Summary
이 연구는 동형접합 메뚜기 돌연변이의 CRISPR/Cas9 리보뉴클레아제 기반 구성의 체계적으로 최적화된 절차와 메뚜기 알의 냉동 보존 및 소생을 위한 상세한 방법을 제공합니다.
Abstract
철새 메뚜기인 Locusta migratoria는 인류에게 막대한 경제적 손실을 초래한 세계적인 역병 메뚜기 중 하나일 뿐만 아니라 곤충 변태에 대한 중요한 연구 모델이기도 합니다. CRISPR/Cas9 시스템은 특정 DNA 유전자좌를 정확하게 찾아내고 표적 부위 내에서 절단할 수 있으며, 이중 가닥 절단을 효율적으로 도입하여 표적 유전자 knockout을 유도하거나 새로운 유전자 단편을 특정 유전자좌에 통합할 수 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집은 메뚜기 연구에서 직면하는 문제를 해결하기 위한 강력한 도구일 뿐만 아니라 메뚜기 제어를 위한 유망한 기술입니다. 이 연구는 철새 메뚜기에서 Cas9 단백질과 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 복합체를 사용한 CRISPR/Cas9 매개 유전자 knockout에 대한 체계적인 프로토콜을 제공합니다. 표적 부위의 선택과 sgRNA의 설계에 대해 자세히 설명한 후 시험 관 내 합성 및 sgRNA의 검증을 수행합니다. 후속 절차에는 낮은 사망률로 성공적인 미세 주입을 달성하기 위한 알 뗏목 수집 및 무두질 계란 분리, 계란 배양, 돌연변이 비율의 예비 추정, 메뚜기 번식, 편집된 메뚜기의 개체군 안정성을 보장하기 위한 돌연변이의 탐지, 보존 및 통과가 포함됩니다. 이 방법은 철새 메뚜기 및 다른 곤충에서 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 응용 분야에 대한 참조로 사용할 수 있습니다.
Introduction
유전자 편집 기술은 특정 게놈 유전자좌에 삽입 또는 결실을 도입하여 목적1에 표적 유전자를 인위적으로 변형시키는 데 사용될 수 있습니다. 지난 몇 년 동안 CRISPR/Cas9 기술은 빠르게 발전했으며 생명 과학 2,3,4,5,6의 다양한 분야에서 응용 범위가 증가하고 있습니다. CRISPR/Cas9 시스템은 1987년7년에 발견되었으며, 박테리아와 고세균에서 널리 발견되었다. 추가 연구에 따르면 파지8에 대항하기 위해 RNA 유도 뉴클레아제 Cas9에 의존하는 원핵생물 적응 면역 시스템이었습니다. 인공적으로 변형된 CRISPR/Cas9 시스템은 주로 단일 가이드 RNA(sgRNA)와 Cas9 단백질의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. sgRNA는 표적 염기서열에 상보적인 CRISPR RNA(crRNA)와 상대적으로 보존된 보조 trans-activating crRNA(tracrRNA)로 구성됩니다. CRISPR/Cas9 시스템이 활성화되면 sgRNA는 Cas9 단백질과 리보핵단백질(RNP)을 형성하고 RNA-DNA 상호작용의 염기쌍을 통해 Cas9을 표적 부위로 안내합니다. 그런 다음 이중 가닥 DNA는 Cas9 단백질에 의해 절단될 수 있으며 그 결과 표적 부위 9,10,11,12의 원형 스페이서 인접 모티프(PAM) 근처에서 이중 가닥 절단(DSB)이 나타납니다. DSB로 인한 손상을 완화하기 위해 세포는 포괄적인 DNA 손상 반응을 활성화하여 게놈 손상을 효율적으로 감지하고 복구 절차를 시작합니다. 세포에는 NHEJ(non-homologous end joining)와 HDR(homology-directed repair)의 두 가지 뚜렷한 복구 메커니즘이 있습니다. NHEJ는 DNA 이중 가닥 파괴를 빠르게 복구하고 세포 사멸을 예방할 수 있는 가장 일반적인 복구 경로입니다. 그러나 DSB 근처에 작은 삽입 및 결실 조각(indels)을 남기기 때문에 오류가 발생하기 쉬우며, 이는 일반적으로 열린 판독 프레임 이동을 초래하여 유전자 녹아웃으로 이어질 수 있습니다. 대조적으로, 상동 수리는 매우 드문 경우입니다. DSB의 맥락과 상동인 서열을 갖는 복구 주형이 존재한다는 조건에서, 세포는 때때로 근처의 주형에 따라 게놈 절단을 복구할 것이다. HDR의 결과는 DSB가 정밀하게 복구된다는 것입니다. 특히, 주형의 상동 서열 사이에 추가 서열이 있으면 HDR을 통해 게놈에 통합될 수 있으며, 이러한 방식으로 특정 유전자 삽입을 실현할 수 있다13.
sgRNA 구조와 Cas9 단백질 변이체의 최적화 및 개발로 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 시스템은 Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella 및 Locusta migratoria 14,15,16,17,18을 포함하되 이에 국한되지 않는 곤충 연구에도 성공적으로 적용되었습니다 ,19. 저자가 아는 한, Cas9 단백질과 시험관 내 전사된 sgRNA로 구성된 RNP가 메뚜기 게놈 편집에 사용되었지만20,21,22, 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이체의 CRISPR/Cas9 리보뉴클레아제 매개 구성에 대한 체계적이고 상세한 프로토콜은 여전히 부족합니다.
