Summary
מוצג פרוטוקול לעיבוד שבלול גרביל צעיר ומזדקן על ידי סימון חיסוני של המבנים הסינפטיים ותאי השערה האפרנטיים, מרווה אוטופלואורסצנטיות ברקמה מזדקנת, ניתוח והערכת אורך השבלול, וכימות הסינפסות בערימות תמונה המתקבלות בהדמיה קונפוקלית.
Abstract
ההנחה היא שאובדן הסינפסות של הסרט המחברות בין תאי שערה פנימיים לסיבי עצב שמיעתיים עזים הוא אחד הגורמים לאובדן שמיעה הקשור לגיל. השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי אובדן של סינפסות סרט היא סימון חיסוני מכיוון שהיא מאפשרת דגימה כמותית מכמה מקומות טונוטופיים בשבב בודד. עם זאת, המבנים המעניינים קבורים עמוק בתוך השבלול הגרמי. גרבילים משמשים כמודל לבעלי חיים לליקוי שמיעה הקשור לגיל. כאן מתוארים פרוטוקולים שגרתיים לקיבוע, אימונו-לבלים של שבלול גרביל, הדמיה קונפוקלית וכימות מספרים ונפחים של סינפסות של סרט. יתר על כן, האתגרים המסוימים הקשורים להשגת חומר טוב מאנשים מזדקנים בעלי ערך מודגשים.
גרבילים מורדמים מורדמים ומופרעים קרדיווסקולרית, או שהבולות הטימפניות שלהם מנותחות בקפידה מתוך הגולגולת. השבלול נפתחים בקצה ובבסיס ומועברים ישירות לקיבוע. ללא קשר לשיטה הראשונית, השבלולים הם postfixed ולאחר מכן decalcified. לאחר מכן, הרקמה מסומנת בנוגדנים ראשוניים נגד מבנים ותאי שיער טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. לאחר מכן, השבלולים מודגרים עם נוגדנים משניים המתויגים פלואורסצנטית שהם ספציפיים כנגד אלה העיקריים שלהם. השבלול של גרבילים מזדקנים מטופלים לאחר מכן באמצעות קוונצ'ר אוטופלואורסצנטי כדי להפחית את הפלואורסצנציה המשמעותית בדרך כלל ברקע של רקמות של בעלי חיים מבוגרים.
לבסוף, שבלול מנותחים לתוך 6-11 קטעים. כל אורך השבלול משוחזר כך שניתן לקבוע באופן מהימן מיקומים ספציפיים של שבלול בין פרטים. ערימות תמונות קונפוקליות, שנרכשו ברצף, מסייעות לדמיין תאי שיער וסינפסות במיקומים שנבחרו. ערימות הקונפוקלים מתפרקות, והסינפסות נספרות באופן ידני באמצעות ImageJ, או שכימות נרחב יותר של מבנים סינפטיים מתבצע עם הליכי ניתוח תמונה שנכתבו בהתאמה אישית ב- Matlab.
Introduction
ליקוי שמיעה הקשור לגיל הוא אחת המחלות הנפוצות ביותר בעולם המשפיעה על יותר משליש מאוכלוסיית העולם בגילאי 65 ומעלה1. הסיבות הבסיסיות עדיין נמצאות בוויכוח ונחקרות באופן פעיל, אך עשויות לכלול את אובדן הסינפסות המיוחדות המחברות תאי שערה פנימיים (IHCs) עם סיבי עצב שמיעתיים2. סינפסות סרט אלה מורכבות ממבנה קדם-סינפטי שיש בו שלפוחיות מלאות במוליך העצבי גלוטמט הקשור אליו, כמו גם קולטני גלוטמט α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית (AMPA) קולטני גלוטמט 3,4,5. בגרביל, כ-20 סיבי עצב שמיעתיים אפרנטיים יוצרים קשר עם IHC אחד 6,7,8. הסיבים ב-IHC הפונים אל המודיולוס מנוגדים לסרטים סינפטיים גדולים, בעוד שהסיבים המתחברים בצד העמוד של ה-IHC מפנים סרטים סינפטיים קטנים (כלומר, בחתולים9, גרבילים7, שרקנים10 ועכברים 3,11,12,13,14). יתר על כן, בגרביל, גודלם של הסרטים הקדם-סינפטיים וכתמי הגלוטמט הפוסט-סינפטיים מתואמים באופן חיובי 7,14. סיבים המתנגדים לסרטים גדולים בצד המודילרי של ה-IHC הם קטנים בקליבר ובעלי קצבים ספונטניים נמוכים וסף גבוה15. ישנן עדויות לכך שסיבים בעלי קצב ספונטני נמוך פגיעים יותר לחשיפה לרעש10 ולתרופות אוטוטוקסיות16 מאשר לסיבים בעלי סף נמוך ספונטני גבוה, הממוקמים בצד העמוד של מעגלים משולבים15.
אובדן הסינפסות של הסרט הוא האירוע הניווני המוקדם ביותר בליקוי שמיעה הקשור לגיל העצבי של השבלול, בעוד שאובדן תאי הגנגליון הספירליים וסיבי עצב השמיעה שלהם מפגרים אחרי17,18. קורלציות אלקטרופיזיולוגיות כוללות הקלטות של תגובות גזע המוח השמיעתי17 ופוטנציאלי פעולה מורכבים8; עם זאת, אלה אינם משקפים את הדקויות של אובדן סינפסה, שכן סיבי קצב ספונטני נמוך אינם תורמים לאמצעים אלה16. מדדים אלקטרופיזיולוגיים מבטיחים יותר הם האינדקס העצבי הנגזר מפוטנציאל המסה19 ותגובת הזמן של הפריסטימולוס20. עם זאת, אלה אמינים רק אם לבעל החיים אין פתולוגיות שבלול אחרות, מעבר לאובדן סיבי עצב שמיעתיים, המשפיעות על פעילותם של סיבי העצב השמיעתיים הנותרים8. יתר על כן, ערכי סף שהוערכו התנהגותית בגרביל לא היו מתואמים עם מספרי סינפסה21. לכן, כימות אמין של סינפסות הסרט ששרדו, ולכן, מספר סיבי העצב השמיעתיים התפקודיים אפשרי רק על ידי בדיקה ישירה של רקמת השבלול.
הגרביל המונגולי (Meriones unguiculatus) הוא מודל חייתי מתאים לחקר ליקוי שמיעה הקשור לגיל. יש לו תוחלת חיים קצרה, יש לו שמיעה בתדירות נמוכה הדומה לבני אדם, הוא קל לתחזוקה, ומראה קווי דמיון לפתולוגיות אנושיות הקשורות לליקוי שמיעה הקשור לגיל 2,22,23,24. גרבילים נחשבים לגיל מבוגר כאשר הם מגיעים לגיל 36 חודשים, שהוא לקראת סוף אורך החיים הממוצע שלהם22. חשוב לציין, אובדן תלוי גיל של סינפסות סרט הודגם בגרבילים שגדלו והתיישנו בסביבות שקטות 8,21.
כאן מוצג פרוטוקול לתבל, לנתח ולנתח שבלול מהגרבילים בגילאים שונים, ממבוגרים צעירים ועד זקנים. נוגדנים המכוונים נגד רכיבים של presynapse (CtBP2), מדבקות קולטן גלוטמט פוסט-סינפטי (GluA2) ו- IHCs (myoVIIa) משמשים. מופעל קוונצ'ר אוטופלואורסצנטי המפחית את הרקע בשבבייה מזדקנת ומשאיר את האות הפלואורסצנטי ללא פגע. יתר על כן, ניתן תיאור של כיצד לנתח את השבלול כדי לבחון הן את האפיתל החושי והן את stria vascularis. אורך השבלול נמדד כדי לאפשר בחירה של מיקומי שבלול מובחנים המתאימים לתדרים הטובים ביותר הספציפיים25. כימות של מספרי סינפסה מתבצע עם התוכנה הזמינה באופן חופשי ImageJ26. כימות נוסף של נפחי סינפסה ומיקומים בתוך HC הבודד מבוצע עם תוכנה מותאמת אישית שנכתבה ב- Matlab. תוכנה זו אינה זמינה לציבור, מכיוון שלמחברים חסרים המשאבים לספק תיעוד ותמיכה מקצועיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים והנהלים אושרו על ידי הרשויות הרלוונטיות של סקסוניה התחתונה, גרמניה, עם מספרי היתר AZ 33.19-42502-04-15/1828 ו- 33.19-42502-04-15/1990. פרוטוקול זה הוא עבור גרבילים מונגולים (M. unguiculatus) משני המינים. מבוגר צעיר מתייחס לגיל של 3-12 חודשים, בעוד גרבילים נחשבים בגיל 36 חודשים ומעלה. כאשר לא צוין אחרת, ניתן להכין מאגרים ופתרונות ולאחסן במקרר עד מספר חודשים (4-8 מעלות צלזיוס). לפני השימוש, ודא שהמאגרים והפתרונות לא זירזו.
