Summary
Представлен протокол обработки молодых взрослых и возрастных улиток песчанок путем иммуномаркировки афферентных синаптических структур и волосковых клеток, гашения автофлуоресценции в стареющей ткани, рассечения и оценки длины улиток и количественной оценки синапсов в стеках изображений, полученных с помощью конфокальной визуализации.
Abstract
Предполагается, что потеря ленточных синапсов, соединяющих внутренние волосковые клетки и афферентные слуховые нервные волокна, является одной из причин возрастной потери слуха. Наиболее распространенным методом обнаружения потери ленточных синапсов является иммуномаркировка, поскольку она позволяет проводить количественный отбор проб из нескольких тонотопных мест в отдельной улитке. Тем не менее, структуры, представляющие интерес, похоронены глубоко внутри костистой улитки. Песчанки используются в качестве животной модели для возрастной потери слуха. Здесь описаны рутинные протоколы фиксации, иммуномаркировки кохлеарных целых креплений песчанки, конфокальной визуализации и количественной оценки количества и объемов синапсов ленты. Кроме того, подчеркиваются особые проблемы, связанные с получением хорошего материала от ценных стареющих людей.
Песчанки усыпляются и либо перфузируются сердечно-сосудисто, либо их барабанные буллы тщательно рассекаются из черепа. Улитки вскрываются на вершине и основании и непосредственно переносятся на фиксатор. Независимо от первоначального метода, улитки постфиксируются и впоследствии декальцифицируются. Затем ткань маркируется первичными антителами против пре- и постсинаптических структур и волосковых клеток. Затем улитки инкубируются со вторичными флуоресцентными антителами, которые специфичны по отношению к их соответствующим первичным. Улитки старых песчанок затем обрабатывают автофлуоресцентным гасителем, чтобы уменьшить типично существенную фоновую флуоресценцию тканей пожилых животных.
Наконец, улитки рассечены на 6-11 сегментов. Вся длина кохлеара реконструируется таким образом, что конкретные кохлеарные места могут быть надежно определены между особями. Конфокальные стеки изображений, полученные последовательно, помогают визуализировать волосковые клетки и синапсы в выбранных местах. Конфокальные стеки деконволюируются, и синапсы либо подсчитываются вручную с помощью ImageJ, либо более обширная количественная оценка синаптических структур осуществляется с помощью процедур анализа изображений, специально написанных в Matlab.
Introduction
Возрастная потеря слуха является одним из наиболее распространенных заболеваний в мире, которое поражает более трети населения мира в возрасте 65 лет и старше1 года. Основные причины все еще обсуждаются и активно исследуются, но могут включать потерю специализированных синапсов, соединяющих внутренние волосковые клетки (IHC) с афферентными слуховыми нервными волокнами2. Эти ленточные синапсы содержат пресинаптическую структуру, которая имеет везикулы, заполненные привязанным к нему нейромедиатором глутаматом, а также постсинаптические α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPA) глутаматных рецепторов 3,4,5. У песчанки ~20 афферентных слуховых нервных волокон контактируют с одним IHC 6,7,8. Волокна на IHC, обращенные к модиолу, противостоят большим синаптическим лентам, в то время как волокна, соединяющиеся на стороне столба IHC, сталкиваются с небольшими синаптическими лентами (т. Е. У кошек9, песчанок7, морских свинок10 и мышей 3,11,12,13,14). Кроме того, у песчанки размер пресинаптических лент и постсинаптических глутаматных пятен положительно коррелирует 7,14. Волокна, которые противостоят большим лентам на модиолярной стороне IHC, имеют малый калибр и имеют низкие спонтанные показатели и высокие пороги15. Имеются данные о том, что волокна с низкой спонтанной скоростью более уязвимы к воздействию шума10 и ототоксических препаратов16, чем высокоспонтанные низкопороговые волокна, которые расположены на стороне столба IHC15.
Потеря ленточных синапсов является самым ранним дегенеративным событием при кохлеарной нервной возрастной тугоухости, в то время как потеря спиральных ганглиозных клеток и их афферентных слуховых нервных волокон отстает от17,18. Электрофизиологические корреляты включают записи слуховых реакций ствола мозга17 и потенциалов действия соединения8; однако они не отражают тонкостей потери синапсов, поскольку низкая спонтанная скорость волокон не способствует этим показателям16. Более перспективными электрофизиологическими метриками являются нейронный индекс19, полученный из потенциала массы, и перистимулированный временной ответ20. Однако они надежны только в том случае, если у животного нет других кохлеарных патологий, кроме потери слуховых нервных волокон, которые влияют на активность оставшихся слуховых нервных волокон8. Кроме того, поведенчески оцененные пороги у песчанки не коррелировали с синапсовыми числами21. Поэтому достоверная количественная оценка сохранившихся ленточных синапсов и, таким образом, количества функциональных слуховых нервных волокон возможна только при непосредственном исследовании кохлеарной ткани.
Монгольская песчанка (Meriones unguiculatus) является подходящей животной моделью для изучения возрастной потери слуха. Он имеет короткую продолжительность жизни, имеет низкочастотный слух, похожий на человеческий, прост в обслуживании и показывает сходство с патологиями человека, связанными с возрастной потерей слуха 2,22,23,24. Песчанки считаются пожилыми, когда они достигают 36-месячного возраста, что ближе к концу их средней продолжительности жизни22. Важно отметить, что возрастная потеря ленточных синапсов была продемонстрирована у песчанок, выросших и выдержанных в спокойной обстановке 8,21.
Здесь представлен протокол иммуномаркировки, вскрытия и анализа улиток у песчанок разного возраста, от молодых людей до пожилых людей. Используются антитела, направленные против компонентов пресинапса (CtBP2), постсинаптических пластырей рецепторов глутамата (GluA2) и IHC (myoVIIa). Применяется автофлуоресцентный гаситель, который уменьшает фон в состаренных улитках и оставляет флуоресцентный сигнал нетронутым. Далее дается описание того, как рассечь улитку для изучения как сенсорного эпителия, так и сосудистой полосы. Длина кохлеарности измеряется для того, чтобы можно было выбрать различные кохлеарные места, соответствующие конкретным наилучшим частотам25. Количественная оценка чисел синапсов осуществляется с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ26. Дополнительная количественная оценка объемов и местоположений синапсов в пределах отдельного HC выполняется с помощью программного обеспечения, написанного на Matlab. Это программное обеспечение не является общедоступным, так как авторам не хватает ресурсов для предоставления профессиональной документации и поддержки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы и процедуры были утверждены соответствующими органами Нижней Саксонии, Германия, с номерами разрешений AZ 33.19-42502-04-15/1828 и 33.19-42502-04-15/1990. Этот протокол предназначен для монгольских песчанок (M. unguiculatus) обоих полов. Молодой взрослый относится к возрасту 3-12 месяцев, в то время как песчанки считаются в возрасте 36 месяцев и старше. Если не указано иное, буферы и растворы могут быть приготовлены и храниться в холодильнике до нескольких месяцев (4-8 °C). Перед использованием убедитесь, что буферы и растворы не выпали в осадок.