철새 메뚜기는 전 세계적으로 분포하고 식량 생산에 상당한 위협을 가하는 중요한 농업 해충으로, 특히 밀, 옥수수, 쌀, 기장과 같은 식물에 해롭다23. 게놈 편집 기술을 기반으로 한 유전자 기능 분석은 철새 메뚜기 통제를 위한 새로운 표적과 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. 본 연구에서는 표적 부위 선정 및 sgRNA 설계, 시험관 내 합성 및 sgRNA 검증, 계란 미세주입 및 배양, 배아 단계의 돌연변이율 추정, 돌연변이 검출, 돌연변이 계대 통과 및 보존 등 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 철새 메뚜기 유전자를 녹아웃하는 상세한 방법을 제안합니다. 이 프로토콜은 대다수의 메뚜기 유전자 조작을 위한 기본 참조로 사용될 수 있으며 다른 곤충의 게놈 편집에 대한 귀중한 참조를 제공할 수 있습니다.
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Protocol
1. 표적 부위 선정 및 sgRNA 설계
- 문헌 연구 및/또는 NCBI 및 메뚜기 데이터베이스24에서 유전자의 mRNA 또는 코딩 DNA 서열(CDS) 검색을 통해 관심 유전자에 대해 가능한 한 많은 서열 정보를 수집합니다.
- 관심 유전자의 서열을 게놈 DNA 서열과 비교하여 엑손과 인트론 영역을 구별합니다.
- 연구 목적에 따라 대상 사이트 디자인을 위한 후보 지역을 선택합니다. 후보 영역 단편을 증폭하기 위해 프라이머 쌍을 설계하고 PCR 산물의 염기서열 분석을 통해 야생형 서열을 검증합니다.
참고: 후보 대상 지역을 선택하는 데는 여러 가지 전략이 있습니다. 예를 들어, 대부분의 유전자/단백질 기능 연구에서 시작 코돈에 가까운 엑손 단편을 후보 영역으로 사용하여 게놈 편집(즉, 유전자 녹아웃) 후 전체 단백질/RNA 기능이 손실되도록 합니다. 특정 도메인의 함수 분석을 위해 도메인의 시작 부분(또는 양쪽 끝)에서 후보 영역을 선택합니다. - E-CRISP Design25 와 같은 온라인 리소스를 사용하여 후보 대상 지역에서 잠재적 대상 사이트를 검색합니다.
- 참조 게놈의 드롭다운 목록에서 "Drosophila melanogaster BDGP6"(또는 다른 곤충)을 선택하고 "입력은 FASTA 시퀀스"를 선택한 다음 대상 영역의 시퀀스를 텍스트 상자(FASTA 형식)에 붙여넣습니다.
- 가능한 표적 부위를 얻기 위해 "medium" 및 "single design"과 함께 "Start sgRNA search"를 눌러 응용 프로그램을 시작합니다. 예측 점수를 기반으로 결과에서 1-3개의 잠재적 표적을 선택하고 그에 따라 해당 sgRNA를 설계합니다.
참고: CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT 등과 같은 CRISPR 설계를 위한 더 많은 온라인 플랫폼이 있습니다( 재료 표 참조). 그들 중 일부는 게놈 서열 데이터가 데이터베이스에 있는 종에 대한 특이성 확인 기능을 가지고 있습니다. 그러나 메뚜기의 게놈 서열은 온라인 웹 사이트에서 발견되지 않았습니다. 메뚜기떼의 CRISPR 설계를 위해 하나 이상의 온라인 도구를 사용하는 것이 좋습니다. 종합적으로 다양한 웹사이트의 결과를 고려하고 가장 높은 특이성, 가장 높은 효율성 및 최소 불일치율의 원칙에 따라 결과에서 sgRNA를 선택합니다(그림 1A, B).
2. in vitro sgRNA의 합성 및 검증
- sgRNA 합성 키트를 이용하여 제조사 매뉴얼(Table of Materials)에 따라 sgRNA를 합성한다. 이 절차는 일반적으로 DNA 주형 증폭, 시험관 내 전사 및 sgRNA 정제의 세 단계를 포함한다21. 합성된 sgRNA를 뉴클레아제가 없는 물로 희석하여 300ng/μL의 저장 농도로 추가 사용을 위해 합니다.
- 표적 유전자 단편을 증폭 및 정제하여 CRISPR/Cas9 시스템의 in vitro 절단 분석의 기질 역할을 합니다. 제조업체의 지침에 따라 다음 단계를 수행합니다.