1. קיבוע ואיסוף איברים
הערה: אם יש צורך רק בשבב, מומלץ לבצע את ההליך הפשוט יותר של קיבוע על ידי טבילה. עם זאת, אם יש צורך גם במוח שהשתמר היטב, אז זלוף טרנסקרדיאלי הוא האפשרות היחידה. המקבע בשני המקרים הוא 4% פרפורמלדהיד (PFA) במי מלח עם מאגר פוספט (PBS). זה צריך להיות טרי, אבל ניתן לאחסן קפוא עד השימוש. השתמש באליקוטים של ~ 300 מ"ל עבור פרפוזיה טרנסקרדיאלית או ~ 50-100 מ"ל לכל שבלול לקיבוע על ידי טבילה.
אזהרה: PFA הוא חומר מסוכן; לטפל בו על פי נהלי בטיחות המעבדה הכלליים.
- קיבוע על ידי פרפוזיה טרנסקרדיאלית
- יש לשטוף את מערך הזלוף עד שהצינורות נקיים מבועות אוויר. מלאו את צינורות הזלוף ב-PBS המכילים הפרין (0.2 מ"ל ב-100 מ"ל של PBS) כדי למנוע קרישת דם. עצרו את הזרימה ברגע שהצינורות מתמלאים ב-PBS ובקבוק אחסון הנוזלים התרוקן זה עתה; לשפוך 200 מ"ל של PFA מופשר לתוכו.
הערה: ההתקנה מוכנה כעת עבור החיה. ה- PBS הנותר בצינורות מספיק כדי לשטוף את הדם, ובאופן אוטומטי ילווה בקיבוע ברגע שהזרימה תחודש. - ודא שמערכת איסוף פסולת קיימת ליציאה של PFA. השתמשו בצינורית טרייה (19 גרם) והכילו מספריים גדולים, מלקחיים (עם קצה שטוח), המוסטאטים, אזמל או צינורית חדה, ומשטח גומי עם סיכות בהישג יד.
- המתת חסד את הגרביל עם מנת יתר תוך-צפקית של פנטוברביטל (160 מ"ג/מ"ל, 0.3 מ"ל לכל חיה, טווח משקל גוף: 50-120 גרם). החזירו את החיה לכלוב שלה. כאשר עצירה נשימתית מתרחשת כך שהנשימה הופכת ללא סדירה עם מרווחים של 30 שניות או יותר, מניחים את הגרביל על גבו על גבו על משטח הגומי ומקבעים את שתי כפות הרגליים הקדמיות ואת כף אחורית אחת עם סיכות (השאירו כף אחורית אחת פנויה לתנועה לשיפוט טוב יותר של הצלחת הזלוף; ראו הערה אחרי שלב 1.1.7).
- כדי לפתוח את חלל בית החזה, הרימו את העור מעל עצם החזה עם מלקחיים וחתכו את העור כ-0.5 ס"מ מתחת לעצם החזה עם מספריים עד שהתהליכה בצבע לבן xiphoideus נראית לעין. החזיקו את עצם החזה ב-processus xiphoideus עם מלקחיים וחתכו לאורך הסרעפת כדי לקבל מבט טוב לתוך חלל בית החזה. חותכים את הצלעות לרוחב משני הצדדים עד שיש גישה טובה ללב. ודא כי זווית המספריים היא מקבילה ושטוחה ביחס לגוף הגרביל כדי למנוע נזק לאיברים, ובכך להבטיח מערכת דם סגורה.
- מהדקים המוסטאט על עצם החזה, מרימים את הצלעות ומניחים את ההמוטט מעל כתף הגרביל מבלי להניח את ההמוטט על חלקי גוף כלשהם כדי למנוע חסימת זרימת הדם.
- פתח מעט את זרימת הנוזל עד שטיפה אחת של PBS זורמת מתוך הצינורית (19 G) בערך כל 2 שניות. להחזיק את הלב עם מלקחיים ולסובב אותו קצת שמאלה כך החדר השמאלי ניתן לראות בבירור. הכנס את הצינורית לחדר השמאלי בזווית שנמנעת מחדירה למחיצה. החזיקו את המחט במקומה ביד או עם המוסטאט אחר.
הערה: ניתן להבדיל בין החדרים השמאליים והימניים על ידי גווני הצבעים השונים שלהם; החדר השמאלי נראה בהיר יותר בצבעו משאר רקמת הלב. - לאט לאט להגביר את הלחץ של זרימת הנוזל ולפתוח את האטריום הימני או עם מספריים עדינים, אזמל, או צינורית אחרת. פתחו את זרימת הנוזלים עוד יותר עד שנצפו כ-2-3 טיפות/שנייה בתא הטפטוף, או קבעו זרימה של 4 מ"ל/דקה עבור המשאבה. ברגע שהקיבעון של הלב נכנס פנימה, ודא כי צינורית הזלוף נשארת במקומה מבלי להיות מוחזקת עוד.
הערה: סימנים של זלוף מוצלח הם התכווצויות שרירים איטיות, התקשות של הצוואר והגפיים, הכבד הולך חיוור, וריאות ורודות. הסימן של זלוף לא מוצלח הוא הלבנה של הריאות, אשר מציין כי זרימת הדם הריאתית הוא perfused עקב ניקוב של המחיצה. - במקרה של זלוף לא מוצלח, נסו להזיז את הצינורית למעלה למעלה, לתוך אבי העורקים, ומהדקים אותה במקומה עם המוסטאט.
- עריפת הגרביל. מוציאים את הבולה וחותכים ומפרקים את העצם כפי שמתואר בשלב 1.2.2.
הערה: אם הרקמה אינה קבועה מספיק, האפיתל החושי יתנתק מהאיבר של קורטי במהלך הנתיחה. - אם הזלוף לא מראה סימנים של קיבוע תוך 5-10 דקות, בטל אותו ומיד בצע את ההליך שלהלן לקיבוע על ידי טבילה. לשם כך, התייחסו לשבבייה כמו בשלב 1.2.2 והניחו את הרקמה בכ-50-80 מ"ל של 4% PFA במיכלי מכסה בורג למשך 1-2 ימים על שייקר דו-ממדי ב-8 מעלות צלזיוס.
הערה: מכיוון שזה יכול להיות קשה בסופו של דבר לדרג את איכות הקיבוע במהלך זלוף, מומלץ לפרסם באופן שגרתי את השבלול כמתואר.
- יש לשטוף את מערך הזלוף עד שהצינורות נקיים מבועות אוויר. מלאו את צינורות הזלוף ב-PBS המכילים הפרין (0.2 מ"ל ב-100 מ"ל של PBS) כדי למנוע קרישת דם. עצרו את הזרימה ברגע שהצינורות מתמלאים ב-PBS ובקבוק אחסון הנוזלים התרוקן זה עתה; לשפוך 200 מ"ל של PFA מופשר לתוכו.
- קיבוע על ידי טבילת רקמות
- המתת חסד את הגרבילים עם מנת יתר תוך-צפקית של פנטוברביטל (160 מ"ג/מ"ל, 0.3 מ"ל לכל חיה, טווח משקל גוף: 50-120 גרם). כאשר הגרביל הפסיק לנשום, ערפו את החיה.
