Summary
Viene presentato un protocollo per l'elaborazione di coclee di gerbillo giovani adulti e invecchiati immunomarcando le strutture sinaptiche afferenti e le cellule ciliate, spegnendo l'autofluorescenza nei tessuti invecchiati, sezionando e stimando la lunghezza delle coclee e quantificando le sinapsi in pile di immagini ottenute con l'imaging confocale.
Abstract
Si presume che la perdita di sinapsi a nastro che collegano le cellule ciliate interne e le fibre nervose uditive afferenti sia una delle cause della perdita dell'udito legata all'età. Il metodo più comune per rilevare la perdita di sinapsi del nastro è l'immunolabeling perché consente il campionamento quantitativo da diverse posizioni tonotopiche in una singola coclea. Tuttavia, le strutture di interesse sono sepolte in profondità all'interno della coclea ossea. I gerbilli sono usati come modello animale per la perdita dell'udito legata all'età. Qui vengono descritti i protocolli di routine per la fissazione, l'immunolabeling dei gerbilli cocleari interi mount, l'imaging confocale e la quantificazione dei numeri e dei volumi delle sinapsi del nastro. Inoltre, vengono evidenziate le particolari sfide associate all'ottenimento di buon materiale da individui invecchiati di valore.
I gerbilli vengono eutanasizzati e perfusi per via cardiovascolare, o le loro bolle timpaniche vengono accuratamente sezionate fuori dal cranio. Le coclee vengono aperte all'apice e alla base e trasferite direttamente al fissativo. Indipendentemente dal metodo iniziale, le coclee vengono postfisse e successivamente decalcificate. Il tessuto viene quindi etichettato con anticorpi primari contro le strutture pre- e postsinaptiche e le cellule ciliate. Successivamente, le coclee vengono incubate con anticorpi secondari marcati con fluorescenza che sono specifici contro i rispettivi primari. Le coclee dei gerbilli invecchiati vengono quindi trattate con un quencher di autofluorescenza per ridurre la fluorescenza di fondo tipicamente sostanziale dei tessuti degli animali più anziani.
Infine, le coclee vengono sezionate in 6-11 segmenti. L'intera lunghezza cocleare viene ricostruita in modo tale che specifiche posizioni cocleari possano essere determinate in modo affidabile tra gli individui. Le pile di immagini confocali, acquisite in sequenza, aiutano a visualizzare le cellule ciliate e le sinapsi nei luoghi scelti. Le pile confocali sono deconvolte e le sinapsi vengono contate manualmente utilizzando ImageJ, oppure viene eseguita una quantificazione più estesa delle strutture sinaptiche con procedure di analisi delle immagini scritte su misura in Matlab.
Introduction
La perdita dell'udito legata all'età è una delle malattie più diffuse al mondo che colpisce più di un terzo della popolazione mondiale di età pari o superiore a 65 anni e1. Le cause sottostanti sono ancora in discussione e attivamente indagate, ma possono includere la perdita delle sinapsi specializzate che collegano le cellule ciliate interne (IHC) con le fibre nervose uditive afferenti2. Queste sinapsi a nastro comprendono una struttura presinaptica che ha vescicole piene del neurotrasmettitore glutammato legato ad esso, così come i recettori del glutammato postsinaptico α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico (AMPA) 3,4,5. Nel gerbillo, ~ 20 fibre nervose uditive afferenti contattano un IHC 6,7,8. Le fibre sull'IHC di fronte al modiolo si oppongono ai grandi nastri sinaptici, mentre le fibre che si collegano sul lato del pilastro dell'IHC affrontano piccoli nastri sinaptici (cioè nei gatti9, gerbilli7, porcellini d'India10 e topi 3,11,12,13,14). Inoltre, nel gerbillo, la dimensione dei nastri presinaptici e dei cerotti di glutammato postsinaptico sono positivamente correlati 7,14. Le fibre che si oppongono ai grandi nastri sul lato modiolare dell'IHC sono di piccolo calibro e hanno bassi tassi spontanei e soglie elevate15. Ci sono prove che le fibre a basso tasso spontaneo sono più vulnerabili all'esposizione al rumore10 e ai farmaci ototossici16 rispetto alle fibre a bassa soglia ad alta spontaneità, che si trovano sul lato del pilastro degli IHC15.