1. Фиксация и органный сбор
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нужны только улитки, рекомендуется провести несколько более простую процедуру фиксации погружением. Однако, если также необходим хорошо сохранившийся мозг, то транскардиальная перфузия является единственным вариантом. Фиксатором в обоих случаях является 4% параформальдегид (PFA) в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS). Это должно быть свежеприготовленным, но может храниться замороженным до использования. Используйте аликвоты ~300 мл для транскардиальной перфузии или ~50-100 мл на улитку для фиксации погружением.
ВНИМАНИЕ: ПФА является опасным веществом; обрабатывать его в соответствии с общими процедурами лабораторной безопасности.
- Фиксация транскардиальной перфузией
- Промывайте перфузионную установку до тех пор, пока трубка не очистится от пузырьков воздуха. Заполните перфузионную трубку PBS, содержащим гепарин (0,2 мл в 100 мл PBS), чтобы предотвратить свертывание крови. Остановите поток после того, как трубка будет заполнена PBS и бутылка для хранения жидкости только что опорожнится; налейте в него 200 мл размороженного ПФА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь настройка готова для животного. Оставшаяся PBS в трубке достаточна для промывания крови и автоматически сопровождается фиксатором после возобновления потока. - Обеспечить наличие системы сбора отходов для оттока PFA. Используйте свежую канюлю (19 г) и имейте большие ножницы, щипцы (с уплощенным кончиком), гемостаты, скальпель или острую канюлю, а также резиновый коврик с булавками под рукой.
- Усыпить песчанку при внутрибрюшинной передозировке пентобарбитала (160 мг/мл, 0,3 мл на животное, диапазон масс тела: 50-120 г). Поместите животное обратно в клетку. Когда остановка дыхания наступает так, что дыхание становится нерегулярным с интервалами 30 с или дольше, поместите песчанку на спину на резиновый коврик и зафиксируйте обе передние лапы и одну заднюю лапу булавками (оставьте одну заднюю лапу свободной для движения для лучшего суждения об успехе перфузии; см. примечание после шага 1.1.7).
- Чтобы открыть грудную полость, поднимите кожу над грудиной щипцами и срежьте кожу примерно на 0,5 см ниже грудины ножницами до тех пор, пока не будет виден белоцветный processus xiphoideus . Удерживайте грудину у отростка xiphoideus щипцами и разрезайте вдоль диафрагмы, чтобы получить хороший обзор грудной полости. Обрежьте ребра сбоку с обеих сторон до тех пор, пока не появится хороший доступ к сердцу. Следите за тем, чтобы угол ножниц был параллельным и плоским по отношению к телу песчанки, чтобы избежать повреждения органов и, таким образом, обеспечить замкнутую кровеносную систему.
- Зажмите гемостат на грудине, поднимите грудную клетку и поместите гемостат через плечо песчанки, не опираясь гемостатом на какие-либо части тела, чтобы избежать блокирования кровотока.
- Слегка откройте поток жидкости до тех пор, пока одна капля PBS не вытечет из канюли (19 g) примерно каждые 2 с. Держите сердце щипцами и поверните его немного влево так, чтобы был хорошо виден левый желудочек. Вставьте канюлю в левый желудочек под углом, который позволяет избежать проникновения в перегородку. Держите иглу на месте либо вручную, либо с помощью другого гемостата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Левый и правый желудочки могут быть дифференцированы по их различным цветовым оттенкам; левый желудочек кажется светлее по цвету, чем остальная часть сердечной ткани. - Медленно увеличьте давление потока жидкости и откройте правое предсердие либо мелкими ножницами, либо скальпелем, либо другой канюлей. Откройте поток жидкости дальше до тех пор, пока в капельной камере не будет наблюдаться примерно 2-3 капли/с, или установите расход 4 мл/мин для насоса. Как только начнется фиксация сердца, убедитесь, что перфузионная канюля остается на месте, не удерживаясь дальше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Признаками успешной перфузии являются медленные мышечные сокращения, жесткость шеи и конечностей, бледность печени и розовые легкие. Признаком неудачной перфузии является отбеливание легких, что свидетельствует о том, что легочное кровообращение перфузировано из-за прокола перегородки. - В случае неудачной перфузии попробуйте переместить канюлю дальше вверх, в аорту, и зажать ее на месте гемостатом.
- Обезглавить песчанку. Удалите буллы, отрежьте и отломите их кость, как описано в шаге 1.2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань недостаточно фиксирована, сенсорный эпителий вытеснится из органа Корти во время рассечения. - Если перфузия не показывает признаков фиксации в течение 5-10 мин, прервите ее и сразу же следуйте приведенной ниже процедуре фиксации погружением. Для этого обработайте улитку как на стадии 1.2.2 и постфиксируйте ткань примерно в 50-80 мл 4% PFA в контейнерах с винтовыми крышками в течение 1-2 дней на 2D-шейкере при 8 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку может быть трудно в конечном итоге оценить качество фиксации во время перфузии, рекомендуется регулярно постфиксировать улитки, как описано.
- Промывайте перфузионную установку до тех пор, пока трубка не очистится от пузырьков воздуха. Заполните перфузионную трубку PBS, содержащим гепарин (0,2 мл в 100 мл PBS), чтобы предотвратить свертывание крови. Остановите поток после того, как трубка будет заполнена PBS и бутылка для хранения жидкости только что опорожнится; налейте в него 200 мл размороженного ПФА.
- Фиксация погружением в ткани
- Усыпляют песчанок при внутрибрюшинной передозировке пентобарбитала (160 мг/мл, 0,3 мл на животное, диапазон масс тела: 50-120 г). Когда песчанка перестанет дышать, обезглавить животное.