- מוציאים את הבולה וחותכים ומפרקים את עצם העצם שלה עם מספריים ומלקחיים, בהתאמה, כדי להגיע לשבבלול. הסר את התעלות המלוס, האינקוס והחצי-עגולות. צור חורים קטנים בנקודת השיא ובפנייה הבסיסית על ידי גירוד זהיר מעל עצם השבלול עם מלקחיים. מעבירים מיד את הבולה לעודף של קיבוע קר (לפחות 50 מ"ל) ומקבעים את הרקמה בקור (4-8 מעלות צלזיוס) תחת תסיסה עדינה (2D-shaker [100 סל"ד]) למשך יומיים.
הערה: לאחר תיקון הרקמה, השבלול יכול להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסן ב- PBS עם 0.05% נתרן אזיד. אזהרה: נתרן אזיד הוא רעיל. שימו לב שאורך האחסון עלול להשפיע לרעה על איכות הכתם. ניסויים מוגבלים הצביעו על כך שהחיסון נראה חלש יותר לאחר שנתיים של אחסון הרקמה בנתרן אזיד.
2. הכנת רקמות ותיוג חיסוני
- ממיסים אבקת חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) ב-PBS כדי לייצר תמיסה של 0.5 M ב-pH 8. לשם כך, מניחים על מערבל מגנטי, ממלאים אותה בכמחצית מהכמות הכוללת של ה-PBS, ומוסיפים את הכמות המתאימה של אבקת EDTA, וכתוצאה מכך תרחיף חומצי. יש להוסיף בזהירות תמיסת נתרן הידרוקסיד מרוכזת (NaOH) תוך ניטור ה-pH באמצעות מד pH. מלאו ב-PBS לנפח הסופי הרצוי וסננו את התמיסה כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי.
הערה: אבקת ה-EDTA תתמוסס לחלוטין רק לאחר שהמתלים יגיעו לערך pH נייטרלי. - עבור decalcification, להעביר את השבלול ל 80 מ"ל של 0.5 M EDTA ב PBS. הדגירה של הרקמה בקור (4-8 מעלות צלזיוס) תחת תסיסה עדינה על ה-2D-shaker (100 סל"ד) למשך יומיים.
הערה: לאחר שלב ההפחתה, ניתן לאחסן את הרקמה ב- PBS למשך מספר ימים עד 3 שבועות לפני שתמשיך עם שלבי העיבוד הנותרים. עבור נוגדנים המסמנים את ה-stria vascularis, מומלץ לחתוך את השבלול לשניים לאורך ציר ה-modiolar בנקודה זו (כלומר, לפני החיסון) כדי להבטיח גישה אחידה של נוגדנים למטרותיהם בהתאמה. זה תלוי בנוגדנים ואינו חל על הנוגדנים המשמשים כאן לסימון מבנים סינפטיים ו- IHCs. השתמש בפיסת סכין גילוח ניתנת לשבירה ובמחזיק להב (כמתואר בשלב 4.2) לחיתוך. - בצע את השלבים הבאים (עד שלב 3.2) בצינורות תגובת איטום בטוח של 2 מ"ל. אם חתיכת הרקמה גדולה מכדי להתאים לתוך הצינור, יש לקצץ את הרקמה העודפת במספריים. כדי לשפר את חדירת הנוגדנים, תחילה חלחלו לרקמה ב-1 מ"ל של 1% טריטון (Triton X-100) ב-PBS על ה-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. שטפו את הרקמה פי 3 עם 1 מ"ל של 0.2% טריטון (טריטון X-100) ב-PBS על ה-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כל אחד.
- כדי לחסום אנטיגנים לא ספציפיים, דגירו את השבלול ב-1 מ"ל של תמיסת חסימה (3% אלבומין בסרום בקר [BSA], 0.2% טריטון, ב-PBS) על ה-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
הערה: ניתן להכין את פתרון החסימה מראש, אך לא אמור להיות ארוך מ- ~ 10 ימים. - דיללו את הנוגדנים הראשוניים הבאים טריים באותו אליקוט של תמיסת חסימה: אנטי-מיו-ויו-יה (מיוזין VIIa) כדי לתייג IHCs (ארנב פוליקלונלי IgG), מדולל 1:400; אנטי-CtBP2 (חלבון קשירת מסוף C 2) לסימון סרטים קדם-סינפטיים (עכבר חד-שבטי IgG1), מדולל 1:400; ואנטי-GluA2 כדי לתייג מדבקות קולטן פוסט-סינפטיות (IgG2a עכבר חד שבטי), מדולל 1:200. וודאו כי השבלול מכוסה באופן מלא בתמיסת הנוגדנים (בדרך כלל 0.4 מ"ל) ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- לאחר מכן, שטפו את הרקמה פי 5 עם 0.2% טריטון ב-PBS ב-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כל אחד. בחר נוגדנים משניים שיתאימו למינים המארחים של עמיתיהם העיקריים ושוב דיללו אותם ב-3% BSA, 0.2% טריטון, ב-PBS: עז נגד עכברים (IgG1)-אלקסה פלואורופור (AF) 488, מדולל 1:1,000; עז נגד עכבר (IgG2a)-AF568, מדולל 1:500; וחמור נגד ארנב-AF647 (IgG), מדולל 1:1,000. עוטפים את הצינור בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה של הפלואורסצנציה. דגירה של השבלול ב-0.4 מ"ל של תמיסת נוגדנים משניים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
הערה: ניסויים מוגבלים הצביעו על כך שדגירה של רקמת שבלול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עם נוגדנים ראשוניים ומשניים הביאה לשמירה חיסונית בהירה יותר מאשר בעקבות הליך הדגירה הנפוץ יותר עם טמפרטורות נמוכות יותר ומשכי זמן קצרים יותר. - שטפו את השבלול 2x עם 1 מ"ל של 0.2% טריטון ב-PBS למשך 5 דקות כל אחד ו-3x עם PBS למשך 5 דקות כל אחד ב-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
הערה: לאחר שלבי כביסה אלה, השבלול יכול להישאר ב- PBS במקרר בטמפרטורה של כ -4 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים.
3. טיפול בקוונצ'ר אוטופלואורסצנטי (אופציונלי)
הערה: שבלולים מהגרבילים בגיל העמידה ובגיל העמידה מראים הצטברות אוטו-פלואורסצנטית נרחבת ברקע. ברקמות בוגרות צעירות, אין צורך בטיפול בקוונצ'ר אוטופלואורסצנטי. ניתן, באופן עקרוני, ליישם את הקוונצ'ר האוטו-פלואורסצנטי לפני הליך השמירה החיסונית, אשר לאחר מכן מונע כל הפחתה בשוגג של הפלואורסצנציה הרצויה של הנוגדן. עם זאת, על פי גיליון הנתונים של היצרן, השימוש בדטרגנטים (כגון Triton X-100 בפרוטוקול הנוכחי) אינו אפשרי עוד מכיוון שהם מסירים את הקוונצ'ר מהרקמה.
- חותכים את השבלול לשניים מתחת לסטריאומיקרוסקופ, כמתואר בשלב 4.2.
- מערבבים את ה-autofluorescence quencher עם 70% אתנול כדי לקבל תמיסה של 5% ומדגרים את השבלול בתמיסה זו על השייקר הדו-ממדי בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. יש לשטוף את השבלול 3x עם 1 מ"ל של PBS על ה-2D-shaker בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כל אחד.
אזהרה: ה-autofluorescence quencher הוא מסוכן ומזיק. ללבוש כפפות בעת טיפול בחומר זה.
4. דיסקציה עדינה סופית
- לנתח את השבלול תחת סטריאומיקרוסקופ. ממלאים צלחת פטרי פוליסטירול ומכסה שלה ב-PBS ושומרים בהישג יד על שני מלקחיים עדינים, מספריים קפיציים של Vannas, מחזיק להב ומכוז גילוח שבירה. לשבור חתיכות מן סכין הגילוח כדי לקבל משטח חיתוך של ~ 2-4 מ"מ בהתאם לשלב הנתיחה. הכינו שקופית מיקרוסקופ על ידי הצבת שלוש טיפות של מדיום הרכבה ברצף.