- 구입한 Cas9 단백질을 뉴클레아제가 없는 물로 300ng/μL로 희석합니다. 1 μL의 sgRNA(300 ng/μL)와 1 μL의 Cas9 단백질(300 ng/μL)을 200 ng의 정제된 표적 단편과 함께 37°C의 절단 완충액에서 1시간 동안 배양합니다(총 부피 10 μL, 표 1 참조). 아가로스 겔 전기영동에 의한 sgRNA 유도 Cas9 절단의 효율을 추정합니다(그림 1C). 다음 미세주입을 위해 활성이 높은 sgRNA를 선택합니다.
참고: 아가로스 겔 전기영동의 결과는 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 그레이스케일 이미지로 변환할 수 있으며 분할 효율은 추측된 크기 밴드의 그레이스케일에 따라 추정됩니다.
3. 계란의 미세주입 및 배양
- 마이크로피펫 풀러(Table of Materials)로 유리 모세관을 당겨 주사 바늘을 준비합니다. 매개변수를 Heat를 588로, Pull을 90으로, Velocity를 60으로, Time을 40으로 설정합니다. 마이크로 그라인더 (재료 표)로 주사 바늘의 끝을 갈아줍니다.
알림: 이상적인 바늘 끝은 열려 있고 날카롭습니다(그림 2A). 주사 중에 바늘이 막히거나 실수로 부러지는 경우가 있으므로 실험을 위해 추가 바늘을 준비하는 것이 좋습니다. - Cas9 단백질 1μL(300ng/μL)과 검증된 sgRNA 1μL(300ng/μL)를 함께 혼합하여 주입용 RNP를 얻습니다. 8 μL의 RNase가 없는 멸균수를 첨가하여 혼합물의 최종 부피를 10 μL로 만듭니다. 용액을 완전히 혼합하고 얼음 위에 보관하십시오.
참고: Cas9 단백질 및 sgRNA의 최종 농도는 편집 결과에 따라 최적화할 수 있습니다. 준비된 RNP 용액의 반복적인 동결 및 해동을 피하고 즉시 사용하는 것이 좋습니다. - 수컷과 암컷 성체 메뚜기를 30°C에서 16(밝음):8(어두운) 광주기로 함께 기르고 충분한 양의 신선한 밀 묘목을 먹이로 공급합니다. 이 메뚜기를 매일 관찰하고 메뚜기가 짝짓기를 하면 산란을 위해 산란 냄비(젖은 멸균 모래로 채워진 플라스틱 화분 또는 컵)를 사육장에 넣습니다.
참고: 일반적으로 사육장(40cm x 40cm x 40cm)에서 사육된 성체 메뚜기 100쌍은 단일 유전자를 제거하기 위한 알을 생성하기에 충분합니다. 더 많은 알이 필요한 경우 추가 메뚜기 쌍을 배양하십시오. - 산란 냄비에서 갓 낳은 달걀 꼬투리를 모으고 달걀 태닝을 위해 약 30분 동안 기다립니다. 가는 솔을 사용하여 물에 있는 달걀 꼬투리에서 달걀을 부드럽게 분리하고 멸균수로 세 번 씻습니다. 계란을 페트리 접시에 보관하고 멸균수를 추가하여 촉촉하게 유지하십시오.
참고: 새로 낳은 알을 태닝하면 돌연변이 효율이 크게 향상될 수 있다21. - 준비된 RNP 용액을 주사 바늘에 채우고 미세 매니퓰레이터(재료 표)에 로드합니다.
- 미세주입 파라미터를 300hPa의 사출 압력(pi), 0.5초의 주입 시간(ti) 및 25hPa의 보상 압력(pc)으로 설정합니다.
- 페달을 밟아 주입된 용액의 부피를 평가합니다. 주입 압력과 주입 시간을 조정하여 주입 부피가 약 50-100nL가 되도록 합니다.
알림: 주사액이 가능한 한 지속적이고 제어 가능하도록 바늘에 남아 있는 공기를 배출하십시오. 바늘과 미세 매니퓰레이터의 연결은 단단해야합니다.
- 멸균 계란을 주입 패드(그림 2B, C)에 정기적으로 배열하고 패드를 현미경의 물체 테이블(그림 3A)에 놓습니다. 알이 관찰 될 때까지 현미경의 배율을 조정하십시오. 주사 팁이 보일 때까지 현미경으로 미세 주입 바늘을 조정하고 주입할 계란 근처에 놓습니다.
- 적절한 높이와 30-45도 각도에서 주입을 시작하십시오. 달걀의 마이크로파일 근처에 팁을 조심스럽게 달걀에 삽입하고(그림 3B) 페달을 밟아 주입합니다. 바늘을 빠르게 집어넣고 다음 달걀을 주입하기 위해 주입 패드를 움직입니다.
알림: 미세주입 동안 계란의 약간의 팽창이 관찰되어야 합니다. 핀홀에서 소량의 세포질 누출이 허용됩니다. 주사 바늘을 새 것으로 교체하거나 유체 유출이 너무 많으면 주사 각도를 조정하십시오. - 주입된 계란을 배양 접시(촉촉한 여과지가 있는 페트리 접시)에 옮기고 30°C의 인큐베이터에 넣습니다.