- Удалите буллы и отрежьте и отломите ее кость ножницами и щипцами, соответственно, чтобы добраться до улитки. Удалите маэллус, инкус и полукруглые каналы. Сделайте небольшие отверстия на вершине и в базальном повороте, аккуратно процарапав кохлеарную кость щипцами. Немедленно переведите буллы в избыток холодового фиксатора (не менее 50 мл) и зафиксируйте ткани на холоде (4-8 °C) при мягком перемешивании (2D-шейкер [100 об/мин]) в течение 2 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации ткани улитки могут быть либо немедленно обработаны, либо сохранены в PBS с 0,05% азидом натрия. ВНИМАНИЕ: Азид натрия токсичен. Отметим, что длительность хранения может негативно повлиять на качество окрашивания. Ограниченные испытания показали, что иммуноокрашивание оказалось слабее после 2 лет хранения ткани в азиде натрия.
2. Тканевая подготовка и иммуномаркировка
- Растворите порошок этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в PBS для получения раствора 0,5 М при рН 8. Для этого поместите стакан на магнитную мешалку, заполните его примерно половиной от общего количества PBS и добавьте соответствующее количество порошка EDTA, в результате чего получится кислая суспензия. Осторожно добавляйте концентрированный раствор гидроксида натрия (NaOH) при мониторинге рН с помощью рН-метра. Заполните PBS до нужного конечного объема и отфильтруйте раствор, чтобы предотвратить микробное загрязнение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порошок ЭДТА полностью растворится только после того, как суспензия достигнет нейтрального значения рН. - Для декальцификации переведите улитки на 80 мл 0,5 М ЭДТА в PBS. Инкубировать ткань на холоде (4-8 °C) при мягком перемешивании на 2D-шейкере (100 об/мин) в течение 2 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: После стадии декальцификации ткань может храниться в PBS в течение нескольких дней до 3 недель, прежде чем продолжить оставшиеся этапы обработки. Для антител, которые маркируют stria vascularis, целесообразно разрезать улитки пополам вдоль модиолярной оси в этой точке (т. Е. До иммуноокрашивания), чтобы обеспечить равномерный доступ антител к их соответствующим мишеням. Это зависит от антител и не относится к антителам, используемым здесь для маркировки синаптических структур и IHC. Используйте кусок бьющегося лезвия бритвы и держатель лезвия (как описано в шаге 4.2) для резки. - Выполните следующие действия (до шага 3.2) в реакционных трубках с безопасным уплотнением объемом 2 мл. Если кусок ткани слишком велик, чтобы поместиться внутри трубки, обрежьте лишнюю ткань ножницами. Для улучшения проникновения антител сначала пермеабилизируют ткань в 1 мл 1% тритона (Triton X-100) в PBS на 2D-шейкере (100 об/мин) при комнатной температуре в течение 1 ч. Промыть ткань 3x с 1 мл 0,2% тритона (Triton X-100) в PBS на 2D-шейкере (100 об/мин) при комнатной температуре по 5 мин каждый.
- Для блокирования неспецифических антигенов инкубируют улитки в 1 мл блокирующего раствора (3% бычьего сывороточного альбумина [BSA], 0,2% тритона, в PBS) на 2D-шейкере (100 об/мин) при комнатной температуре в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий раствор может быть приготовлен заранее, но не должен быть старше ~ 10 дней. - В той же аликвоте блокирующего раствора разводят следующие первичные антитела: антимиоVIIa (миозин VIIa) для маркировки IHC (IgG поликлональный кролик), разбавленный 1:400; анти-CtBP2 (С-концевой связывающий белок 2) для маркировки пресинаптических лент (моноклональная мышь IgG1), разбавленная 1:400; и анти-GluA2 для маркировки постсинаптических рецепторных пластырей (IgG2a моноклональная мышь), разбавленная 1:200. Убедитесь, что улитки полностью покрыты раствором антител (обычно 0,4 мл) и инкубируют их при 37 °C в течение 24 ч.
- Далее промыть ткань 5x с 0,2% тритоном в PBS на 2D-шейкере (100 об/мин) при комнатной температуре в течение 5 мин каждая. Выбирают вторичные антитела в соответствии с видами хозяев их первичных собратьев и снова только что разбавляют их в 3% BSA, 0,2% тритона, в PBS: козий антимыший (IgG1)-Alexa флуорофор (AF) 488, разбавленный 1:1000; козий антимышиный (IgG2a)-AF568, разбавленный 1:500; и ослик анти-кролик-AF647 (IgG), разбавленный 1:1000. Оберните трубку в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить отбеливание флуоресценции. Инкубировать улитки в 0,4 мл раствора вторичных антител при 37 °С в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ограниченные испытания показали, что инкубация кохлеарной ткани при 37 °C в течение 24 ч с первичными и вторичными антителами приводила к более яркому иммуноокрашиванию, чем после более распространенной процедуры инкубации с более низкими температурами и более короткой продолжительностью. - Промыть улитки 2x с 1 мл 0,2% тритона в PBS в течение 5 мин каждый и 3x pBS в течение 5 мин каждый на 2D-шейкере (100 об/мин) при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этих этапов мытья улитки могут оставаться в PBS в холодильнике при ~4 °C в течение нескольких дней.
3. Лечение автофлуоресцентным гасителем (опционально)
ПРИМЕЧАНИЕ: Улитки среднего и пожилого возраста песчанок демонстрируют обширную фоновую автофлуоресценцию. В молодых взрослых тканях лечение автофлуоресцентным гасителем не требуется. В принципе, можно применить автофлуоресцентный гаситель перед процедурой иммуноокрашивания, что затем позволяет избежать непреднамеренного снижения желаемой флуоресценции антител. Однако, согласно техническому описанию производителя, использование моющих средств (таких как Triton X-100 в текущем протоколе) больше невозможно, поскольку они удаляют гаситель из ткани.
- Разрежьте улитки пополам под стереомикроскопом, как описано в шаге 4.2.
- Смешайте автофлуоресцентный гаситель с 70% этанолом до получения 5% раствора и инкубируйте улитку в этом растворе на 2D-шейкере при комнатной температуре в течение 1 мин. Промыть улитки 3 раза 1 мл PBS на 2D-шейкере при комнатной температуре в течение 5 мин каждый.
ВНИМАНИЕ: Автофлуоресцентный гаситель опасен и вреден. Надевайте перчатки при обращении с этим веществом.
4. Заключительное тонкое рассечение
- Рассекните улитку под стереомикроскопом. Наполните полистироловую чашку Петри и ее крышку PBS и держите под рукой два тонких щипца, пружинные ножницы Vannas, держатель лезвия и бьющийся бритвенный клинок. Отламывайте куски от бритвенного лезвия для получения режущей поверхности ~2-4 мм в зависимости от стадии рассечения. Подготовьте слайд микроскопа, поместив три капли монтажной среды в ряд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Режущая поверхность лезвия бритвы быстро стирается. Лезвие необходимо заменить после рассечения и монтажа примерно каждого второго куска улитки. - Если это еще не сделано на этапе 3.1, сначала разрежьте улитку пополам вдоль модиола под стереомикроскопом. Для этого поместите кусок бритвенного лезвия длиннее свернутой длины улитки в держатель лезвия. Поместите улитку в чашку Петри и отрежьте лишнюю ткань куском бритвенного лезвия. Подержите улитку на месте тонкими щипцами и разрежьте пополам вдоль модиола.