La perdita di sinapsi del nastro è il primo evento degenerativo nella perdita dell'udito correlata all'età neurale cocleare, mentre la perdita delle cellule gangliari a spirale e delle loro fibre nervose uditive afferenti è in ritardo rispetto a17,18. I correlati elettrofisiologici includono registrazioni delle risposte uditive del tronco cerebrale17 e dei potenziali d'azione composti8; tuttavia, questi non riflettono le sottigliezze della perdita di sinapsi, poiché le fibre a basso tasso spontaneo non contribuiscono a queste misure16. Metriche elettrofisiologiche più promettenti sono l'indice neurale derivato dal potenziale di massa19 e la risposta temporale peristimulo20. Tuttavia, questi sono affidabili solo se l'animale non ha altre patologie cocleari, oltre alla perdita di fibre nervose uditive, che influenzano l'attività delle restanti fibre nervose uditive8. Inoltre, le soglie valutate comportamentalmente nel gerbillo non erano correlate con i numeri di sinapsi21. Pertanto, una quantificazione affidabile delle sinapsi del nastro sopravvissute e, quindi, del numero di fibre nervose uditive funzionali è possibile solo mediante l'esame diretto del tessuto cocleare.
Il gerbillo mongolo (Meriones unguiculatus) è un modello animale adatto per lo studio della perdita dell'udito legata all'età. Ha una breve durata della vita, ha un udito a bassa frequenza simile agli esseri umani, è facile da mantenere e mostra somiglianze con patologie umane legate alla perdita dell'udito legata all'età 2,22,23,24. I gerbilli sono considerati invecchiati quando raggiungono i 36 mesi di età, che è vicino alla fine della loro vita mediadi 22 anni. È importante sottolineare che una perdita di sinapsi del nastro legata all'età è stata dimostrata in gerbilli allevati e invecchiati in ambienti tranquilli 8,21.
Qui viene presentato un protocollo per immunolabel, sezionare e analizzare le coclee da gerbilli di diverse età, dai giovani adulti agli anziani. Vengono utilizzati anticorpi diretti contro i componenti della presinapsi (CtBP2), i cerotti del recettore postsinaptico del glutammato (GluA2) e gli IHC (myoVIIa). Viene applicato un quencher ad autofluorescenza che riduce lo sfondo nelle coclee invecchiate e lascia intatto il segnale di fluorescenza. Inoltre, viene fornita una descrizione di come sezionare la coclea per esaminare sia l'epitelio sensoriale che la stria vascolare. La lunghezza cocleare viene misurata per consentire la selezione di posizioni cocleari distinte che corrispondono a specifiche migliori frequenze25. La quantificazione dei numeri delle sinapsi viene effettuata con il software liberamente disponibile ImageJ26. Un'ulteriore quantificazione dei volumi e delle posizioni delle sinapsi all'interno del singolo HC viene eseguita con un software personalizzato scritto in Matlab. Questo software non è reso disponibile al pubblico, in quanto gli autori non hanno le risorse per fornire documentazione e supporto professionali.
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Protocol
Tutti i protocolli e le procedure sono stati approvati dalle autorità competenti della Bassa Sassonia, Germania, con numeri di permesso AZ 33.19-42502-04-15/1828 e 33.19-42502-04-15/1990. Questo protocollo è per i gerbilli mongoli (M. unguiculatus) di entrambi i sessi. Il giovane adulto si riferisce all'età di 3-12 mesi, mentre i gerbilli sono considerati di età pari o superiore a 36 mesi. Se non diversamente specificato, tamponi e soluzioni possono essere preparati e conservati in frigorifero per un massimo di diversi mesi (4-8 °C). Prima dell'uso, assicurarsi che i tamponi e le soluzioni non siano precipitati.
1. Fissazione e raccolta di organi
NOTA: Se sono necessarie solo le coclee, si consiglia di eseguire la procedura un po 'più semplice di fissazione per immersione. Tuttavia, se è necessario anche un cervello ben conservato, la perfusione transcardica è l'unica opzione. Il fissativo in entrambi i casi è il 4% di paraformaldeide (PFA) nella soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Questo dovrebbe essere appena fatto ma può essere conservato congelato fino all'uso. Utilizzare aliquote di ~ 300 mL per una perfusione transcardica o ~ 50-100 mL per coclea per la fissazione per immersione.