참고: 애벌레가 주입된 알에서 부화할 때까지 약 13-14일이 소요됩니다(표적 유전자의 돌연변이가 배아 발달에 영향을 미치지 않는 조건)(그림 3C). 특정 유전자를 제거하기에 충분한 부화 및 방출량을 보장하기 위해 최소 100개의 알을 주입합니다.
4. 돌연변이율 추정 및 돌연변이 스크리닝
- 주사 후 매일 주입 된 계란의 발달을 확인하십시오. 주입 된 계란을 처음 5 일 동안 24 시간마다 새로운 배양 접시로 옮깁니다.
- 주사 후6일째 (또는 그 이후)에 무작위로 계란 10개를 골라 튜브에 옮기고 그라인더를 사용하여 60Hz에서 6분 동안 두 개의 강철 볼로 계란을 적절하게 분쇄합니다( 재료 표 참조). 1mL의 PBS로 파편을 재현탁합니다. 혼합물 5 μL를 50 mM NaOH 45 μL로 옮기고 95°C에서 5분 동안 용해시킨다. 5μL의 1M Tris-HCl(pH=8.0)을 용해 시스템에 추가하여 알칼리 용해 반응을 종료합니다.
참고: 마지막 이식 후 언제든지 알칼리 용해를 위해 난자를 채취할 수 있으며 발달 상황에 따라 여러 개의 난자를 하나의 샘플로 사용할 수 있습니다(예: 6일 된 배아 5개를 하나의 샘플로 사용할 수 있고 10일 된 배아 2개를 하나의 샘플로 사용할 수 있음). 때로는 알칼리성 용해 방법을 사용하여 계란의 게놈 DNA를 얻는 것이 불가능합니다. 상업용 게놈 DNA 추출 키트는 계란에서 게놈 DNA를 분리하기 위한 대체 방법으로 사용할 수 있습니다. - 용해 산물 1μL를 PCR 주형으로 삼아 표적 유전자 단편을 증폭하고(표 2 및 표 3) 시퀀싱을 위해 PCR 산물을 보냅니다. 염기서열 분석 결과를 야생형 염기서열과 비교하여 CRISPR/Cas9 시스템이 생체 내에서 표적 유전자를 절단했는지 여부를 예비적으로 평가합니다(그림 4A). 배아 단계에서 indels가 검출되는 조건에서 후속 발달을 위해 나머지 난자를 허용하십시오.
참고: 이러한 방식으로 돌연변이 비율은 배아 단계에서 예비적으로 추정할 수 있습니다. 이 단계에서 인델이 발견되지 않으면 표적 유전자에 대한 새로운 sgRNA를 준비하고 2.1 단계의 녹아웃 프로토콜을 반복합니다. - 부화한 님프를 사육장으로 옮기고 3.3단계에 설명된 대로 배양합니다. 님프가 다섯 번째 instar 단계로 발달하면 플라스틱 배양 컵(님프 1개/컵)으로 분리합니다.
참고: 님프가 다섯 번째 인스타로 발달하는 데 일반적으로 약 25-35일이 걸리며 가장 명백한 표현형은 날개 봉오리가 네 번째 또는 다섯 번째 복부 부분까지 확장된다는 것입니다. 또한, 추가 연구에서 표적 유전자와 표현형 사이의 관계를 예측하기 위해 죽은 님프의 표현형을 기록하는 것이 좋습니다. - 해부 가위로 약 2mm 길이의 안테나를 잘라내고 알칼리 용해 방법을 사용하여 용해합니다(4.2단계). 상기와 같이 이들 님프의 표적 유전자 단편 서열을 분석하여(단계 4.3)G0 돌연변이체를 확인하였다(도 4B).
알림: 용해를 위해 절단된 더듬이는 조금 더 길어질 수 있으며 더듬이를 직접 소화할 수 있지만 더듬이를 갈거나 다지는 것이 용해에 도움이 됩니다. 시퀀싱 결과에서 표적 부위 근처에 여러 피크가 있는 개체는 양성 돌연변이로 식별되고 후속 발달 및 교미가 허용됩니다.
5. 돌연변이 계통의 확립 및 통과
- G0 돌연변이체와 야생형 메뚜기를 사용하여 교차 번식을 수행합니다(그림 4B). 난포를 수집하고 이 난포낭을 30°C에서 별도로 배양합니다. 4.2 단계와 4.3 단계에서 설명한대로 돌연변이를 검출하기 위해 각 oocyst에 3-6 개의 발달 된 알을 사용하십시오. 후속 발달을 위해 돌연변이 양성 난포낭을 유지하고 돌연변이 음성 난포낭을 포기하십시오.
참고: 배아 단계에서의 돌연변이율 추정은 G1 돌연변이체의 스크리닝을 크게 가속화할 수 있습니다. 보통, 3-6개의 개발된 난자는 상기와 같이 PCR 매개 유전자형 분석을 위한 하나의 샘플로서 혼합될 수 있다. - 4.4단계에서 설명한 대로 G1 님프를 후면합니다. G1 이형접합체를 검출하기 위한 단계 4.5에 기재된 바와 같이 PCR 기반 유전형 분석을 수행하기 위해 약 2 mm 길이의 안테나를 잘라낸다. 제조업체의 지침(재료 표 참조)에 따라 TA 복제를 수행하여 돌연변이를 식별합니다. 동일한 돌연변이를 가진 G1 이형 접합체를 사용하여 교차를 수행하여 G2 님프를 얻습니다.
