入します。
4. 変異率推定と変異体のスクリーニング
- 注射後毎日注射卵の発育を確認してください。注入した卵を最初の5日間は24時間ごとに新しい培養皿に移します。
- 注射後6日目( またはそれ以降)に、10個の卵をランダムに摘み取ってチューブに移し、グラインダーを使用して60 Hzで6分間2つの鋼球で卵を適切に粉砕します( 材料の表を参照)。破片を1 mLのPBSで再懸濁します。5 μLの混合物を45 μLの50 mM NaOHに移し、95°Cで5分間溶解します。5 μLの1 M Tris-HCl(pH=8.0)を溶解システムに加え、アルカリ溶解反応を終了します。
注:最後の移植後の任意の日にアルカリ溶解のために卵を選ぶことができ、発生状況に応じて複数の卵を1つのサンプルとして使用できます(たとえば、5つの6日齢の胚を1つのサンプルとして使用し、2つの10日齢の胚を1つのサンプルとして使用できます)。アルカリ溶解法を使用して卵のゲノムDNAを取得することが不可能な場合があります。市販のゲノムDNA抽出キットは、卵からゲノムDNAを単離するための代替方法として使用できます。 - 1 μLの溶解産物をPCRテンプレートとして取り、標的遺伝子断片を増幅し(表2 および 表3)、PCR産物をシーケンシングに送ります。シーケンシング結果を野生型配列と比較して、CRISPR/Cas9システムが in vivoで 標的遺伝子を切断したかどうかを事前に評価します(図4A)。インデルが胚期に検出されることを条件に、その後の発達のために残りの卵を許可します。
注:このようにして、胚段階で突然変異率を事前に推定することができます。このステップでインデルが見つからない場合は、ターゲット遺伝子用の新しいsgRNAをいくつか準備し、ステップ2.1のノックアウトプロトコルを繰り返します。 - 孵化したニンフを飼育ケージに移し、ステップ3.3の説明に従って培養します。ニンフが5齢期に発達したら、プラスチック製の培養カップ(1ニンフ/カップ)でそれらを分離します。
注:ニンフが5齢に発達するのに通常約25〜35日かかり、最も明白な表現型は、翼芽が4番目または5番目の腹部に伸びることです。さらに、さらなる研究において、標的遺伝子と表現型との関係を予測するために、死んだニンフの表現型を記録することが推奨される。 - 触角の長さ約2mmを解剖ハサミで切り取り、アルカリ溶解法を用いて溶解する(ステップ4.2)。上記のようにこれらのニンフの標的遺伝子断片配列を解析し(ステップ4.3)、G0 変異体を同定する(図4B)。
注:溶解のためにカットされたアンテナは少し長くなる可能性があり、アンテナを直接消化することができますが、アンテナを粉砕またはミンチすることは溶解に役立ちます。シーケンシング結果で標的部位の近くに複数のピークを持つ個体は、陽性変異体として識別され、その後の発生と交配が可能になります。
5. 変異株の確立と継代
- G0変異体と野生型バッタを用いて交雑育種を行う(図4B)。オーシストを収集し、これらのオーシストを30°Cで別々にインキュベートします。 各オーシストに3〜6個の発育卵を使用して、手順4.2および4.3で説明されているように突然変異を検出します。その後の開発のために突然変異陽性オーシストを保持し、突然変異陰性オーシストを放棄する。
注:胚期での突然変異率の推定は、G1 変異体のスクリーニングを大幅に加速することができます。通常、3〜6個の発育卵は、上記のようにPCR媒介ジェノタイピングのための1つのサンプルとして混合することができる。 - 手順4.4の説明に従って、G1 ニンフを後方にします。G1 ヘテロ接合体を検出するためのステップ4.5に記載されるようにPCRベースのジェノタイピングを実行するために、アンテナの長さ約2mmを切り取る。製造元の指示に従ってTAクローニングを実行し( 材料表を参照)、それらの変異を特定します。同じ変異を有するG1 ヘテロ接合体を用いてインクロスを行い、G2 ニンフを得る。
注:PCR産物のサンガーシーケンシングは、ヘテロ接合体を見つけるための情報しか提供できず、正確な変異を特定するための十分な情報を提供しません。したがって、PCR産物を用いたTAクローニングは、変異を明確に同定し、安定な変異株の樹立を促進するために必要である。 - G2 ニンフを5齢まで後押しします。ステップ5.2で説明されているPCRベースのジェノタイピングを使用して、さらなる研究と安定した継代に適したホモ接合体および/またはヘテロ接合体を特定します(図4B)。