ATTENZIONE: il PFA è una sostanza pericolosa; gestirlo secondo le procedure generali di sicurezza del laboratorio.
- Fissazione per perfusione transcardica
- Lavare la configurazione della perfusione fino a quando il tubo non è privo di bolle d'aria. Riempire il tubo di perfusione con PBS contenente eparina (0,2 ml in 100 ml di PBS) per prevenire la coagulazione del sangue. Interrompere il flusso una volta che il tubo è stato riempito con PBS e la bottiglia di stoccaggio del fluido si è appena svuotata; versare 200 ml di PFA scongelato in esso.
NOTA: la configurazione è ora pronta per l'animale. Il PBS rimanente nel tubo è sufficiente per scovare il sangue e sarà automaticamente seguito dal fissativo una volta ripreso il flusso. - Garantire che sia in atto un sistema di raccolta dei rifiuti per il deflusso di PFA. Usa una cannula fresca (19 G) e avere grandi forbici, pinze (con una punta appiattita), emostati, bisturi o cannula affilata e un tappetino di gomma con spilli a portata di mano.
- Eutanasia del gerbillo con sovradosaggio intraperitoneale di pentobarbital (160 mg / mL, 0,3 mL per animale, intervallo di peso corporeo: 50-120 g). Rimetti l'animale nella sua gabbia. Quando l'arresto respiratorio si manifesta in modo tale che la respirazione diventi irregolare con intervalli di 30 s o più, posizionare il gerbillo sul dorso sul tappetino di gomma e fissare sia le zampe anteriori che una zampa posteriore con gli spilli (lasciare una zampa posteriore libera di muoversi per un migliore giudizio del successo della perfusione; vedere nota dopo il passaggio 1.1.7).
- Per aprire la cavità toracica, sollevare la pelle sopra lo sterno con una pinza e tagliare la pelle a circa 0,5 cm sotto lo sterno con le forbici fino a quando il processus xiphoideus di colore bianco è visibile. Tenere lo sterno al processus xiphoideus con una pinza e tagliare lungo il diaframma per ottenere una buona visione nella cavità toracica. Tagliare le costole lateralmente su entrambi i lati fino a quando non c'è un buon accesso al cuore. Assicurarsi che l'angolo delle forbici sia parallelo e piatto rispetto al corpo del gerbillo per evitare danni agli organi e, quindi, garantire un sistema circolatorio chiuso.
- Bloccare un emostato sullo sterno, sollevare la gabbia toracica e posizionare l'emostato sopra la spalla del gerbillo senza appoggiare l'emostato su nessuna parte del corpo per evitare di bloccare il flusso sanguigno.
- Aprire leggermente il flusso del fluido fino a quando una goccia di PBS fuoriesce dalla cannula (19 G) circa ogni 2 s. Tieni il cuore con una pinza e giralo un po 'a sinistra in modo che il ventricolo sinistro possa essere visto chiaramente. Inserire la cannula nel ventricolo sinistro con un angolo che evita di penetrare nel setto. Tenere l'ago in posizione a mano o con un altro emostato.
NOTA: I ventricoli sinistro e destro possono essere differenziati per le loro diverse tonalità di colore; il ventricolo sinistro appare di colore più chiaro rispetto al resto del tessuto cardiaco. - Aumentare lentamente la pressione del flusso del fluido e aprire l'atrio destro con forbici fini, un bisturi o un'altra cannula. Aprire ulteriormente il flusso del fluido fino a quando non si osservano circa 2-3 gocce/s nella camera di gocciolamento o impostare un flusso di 4 ml / min per la pompa. Una volta che la fissazione del cuore si instaura, assicurarsi che la cannula di perfusione rimanga in posizione senza essere tenuta ulteriormente.
NOTA: I segni di perfusione di successo sono contrazioni muscolari lente, irrigidimento del collo e delle estremità, fegato pallido e polmoni rosei. Il segno di perfusione infruttuosa è lo sbiancamento dei polmoni, che indica che la circolazione polmonare è perfusa a causa della puntura del setto. - In caso di perfusione infruttuosa, provare a spostare la cannula più in alto, nell'aorta, e bloccarla in posizione con un emostato.