참고: PCR 산물의 Sanger 염기서열 분석은 이형접합체를 찾기 위한 정보만 제공할 수 있지만 정확한 돌연변이를 식별하기 위한 정보는 충분하지 않습니다. 따라서, PCR 산물을 이용한 TA 클로닝은 돌연변이를 명확히 규명하고 안정한 돌연변이 주(phynt)의 확립을 촉진할 수 있다. - 다섯 번째 인스타까지 G2 님프를 후방으로 돌립니다. 5.2단계에 설명된 PCR 기반 유전형 분석을 사용하여 추가 연구 및 안정적인 계대배양에 적합한 동형접합체 및/또는 이형접합체를 식별합니다(그림 4B).
참고: 동형접합체와 이형접합체가 혼합되지 않도록 주의하십시오. 각 집단의 동형접합성 및/또는 이형접합성을 확인하기 위해 모든 세대에서 PCR 기반 유전형 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 이 검사에 사용되는 메뚜기의 수는 개체군 크기에 따라 다릅니다. 더욱이 메뚜기 개체수는 교차 전략으로 확대 될 수 있습니다.
6. 계란 냉동 보존 및 소생술
- 냉동 보존할 계란을 멸균수로 세척하고 5-6일 동안 위에서 설명한 대로(단계 3.8) 배양 접시에서 배양합니다. 이 알을 배양 접시에 모으고 여과지 조각으로 덮으십시오. 전체 배양 접시를 파라핀 필름으로 감싼다.
- 접시를 25°C에서 2일 동안 유지한 후 비교적 낮은 온도(13-16°C)에서 2일 더 보관합니다. 그런 다음 접시를 6°C 냉장고로 옮깁니다. 계란에 촉촉한 환경을 제공하기 위해 2주마다 물을 추가합니다(그림 5A).
참고: 배아는 30°C에서 5-6일 동안 발달한 후 카타트렙시스 단계에 있는 것으로 추측된다26. 그래디언트 냉각은 계란의 냉동 보존에 도움이 됩니다(표 5). - 냉동보존된 계란을 소생시키려면 냉장고에서 페트리 접시를 꺼내 25°C에서 2일 동안 보관하세요. 님프가 부화할 때까지 이 알을 30°C 인큐베이터에 넣습니다(그림 5B).
참고: 냉동보관계란을 25°C 인큐베이터로 옮기기 전에 30°C에 넣어야 합니다. 배아는 최소 5개월 동안 냉동보존할 수 있지만 냉동보존으로 인해 부화율과 폐고율이 감소할 수 있습니다(표 5).
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Representative Results
이 프로토콜에는 Cas9 단백질과 시험관 내에서 합성된 sgRNA로 구성된 RNP를 사용하여 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이를 생성하기 위한 자세한 단계가 포함되어 있습니다. 다음은 표적 선택, sgRNA 합성 및 검증(그림 1A), 난자 채취 및 주입, 돌연변이 스크리닝 및 계대배양, 냉동보존, 동형접합체 알의 소생술 등 메뚜기에서 CRISPR/Cas9 매개 표적 유전자 knockout의 대표적인 결과입니다.
이 연구에서는 세 가지 온라인 프로그램(E-CRISP, CRISPOR, ZiFit)의 결과에 따라 CRISPR/Cas9 시스템의 표적 부위를 선택하고 첫 번째 엑손에 위치합니다(그림 1B). 시험관 내 Cas9 절단 분석(표 1)에 따르면 CRISPR/Cas9 RNP는 약 55%의 절단 속도로 PCR 단편(표적 부위 포함)을 분해할 수 있습니다(그림 1C). 그런 다음 이 RNP를 표준 미세주입 시스템을 사용하여 단일 세포 단계에서 120개의 수정란에 미세주입했습니다(그림 2 및 그림 3). 배아 단계 돌연변이율 추정을 위한 시퀀싱 결과는 표적 부위에서 효율적인 게놈 편집을 제안했습니다(그림 4A). 또한, 이 연구는 52.73%의 님프 부화율을 가져왔고G0 성체의 66.7%가 모자이크 돌연변이체였습니다(표 4).
또한,G0 키메라를 야생형 메뚜기와 교배시켜 이형접합체 G1 개체를 얻고, 동일한 돌연변이를 갖는G1 이형접합체(TA-클로닝에 의해 스크리닝됨)를 교배하여G2 동물을 생성하였다. PCR 기반 표현형 분석을 사용하여 돌연변이체를 검출하고 얻은 동형접합체를 인크로스하여 안정적인 돌연변이 라인을 확립했습니다(그림 4B).
한편, 과잉 동형접합 난자는 동형접합체의 이용률을 향상시키기 위해 냉동보존되었습니다. 냉동보존된 알의 부화율은 냉동보존시간이 연장됨에 따라 감소했지만(표 5), 알을 젖은 상태로 유지하기 위해 여과지 조각을 적용하고 이러한 보존된 알을 온도 상승의 구배로 회수하는 등의 개선 조치는 모두 소생에 도움이 되었습니다(그림 5 및 표 5). 마지막으로, 돌연변이의 동형 접합 개체군은 후속 연구를 위해 성공적으로 유지되었습니다.