注:ホモ接合体とヘテロ接合体の混合を避けるように注意してください。各集団のホモ接合性および/またはヘテロ接合性を確認するために、すべての世代でPCRベースのジェノタイピングを実行することをお勧めします。このチェックに使用されるイナゴの数は、個体群のサイズによって異なります。さらに、イナゴの個体数は、インクロス戦略によって拡大することができます。
6.卵の凍結保存と蘇生
- 凍結保存する卵を滅菌水で洗浄し、上記の培養皿で5〜6日間インキュベートします(ステップ3.8)。これらの卵を培養皿に集め、ろ紙の破片で覆います。培養皿全体をパラフィンフィルムで包みます。
- 皿を25°Cで2日間保ち、その後さらに2日間比較的低い温度(13〜16°C)で保ちます。その後、皿を6°Cの冷蔵庫に移します。卵に湿った環境を提供するために、2週間ごとに水を追加します(図5A)。
注:胚は、30°Cで5〜6日間発生した後、カタトレプシス段階にあると推測されています26。勾配冷却は卵の凍結保存に役立ちます(表5)。 - 凍結保存された卵を蘇生させるには、冷蔵庫からシャーレを取り出し、25°Cで2日間保管します。これらの卵をニンフが孵化するまで30°Cのインキュベーターに入れます(図5B)。
注:凍結保存された卵を25°Cに入れてから、30°Cのインキュベーターに移す必要があります。胚は少なくとも5ヶ月間凍結保存することができますが、凍結保存のために孵化率と閉鎖率が低下する可能性があります(表5)。
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Representative Results
このプロトコルには、Cas9タンパク質と in vitro で合成されたsgRNAからなるRNPを持つ移動性イナゴのホモ接合変異体を生成するための詳細な手順が含まれています。以下は、標的選択、sgRNA合成と検証(図1A)、採卵と注射、変異体スクリーニングと継代、凍結保存、ホモ接合卵の蘇生など、イナゴにおけるCRISPR/Cas9を介した標的遺伝子ノックアウトの代表的な結果です。
本研究では、3つのオンラインプログラム(E-CRISP、CRISPOR、およびZiFit)の結果に従って、CRISPR/Cas9システムのターゲットサイトを選択し、最初のエクソンに配置します(図1B)。 in vitro でのCas9切断アッセイ(表1)によると、CRISPR/Cas9 RNPはPCRフラグメント(標的部位を含む)を約55%の切断率で消化することができました(図1C)。次に、このRNPを、標準的なマイクロインジェクションシステムを使用して、単一細胞段階で120個の受精卵にマイクロインジェクションしました(図2 および 図3)。胚期突然変異率推定のシーケンシング結果は、標的部位での効率的なゲノム編集を示唆しました(図4A)。さらに、この研究は52.73%のニンフ孵化率をもたらし、G0 成体の66.7%がモザイク変異体であった(表4)。
また、G0キメラを野生型バッタと交配してヘテロ接合型のG1個体を得、同じ変異を有するG1ヘテロ接合体(TAクローニングによりスクリーニング)を交配してG2動物を作製した。変異体の検出にはPCRベースの表現型を使用し、得られたホモ接合体をインクロスして安定した変異株を確立しました(図4B)。
一方、余剰のホモ接合卵は凍結保存し、ホモ接合体の利用率を向上させた。凍結保存卵の孵化率は凍結保存時間の延長とともに低下したが(表5)、卵を湿らせておくためにろ紙片を塗布し、温度上昇の勾配でこれらの保存卵を回収するなどの是正措置は、どちらも蘇生に役立ちました(図5および表5)。最後に、変異体のホモ接合集団は、その後の研究のために首尾よく維持された。
図1:標的の設計とsgRNAの インビトロ 検証 。 (A)イン ビトロ での標的選択、sgRNA合成、および生理活性検証(イナゴを含むがこれに限定されない)のフロー図。(b)遺伝子構造および標的部位の模式図。この標的遺伝子のエクソンは青色ドメインとして示され、標的部位はエクソン1の開始コドンの下流に選択された。ターゲットシーケンスは赤で強調表示されます。(C)アガロースゲル電気泳動の in vitro Cas9切断アッセイの結果。標的配列(長さ約400bp)を有するDNA断片を増幅し、Cas9消化の基質として使用した。予想される小さなバンド(ここでは約100 bpと300 bp、赤い三角形でマーク)は、合成されたsgRNAが効果的なCas9切断を誘導できることを示唆しました。グレースケール分析によると、切断率は約55%でした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:イナゴ卵用の針の準備とマイクロ注入パッド 。 (A)イナゴの卵をマイクロインジェクションするために準備された針の先端。スケールバー:1 mm。 (B)卵(赤い三角形で示されている)が配置されたマイクロインジェクションパッドの写真。スケールバーは1cmを表す。 (C)マイクロインジェクションパッドのサイズ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:卵のマイクロインジェクション。 (A)顕微鏡(中央)とマイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーター(右)を示す赤いボックスでラベル付けされた代表的なマイクロインジェクションシステム(左)。コンピュータは、データストレージと補助観測を提供するために使用されます。(B)イナゴの卵の注射。注射部位は赤い三角形でマークされています。(C)顕微鏡下で孵化したニンフ。スケールバーは1mmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:G0動物の配列決定結果および変異株の継代戦略。 (a)典型的な配列決定は、G0スクリーニングをもたらす。標的部位付近の複数のピーク(野生型配列で赤い長方形でマーク)は、試験した卵/イナゴがCRISPR/Cas9システム(G 0-1およびG0-2に示すように)によって正常に編集されたことを示し、配列決定結果に何の変化もない個体は編集されず、放棄されたと見なされた(例えば、 G0-3)。(B)変異株の継代戦略。最初にPCRを介したジェノタイピングによってG0動物をスクリーニングし、シーケンシング結果に複数のピークがある動物を野生型バッタと交配してG1動物を生成しました。PCRを介したジェノタイピングおよびTAクローニングを用いて、G1ヘテロ接合体を同定した。次いで、同じ変異を有するヘテロ接合体をインクロスして、さらなる研究および継代のためにG2動物(ホモ接合体およびヘテロ接合体)を生成した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:卵の凍結保存と蘇生 。 (A)凍結保存の手順:卵のさやから卵を分離し、滅菌水で洗浄した後、30°Cで5〜6日間インキュベートします。次に、発育した卵をペトリ皿に集め、湿ったろ紙の小さな切れ端で覆います。ペトリ皿全体をパラフィンフィルムで包み、25°Cで2日間保持した後、比較的低い温度(13〜16°Cなど)でさらに2日間保ちます。最後に、6°Cで冷蔵します。 (B)蘇生の手順:凍結保存卵の入ったシャーレを冷蔵庫から取り出し、ろ紙の切れ端を取り除いた後、25°Cで2日間保管します。その後、卵子は、ニンフが孵化するまで30°Cでその後の発育のために培養することができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 試薬 | 容量(μL) |
| Cas9タンパク質 (300 ng/μL) | 1 |
| sgRNA (300 ng/μL) | 1 |
| PCR産物 (200 ng/μL) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 6 |
表1: インビトロ 消化システム。 200 ngの精製ターゲットフラグメント(PCR産物)をCRISPR/Cas9システム(各成分300 ng)と混合し、合成したsgRNAの生物活性を試験しました。市販のバッファーを使用し、ヌクレアーゼフリーの水を加えて総容量を10 μLにしました。
| 試薬 | 容量(μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| フォワードプライマー | 0.5 |
| リバースプライマー | 0.5 |
| テンプレート(溶解生成物) | 1 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 10.5 |
表2:標的遺伝子断片増幅のためのPCRシステム。 標的遺伝子のゲノム断片を増幅するために、市販のTaqミックスを使用し、製造元の指示に従ってプライマーを添加した。1 μLの溶解生成物を鋳型として使用し、ヌクレアーゼフリーの水を使用して総容量を25 μLにしました。
| 気温(°C) | 時間 | サイクル |
| 95 | 5 ミン | 1 |
| 95 | 30秒 | 35 |
| 55 | 30秒 | |
| 72 | 40秒 | |
| 72 | 10 ミン | 1 |