הערה: משטח החיתוך של סכין הגילוח מתפוגג במהירות. יש להחליף את הלהב לאחר ניתוח הרכבה והרכבה של בערך כל חתיכה שנייה של השבלול. - אם עדיין לא נעשה בשלב 3.1, תחילה חתכו את השבלול לשניים לאורך המודיולוס תחת סטריאומיקרוסקופ. לשם כך, מקם חתיכה של סכין גילוח ארוכה יותר מהאורך המפותל של השבלול לתוך מחזיק להב. מניחים את השבלול בצלחת פטרי וחותכים את עודפי הרקמה עם פיסת סכין הגילוח. החזיקו את השבלול במקומו עם מלקחיים עדינים וחתכו לשניים לאורך המודיולוס.
- התחילו עם מחצית אחת, אבל השאירו גם את החצי השני בצלחת פטרי. בזהירות לקבע את חצי השבלול עם מלקחיים כך שקצה החנית פונה כלפי מעלה. השתמש במספריים קפיציים עדינים כדי לחתוך את עצם השבלול מעל ההליקוטרמה, המכסה את הפסגה.
- כדי להתחיל את ההפרדה של חתיכות שבלול, לבודד את הפנייה האמצעית על ידי חיתוך עם מספריים דרך modiolus ו עצב השמיעה, מעל (scala vestibuli) ומתחת (scala tympani).
- חותכים דרך עצם השבלול המכסה את הסטריה וסקולריס בתוך צינור השבלול. בצעו שני חתכים משני צידי עצם השבלול מעל איברו של קורטי ולאורך הסטריה וסקולריס והשתמשו בסכין הגילוח כדי להפריד בסופו של דבר את חלקי השבלול.
הערה: הסטריה וסקולריס נראית בקלות כפס כהה. חיתוך לאורך stria vascularis משאיר את האיבר של קורטי שלם. - אופציונלי: כדי לאסוף את stria vascularis, לחתוך בזהירות בין האיבר של קורטי לבין stria vascularis כדי להפריד בין השניים. השאירו את הסטריה וסקולריס מחוברת לרצועה הספירלית (המחוברת לעצם המכסה את המשטח החיצוני של השבלול) והסירו את העצם הדקולרית באמצעות מלקחיים. מניחים את היצירה עם הצד הסטריאלי למעלה על שקופית המיקרוסקופ בטיפה של מדיום הרכבה.
הערה: אם היצירה שנאספה מעוקלת חזק מדי, ייתכן שיהיה צורך לחלק אותה לחתיכות קטנות יותר כדי שהיא תהיה שטוחה מספיק להרכבה על המגלשה. - מעבירים את חלקי השבלול למכסה מלא PBS של צלחת הפוליסטירול פטרי, ומבטיחים כי תושבות השבלול השלמות נמצאות שטוחות ככל האפשר על המגלשה. הסר רקמות עודפות, כגון חלקים של הרצועה הספירלית בצד האבניורלי וחלקים של הלימבוס הספירלי בצד העצבי. בזהירות להסיר את קרום tectorial עם מלקחיים עדינים במיוחד.
- מניחים את חלקי השבלול על המגלשה לתוך טיפה של מדיום הרכבה. הניחו את התושבות השלמות של השבלול כאשר האיבר של קורטי פונה כלפי מעלה על המגלשה כדי למנוע טשטוש של מעגלים משולבים בנתיב האופטי להדמיה. חפשו את האינווגינציה של הלימבוס הספירלי בסמיכות ל-IHCs, הנראית לעין על ידי הסטת החלק השבלולי לתוך המישור הסגיטלי כדי לזהות את הצד לפנים כלפי מעלה.
הערה: כדי לשחזר באופן דיגיטלי את השבלול השלם מהחלקים הבודדים שלו במהלך עיבוד נוסף, מומלץ מאוד לתעד רישומים של היצירות ולציין ציוני דרך. יתר על כן, החלקים צריכים להיות מסודרים באופן אידיאלי בסדר הנכון על השקופית. - חזור על שלבים 4.3 עד 4.8 עד שכל השבלול מועבר לשקופית המיקרוסקופ. במידת הצורך, יש להוסיף עוד מדיום הרכבה, לכסות את המגלשה ולאטום את הכיסוי במקומו עם לק שחור הצבוע סביב הקצוות. תן לו להתייבש בחושך בטמפרטורת החדר ולאחר מכן אחסן את המגלשה בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: גם אם חלקים מהאפיתל החושי עצמו הולכים לאיבוד בטעות, חשוב בכל זאת להרכיב את מה שנותר מחתיכת השבלול לצורך הערכת אורך נכונה.
5. מדידת אורך שבלול
- מדוד את אורך השבלול מתמונות שדה בהיר של חלקיו באמצעות מערכת מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטית ותוכנה נלווית. חסוך תמונות בהגדלה נמוכה (עדשת 4x) מכל פיסת שבלול והשתמש בכלי מדידת הלאסו של תוכנת המיקרוסקופ כדי לצייר קו לאורך שורת המעגלים המשולבים בכל אחת מהתמונות. חשב את האורך הכולל על-ידי הוספת האורכים של כל החלקים.
הערה: כאשר חלקים של האפיתל החושי חסרים בתוך חתיכת שבלול, לבצע אינטרפולציה של הקו. - כדי להגדיר את מיקומי השבלול שיש לנתח בשבלול בודד, חישבו את המרחקים המקבילים שלהם מהפסגה באמצעות המשוואה שניתנה על ידי מולר25. סמן את המיקומים האלה, למשל, על תדפיס של חתיכות השבלול.
6. רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי
- השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של טבילת שמן 40x (מפתח צמצם מספרי 1.3) והשמן המתאים להדמיה ברזולוציה גבוהה.
הערה: אם למיקרוסקופ הקונפוקלי יש נתיב אור הפוך, יש למקם את המגלשה במהופך. במקרה זה, תנו לדגימה כ-30 דקות לשקוע ולנוח ביציבות על הכיסוי לפני תחילת הסריקה הסופית. לחלופין, השתמש בתווך הרכבה שהוא זורם לאורך כל משך הנתיחה אך מתמצק מאוחר יותר ומשמר בו זמנית את הפלואורסצנציה. - הפעל את הלייזרים המתאימים: שני לייזרים מוליכים למחצה שאובים אופטית עם אורכי גל של λ = 488 ננומטר ו- λ = 522 ננומטר, ולייזר דיודה עם אורך גל של λ = 638 ננומטר משמשים בפרוטוקול זה. בחר את טווח הפליטה של תגי הפלואורסצנציה (AF488: 499-542 ננומטר, AF568: 582-621 ננומטר, AF647: 666-776 ננומטר). כאשר גלאי היברידי סופר את הפוטונים המשוחררים, מקם את קו הלייזר במרחק של לפחות 10 ננומטר מעקומת הפליטה.
הערה: חשוב לבצע בדיקות ראשוניות עם רקמה בעלת תווית אחת כדי לוודא שרוחבי הפס של הגלאי שנבחרו מפרידים בצורה נקייה בין ערוצי הצבע (כלומר, אינם מובילים להצלבת ערוצים). גלי רדיו מפריעים לגלאי ההיברידי, וכתוצאה מכך ספירת הפוטונים המרבית, ובכך גורמים לפסים אמנותיים בערימה. לכן, הימנע משימוש בטלפון נייד ליד המיקרוסקופ. - הגדל את הרקמה עד שהתמונה משתרעת על פני 10 IHCs. בחר את הרזולוציה של התמונה בהתאם לדגימת Nyquist, שהיא בדרך כלל ~ 40-60 ננומטר / פיקסל. הגדר את גודל הצעד בכיוון z ל- 0.3 מיקרומטר ואת מהירות ההדמיה ל- 400-700 הרץ.
הערה: שתי ההגדרות הללו (גודל צעד ומהירות הדמיה) הן פשרות בין שימוש בפרמטרים אופטימליים של הדמיה לבין חיסכון בזמן הסריקה. - בצע דגימה דו-כיוונית כדי לקצר את זמן ההדמיה. לצבור את המסגרת עבור ערוץ 488 ננומטר ו- 638 ננומטר 3x ועבור ערוץ 522 ננומטר 6x; בנוסף, ממוצע הקווים 3x עבור כל ערוץ. בחר את ההתחלה והסוף של הערימה בממד z.