그림 1: 표적 설계 및 sgRNA의 시험관 내 검증. (A) 표적 선택, sgRNA 합성 및 생체 활성 검증을 위한 흐름도(메뚜기를 포함하되 이에 국한되지 않음). (B) 유전자 구조 및 표적 부위의 개략도. 이 표적 유전자의 엑손은 청색 도메인으로 표시하고, 표적 부위는 엑손 1에서 시작 코돈의 하류에서 선택하였다. 대상 시퀀스가 빨간색으로 강조 표시됩니다. (C) 시험관 내 Cas9 절단 분석의 아가로스 겔 전기영동 결과. 표적 염기서열(길이 약 400bp)을 포함하는 DNA 단편을 증폭하여 Cas9 분해를 위한 기질로 사용했습니다. 예상되는 작은 밴드(여기서는 약 100bp 및 300bp, 빨간색 삼각형으로 표시됨)는 합성된 sgRNA가 효과적인 Cas9 절단을 유도할 수 있음을 시사했습니다. 절단율은 그레이스케일 분석에 따라 약 55%였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 메뚜기 알을 위한 바늘 준비 및 미세주입 패드. (A) 메뚜기 알의 미세 주입을 위해 준비된 바늘의 끝. 스케일 바: 1mm. (B) 달걀(빨간색 삼각형으로 표시)이 배열된 미세주입 패드 사진. 눈금 막대는 1cm를 나타냅니다. (C) 미세 주입 패드의 크기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 계란 미세 주입. (A) 현미경(가운데)과 미세 주입기(왼쪽)에 연결된 미세 조작기(오른쪽)를 나타내는 빨간색 상자로 표시된 대표적인 미세주입 시스템. 컴퓨터는 데이터 저장 및 보조 관찰을 제공하는 데 사용됩니다. (B) 메뚜기 알의 주입. 주사 부위는 빨간색 삼각형으로 표시됩니다. (C) 현미경으로 부화한 님프. 눈금 막대는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: G0 동물의 염기서열 분석 결과 및 돌연변이 계통의 계대배양 전략 . (a) 전형적인 시퀀싱은G0 스크리닝을 초래한다. 표적 부위 근처의 여러 피크(야생형 서열에서 빨간색 직사각형으로 표시됨)는 테스트된 알/메뚜기가 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 성공적으로 편집되었음을 나타내는 반면(G 0-1 및 G0-2에 표시됨), 시퀀싱 결과에 변화가 없는 개체는 편집되지 않고 버려진 것으로 간주되었습니다(예: G0-3)을 참조한다. (B) 돌연변이 라인의 패시징 전략. G0 동물을 먼저 PCR-매개 유전자형 분석에 의해 스크리닝하고, 시퀀싱 결과에서 다중 피크를 갖는 동물을 야생형 메뚜기와 교배하여 G1 동물을 생성하였다. PCR-매개 유전자형 분석 및 TA 클로닝을 사용하여G1 이형접합체를 확인했습니다. 이어서, 동일한 돌연변이를 갖는 이형접합체를 인-크로스하여 추가 연구 및 계대시를 위한G2 동물(동형접합체 및 이형접합체)을 생성하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 계란 냉동 보존 및 소생술. (A) 냉동보존 절차: 달걀 꼬투리에서 달걀을 분리하고 멸균수로 세척한 후 30°C에서 5-6일 동안 배양합니다. 그런 다음 개발 된 계란을 페트리 접시에 모으고 축축한 여과지의 작은 조각으로 덮으십시오. 전체 페트리 접시를 파라핀 필름으로 감싸고 25°C에서 2일 동안 유지한 다음, 비교적 낮은 온도(예를 들어, 13-16°C)에서 2일 더 유지한다. 마지막으로 6°C에서 냉장 보관합니다. (B) 소생술 절차: 냉동보존계란이 담긴 페트리 접시를 냉장고에서 꺼내 여과지 조각을 제거한 후 25°C에서 2일간 보관한다. 그런 다음 애벌레가 부화할 때까지 30°C에서 후속 발달을 위해 알을 배양할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 부피 (μL) |
| Cas9 단백질(300ng/μL) | 1 |
| sgRNA(300ng/μL) | 1 |
| PCR 산물(200ng/μL) | 1 |
| 10×NE버퍼 r3.1 | 1 |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 6 |
표 1: 시험관 내 소화 시스템. 합성된 sgRNA의 생체 활성을 테스트하기 위해 정제된 표적 절편(PCR 산물) 200ng을 CRISPR/Cas9 시스템(각 성분 300ng)과 혼합했습니다. 상업용 완충액을 사용하고 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 총 부피를 10μL로 구성했습니다.