- Начните с одной половины, но оставьте и другую половину в чашке Петри. Тщательно зафиксируйте улитку щипцами так, чтобы режущая кромка была обращена вверх. Используйте тонкие пружинные ножницы, чтобы отрезать кость улитки над хеликотремой, покрывая верхушку.
- Чтобы начать отделение кохлеарных кусков, изолируйте средний поворот, разрезав ножницами через модиол и слуховой нерв, выше (scala vestibuli) и ниже (scala tympani).
- Прорежьте кохлеарную кость, покрывающую стрию васкуляра в кохлеарном протоке. Сделайте два разреза с обеих сторон кохлеарной кости над органом Корти и вдоль stria vascularis и используйте лезвие бритвы, чтобы в конечном итоге отделить кохлеарные кусочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стрия сосудистая легко видна в виде темной полосы. Разрезание вдоль стрии сосудистой оставляет орган Корти нетронутым. - Необязательно: Чтобы собрать stria vascularis, тщательно разрезайте между органом Corti и stria vascularis, чтобы разделить их. Оставьте stria vascularis, соединенным со спиральной связкой (прикрепленной к кости, покрывающей внешнюю поверхность улитки) и удалите декальцифицированную кость с помощью щипцов. Поместите кусок стороной стрии вверх на предметное стекло микроскопа в капле монтажной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если собранный кусок изогнут слишком сильно, может потребоваться разделить его на более мелкие части, чтобы он был достаточно плоским для монтажа на слайде. - Переложите кохлеарные части на заполненную PBS крышку полистирольной чашки Петри, гарантируя, что кохлеарные целые крепления лежат как можно более плоскими на слайде. Удалите лишнюю ткань, такую как части спиральной связки на абневральной стороне и части спирального лимбуса на нервной стороне. Аккуратно удалите текториальную мембрану сверхтонкими щипцами.
- Поместите кохлеарные части на затвор в каплю монтажной среды. Поместите кохлеарные целые крепления с органом Корти лицом вверх на слайде, чтобы избежать затемнения IHC в оптической траектории для визуализации. Ищите инвагинацию спирального лимбуса в непосредственной близости от IHC, которая видна при смещении кохлеарного куска в сагиттальную плоскость, чтобы идентифицировать сторону вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы в цифровом виде реконструировать полную улитку из отдельных ее частей во время дальнейшей обработки, настоятельно рекомендуется документировать эскизы частей и отмечать ориентиры. Кроме того, кусочки в идеале должны быть расположены в правильном порядке на слайде. - Повторяйте шаги с 4.3 по 4.8 до тех пор, пока вся улитка не будет перенесена на предметное стекло микроскопа. При необходимости добавьте дополнительную монтажную среду, обкройте слайд и запечатайте крышку на месте черным лаком для ногтей, окрашенным по краям. Дайте ему высохнуть в темноте при комнатной температуре, а затем храните горку в темноте при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Даже если части самого сенсорного эпителия случайно потеряны, важно, тем не менее, смонтировать то, что осталось от кохлеарного куска для правильной оценки длины.
5. Кохлеарное измерение длины
- Измерьте длину улитки по ярким изображениям ее частей с помощью системы эпифлуоресцентного микроскопа и связанного с ней программного обеспечения. Сохраняйте изображения с низким увеличением (объектив 4x) с каждого кохлеарного куска и используйте инструмент измерения лассо программного обеспечения микроскопа, чтобы нарисовать линию вдоль ряда IHC на каждом из изображений. Рассчитайте общую длину, сложив длины всех частей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда части сенсорного эпителия отсутствуют в кохлеарном куске, интерполируйте линию. - Чтобы определить кохлеарные местоположения, которые должны быть проанализированы в отдельной улитке, вычислите соответствующие им расстояния от вершины, используя уравнение, данное Мюллером25. Отметьте эти места, например, на распечатке кохлеарных кусков.
6. Получение изображений с помощью конфокального микроскопа
- Используйте конфокальный микроскоп с масляным погружением в 40x объектив (числовая диафрагма 1.3) и соответствующим маслом для визуализации с высоким разрешением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если конфокальный микроскоп имеет перевернутый световой путь, слайд должен быть расположен вверх ногами. В этом случае дайте образцу примерно 30 минут, чтобы он погрузился и стабильно отдыхал на крышке, прежде чем начать окончательное сканирование. Альтернативно, используйте монтажную среду, которая является жидкой на протяжении всей продолжительности рассечения, но затвердевает позже и одновременно сохраняет флуоресценцию. - Активируют соответствующие лазеры: в этом протоколе используются два полупроводниковых лазера с оптической накачкой с длинами волн λ = 488 нм и λ = 522 нм, и диодный лазер с длиной волны λ = 638 нм. Выберите диапазон излучения флуоресцентных меток (AF488: 499-542 нм, AF568: 582-621 нм, AF647: 666-776 нм). Поскольку гибридный детектор подсчитывает выпущенные фотоны, поместите лазерную линию на расстоянии не менее 10 нм от кривой излучения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно проводить предварительные проверки с помощью одномаркированной ткани, чтобы убедиться, что выбранные полосы пропускания детектора четко разделяют цветовые каналы (т.е. не приводят к перекрестным помехам канала). Радиоволны мешают гибридному детектору, что приводит к максимальному количеству фотонов и, таким образом, вызывает артефактные полосы в стеке. Поэтому избегайте использования мобильного телефона рядом с микроскопом. - Увеличьте масштаб ткани до тех пор, пока изображение не достигнет 10 IHC. Выберите разрешение изображения в соответствии с выборкой Найквиста, которое обычно составляет ~ 40-60 нм / пиксель. Установите размер шага в z-направлении на 0,3 мкм, а скорость изображения на 400-700 Гц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обе эти настройки (размер шага и скорость изображения) являются компромиссом между использованием оптимальных параметров изображения и экономией времени сканирования. - Выполняйте двунаправленную выборку, чтобы сократить время визуализации. Аккумулируйте кадр для канала 488 нм и 638 нм 3x и для канала 522 нм 6x; кроме того, усредните линии 3x для каждого канала. Выберите начало и конец стека в z-измерении.