- הגדר את הרווח ל- 100 בעת שימוש בגלאי ההיברידי (מצב ספירה) כדי למנוע ירידה ביחס האות לרעש. הגדר את עוצמת הלייזר כך שאף פיקסל לא יהיה רווי באזור העניין, אך המבנים מכסים בעיקר את טווח 8 הסיביות המלא. התחילו בהספק לייזר נמוך של 0.5% והגדילו אותו עד שמבנים נראים לעין.
הערה: צביעה טובה זקוקה בדרך כלל לעוצמת לייזר בין 0.1% ל-5%. - השתמש בתוכנת deconvolution לעיבוד פוסט-הוק של ערימות התמונות כדי להסיר את ההילה המטשטשת סביב מבנים פלואורסצנטיים קטנים באמצעות פונקציית התפשטות נקודתית תיאורטית. השתמש באותן הגדרות עבור כל מחסנית בתוך ניסוי. שמור את התמונות המדולדלות כ.tif או .ics.
הערה: תווית myoVIIa (IHCs) אינה נהנית מפירוק וניתן להשמיט אותה כדי לחסוך זמן. התוכנה משתמשת במטא-נתונים של קבצי התמונה; עם זאת, יש לציין מספר פרמטרים כגון נתיב האור, מדיום ההטבעה או מדיום הטבילה.
7. כימות סינפסה
- פתח עותק של הערימות המפורקות בתוכנה הנגישה באופן חופשי ImageJ עם תוסף Biovoxxel הנוסף, הזמין גם באתר האינטרנט שלהם.
- התאמת הצבעים של ערוצים בודדים על-ידי פיצול הערוצים (תמונה | | צבע ערוצים מפוצלים) ומיזוג (תמונה | | צבע מיזוג ערוצים) אותם שוב, הקצאת צבעים שונים. המרת התמונה למחסנית RGB (תמונה | | צבע ערימה ל-RGB) והתאמת הבהירות והניגודיות (תמונה | התאמת | בהירות/ניגודיות | או אוטומטי או מחוון לגבי המקסימום), במידת הצורך, כך שהמבנים שלפני ואחרי הסינפטיים ותווית ה- IHC נבדלים באופן נעים מהרקע.
- בחר חמישה מעגלים משולבים ותייג אותם בכלי הטקסט (IHC1-IHC5) על-ידי לחיצה על המיקום הרצוי בתוך הערימה. פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה (נתח | כלים | מנהל החזר ההשקעה); הפעל את תיבת הסימון תוויות כדי לתייג את הנקודות במספר. התקרבו ל-IHC המעניין.
- השתמש בכלי נקודה/ריבוי נקודות במצב ריבוי נקודות (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי כדי לבחור בין מצב נקודה או ריבוי נקודות). לחץ על סינפסת סרט פונקציונלית (כלומר, סרט קדם-סינפטי בהתאמה קרובה לתיקון גלוטמט פוסט-סינפטי) תוך כדי גלילה בממד z.
הערה: בהתאם לכמות החפיפה שלהם ולצבע שנבחר עבור כל ערוץ, הפיקסלים המשותפים מופיעים בצבעים מעורבים. בדרך כלל, ההבחנה בין סינפסות פונקציונליות בודדות היא פשוטה מכיוון שהן רחוקות מספיק זו מזו. - כאשר כל המבנים המעניינים מסומנים, לחץ על הוסף את ממשק המשתמש הגרפי של מנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על השם השרירותי ובחר שנה שם.
הערה: תוויות הנקודה עדיין נשארות בכל המישורים של הערימה כאשר תיבת הסימון הצג את כל הפריטים נבחרת בתפריט אפשרויות כלי הנקודות (לחץ פעמיים על סמל הכלי נקודה ), מה שעוזר להימנע מספירת אותה סינפסת רצועת כלים מספר פעמים. - בעת בחירת ה- IHC הבא לספירה, הימנע מהוספה לא מכוונת של ספירות על-ידי התאמת התמונה להצגה מלאה של ה- IHC הבא באמצעות כלי היד. שנה מכלי מרובה נקודות לכלי הצבעה כדי להימנע מהוספת פונקטה נוספת לנתונים שאוחסנו בעבר. לחץ על מבנה עניין בתוך ה- IHC הבא ושנה בחזרה לכלי ריבוי נקודות. חזור על שלבים 7.4 עד 7.5 עד שכל ה- IHCs המעניינים מוערכים.
- כדי לשמור נתונים, לחץ על ערכת נתונים במנהל ההחזר על ההשקעה ולאחר מכן על מדידה. המתן עד שיופיע חלון חדש המפרט את נקודות הנתונים שנמדדו. שמור רשימה זו כקובץ גיליון אלקטרוני (קובץ | שמור כ). שמור את התמונה על-ידי הפעלת 'הצג הכל ' במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על Flatten כדי להוסיף לצמיתות את תוויות הנקודה לערימה. בעת סגירת ערימת התמונות, הסכימו לשמור את השינויים.
8. ניתוח נפח סינפסה ומיקום על תא השיער
הערה: המחברים השתמשו בהליך מתוכנת מותאם אישית המבוסס על Matlab. מכיוון שהוא אינו זמין לציבור, הוא מתואר כאן רק במונחים רחבים (ראו גם7). אנא צרו קשר עם המחבר המתאים אם אתם מעוניינים להשתמש בו. ההליך מצפה לערימת תמונות עם תווית משולשת (IHCs, טרום ופוסט-סינפטי) בפורמט TIFF כקלט, מנחה את המשתמש בשלבי הניתוח השונים באמצעות ממשק גרפי, ומספק פלט נרחב של התוצאות בפורמט גיליון אלקטרוני.
- נרמלו את מיקומם של המבנים הסינפטיים למערכת קואורדינטות תלת-ממדית המוגדרת על ידי היקף ה-IHC הבודד על ציר העמוד-טודיולר והציר האפיקלי-בזלתי השבלולי והציר העליון (לוחית קוטיקולרית) של ה-IHC עד התחתון (הקוטב הסינפטי).
הערה: הנפחים של אלמנטים סינפטיים (הן טרום-סינפטיים והן פוסט-סינפטיים, והנפח המשולב של סינפסות פונקציונליות) מסופקים ב- μm3 ומנורמלים לערך החציוני המתאים3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שבלולים נקטפו לאחר זלוף קרדיווסקולרי עם קיבוע של החיה כולה או נותחו במהירות לאחר המתת החסד של החיה וטבילה קבועה. בשיטה השנייה, ה-IHCs נשארו במקומם במהלך הנתיחה, בעוד שבמקרים של זלוף לא מוצלח ולכן רקמה לא קבועה מספיק, האפיתל החושי הושמד לעתים קרובות. שימו לב שהמחברים נתקלו במקרים שבהם קיבוע השבלול לאחר זלוף טרנסקרדיאלי לא היה מספיק בזמן שקיבוע המוח עדיין היה מספיק. עדיין ניתן היה להציל רקמה מפיח נחות על ידי פתיחת חורים לתוך הפסגה והבסיס של השבלול ודחיית השבלול על ידי טבילה ב-4% PFA למשך יומיים.
קביעת האורך של השבלול כולו נערכה על פי מולר25 כדי להעריך IHCs ואת הסינפסות שלהם במיקומי שבלול ספציפיים, המקבילים לתדרים אופייניים נפרדים (טבלה 1). לשם כך חושבו מיקומי השבלול הרצויים כאחוזים של אורך קרום הבזילרי מבסיס השבלול. אורך השבלול החציוני של 13 שבלולים מגרבילים בוגרים צעירים היה 11.3 מ"מ (טווח בין-קווי: 11.02-11.52 מ"מ). אורך השבלול החציוני של 24 שבלולים מהגרבילים המיושנים היה 11.5 מ"מ (טווח בין-קווי: 11.24-11.73 מ"מ). לא היה הבדל משמעותי בין אורך השבלול הצעיר לבין השבלול הזקן (מבחן U של מאן-וויטני: U = -1.62, p = 0.105); החציון הכולל היה 11.48 מ"מ. ניתן לטעון כי וריאציה זו באורך השבלול הבודד הייתה קטנה ושימוש במיקומי אורך קבועים (במ"מ) הוא מספיק. עם זאת, פונקציית תדר המקום אינה ליניארית. לכן, סטייה מהאורך החציוני גורמת לשגיאה גדולה יותר עבור מיקומי שבלול בסיסיים מאשר עבור מיקומי שבלול אפיים יותר. לדוגמה, עבור מיקום השבלול השווה לתדר של 1 קילוהרץ, המחושב על בסיס אורך השבלול החציוני (כלומר, 11.48 מ"מ), התדר המתאים נע בין 1.16 קילוהרץ ל-0.91 קילוהרץ עבור הקצר ביותר (10.36 מ"מ) והשבלול הארוך ביותר (12.28 מ"מ) בדגימה זו, בהתאמה. עבור תדר הממוקם בבסיס (למשל, 32 קילוהרץ), טווח התדרים היה 51.62 קילוהרץ עד 23.97 קילוהרץ, עבור השבלול הקצר והארוך ביותר, בהתאמה. לכן, מומלץ לחשב את המיקומים הבודדים על כל שבלול, בפרט כאשר בוחנים מיקומי שבלול בסיסיים.