| 시약 | 부피 (μL) |
| 2xEs Taq 마스터믹스 | 12.5 |
| 포워드 프라이머 | 0.5 |
| 리버스 프라이머 | 0.5 |
| 템플릿(용해 제품) | 1 |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 10.5 |
표 2: 표적 유전자 단편 증폭을 위한 PCR 시스템. 표적 유전자의 게놈 단편을 증폭하기 위해 상업용 Taq 믹스를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 프라이머를 첨가했습니다. 용해 생성물 1 μL를 주형으로 사용하였고, 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 총 부피를 25 μL로 만들었다.
| 온도(°C) | 시간 | 사이클 |
| 95 | 5 분 | 1 |
| 95 | 30초 | 35 |
| 55 | 30초 | |
| 72 | 40초 | |
| 72 | 10 분 | 1 |
표 3: 표적 유전자 증폭을 위한 PCR 프로그램. 표적 유전자 증폭을 위한 PCR 프로그램은 다음과 같았다: 95°C에서 5분; 30초 동안 95°C, 30초 동안 55°C, 40초 동안 72°C의 35 사이클; 72°C에서 10분 동안
| 항목 | 데이터 |
| 주입된 계란의 수 | 120 |
| 테스트 된 배아 | 10 |
| 부화 한 님프의 수 | 58 |
| 부화율 | 52.73% |
| G0 성인 번호 | 12 |
| G0 돌연변이 수 | 8 |
| G0 성인의 돌연변이 효율 | 66.67% |
표 4: 편집 효율성 요약. 표적 유전자를 녹아웃시키기 위해 120개의 알을 주입하고 배아 단계에서 테스트를 위해 10개의 알을 채취했습니다. 나머지 배아에서 58 마리의 님프가 부화했습니다 (부화율은 52.73 %였습니다). 마지막으로, 12 G0 메뚜기는 성충 단계로 발달했고 그 중 8 마리는 대상 사이트에서 성공적으로 편집되었습니다. G0 성인의 돌연변이율은 66.67%였다.
| 대조군 | 그룹 1 | 그룹 2 | 그룹 3 | 그룹 4 | |
| 계란 수 | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| 보관을 위한 온도 처리 | 섭씨 30도 | 30°C(5-6일)→6°C | 30°C(5-6일)→25°C(2일)→13-16°C(2일)→6°C | 30°C(5-6일)→25°C(2일)→13-16°C(2일)→6°C | 30°C(5-6일)→25°C(2일)→13-16°C(2일)→6°C |
| 보관 시간 | 14 일 | 14 일 | 1개월 | 3 개월 | 5 개월 |
| 소생술을위한 온도 치료 | 섭씨 30도 | 6°C→30°C | 6°C→25°C(2일)→30°C | 6°C→25°C(2일)→30°C | 6°C→25°C(2일)→30°C |
| 부화한 메뚜기의 수 | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| 부화율 | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| 성인 메뚜기 수 | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Eclosion 비율 | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
표 5: 계란의 냉동보존 및 소생술 요약. 600개의 난자를 냉동보존 및 소생술 연구를 위해 5개 그룹으로 나누었습니다. 120 알의 첫 번째 그룹(대조군)은 항상 30°C에서 배양하고 14일 동안 보관했습니다. 120마리의 알의 제2군(Group 1)을 30°C에서 5-6일 동안 배양한 후 냉장고로 옮겨 6°C에서 14일 동안 보관하였다. 이어서, 이들 알을 소생술을 위해 30°C로 옮겼다. 다른 그룹(그룹 2, 그룹 3 및 그룹 4, 각 그룹에는 120개의 난자가 포함됨)은 프로토콜(단계 6.1-6.3)에 설명된 대로 다른 보관 시간(그룹 2의 경우 1개월, 그룹 3의 경우 3개월, 그룹 4의 경우 5개월). 마침내 108마리의 애벌레가 대조군에서 부화했고(부화율 90%), 그 중 81마리가 성충 단계(폐루율의 75%)로 발달했습니다. 두 번째 그룹(그룹 1)에서는 메뚜기가 부화하지 않았습니다. 다른 그룹의 부화율과 폐루율은 대조군에 비해 낮았고 저장 시간에 따라 감소했습니다. 96 마리의 님프가 2 군에서 부화했고 그 중 60 마리가 성충으로 발전했습니다. 86 마리의 님프가 그룹 3에서 부화했고 그 중 46 마리가 성충으로 발전했습니다. 그룹 4에서는 78 마리의 님프가 부화했고 그 중 31 마리가 성충으로 발전했습니다.
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Discussion
메뚜기는 인류 문명 이래 농업에 가장 치명적인 해충 중 하나였습니다23. CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 기술은 메뚜기의 생물학적 메커니즘에 대한 더 나은 지식과 유망한 해충 방제 전략을 제공하는 강력한 도구입니다. 따라서 동형접합체 메뚜기 돌연변이체의 CRISPR/Cas9 매개 구조의 효율적이고 사용하기 쉬운 방법을 개발하는 것은 큰 이점이 있습니다. 메뚜기18,20,21,22의 게놈 편집을 위한 몇 가지 훌륭한 작업이 보고되고 몇 가지 기본 워크플로를 제공했지만 전체 절차의 체계적인 최적화는 여전히 부족합니다. 일반적으로 CRISPR/Cas9 시스템의 배아 주입에 의해 생성된 동형접합 로커스트 돌연변이는 a) sgRNA 설계, 합성 및 in vitro, b) 난자 채취, 준비 및 주입의 세 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다. 및 c) 돌연변이 스크리닝 및 동형접합체 유지. 이 프로토콜은 최적화된 워크플로우를 제공하며, 표적 부위 선택, 시험관 내 sgRNA 스크리닝, 계란의 미세주입 및 돌연변이 검출 단계는 CRISPR/Cas9 시스템으로 동형접합 돌연변이 메뚜기를 효과적으로 생성하는 데 특히 중요합니다.