- Установите коэффициент усиления равным 100 при использовании гибридного детектора (режим подсчета), чтобы избежать снижения отношения сигнал/шум. Установите мощность лазера таким образом, чтобы ни один пиксель не был насыщен в интересующей области, но структуры охватывают в основном весь 8-битный диапазон. Начните с низкой мощности лазера 0,5% и увеличивайте ее до тех пор, пока не станут видны структуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее окрашивание обычно требует мощности лазера от 0,1% до 5%. - Используйте программное обеспечение для деконволюции для пост-специальной обработки стеков изображений, чтобы удалить размытый ореол вокруг небольших флуоресцентных структур с помощью теоретической функции точечного разброса. Используйте одни и те же параметры для каждого стека в эксперименте. Сохраните деконволюционные изображения как .tif или .ics.
ПРИМЕЧАНИЕ: MyoVIIa-метка (IHC) не выигрывает от деконволюции и может быть опущена для экономии времени. Программа использует метаданные файлов изображений; однако необходимо указать несколько параметров, таких как световой путь, среда встраивания или среда погружения.
7. Количественная оценка синапсов
- Откройте копию деконволюционных стеков в свободно доступном программном обеспечении ImageJ с помощью дополнительного Biovoxxel-плагина, который также доступен на их сайте.
- Настройка цветов отдельных каналов путем разделения каналов (Image | Цвет | Разделенные каналы) и слияние (image | Цвет | Merge Channels) их снова, назначая разные цвета. Преобразование изображения в RGB-стек (Image | Цвет | Stack to RGB) и отрегулируйте яркость и контрастность (Image | Отрегулируйте | | яркости/контрастности Либо Auto , либо ползунок относительно Maximum), если это необходимо, так что до- и постсинаптические структуры и метка IHC приятно отличаются от фона.
- Выберите пять IHC и пометьте их текстовым инструментом (IHC1-IHC5), щелкнув нужное место в стеке. Откройте менеджер окупаемости инвестиций (Анализ | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций); активируйте флажок Метки , чтобы пометить точки числом. Увеличьте масштаб интересующего IHC.
- Используйте инструмент «точка/многоточка» в многоточечном режиме (щелкните правой кнопкой мыши инструмент, чтобы выбрать между точечным или многоточечным режимом). Нажмите на функциональный синапс ленты (т. е. пресинаптическую ленту в тесном сопоставлении с постсинаптическим глутаматным пятном) при прокрутке z-измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от их перекрытия и цвета, выбранного для каждого канала, общие пиксели отображаются в смешанном цвете. Обычно различие между отдельными функциональными синапсами простое, поскольку они достаточно удалены друг от друга. - Когда все интересующие структуры будут отмечены, нажмите кнопку Добавить в графическом пользовательском интерфейсе менеджера ROI. Нажмите на произвольное имя и выберите Переименовать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метки точек по-прежнему остаются во всех плоскостях стека, когда в меню параметров инструмента «Точка» установлен флажок «Показать все» (дважды щелкните значок инструмента «Точка»), что помогает избежать многократного подсчета одного и того же синапса ленты. - При выборе следующего IHC для подсчета избегайте непреднамеренного добавления счетчиков, настроив изображение для полного отображения следующего IHC с помощью ручного инструмента. Переходите от многоточечного инструмента к точечному инструменту , чтобы избежать добавления дополнительных пунктов к ранее сохраненным данным. Нажмите на интересующую структуру в следующем IHC и вернитесь к многоточечному инструменту. Повторяйте шаги с 7.4 по 7.5 до тех пор, пока не будут оценены все интересующие IHC.
- Чтобы сохранить данные, щелкните набор данных в менеджере ROI, а затем на измерение. Подождите, пока появится новое окно со списком измеренных точек данных. Сохраните этот список в виде файла электронной таблицы (Файл | Сохранить как). Сохраните изображение, активировав Show All в менеджере ROI. Нажмите кнопку Сведение , чтобы окончательно добавить метки точек в стек. При закрытии стека изображений согласитесь сохранить изменения.
8. Анализ объема и положения синапса на волосковых клетках
ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы использовали индивидуально запрограммированную процедуру на основе Matlab. Поскольку он не является общедоступным, он изложен здесь только в общих чертах (см. также7). Пожалуйста, свяжитесь с соответствующим автором, если вы заинтересованы в его использовании. Процедура предполагает тройной (IHC, пре- и постсинаптический) стек изображений в формате TIFF в качестве входных данных, проводит пользователя через различные этапы анализа через графический интерфейс и обеспечивает обширный вывод результатов в формате электронной таблицы.
- Нормализуйте положение синаптических структур до 3D-системы координат, определяемой протяженностью отдельного IHC на столбово-модиолярной оси и кохлеарной апикально-базальной оси и верхней (кутикулярной пластине) до нижней (синаптический полюс) оси.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы синаптических элементов (как пре-, так и постсинаптических, а также комбинированный объем функциональных синапсов) приведены в мкм3 и нормализованы до соответствующего медианного значения3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Улитки либо собирали после сердечно-сосудистой перфузии с фиксацией всего животного, либо быстро рассекали после усыпления животного и фиксировали погружением. При последнем методе IHC оставались на месте во время рассечения, тогда как в случаях неудачной перфузии и, следовательно, недостаточно фиксированной ткани сенсорный эпителий часто разрушался. Отметим, что авторы сталкивались со случаями, когда фиксация улиток после транскардиальной перфузии была недостаточной, в то время как фиксация мозга была еще адекватной. Ткань от нижней перфузии все еще может быть сохранена путем открытия отверстий в кохлеарной вершине и основании и постфиксации улитки путем погружения в 4% PFA в течение 2 дней.
Определение длины всей улитки проводили по Мюллеру25 для оценки IHC и их синапсов в определенных кохлеарных положениях, эквивалентных различным характеристическим частотам (таблица 1). Для этого желаемые кохлеарные положения рассчитывали как проценты длины базилярной мембраны от кохлеарного основания. Средняя длина улитки 13 улиток у молодых взрослых песчанок составляла 11,3 мм (межквартильный диапазон: 11,02-11,52 мм). Средняя длина улитки 24 улиток у выдержанных песчанок составляла 11,5 мм (межквартильный диапазон: 11,24-11,73 мм). Не было выявлено существенной разницы между длиной молодых взрослых и возрастных улиток ( U-тест Манна-Уитни: U = -1,62, p = 0,105); общий медиана составила 11,48 мм. Можно утверждать, что это изменение длины отдельных улиток было небольшим и использование положений фиксированной длины (в мм) является адекватным. Однако функция место-частота является нелинейной. Таким образом, отклонение от медианной длины вызывает большую погрешность для базальных кохлеарных расположений, чем для относительно более апикальных кохлеарных расположений. Например, для кохлеарного расположения, эквивалентного частоте 1 кГц, рассчитанной на основе медианной кохлеарной длины (т.е. 11,48 мм), соответствующая частота варьировалась от 1,16 кГц до 0,91 кГц для самой короткой (10,36 мм) и самой длинной улитки (12,28 мм) в данном образце соответственно. Для базально расположенной частоты (например, 32 кГц) диапазон частот составлял от 51,62 кГц до 23,97 кГц для самой короткой и самой длинной улитки, соответственно. Поэтому целесообразно рассчитать отдельные места на каждой улитке, в частности при обследовании базальных кохлеарных локаций.