איור 1 מתאר הקרנות של שבלול בעוצמה המרבית של שבלול ממבוגר צעיר (10 חודשים, איור 1A) וגרביל זקן (38 חודשים, איור 1B), שהן דוגמאות לתבלים חיסוניים אידיאליים. בתמונה המתארת את השבלול של הגרביל הבוגר הצעיר, ה-IHCs המסומנים ב-myoVIIa, המוצגים כאן בכחול, נמצאים בניגוד חריף לרקע השחור. לכן, IHCs בודדים ניתנים לזיהוי בקלות. המבנים הטרום-סינפטיים והפוסט-סינפטיים נראים בבירור כאלמנטים ירוקים ואדומים, בהתאמה. ההנחה היא שהם יוצרים סינפסה פונקציונלית בכל פעם שהם נמצאים בסמיכות קרובה (איור 1A',B' ). רק לעתים רחוקות היו מבנים פרה-סינפטיים לא מזווגים (סרטים יתומים) הנראים בשבב של גרבילים זקנים. השבלול מהגרביל הישן (איור 1B) טופל בקוונצ'ר האוטו-פלואורסצנטי. תווית ה-IHC נראית חלשה יותר, אם כי כוח הלייזר שבו נעשה שימוש בדגימה זו היה גבוה פי שלושה מזה ששימש את השבלול מהגרביל הבוגר הצעיר. עם זאת, ה-IHCs עדיין נבדלים מהרקע. המבנים שלפני ואחרי הסינפטי נראים בבירור, ועוצמת הלייזר ששימשה לשני הערוצים הללו הייתה דומה או אפילו מתחת לזו של הדגימה הבוגרת הצעירה. רקמות מבעלי חיים זקנים הראו בדרך כלל הרבה יותר אות פלואורסצנטי לא ספציפי למראה. לכן, ההבדל העיקרי בפרוטוקול עבור חומר למבוגרים צעירים ומבוגרים הוא הטיפול עם quencher autofluorescence. שימו לב שזה בוצע לאחר ההדבקה החיסונית עם נוגדנים המתויגים בפלואורסצנציה ועשוי, באופן עקרוני, להשפיע גם על תווית הנוגדנים המיועדת. עם זאת, הטיפול למעשה הפחית פלואורסצנציה חיצונית ממקור לא ספציפי, תוך השארת אות מספיק של התווית הספציפית של המבנים המעניינים (השווה את איור 1B לאיור 2B). תוצאות ראשוניות הצביעו, עם זאת, על כך שב-stria vascularis, פלואורסצנציה חיצונית לא באה לידי ביטוי בדגימות מהגרבילים מזדקנים.
דוגמאות לערימות שעובדו באופן לא אופטימלי מוצגות באיור 2. איור 2A מתאר את ההטלה z בעוצמה המרבית של ערימה מגרביל ישן (36 חודשים), שבו ה-IHCs, שגם הם היו כפופים באופן לא טבעי או נקרעו לגזרים, לא נסרקו בשלמותם. כתוצאה מכך, רק הקטבים האפיקליים והבסיסיים של IHCs נראים בסריקה זו. לא ניתן לשלול כי יותר סינפסות היו ממוקמות בחלק האמצעי החסר של ה- IHCs, ולכן, ניתוח אמין אינו אפשרי. לפיכך, חיוני שכל ה- IHCs המוערכים ייסרקו לחלוטין במחסנית הקונפוקלית. איור 2B מראה את ההטלה z בעוצמה המרבית של ערימה שנדגמה בגרביל מיושן (38 חודשים). הפלואורסצנציה של מקור לא ברור היא גבוהה מכיוון שלא נעשה שימוש בקוונצ'ר האוטו-פלואורסצנטי במקרה זה. עם זאת, הפלואורסצנציה החיצונית הוגבלה במידה רבה לתעלה (האדומה) הקשורה לתווית GluA2, שהיא אופיינית למדי. במקרים כאלה, עדיין ניתן יהיה לספור סינפסות פונקציונליות אם תווית ה- CtBP2 של הסרטים נקייה וספציפית יחסית. איור 2C מתאר את ההטלה z בעוצמה המרבית של ערימה המתקבלת מגרביל זקן (42 חודשים). כאן, לא ניתן להקצות את הסינפסות ל-IHCs בודדים מכיוון שה-IHCs היו מפורקים ברובם; ואכן, קשה להיות בטוח כמה IHCs מיוצגים. בדוגמה המוצגת באיור 3A, נעשה שימוש בטלפון נייד בקרבת המיקרוסקופ הקונפוקלי במהלך הסריקה. פסים נראים בערוץ הכחול (תווית IHC). למרבה המזל, במקרה זה, זה לא השפיע על הערוצים הסינפטיים והשפיע רק על החלק העליון של IHCs, ולכן, ניתוח עדיין היה בר קיימא.
איור 3 מציג הקרנות z בעוצמה מרבית של ערימות שנלקחו מאותה פיסת שבלול מגרביל בוגר צעיר, שנרכשו 3 חודשים (איור 3A,A') ו-29.5 חודשים (איור 3B,B') לאחר חיסון. כדי להישאר דומות, התמונות לא נלקחו מאותו מיקום בדיוק (שאולי סבל מהלבנה מהסריקה הקודמת) אלא מאותו קטע שבלול. עבור הסריקה שצולמה בנקודת הזמן המאוחרת יותר, היה צורך להגדיל את כוח הלייזר פי 2 עד פי 3. עם זאת, המבנים המסומנים עדיין ברורים. יחס האות לרעש פחת, במיוחד בערוצים שהציגו מבנים פוסט-סינפטיים ו-IHC, בעוד שהערוץ עם התווית הקדם-סינפטית הושפע פחות. כימות של סינפסות פונקציונליות לכל IHC עדיין אפשרי.
תוצאות אופייניות לניתוח נפח הסינפסה והמיקום על ה-IHC מתוארות באיור 4, באמצעות הערימה הקונפוקלית המוצגת באיור 1A. מעגלים משולבים המוגדרים בנפרד מוצגים באופן גרפי כשחזורי רשת בצבעים שונים, כאשר או בלי הסינפסות הפונקציונליות (המוגדרות על ידי קולוקליזציה של תוויות טרום ופוסט-סינפטיות) מוקצות לכל אחת מהן. ניתן לסובב תצוגה זו באופן חופשי בתלת-ממד כדי לקבל זוויות צפייה שונות (איור 4A,B). ניתן גם לבודד IHCs לתצוגה גרפית (איור 4B). מגוון גדול של גרפי נתונים, הממחישים היבטים שונים של התפלגות הנפחים הסינפטיים בתוך מערכת הקואורדינטות הממוקדת ב-IHC, מופק (דוגמאות באיור 4C-E). הנתונים הכמותיים הגולמיים עבור כל IHC וכל אלמנט סינפטי זמינים גם כגליונות אלקטרוניים אשר לאחר מכן, למשל, ניתן לשלבם על פני מספר ערימות קונפוקליות לניתוח סטטיסטי נוסף.