- Decapitare il gerbillo. Rimuovere le bolle e tagliarle e romperne l'osso come descritto al punto 1.2.2.
NOTA: Se il tessuto non è sufficientemente fisso, l'epitelio sensoriale si sposterà dall'organo di Corti durante la dissezione. - Se la perfusione non mostra segni di fissazione entro 5-10 minuti, interromperla e seguire immediatamente la procedura riportata di seguito per la fissazione per immersione. Per questo, trattare la coclea come nel passaggio 1.2.2 e postfiggere il tessuto in circa 50-80 ml di PFA al 4% in contenitori con tappo a vite per 1-2 giorni su uno shaker 2D a 8 °C.
NOTA: Poiché può essere difficile valutare la qualità della fissazione durante la perfusione, si consiglia di postfissare regolarmente le coclee come descritto.
- Lavare la configurazione della perfusione fino a quando il tubo non è privo di bolle d'aria. Riempire il tubo di perfusione con PBS contenente eparina (0,2 ml in 100 ml di PBS) per prevenire la coagulazione del sangue. Interrompere il flusso una volta che il tubo è stato riempito con PBS e la bottiglia di stoccaggio del fluido si è appena svuotata; versare 200 ml di PFA scongelato in esso.
- Fissazione per immersione tissutale
- Eutanasia dei gerbilli con sovradosaggio intraperitoneale di pentobarbital (160 mg / mL, 0,3 mL per animale, intervallo di peso corporeo: 50-120 g). Quando il gerbillo ha smesso di respirare, decapitare l'animale.
- Rimuovere le bolle e tagliare e rompere il suo osso con forbici e pinze, rispettivamente, per raggiungere le coclee. Rimuovere il maellus, l'incus e i canali semicircolari. Fai piccoli fori all'apice e nel giro basale grattando attentamente l'osso cocleare con una pinza. Trasferire immediatamente le bolle in un eccesso di fissativo freddo (almeno 50 ml) e fissare il tessuto al freddo (4-8 °C) sotto agitazione delicata (2D-shaker [100 rpm]) per 2 giorni.
NOTA: Dopo aver fissato il tessuto, le coclee possono essere lavorate immediatamente o conservate in PBS con sodio azide allo 0,05%. ATTENZIONE: l'azide di sodio è tossico. Si noti che la durata della conservazione può influenzare negativamente la qualità della colorazione. Studi limitati hanno suggerito che l'immunocolorazione appariva più debole dopo 2 anni di conservazione del tessuto in azide di sodio.
2. Preparazione dei tessuti e immunolabeling
- Sciogliere la polvere di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS per produrre una soluzione da 0,5 M a pH 8. Per questo, posizionare un becher su un agitatore magnetico, riempirlo con circa la metà della quantità totale del PBS e aggiungere la quantità appropriata di polvere di EDTA, con conseguente sospensione acida. Aggiungere con attenzione la soluzione concentrata di idrossido di sodio (NaOH) durante il monitoraggio del pH con un pHmetro. Riempire con PBS fino al volume finale desiderato e filtrare la soluzione per prevenire la contaminazione microbica.
NOTA: La polvere di EDTA si dissolverà completamente solo quando la sospensione avrà raggiunto un valore di pH neutro. - Per la decalcificazione, trasferire le coclee a 80 ml di 0,5 M EDTA in PBS. Incubare il tessuto al freddo (4-8 °C) sotto una leggera agitazione sullo shaker 2D (100 giri / min) per 2 giorni.