表3:標的遺伝子増幅のためのPCRプログラム。 標的遺伝子増幅のためのPCRプログラムは、95°Cで5分間でした。95°Cで30秒、55°Cで30秒、72°Cで40秒の35サイクル。72°Cで10分間。
| 項目 | データ |
| 注入卵数 | 120 |
| テストされた胚 | 10 |
| 孵化したニンフの数 | 58 |
| 孵化率 | 52.73% |
| Gの番号0 大人 | 12 |
| G0 変異体数 | 8 |
| G0 成人における突然変異効率 | 66.67% |
表4:編集効率の概要。 標的遺伝子をノックアウトするために120個の卵を注入し、胚段階でテストするために10個の卵を採取しました。残りの胚から58匹のニンフが孵化した(孵化率は52.73%)。最後に、12匹のG0 バッタが成虫期に発達し、そのうち8匹が標的部位で正常に編集されました。成人G0 の突然変異率は66.67%であった。
| 対照群 | グループ1 | グループ2 | 集団 3 | 集団 4 | |
| 卵の数 | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| 保管のための温度処理 | 30 °C | 30°C (5-6 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C |
| 保管時間 | 14日間 | 14日間 | 1ヶ月 | 3ヶ月 | 5ヶ月 |
| 蘇生のための温度治療 | 30 °C | 6°C→30 °C | 6°C→25°C(2日間)→30°C | 6°C→25°C(2日間)→30°C | 6°C→25°C(2日間)→30°C |
| 孵化したイナゴの数 | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| 孵化率 | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| 成虫のイナゴ数 | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| 閉塞率 | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
表5:卵の凍結保存と蘇生の概要。 600個の卵を凍結保存および蘇生研究のために5つのグループに分けた。120個の卵の最初の群(対照)を常に30°Cでインキュベートし、14日間保存した。120個の卵の2番目のグループ(グループ1)は、30°Cで5〜6日間インキュベートした後冷蔵庫に移し、6°Cで14日間保存しました。次に、これらの卵を蘇生のために30°Cに移した。他のグループ(グループ2、グループ3、およびグループ4、各グループには120個の卵が含まれていました)は、プロトコル(ステップ6.1〜6.3)に記載されているように、異なる保管時間(グループ2の場合は1か月、グループ3の場合は3か月、グループ4の場合は5か月)で勾配冷却および回復温度処理を経験しました。最後に、対照群から108匹のニンフが孵化し(孵化率90%)、そのうち81匹が成体期に発達しました(卵化率の75%)。2番目のグループ(グループ1)ではバッタは孵化しませんでした。他の群の孵化率と閉塞率は対照群と比較して低く、貯蔵時間とともに減少した。グループ2で孵化した96匹のニンフと、そのうち60匹が成体期に発達した。グループ3で孵化した86匹のニンフと、そのうち46匹が成体期に発達しました。グループ4では、78匹のニンフが孵化し、そのうち31匹が成体期に発達しました。
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Discussion
イナゴは、人間の文明以来、農業にとって最も壊滅的な害虫の1つです23。CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集技術は、バッタの生物学的メカニズムに関するより良い知識と有望な害虫駆除戦略を提供するための強力なツールです。したがって、ホモ接合型ローカスト変異体のCRISPR/Cas9を介した構築の効率的で使いやすい方法を開発することは大きな利益です。いくつかの素晴らしい研究が報告され、バッタのゲノム編集のためのいくつかの基本的なワークフローが提供されましたが18,20,21,22、手順全体の体系的な最適化はまだ不足しています。一般に、CRISPR / Cas9システムの胚注入によって生成されたホモ接合型イナゴ変異体は、3つの主要なステップに分けることができます:a)in vitroでのsgRNAの設計、合成、およびスクリーニング、b)卵の収集、準備、および注射。c)変異体のスクリーニングおよびホモ接合体維持。このプロトコルは最適化されたワークフローを提供し、標的部位の選択、in vitro sgRNAスクリーニング、卵のマイクロインジェクション、および変異体の検出のステップは、CRISPR/Cas9システムでホモ接合変異バッタを効果的に生成するために特に重要です。