איור 1: דוגמאות לשבבייה מעובדת בהצלחה. הקרנות z בעוצמה מרבית של ערימות קונפוקליות מ-(A) גרביל בוגר צעיר (10 חודשים), שהתקבלו במיקום שבלול המתאים ל-1 קילוהרץ, ו-(B) גרביל זקן (38 חודשים, לוח B), שהתקבלו במיקום שבלול השווה ל-500 הרץ. וכתמי גלוטמט פוסט-סינפטיים סומנו ב-anti-GluA2 (אדום). השבלול של הגרביל הזקן טופל ב-autofluorescence quencher לאחר ה-immunostaining. לשם הבהירות, קווי המתאר של ה- IHCs מסומנים על-ידי קווים מקווקווים. לוחות (A') ו- (B') מציגים הגדלה של השטחים המתוארים על-ידי הריבועים בשבלול המתאים מהלוחות (A) ו- (B). ראשי חצים צהובים מצביעים על סינפסות פונקציונליות. הערוצים שהציגו את המבנים הטרום-סינפטיים והפוסט-סינפטיים (אך לא את ערוץ ה-IHC) עברו דה-קונבולוציה. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר (A,B), 1 מיקרומטר (A',B'). קיצורים: IHC = תא שיער פנימי; myoVIIa = מיוזין VIIa; CtBP2 = חלבון קשירת מסוף C 2; GluA2 = קולטן גלוטמט יונוטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דוגמאות לשבבייה מעובדת באופן לא אופטימלי. הקרנות z בעוצמה מרבית של ערימות קונפוקליות שעבורן העיבוד היה לא אופטימלי, מהגרבילים שהיו (A) בני 36 חודשים ו-(B, C) בני 38 חודשים וממיקומים שבלוליים המתאימים ל-16 קילוהרץ, 8 קילוהרץ ו-32 קילוהרץ, בהתאמה. גרבילים שמהם נגזרו השבלולים בפאנלים (A) ו-(C) הוכנסו באופן טרנסקרדיאלי, והשבלול מפאנל (C) הונח בנוסף למשך 3 ימים ב-4% PFA. השבלול מ-(B) היה קבוע ב-4% PFA למשך יומיים. שבלולים מ-(A) ו-(C) טופלו ב-autofluorescence quencher. IHCs הוכתמו בנוגדן נגד myoVIIa (כחול), סרטים קדם-סינפטיים סומנו באנטי-CtBP2 (ירוק), וכתמי גלוטמט פוסט-סינפטיים סומנו באנטי-GluA2 (אדום). כל הערוצים היו מנותקים. הבהירות והניגודיות הותאמו עוד יותר לאחר הסריקה הקונפוקלית. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: PFA = paraformaldehyde; IHC = תא שיער פנימי; myoVIIa = מיוזין VIIa; CtBP2 = חלבון קשירת מסוף C 2; GluA2 = קולטן גלוטמט יונוטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: יציבות של אימונובל לאחר אחסון ממושך. הקרנות z בעוצמה מרבית של ערימות קונפוקליות מגרביל בוגר צעיר (10 חודשים), שצולמו במיקום השבלול של 16 קילוהרץ, (A) 3 חודשים לאחר ההכתמה ו-(B) במיקום מעט יותר בסיסי של שבלול על אותה פיסת שבלול 29.5 חודשים לאחר ההכתמה. השבלול היה קבוע ב-4% PFA במשך יומיים. למען הבהירות, (A') ו-(B') מתקרבים רק לסינפסות פונקציונליות מעטות מהאזורים המסומנים בריבועים ב-(A) ו-(B), בהתאמה. IHCs הוכתמו בנוגדן נגד myoVIIa (כחול), סרטים קדם-סינפטיים סומנו באנטי-CtBP2 (ירוק), וכתמי גלוטמט פוסט-סינפטיים סומנו באנטי-GluA2 (אדום). הספק הלייזר של ערוצי IHC היה 1.3% ו-3%, עבור הערוצים הקדם-סינפטיים 0.4% ו-1.1%, ועבור הערוצים הפוסט-סינפטיים 1.1% ו-2% ב-(A) ו-(B), בהתאמה. שימו לב שב-(A), פסים כחולים נראים בחלק העליון של ה-IHCs, הנובעים משימוש בטלפון נייד בקרבת מיקרוסקופ הקונפוקלי. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר (A, B), 1 μm (A', B'). קיצורים: PFA = paraformaldehyde; IHC = תא שיער פנימי; myoVIIa = מיוזין VIIa; CtBP2 = חלבון קשירת מסוף C 2; GluA2 = קולטן גלוטמט יונוטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תוצאות מייצגות של כימות נפח הסינפסה. הסינפסות הפונקציונליות הקשורות אליהם, המוגדרות על ידי אלמנטים בעלי תווית CtBP2-(ירוק) ו-GluA2 (אדום) מורכבת, מוצגות יחד עם ה-IHCs, וגם בנפרד להלן, לבהירות. שימו לב שזווית הראייה נבחרה להיות בניצב לציר הארוך של ה-IHCs ולכן שונה מהתמונה הקונפוקלית המקורית (איור 1A). (B) אחד מה-IHCs התבלט והוצג מסובב ב-90°. המישור השחור הוגדר באופן ידני על ידי המשתמש וחותך את ה-IHC לאורך ציר העמודים-טודיולר שלו. (C) תרשים בועה המציג את המיקום של כל הסינפסות הפונקציונליות במחסנית קונפוקלית זו, ביחס לשלושת הצירים המנורמלים של ה- IHC שלהם בהתאמה. גודל הסמלים פרופורציונלי לנפח של האלמנט הקדם-סינפטי. שים לב שזווית הראייה נבחרה להיות דומה לפאנל (B). (D) Boxplot של הנפחים המנורמלים של אלמנטים סינפטיים, בנפרד עבור השותפים הפרה-סינפטיים (2 תיבות שמאל) והפוסט-סינפטיים (2 תיבות ימניות) של סינפסות פונקציונליות ומופרדים עוד יותר בהתאם למיקומם במחצית המודיולית או העמודית של ה-IHC (צבעים שונים) המתאימים שלהם. תיבות מייצגות טווחים בין-קוויים, כאשר החציון מצוין על ידי קווים. שפם מקווקו מציין פי 1.5 מהטווח הבין-קווי, והצלבים מציינים ערכים מרוחקים מעבר לכך. (E) פיזור של הנפחים המנורמלים של שותפים טרום-סינפטיים לעומת פוסט-סינפטיים של סינפסות פונקציונליות. סמלים שונים מציינים את המיקום במחצית המודילרית או העמודית של ה-IHC שלהם. קיצורים: IHC = תא שיער פנימי; myoVIIa = מיוזין VIIa; CtBP2 = חלבון קשירת מסוף C 2; GluA2 = קולטן גלוטמט יונוטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: מרחקים מהפסגה שקולים לתדרי מטרה ספציפיים בשבלול באורכים שונים. התדרים הטובים ביותר המקבילים חושבו על סמך המשוואה שניתנה על ידי מולר25. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעזרת השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, ניתן לאימונולציה של IHCs ומבנים סינפטיים בשבלול מגרבילים צעירים ומבוגרים, לזהות סינפסות פונקציונליות משוערות על ידי לוקליזציה משותפת של אלמנטים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, להקצות אותם ל-IHCs בודדים ולכמת את מספרם, נפחם ומיקומם. הנוגדנים המשמשים בגישה זו תייגו גם תאי שיער חיצוניים (OHCs; myoVIIa) ואת הסרטים הקדם-סינפטיים שלהם. יתר על כן, חלופה בת קיימא לתיוג חיסוני הן של IHCs והן של OHCs היא נוגדן נגד אוטופרלין, כאשר OHCs נראים הרבה יותר חלשים מ- IHCs.
ניתן לבצע זלוף באמצעות שתי הגדרות שונות. 1) מערכת קו טפטוף הניזונה מכוח הכבידה, שבה תלוי בקבוק בודד המזין קו טפטוף מסחרי על גלגלת בגובה של כ-1.5 מ' מעל החיה. נוזלים מוצגים ברצף לאחר הורדת הבקבוק, הפתוח בחלקו העליון. 2) מערכת המשתמשת במשאבה פריסטלטית דיגיטלית במהירות משתנה, עם צינור דק וארוך הפתוח בקצה אחד כדי לקלוט את הנוזל ומחט שניתן לחבר בקלות בקצה השני. שניהם עובדים טוב באותה מידה, וההבדלים הדקים לא יפורטו כאן. המחברים ממליצים באופן ספציפי, עם זאת, על שולחן עבודה בסגנון טיוטה למטה, עם החיה על פלטפורמה מחוררת והאדים נמשכים למטה. זה מאפשר גישה טובה לאזור הניתוח מבלי להתפשר על פונקציית הפליטה (בניגוד לעבודה בארון אדים פתוח).