NOTA: Dopo la fase di decalcificazione, il tessuto può essere conservato in PBS per diversi giorni fino a 3 settimane prima di continuare con le restanti fasi di lavorazione. Per gli anticorpi che etichettano la stria vascolare, è consigliabile tagliare le coclee a metà lungo l'asse modiolare in questo punto (cioè prima dell'immunocolorazione) per garantire un accesso uniforme degli anticorpi ai rispettivi bersagli. Questo è anticorpo-dipendente e non si applica agli anticorpi utilizzati qui per etichettare le strutture sinaptiche e IHC. Utilizzare un pezzo di lama di rasoio frangibile e un supporto per lama (come descritto al punto 4.2) per il taglio. - Eseguire i seguenti passaggi (fino al passaggio 3.2) in tubi di reazione a tenuta sicura da 2 ml. Se il pezzo di tessuto è troppo grande per adattarsi all'interno del tubo, tagliare il tessuto in eccesso con le forbici. Per migliorare la penetrazione degli anticorpi, prima permeabilizzare il tessuto in 1 mL di tritone all'1% (Triton X-100) in PBS sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare il tessuto 3x con 1 mL di tritone allo 0,2% (Triton X-100) in PBS sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuno.
- Per bloccare antigeni non specifici, incubare le coclee in 1 mL di soluzione bloccante (3% albumina sierica bovina [BSA], 0,2% tritone, in PBS) sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente per 1 ora.
NOTA: la soluzione di blocco può essere preparata in anticipo, ma non deve essere più vecchia di ~ 10 giorni. - Diluire i seguenti anticorpi primari appena nella stessa aliquota di soluzione bloccante: anti-mioVIIa (miosina VIIa) per etichettare IHC (coniglio policlonale IgG), diluito 1:400; anti-CtBP2 (C-terminal binding protein 2) per etichettare nastri presinaptici (topo monoclonale IgG1), diluiti 1:400; e anti-GluA2 per etichettare i cerotti del recettore postsinaptico (topo monoclonale IgG2a), diluiti 1:200. Assicurarsi che le coclee siano completamente coperte con la soluzione anticorpale (in genere 0,4 ml) e incubarle a 37 °C per 24 ore.
- Quindi, lavare il tessuto 5x con lo 0,2% di tritone in PBS sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuno. Scegliere gli anticorpi secondari per abbinare le specie ospiti delle loro controparti primarie e di nuovo diluirli nuovamente in 3% BSA, 0,2% tritone, in PBS: capra anti-topo (IgG1)-Alexa fluoroforo (AF) 488, diluito 1:1.000; capra anti-topo (IgG2a)-AF568, diluito 1:500; e asino anti-coniglio-AF647 (IgG), diluito 1:1.000. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento della fluorescenza. Incubare le coclee in 0,4 mL di soluzione di anticorpi secondari a 37 °C per 24 ore.
NOTA: Studi limitati hanno indicato che l'incubazione del tessuto cocleare a 37 °C per 24 ore con anticorpi primari e secondari ha portato a immunocolorazione più brillante rispetto alla procedura di incubazione più comune con temperature più basse e durate più brevi. - Lavare le coclee 2x con 1 mL di tritone allo 0,2% in PBS per 5 minuti ciascuna e 3x con PBS per 5 minuti ciascuna sullo shaker 2D (100 rpm) a temperatura ambiente.
NOTA: Dopo queste fasi di lavaggio, le coclee possono rimanere in PBS in frigorifero a ~ 4 ° C per diversi giorni.
3. Trattamento con quencher ad autofluorescenza (opzionale)
NOTA: Le coclee di gerbilli di mezza età e invecchiati mostrano un'ampia autofluorescenza di fondo. Nel tessuto giovane adulto, il trattamento con un quencher ad autofluorescenza non è necessario. In linea di principio, è possibile applicare il quencher di autofluorescenza prima della procedura di immunocolorazione, che quindi evita qualsiasi riduzione involontaria della fluorescenza anticorpale desiderata. Tuttavia, secondo la scheda tecnica del produttore, l'uso di detergenti (come Triton X-100 nel protocollo attuale) non è più possibile in quanto rimuovono il quencher dal tessuto.
- Tagliare le coclee a metà sotto uno stereomicroscopio, come descritto al punto 4.2.
- Mescolare il quencher ad autofluorescenza con etanolo al 70% per ottenere una soluzione al 5% e incubare le coclee in questa soluzione sullo shaker 2D a temperatura ambiente per 1 minuto. Lavare le coclee 3x con 1 mL di PBS sullo shaker 2D a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuna.
ATTENZIONE: Il quencher ad autofluorescenza è pericoloso e dannoso. Indossare guanti quando si maneggia questa sostanza.