На рисунке 1 изображены проекции максимальной интенсивности z-размерности улиток от молодого взрослого человека (10 месяцев, рисунок 1A) и пожилой песчанки (38 месяцев, рисунок 1B), которые являются примерами идеальных иммунотрудов. На изображении, изображающем улитку молодой взрослой песчанки, меченые myoVIIa IHC, показанные здесь синим цветом, резко контрастируют с черным фоном. Таким образом, отдельные IHC легко обнаруживаются. Пре- и постсинаптические структуры хорошо видны в виде зеленых и красных элементов соответственно. Предполагается, что они образуют функциональный синапс всякий раз, когда они находятся в тесном сопоставлении (рисунок 1A', B'). Редко встречались непарные пресинаптические структуры (осиротевшие ленты), проявляющиеся в улитках стареющих песчанок. Улитку старой песчанки (рисунок 1В) обрабатывали автофлуоресцентным гасителем. Метка IHC кажется слабее, хотя мощность лазера, используемая в этом образце, была в три раза выше, чем у улитки у молодой взрослой песчанки. Тем не менее, IHC по-прежнему отличаются от фона. Пред- и постсинаптические структуры хорошо видны, и мощность лазера, используемая для обоих этих каналов, была аналогична или даже ниже, чем у молодого взрослого образца. Ткани пожилых животных обычно показывали значительно более неспецифический флуоресцентный сигнал. Поэтому основным отличием протокола для молодого взрослого и пожилого материала является лечение автофлуоресцентным гасителем. Обратите внимание, что это было проведено после иммуноокрашивания флуоресцентными антителами и может, в принципе, также повлиять на предполагаемую метку антитела. Однако лечение эффективно уменьшало постороннюю флуоресценцию неспецифического происхождения, оставляя при этом достаточный сигнал конкретной метки интересующих структур (сравните Рисунок 1В с Рисунком 2В). Предварительные результаты показали, однако, что в stria vascularis посторонняя флуоресценция не проявлялась в образцах от пожилых песчанок.
Примеры стеков, которые были субоптимально обработаны, показаны на рисунке 2. На рисунке 2А показана z-проекция максимальной интенсивности стопки из старой песчанки (36 месяцев), где IHC, которые также были либо неестественно изогнуты, либо разорваны на части, не были отсканированы полностью. В результате на этом сканировании видны только апикальные и базальные полюса IHC. Нельзя исключать, что в отсутствующей средней части IHC располагалось больше синапсов и, следовательно, достоверный анализ невозможен. Таким образом, крайне важно, чтобы все оцениваемые IHC полностью сканировались в конфокальном стеке. На рисунке 2B показана z-проекция максимальной интенсивности стека, отобранного у пожилой песчанки (38 месяцев). Флуоресценция неясного происхождения высока, так как автофлуоресцентный гаситель в данном случае не использовался. Однако посторонняя флуоресценция была в значительной степени ограничена (красным) каналом, связанным с GluA2-меткой, что довольно типично. В таких случаях все еще можно подсчитать функциональные синапсы, если ctBP2-метка лент является относительно чистой и специфичной. На рисунке 2С показана z-проекция максимальной интенсивности стека, полученная от стареющей песчанки (42 месяца). Здесь синапсы не могут быть отнесены к отдельным IHC, поскольку IHC были в значительной степени распавшимися; действительно, трудно быть уверенным в том, сколько IHC представлено. В примере, показанном на фиг.3А, мобильный телефон использовался в непосредственной близости от конфокального микроскопа во время сканирования. Полосы видны в синем канале (метка IHC). К счастью, в данном случае это не повлияло на синаптические каналы и затронуло только верхнюю часть IHC, таким образом, анализ все же был жизнеспособным.
На рисунке 3 показаны z-проекции максимальной интенсивности стеков, взятых из того же куска улитки у молодой взрослой песчанки, приобретенной через 3 месяца (рисунок 3A,A') и 29,5 месяцев (рисунок 3B,B') после иммуноокрашивания. Чтобы оставаться сопоставимыми, изображения были сделаны не из того же места (которое могло пострадать от отбеливания от предыдущего сканирования), а из одного и того же кохлеарного куска. Для сканирования, сделанного в более поздний момент времени, мощность лазера должна была быть увеличена от ~ 2 до 3 раз. Тем не менее, маркированные структуры по-прежнему ясны. Отношение сигнал/шум уменьшилось, особенно в каналах, отображающих постсинаптические и IHC структуры, в то время как канал с пресинаптической меткой был затронут меньше. Количественная оценка функциональных синапсов на IHC все еще возможна.
Типичные результаты анализа объема и положения синапсов на IHC проиллюстрированы на рисунке 4 с использованием конфокального стека, показанного на рисунке 1A. Индивидуально определенные IHC графически отображаются в виде реконструкций сетки в разных цветах, с или без функциональных синапсов (определяемых колокализацией до- и постсинаптических меток), выделенных каждому. Этот дисплей можно свободно поворачивать в 3D для получения различных углов обзора (рисунок 4A,B). IHC также могут быть выделены для графического отображения (рисунок 4B). Получено большое разнообразие графиков данных, иллюстрирующих различные аспекты распределения синаптических объемов в рамках IHC-центрированной системы координат (примеры на рисунке 4C-E). Необработанные количественные данные по каждому IHC и каждому синаптическому элементу также доступны в виде электронных таблиц, которые затем могут, например, быть объединены в несколько конфокальных стеков для дальнейшего статистического анализа.