첫째, 표적 부위, 해당 sgRNA의 형태 및 sgRNA의 농도가 곤충의 게놈 편집 효율의 중요한 요소로 제안되었습니다18,27,28. 이 문제를 해결하려면 먼저 유전자 구조를 분석하고 온라인 리소스를 사용하여 엑손 1 또는 시작 코돈 근처에 둘 이상의 표적 부위를 설계하는 것이 좋습니다. 그런 다음 in vitro에서 sgRNA를 합성하고 Cas9 단백질과 다양한 농도로 혼합하여 RNP의 절단 효율을 최적화합니다. 이 절차는 높은 생체 활성을 가진 sgRNA를 확인하고 후보 표적 유전자에 대한 RNP 복합체의 구성을 최적화하는 데 도움이 될 것입니다.
둘째, 제한된 시간 내에 가능한 한 많은 신선한 난자를 수집하고 부화율과 돌연변이율을 개선하는 것도 게놈 편집 작업의 큰 과제입니다. 16 (밝음) : 8 (어두운) 광주기의 조건에서 사육 된 사교적 인 성인 메뚜기는 오전 9 : 00-11 : 00 동안 짧은 기간에 충분한 알을 모으는 데 사용됩니다. 꼬투리에서 계란을 조심스럽게 분리하기 위해 페인트 브러시 또는 핀셋을 사용하여 계란 사이에 부드럽게 아래쪽 압력을 가하는 것이 중요합니다. 충분한 연습을 통해 여러 사용자가 포드에서 개별 달걀을 안정적으로 분리 할 수 있습니다. 각 계란을 분리하고 멸균수로 세척한 후 계란을 설계된 주입 패드(그림 2B, C)에 정렬하여 미세주입 중에 계란을 안정화합니다. 난자에 마이크로파일 근처에 최적화된 RNP를 주입합니다. 기계적 손상을 제한하고 달걀의 오염을 최소화하기 위해, 신선한 달걀을 꼬투리에 약 30분 동안 두어 달걀 껍질 태닝이 미세주입에 이상적인지 확인한다21, 응축된 구조와 충분한 태닝 후 침입에 대한 높은 방어 능력29,30. 한편, 발표된 보고서에 따르면 메뚜기 알의 세포융합 분열(31)은 산란 후 0시간에서 4시간 사이의 어느 시점에서 발생합니다. 현재 표준 미세주입 프로토콜을 사용하면 40분 이내에 약 100개의 알을 주입할 수 있습니다. 종합하면, 100 개의 수정란을 태닝하고 미세 주입하는 절차는 2 시간 이내에 완료 될 수 있습니다. 따라서 주입된 알과 미래의 성체 메뚜기에서 효율적인 돌연변이를 달성하기 위해 CRISRP/Cas9 매개 절단 및 표적 유전자 복구를 위해 최소 2시간이 남아 있습니다.
마지막으로, 계대배양 및 돌연변이 식별을 위한 효과적인 전략은 대부분의 돌연변이 동물에서 동형접합체를 생성하는 데 중요합니다. 메뚜기에서, 편집 후 치명적이지 않은 유전자에 대해, 여기에서 제안된 교차 전략은G0 돌연변이가 광형메뚜기와 교차하고, 다음 세대에서 동형접합체 돌연변이를 생성하기 위해 동일한 돌연변이를 갖는G1 이형접합체를 사용하여 추가 인-크로스를 수행할 수 있다는 것이다. 돌연변이 유전 과정에서 각 메뚜기의 돌연변이를 확인하려면 PCR 기반 유전형 분석을 위한 주형으로 안테나의 짧은 부분을 소화하기 위해 알칼리 용해 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 개체군을 확장하기 위해 더 많은 인크로스를 위해 얻은 동형접합 성인을 사용합니다. 동형접합 메뚜기 사이의 개체군 크기와 발달 단계 차이에 의해 제한되며, 초과 알은 6°C에서 냉동 보존하고 기울기 온도 상승에 의한 소생을 권장하며(그림 5), 이는 철새 메뚜기 알의 저온 휴면 및 고온 휴면 방출 원리를 기반으로 합니다32,33.
요컨대, CRISPR/Cas9 시스템은 철새 메뚜기의 기능적 유전체학 연구를 용이하게 하는 신뢰할 수 있는 도구임이 입증되었습니다. 이 상세한 프로토콜은 철새 메뚜기 및 다른 곤충에서 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 응용 분야에 대한 참조로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32070502, 31601697, 32072419과 중국 박사후 과학 재단 (2020M672205)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
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