4. Dissezione fine finale
- Seziona la coclea sotto uno stereomicroscopio. Riempi una capsula di Petri in polistirolo e il suo coperchio con PBS e tieni a portata di mano due pinze sottili, le forbici a molla Vannas, un supporto per lame e una lama di rasoio frangibile. Rompere i pezzi dalla lama di rasoio per ottenere una superficie di taglio di ~ 2-4 mm a seconda della fase di dissezione. Preparare un vetrino per microscopio posizionando tre gocce di terreno di montaggio in fila.
NOTA: la superficie di taglio della lama del rasoio svanisce rapidamente. La lama deve essere sostituita dopo aver sezionato e montato circa ogni secondo pezzo della coclea. - Se non è già stato fatto nel passaggio 3.1, prima tagliare la coclea a metà lungo il modiolo sotto uno stereomicroscopio. Per questo, posizionare un pezzo di una lama di rasoio più lungo della lunghezza arrotolata della coclea in un supporto per lame. Metti la coclea nella capsula di Petri e taglia via il tessuto in eccesso con il pezzo di lama di rasoio. Tenere la coclea in posizione con una pinza fine e tagliarla a metà lungo il modiolo.
- Inizia con una metà, ma lascia anche l'altra metà nella capsula di Petri. Fissare con cura la metà cocleare con una pinza in modo tale che il tagliente sia rivolto verso l'alto. Utilizzare forbici a molla fine per tagliare via l'osso della coclea sopra l'elicotrema, coprendo l'apice.
- Per iniziare la separazione dei pezzi cocleari, isolare il giro centrale tagliando con le forbici attraverso il modiolo e il nervo uditivo, sopra (scala vestibuli) e sotto (scala tympani).
- Tagliare l'osso cocleare che copre la stria vascolare all'interno del dotto cocleare. Fai due tagli su entrambi i lati dell'osso cocleare sopra l'organo di Corti e lungo la stria vascolare e usa la lama del rasoio per separare eventualmente i pezzi cocleari.
NOTA: La stria vascolare è facilmente visibile come una striscia scura. Il taglio lungo la stria vascolare lascia intatto l'organo di Corti. - Facoltativo: Per raccogliere la stria vascolare, tagliare con cura tra l'organo di Corti e la stria vascolare per separare i due. Lasciare la stria vascolare collegata al legamento a spirale (attaccato all'osso che copre la superficie esterna della coclea) e rimuovere l'osso decalcificato usando una pinza. Posizionare il pezzo con il lato stria verso l'alto sul vetrino del microscopio in una goccia di mezzo di montaggio.
NOTA: se il pezzo raccolto è curvo troppo forte, potrebbe essere necessario dividerlo in pezzi più piccoli in modo che sia abbastanza piatto per il montaggio sulla slitta. - Trasferire i pezzi cocleari sul coperchio riempito di PBS della capsula di Petri in polistirolo, assicurandosi che i supporti interi cocleari si trovino il più piatti possibile sulla diapositiva. Rimuovere il tessuto in eccesso, come parti del legamento a spirale sul lato abneurale e parti del limbus a spirale sul lato neurale. Rimuovere con cura la membrana tectoriale con una pinza super fine.
- Posizionare i pezzi cocleari sulla diapositiva in una goccia di mezzo di montaggio. Posizionare i supporti cocleari interi con l'organo di Corti rivolto verso l'alto sul vetrino per evitare di oscurare gli IHC nel percorso ottico per l'imaging. Cerca l'invaginazione del limbus a spirale in prossimità degli IHC, che è visibile spostando il pezzo cocleare nel piano sagittale per identificare il lato rivolto verso l'alto.
NOTA: Per ricostruire digitalmente la coclea completa dai suoi singoli pezzi durante l'ulteriore lavorazione, si consiglia vivamente di documentare gli schizzi dei pezzi e annotare i punti di riferimento. Inoltre, i pezzi dovrebbero idealmente essere disposti nell'ordine corretto sulla diapositiva. - Ripetere i passaggi da 4,3 a 4,8 fino a quando l'intera coclea non viene trasferita sul vetrino del microscopio. Se necessario, aggiungere altro mezzo di montaggio, coprire la slitta e sigillare il coperchio in posizione con smalto nero dipinto attorno ai bordi. Lasciare asciugare al buio a temperatura ambiente e poi conservare il vetrino al buio a 4 °C.