Рисунок 1: Примеры успешно обработанных улиток. Z-проекции максимальной интенсивности конфокальных стеков от (А) молодой взрослой песчанки (10 месяцев), полученной в кохлеарном месте, соответствующем 1 кГц, и (В) стареющей песчанки (38 месяцев, панель В), полученной в кохлеарном месте, эквивалентном 500 Гц. ИХК окрашивали антителом против myoVIIa (синий), пресинаптические ленты маркировали анти-CtBP2 (зеленым), а постсинаптические глутаматные пластыри были помечены анти-GluA2 (красным цветом). Улитку стареющей песчанки лечили автофлуоресцентным гасителем после иммуноокрашения. Для ясности контуры IHC обозначены пунктирными линиями. Панели (A') и (B') отображают увеличение областей, очерченных квадратами в соответствующих улитках из панелей (A) и (B). Желтые наконечники стрелок указывают на функциональные синапсы. Каналы, отображающие пре- и постсинаптические структуры (но не канал IHC), подверглись деконволюции. Шкала стержней = 10 мкм (A,B), 1 мкм (A',B'). Сокращения: IHC = внутренняя волосковая клетка; myoVIIa = миозин VIIa; CtBP2 = С-концевой связывающий белок 2; GluA2 = ионотропный глутаматный рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Примеры неоптимально обработанных улиток. Z-проекции максимальной интенсивности конфокальных стеков, для которых обработка была неоптимальной, от песчанок, которым было (А) 36 месяцев и (В, С) 38 месяцев, и от кохлеарных мест, соответствующих 16 кГц, 8 кГц и 32 кГц, соответственно. Песчанки, из которых были получены улитки в панелях (A) и (C), были транскардиально перфузированы, а улитка из панели (C) была дополнительно постфиксирована в течение 3 дней в 4% PFA. Улитка из (B) была погружена в 4% PFA в течение 2 дней. Улитки из (А) и (С) обрабатывали автофлуоресцентным гасителем. IHC были окрашены антителом против myoVIIa (синий), пресинаптические ленты были помечены анти-CtBP2 (зеленый), а постсинаптические глутаматные пластыри были помечены анти-GluA2 (красный). Все каналы были деконвированы. Яркость и контрастность были дополнительно скорректированы после конфокального сканирования. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: PFA = параформальдегид; IHC = внутренняя волосковая клетка; myoVIIa = миозин VIIa; CtBP2 = С-концевой связывающий белок 2; GluA2 = ионотропный глутаматный рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Стабильность иммуномарка после длительного хранения. Z-проекции максимальной интенсивности конфокальных стеков от молодой взрослой песчанки (10 месяцев), взятые в кохлеарном месте 16 кГц, (А) через 3 месяца после окрашивания и (В) в несколько более базальном кохлеарном месте на том же кохлеарном куске через 29,5 месяцев после окрашивания. Улитка была погружена в 4% PFA в течение 2 дней. Для ясности (A') и (B') увеличивают только несколько функциональных синапсов из областей, обозначенных квадратами в (A) и (B) соответственно. IHC были окрашены антителом против myoVIIa (синий), пресинаптические ленты были помечены анти-CtBP2 (зеленый), а постсинаптические глутаматные пластыри были помечены анти-GluA2 (красный). Мощность лазера для каналов IHC составила 1,3% и 3%, для пресинаптических каналов 0,4% и 1,1%, а для постсинаптических каналов 1,1% и 2% в (A) и (B) соответственно. Обратите внимание, что в (A) синие полосы видны в верхней части IHC, которые являются результатом использования мобильного телефона в непосредственной близости от конфокального микроскопа. Шкала стержней = 10 мкм (A, B), 1 мкм (A', B'). Сокращения: PFA = параформальдегид; IHC = внутренняя волосковая клетка; myoVIIa = миозин VIIa; CtBP2 = С-концевой связывающий белок 2; GluA2 = ионотропный глутаматный рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты количественной оценки объема синапсов. (A) Десять IHC показаны в виде реконструкций сетки различного цвета на основе иммуноблабеля myoVIIa. Связанные с ними функциональные синапсы, определяемые колокализованными ctBP2-(зелеными) и GluA2-мечеными элементами (красный), отображаются вместе с IHC, а также отдельно ниже, для ясности. Обратите внимание, что угол обзора был выбран перпендикулярно длинной оси IHC и, таким образом, отличается от исходного конфокального изображения (рисунок 1A). (B) Один из выделенных и показанных IHC повернут на 90°. Черная плоскость была вручную определена пользователем и делит IHC пополам вдоль своей полюсно-модиолярной оси. (C) Пузырьковый график, показывающий расположение всех функциональных синапсов в этом конфокальном стеке относительно нормализованных трех осей их соответствующих IHC. размер символов пропорционален объему пресинаптического элемента. Обратите внимание, что угол обзора был выбран таким образом, чтобы быть похожим на панель (B). (D) Boxplot нормализованных объемов синаптических элементов, отдельно для пресинаптических (слева 2 коробки) и постсинаптических (справа 2 коробки) партнеров функциональных синапсов и далее разделенных в соответствии с их положением в модиолярной или столбовой половине их соответствующих IHC (разные цвета). Квадраты представляют собой межквартильные диапазоны, причем медианы обозначены линиями. Пунктирные усы указывают на 1,5-кратный межквартильный диапазон, а крестики указывают на отдаленные значения за пределами этого. (E) Диаграмма рассеяния нормализованных объемов пред- и постсинаптических партнеров функциональных синапсов. Различные символы обозначают положение в модиолярной или столбовой половине их соответствующих IHC. Сокращения: IHC = внутренняя волосковая клетка; myoVIIa = миозин VIIa; CtBP2 = С-концевой связывающий белок 2; GluA2 = ионотропный глутаматный рецептор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Расстояния от вершины, эквивалентные конкретным целевым частотам в улитках различной длины. Эквивалентные лучшие частоты были рассчитаны на основе уравнения, заданного Мюллером25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С помощью метода, описанного в этом протоколе, можно иммуномаркировать IHC и синаптические структуры в улитках молодых взрослых и пожилых песчанок, идентифицировать предполагаемые функциональные синапсы путем совместной локализации пре- и постсинаптических элементов, распределить их по отдельным IHC и количественно оценить их количество, объем и местоположение. Антитела, используемые в этом подходе, также маркировали наружные волосковые клетки (OHCs; myoVIIa) и их пресинаптические ленты. Кроме того, жизнеспособной альтернативой иммуномаркировке как IHC, так и OHCs является антитело против отоферлина, причем OHC кажутся намного слабее, чем IHC.