第一に、標的部位、対応するsgRNAの形態、およびsgRNAの濃度が、昆虫のゲノム編集効率の重要な要因として示唆されている18,27,28。この問題を解決するには、まず遺伝子構造を解析し、オンラインリソースを使用してエクソン1上または開始コドン付近の複数の標的部位を設計することをお勧めします。次に、in vitroでsgRNAを合成し、それを異なる濃度でCas9タンパク質と混合して、RNPの切断効率を最適化します。この手順は、高い生理活性を有するsgRNAを同定し、候補標的遺伝子に対するRNP複合体の組成を最適化するのに役立つ。
第二に、限られた時間でできるだけ多くの新鮮な卵を採取し、孵化率や突然変異率を向上させることも、ゲノム編集作業にとって大きな課題です。16(明):8(暗)の日長の条件で飼育された群生バッタは、午前9:00〜11:00の短期間で十分な卵を集めるために使用されます。絵筆やピンセットを使って卵の間にゆっくりと下向きの圧力をかけ、卵をポッドから慎重に隔離することが重要です。十分な練習をすれば、複数のユーザーが個々の卵をポッドから確実に分離できます。各卵を単離し、滅菌水で洗浄した後、マイクロインジェクション中に卵を安定させるために、卵を設計された注射パッド(図2B、C)に揃えます。卵はマイクロパイルの近くに最適化されたRNPを注入されます。機械的損傷を制限し、卵の汚染を最小限に抑えるために、新鮮な卵を約30分間ポッドにとどまらせて、卵殻のなめしがマイクロインジェクションに理想的であることを確認します21、十分な日焼け後の侵入に対する高い防御能力21。一方、公表された報告によると、イナゴの卵の合胞体分裂31は、産卵後0時間から4時間の間のある時点で発生します。現在の標準的なマイクロインジェクションプロトコルでは、約100個の卵の注入を40分以内に達成できます。まとめると、100個の受精卵の日焼けとマイクロインジェクションの手順は2時間以内に完了することができます。したがって、CRISRP / Cas9を介した切断と標的遺伝子の修復には、注入された卵と将来の成虫のバッタの効率的な突然変異を達成するための少なくとも2時間が残っています。
最後に、継代と変異体の同定のための効果的な戦略は、ほとんどの変異動物でホモ接合体を生成するために重要です。イナゴにおいて、編集後に非致死性となる遺伝子について、ここで提案する交雑戦略は、G0変異体とワイド型バッタを交雑させ、さらに同じ変異を有するG1ヘテロ接合体を用いてインクロスを行い、次の世代のホモ接合変異体を生成することである。変異体継承プロセス中に各イナゴの突然変異を検証するには、PCRベースのジェノタイピングのテンプレートとして、アルカリ溶解法を使用してアンテナの短いセグメントを消化することをお勧めします。最後に、得られたホモ接合性の成体をさらにインクロスに使用して、人口を拡大します。ホモ接合型バッタ間の個体数と発生段階の違いによって制限され、過剰な卵は、6°Cでの凍結保存と、渡りバッタ卵の低温休眠と高温休眠放出の原理に基づく勾配温度上昇による蘇生に推奨されます(図5)32,33。
要するに、CRISPR/Cas9システムは、渡りバッタの機能ゲノミクスの研究を促進するための信頼できるツールであることが証明されています。この詳細なプロトコルは、渡りバッタや他の昆虫におけるCRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集アプリケーションのリファレンスとして使用できます。
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Disclosures
著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(32070502、31601697、32072419および中国ポスドク科学基金会(2020M672205)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
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