NOTA: Anche se parti dell'epitelio sensoriale stesso vengono accidentalmente perse, è importante montare comunque ciò che rimane del pezzo cocleare per una corretta stima della lunghezza.
5. Misurazione della lunghezza cocleare
- Misurare la lunghezza della coclea dalle immagini in campo luminoso dei suoi pezzi utilizzando un sistema di microscopio a epi-fluorescenza e il software associato. Salva immagini a basso ingrandimento (obiettivo 4x) da ogni pezzo cocleare e utilizza lo strumento di misurazione lazo del software del microscopio per tracciare una linea lungo la fila di IHC in ciascuna delle immagini. Calcola la lunghezza totale aggiungendo le lunghezze di tutti i pezzi.
NOTA: quando mancano parti dell'epitelio sensoriale all'interno di un pezzo cocleare, interpolare la linea. - Per definire le posizioni cocleari che dovrebbero essere analizzate in una singola coclea, calcolare le distanze corrispondenti dall'apice usando l'equazione data da Müller25. Segna queste posizioni, ad esempio, su una stampa dei pezzi cocleari.
6. Acquisizione di immagini con un microscopio confocale
- Utilizzare un microscopio confocale con un obiettivo 40x ad immersione in olio (apertura numerica 1.3) e l'olio appropriato per l'imaging ad alta risoluzione.
NOTA: Se il microscopio confocale ha un percorso luminoso invertito, il vetrino deve essere posizionato a testa in giù. In questo caso, dare al campione circa 30 minuti per affondare e riposare stabilmente sul coperchio prima di iniziare la scansione finale. In alternativa, utilizzare un mezzo di montaggio che sia fluido per tutta la durata della dissezione ma si solidifichi in seguito e contemporaneamente conservi la fluorescenza. - Attivare i laser appropriati: in questo protocollo vengono utilizzati due laser a semiconduttore pompati otticamente con lunghezze d'onda di λ = 488 nm e λ = 522 nm e un laser a diodi con una lunghezza d'onda di λ = 638 nm. Scegli l'intervallo di emissione dei tag di fluorescenza (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Poiché un rivelatore ibrido conta i fotoni rilasciati, posizionare la linea laser ad almeno 10 nm di distanza dalla curva di emissione.
NOTA: è importante effettuare controlli preliminari con tessuto monomarcato per garantire che le larghezze di banda del rilevatore scelte separino in modo pulito i canali di colore (cioè, non portino alla diafonia del canale). Le onde radio interferiscono con il rivelatore ibrido, con conseguente numero massimo di fotoni, e quindi causano strisce artefatte nella pila. Pertanto, evitare di utilizzare un telefono cellulare vicino al microscopio. - Ingrandisci il tessuto fino a quando l'immagine si estende su 10 IHC. Scegli la risoluzione dell'immagine in base al campionamento Nyquist, che in genere è ~ 40-60 nm / pixel. Impostare la dimensione del passo nella direzione z su 0,3 μm e la velocità di imaging su 400-700 Hz.
NOTA: entrambe queste impostazioni (dimensioni del passo e velocità di imaging) sono compromessi tra l'utilizzo di parametri di imaging ottimali e il risparmio di tempo di scansione. - Eseguire campionamenti bidirezionali per ridurre i tempi di imaging. Accumulare il telaio per il canale 3x da 488 nm e 638 nm e per il canale 6x da 522 nm; inoltre, media le linee 3x per ogni canale. Scegliete l'inizio e la fine della pila nella dimensione z.
- Impostare il guadagno su 100 quando si utilizza il rilevatore ibrido (modalità di conteggio) per evitare una diminuzione del rapporto segnale-rumore. Imposta la potenza del laser in modo che nessun pixel sia saturo nella regione di interesse, ma le strutture coprono principalmente l'intera gamma di 8 bit. Inizia con una bassa potenza laser dello 0,5% e aumentala fino a quando le strutture sono visibili.