Перфузия может осуществляться с использованием двух различных установок. 1) Система капельной линии с гравитационной подачей, в которой одна бутылочка, подающая коммерческую капельную линию, подвешена на колесе шкива примерно в 1,5 м над животным. Жидкости вводят последовательно после опускания бутылки, которая открыта сверху. 2) Система, использующая цифровой перистальтический насос с переменной скоростью, с тонкой длинной трубкой, открытой на одном конце, чтобы принять жидкость, и иглой, которая может быть легко прикреплена на другом конце. Оба работают одинаково хорошо, и тонкие различия здесь не будут подробно рассмотрены. Авторы специально рекомендуют, однако, пуховый верстак в стиле черновика, с животным на перфорированной платформе и парами, отводимыми ниже. Это обеспечивает хороший доступ к хирургической области без ущерба для функции выхлопа (в отличие от работы в открытом вытяжном шкафу).
Правильная фиксация ткани имеет решающее значение, так как в противном случае сенсорный эпителий будет отделяться и распадаться во время рассечения. У песчанки необходимо более длительное воздействие фиксатора, чем обычно используется (например, для мышей17,27,13 или морских свинок28). Предпочтительным методом для песчанок является быстрое извлечение улитки после смерти животного и погружение-фиксация в течение не менее 1,5 дней. Если сердечно-сосудистая перфузия предпочтительнее, очень важно, чтобы фиксация наступила в течение нескольких минут и протекала хорошо. Поскольку в конечном итоге может быть трудно оценить качество фиксации во время перфузии, рекомендуется регулярно постфиксировать улитки, как описано.
Важно соблюдать этапы стирки, в соответствии с которыми последний этап стирки (шаг 2.7) является наиболее важным. При недостаточной промывке ткань становится липкой и прилипает к инструментам рассечения, что затрудняет рассечение. Также рекомендуется использовать автофлуоресцентный гаситель в улитках, собранных из выдержанных песчанок, чтобы уменьшить неспецифическую флуоресценцию. Аутофуоресценция может происходить от липофусцина, который распространен в тканях пожилых животных 29,30,31 и, по-видимому, широко возбуждается, а также широко излучает. При возбуждении с длиной волны в УФ-спектре (λ = 364 нм) липофусцин имеет широкий диапазон излучения (λ = 400-700 нм, с максимумом при ~λ = 568 нм)32. В ткани миокарда человека липофусцин виден с возбуждением λ = 555 нм и излучением λ = 605 нм33. Аналогичным образом, в IHC песчанок авторы заметили увеличение неспецифической флуоресценции наиболее заметно в канале, используемом для антител AF568, что предполагает аутофуоресценцию из гранул липофусцина. Таким образом, общей рекомендацией при работе с тканями животных является использование полосы возбуждения около 550-600 нм для наименее критического иммуноблока.
Измерение общей кохлеарной длины и правильное определение конкретных кохлеарных положений возможно только при условии сохранения всей его длины. Если части сенсорного эпителия теряются при рассечении, рекомендуется все же смонтировать оставшуюся часть или даже только спиральный ганглиозный кусок и вести подробные записи. Затем обычно можно оценить недостающий участок с разумной точностью. Если верхушечные части улитки полностью сохранены, но базальный конец отсутствует, конкретные кохлеарные места на апикальной части могут быть определены путем вычисления положений на основе медианной кохлеарной длины в используемой популяции песчанок, поскольку отклонение от реального значения невелико.
Важным ограничением количественной оценки объема синапсов является то, что результирующие абсолютные объемы несопоставимы между различными конфокальными стеками. Критическим этапом, определяющим результирующие объемы синаптических элементов, является выбор порога интенсивности для первоначального обнаружения. Однако выбор этого порога интенсивности делается субъективно пользователем в текущем протоколе и многих других 3,27,34. Кроме того, яркость иммунофлуоресценции в конфокальном изображении зависит от многих факторов, которые очень трудно стандартизировать по образцам, таких как толщина ткани, ориентация ткани относительно оптического пути, продолжительность лазерного воздействия и точные конфокальные и деконволюционные настройки. Все эти предостережения усугубляются, если редкий материал приобретается в течение значительного периода времени, как это характерно для стареющих песчанок. В совокупности это означает, что смещения очень трудно исключить в объединенных данных, и лучшим сценарием является набор данных с высокой дисперсией. Таким образом, рекомендуется регулярно нормализовать синаптические объемы до соответствующего медианного объема отдельного конфокального стека, как это было введено Liberman et al.3. Очевидным недостатком является то, что синаптические объемы сопоставимы только в пределах данного стека изображений, например, между различными местами на IHC, но не между различными кохлеарными местоположениями или возрастом образцов.
Двойная маркировка пре- и постсинаптических структур и требование колокализации позволяют более надежно оценить количество функциональных синапсов, чем использование только любой метки. Если возможна только одна метка, рекомендуется использовать пресинаптический анти-CtBP2, связанный с AF488 или флуоресцентными метками с аналогичной спецификой длины волны, по двум причинам. Во-первых, осиротевшие ленты, то есть элементы, меченые CtBP2 без колокализованной постсинаптической метки, по-видимому, редки17, и авторы подтвердили это для пожилых песчанок. Таким образом, ошибка, возникающая из-за невозможности проверить совместную локализацию с постсинаптическим партнером, невелика. Следует, однако, отметить, что это становится более серьезной проблемой при изучении ушей, подвергающихся воздействию шума (например, 28). Во-вторых, в случаях с высоким флуоресцентным сигналом неясного происхождения шум обычно воздействовал на канал, используя длину волны возбуждения около 568 нм в наибольшей степени (пример на рисунке 2B, представляющем метку GluA2). По меньшей мере часть этого шума может быть в тканях пожилых животных автофлуоресценцией липофусцина. Таким образом, чтобы максимизировать шанс на чистую, единую анти-CtBP2 метку, желательно избегать этого канала длины волны. Наконец, было показано, что при надлежащих прохладных и темных условиях хранения используемая здесь иммуномаркировка стабильна в течение длительных периодов времени, по крайней мере, до 2,5 лет (рисунок 3B), что делает возможной повторную оценку ценных тканей, таких как у пожилых песчанок.
Количественная оценка числа афферентных синапсов IHC стала важной метрикой для оценки состояния периферической слуховой системы во многих контекстах, среди которых возрастная потеря слуха. В настоящее время опубликованы различные протоколы (например, песчанки21, мыши17,13, морские свинки10,28 и люди35). Метод, описанный здесь, в своих деталях специфичен для молодых взрослых и пожилых песчанок, но были получены некоторые общие рекомендации, которые могут быть полезны и у других видов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность Личун Чжану за помощь в создании метода и Службы флуоресцентной микроскопии Университета Карла фон Осецкого в Ольденбурге за использование средств визуализации. Это исследование финансировалось Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии - EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H.
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