קיבוע נכון של הרקמה הוא בעל חשיבות קריטית, שכן אחרת האפיתל החושי יתנתק ויתפורר במהלך הנתיחה. בגרביל, יש צורך בחשיפה ממושכת יותר לקיבוע מאשר בדרך כלל (למשל, עבור עכברים 17,27,13 או שרקנים 28). השיטה המועדפת על גרבילים היא מיצוי מהיר של השבלול לאחר מות החיה וקיבוע טבילה למשך יום וחצי לפחות. אם עדיף זלוף קרדיווסקולרי, חשוב מאוד שהקיבוע ייכנס תוך מספר דקות ויתקדם היטב. מכיוון שזה יכול להיות קשה בסופו של דבר לדרג את איכות הקיבוע במהלך זלוף, מומלץ לאחר מכן באופן שגרתי את השבלול כמתואר.
חשוב לעמוד בשלבי הכביסה, לפיהם שלב הכביסה האחרון (שלב 2.7) הוא החשוב ביותר. אם לא נשטף כראוי, הרקמה דביקה ונצמדת למכשירי הנתיחה, מה שמקשה על הנתיחה. כמו כן, מומלץ להשתמש בקוונצ'ר אוטופלואורסצנטי בשבב שנקטף מהגרבילים זקנים כדי להפחית פלואורסצנציה לא ספציפית. ייתכן שמקורו ב-Autofluorescence בליפופוסין, הנפוץ ברקמות מבעלי חיים מבוגרים בני 29,30,31, ונראה כי הוא נרגש באופן נרחב כמו גם פולט באופן נרחב. כאשר מתרגשים עם אורך גל בספקטרום ה-UV (λ = 364 ננומטר), לליפופוצין יש טווח פליטה רחב (λ = 400-700 ננומטר, עם מקסימום של ~λ = 568 ננומטר)32. ברקמת שריר הלב האנושית, ליפופוסין נראה עם עירור של λ = 555 ננומטר ופליטה של λ = 605 ננומטר33. באופן דומה, ב-IHCs של גרבילים, החוקרים הבחינו בעלייה בפלואורסצנטיות לא ספציפית באופן הבולט ביותר בתעלה המשמשת לנוגדן AF568, מה שמרמז על אוטופלואורסצנציה מגרגירי ליפופוסין. המלצה כללית כאשר עובדים עם רקמות מבעלי חיים היא אפוא להשתמש ברוחב הפס של העירור סביב 550-600 ננומטר עבור האימונו-לבל הכי פחות קריטי.
מדידת אורך השבלול הכולל והזיהוי הנכון של מיקומי שבלול ספציפיים אפשריים רק אם כל אורכו נשמר. אם חלקים של האפיתל החושי הולכים לאיבוד בניתוח, מומלץ עדיין להרכיב את החלק הנותר או אפילו רק את חתיכת הגנגליון הספירלית, ולשמור הערות מפורטות. אז בדרך כלל ניתן להעריך את החלק החסר בדיוק סביר. אם החלקים האפיקליים של השבלול נשמרים לחלוטין, אך הקצה הבסיסי חסר, ניתן להגדיר מיקומי שבלול ספציפיים בחלק האפיקלי על ידי חישוב המיקומים בהתבסס על אורך השבלול החציוני באוכלוסיית הגרביל המשומשת מכיוון שהסטייה מהערך הממשי היא קטנה.
מגבלה חשובה של כימות נפח הסינפסה היא שהנפחים המוחלטים המתקבלים אינם ברי השוואה בין ערימות קונפוקליות שונות. השלב הקריטי שקובע את הנפחים המתקבלים של אלמנטים סינפטיים הוא בחירת סף העוצמה לזיהוי ראשוני. עם זאת, הבחירה בסף עוצמה זה נעשית באופן סובייקטיבי על ידי המשתמש בפרוטוקול הנוכחי ורבים אחרים 3,27,34. יתר על כן, הבהירות של האימונופלואורסצנציה בתמונה הקונפוקלית תלויה בגורמים רבים, שקשה מאוד לתקנן אותם על פני דגימות, כגון עובי הרקמה, כיוון הרקמה ביחס לנתיב האופטי, משך החשיפה ללייזר והגדרות קונפוקליות ודה-קונבולוציה מדויקות. כל האזהרות הללו מחריפות אם חומר נדיר נרכש במשך זמן רב, כמקובל בגרבילים מזדקנים. יחד, משמעות הדבר היא שקשה מאוד לא לכלול הטיות בנתונים מרוכזים, והתרחיש הטוב ביותר הוא מערך נתונים עם שונות גבוהה. לפיכך מומלץ לנרמל באופן שגרתי את הנפחים הסינפטיים לנפח החציוני המתאים של הערימה הקונפוקלית הבודדת, כפי שהוצג על ידי Liberman et al.3. החיסרון הברור הוא שנפחים סינפטיים ניתנים להשוואה רק בתוך ערימת תמונות נתונה, למשל, בין מיקומים שונים ב-IHC, אך לא בין מיקומי שבלול שונים או גילי דגימות שונים.
התיוג הכפול של מבנים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים והדרישה ללוקליזציה משותפת מאפשרים הערכה אמינה יותר של מספר הסינפסות הפונקציונליות מאשר שימוש בכל אחת מהתוויות בלבד. אם רק תווית אחת אפשרית, מומלץ להשתמש באנטי-CtBP2 הקדם-סינפטי, המוצמד לתגי AF488 או פלואורסצנטיים עם פרטים דומים על אורכי גל, משתי סיבות. ראשית, סרטים יתומים, כלומר, אלמנטים עם תווית CtBP2 ללא תווית פוסט-סינפטית מקומית משותפת, נראיםנדירים 17, והמחברים אישרו זאת עבור גרבילים זקנים. לפיכך, השגיאה שהוצגה על ידי אי היכולת לאמת לוקליזציה משותפת עם שותף postynaptic היא קטנה. עם זאת, יש לציין כי הדבר הופך לסוגיה משמעותית יותר כאשר בוחנים אוזניים חשופות לרעש (למשל, 28). שנית, במקרים עם אות פלואורסצנטי גבוה ממקור לא ברור, הרעש השפיע בדרך כלל על הערוץ באמצעות אורך גל של עירור סביב 568 ננומטר במידה הגדולה ביותר ( לדוגמה באיור 2B, המייצג את התווית GluA2). לפחות חלק מהרעש הזה עשוי, ברקמות מבעלי חיים זקנים, להיות ליפופוסין אוטופלואורסצנציה. לכן, כדי למקסם את הסיכוי לתווית נקייה ובודדת נגד CtBP2, מומלץ להימנע מערוץ אורך גל זה. לבסוף, הוכח כי עם תנאי אחסון קרירים וכהים נאותים, האימונו-לבלים המשמשים כאן יציבים לאורך תקופות זמן ארוכות, עד לפחות 2.5 שנים (איור 3B), מה שהופך את ההערכה המחודשת של רקמות יקרות ערך, כגון מגרבילים זקנים, לאפשרית.
הכימות של מספר הסינפסה האפרנטית של IHC הפך למדד חשוב להערכת מצבה של מערכת השמיעה ההיקפית בהקשרים רבים, ביניהם ליקוי שמיעה הקשור לגיל. ישנם פרוטוקולים שונים שפורסמו כעת (למשל, גרבילים21, עכברים17,13, שרקנים10,28 ובני אדם35). השיטה המתוארת כאן היא, בפרטיה, ספציפית לגרבילים צעירים ומבוגרים, אך נגזרו כמה המלצות כלליות שעשויות להיות שימושיות גם במינים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
Acknowledgments
המחברים מודים לליצ'ון ז'אנג על שסייע בהקמת השיטה וליחידת השירות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, אוניברסיטת קרל פון אוסייצקי באולדנבורג, על השימוש במתקני ההדמיה. מחקר זה מומן על ידי ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H.
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