NOTA: una buona colorazione richiede in genere una potenza laser compresa tra lo 0,1% e il 5%. - Utilizzare un software di deconvoluzione per l'elaborazione post hoc delle pile di immagini per rimuovere l'alone di sfocatura attorno a piccole strutture fluorescenti utilizzando una funzione teorica di diffusione puntuale. Utilizzare le stesse impostazioni per ogni stack all'interno di un esperimento. Salvare le immagini deconvolte come .tif o .ics.
NOTA: L'etichetta myoVIIa (IHC) non beneficia della deconvoluzione e può essere omessa per risparmiare tempo. Il software utilizza i metadati dei file di immagine; tuttavia, è necessario specificare diversi parametri come il percorso della luce, il mezzo di incorporamento o il mezzo di immersione.
7. Quantificazione delle sinapsi
- Apri una copia degli stack deconvolti nel software liberamente accessibile ImageJ con il plugin aggiuntivo Biovoxxel, disponibile anche sul loro sito web.
- Regola i colori dei singoli canali dividendo i canali (Immagine | | colore Split Channels) e unione (Image | | colore Unisci canali) di nuovo, assegnando colori diversi. Convertire l'immagine in uno stack RGB (Image | | colore Impila su RGB) e regola la luminosità e il contrasto (Image | Regolare | | luminosità/contrasto Auto o slider per quanto riguarda il massimo), se necessario, in modo che le strutture pre e postsinaptiche e l'etichetta IHC siano piacevolmente distinte dallo sfondo.
- Scegli cinque IHC ed etichettali con lo strumento di testo (IHC1-IHC5) facendo clic sulla posizione desiderata all'interno dello stack. Apri il ROI manager (Analizza | Strumenti | ROI Manager); attivare la casella di controllo Etichette per etichettare i punti con un numero. Ingrandisci l'IHC di interesse.
- Utilizzare lo strumento punto/multipunto in modalità multipunto (fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento per scegliere tra la modalità punto o multipunto). Fare clic su una sinapsi del nastro funzionale (ad esempio, un nastro presinaptico in stretta giustapposizione a un cerotto glutammato postsinaptico) mentre si scorre attraverso la dimensione z.
NOTA: a seconda della quantità di sovrapposizione e del colore scelto per ciascun canale, i pixel condivisi vengono visualizzati in colore misto. Di solito, la distinzione tra le singole sinapsi funzionali è semplice perché sono sufficientemente distanti l'una dall'altra. - Quando tutte le strutture di interesse sono spuntate, fai clic su Aggiungi nell'interfaccia utente grafica del ROI manager. Fare clic sul nome arbitrario e scegliere Rinomina.
NOTA: le etichette dei punti rimangono ancora su tutti i piani dello stack quando la casella di controllo Mostra tutto è selezionata nel menu delle opzioni dello strumento punto (fare doppio clic sull'icona dello strumento punto ), che consente di evitare di contare più volte la stessa sinapsi della barra multifunzione. - Quando si sceglie l'IHC successivo da contare, evitare di aggiungere inavvertitamente conteggi regolando l'immagine per visualizzare completamente l'IHC successivo con lo strumento manuale. Passare dallo strumento multipunto allo strumento punto per evitare di aggiungere più puncta ai dati memorizzati in precedenza. Fare clic su una struttura di interesse all'interno del prossimo IHC e tornare allo strumento multipunto. Ripetere i passaggi da 7,4 a 7,5 fino a quando non vengono valutati tutti gli IHC di interesse.
- Per salvare i dati, fare clic su un set di dati nel roi manager e quindi su misura. Attendi che venga visualizzata una nuova finestra che elenca i punti dati misurati. Salva questo elenco come file di foglio di calcolo (File | Salva con nome). Salva l'immagine attivando Mostra tutto nel roi manager. Fare clic su Appiattisci per aggiungere in modo permanente le etichette puntiformi allo stack. Quando chiudi la pila di immagini, accetta di salvare le modifiche.
8. Analisi del volume e della posizione delle sinapsi sulla cellula ciliata
NOTA: gli autori hanno utilizzato una procedura programmata su misura basata su Matlab. Poiché non è disponibile al pubblico, è qui delineato solo in termini generali (cfr. anche7). Si prega di contattare l'autore corrispondente se interessati a usarlo. La procedura prevede uno stack di immagini a tripla etichetta (IHC, pre e postsinaptico) in formato TIFF come input, guida l'utente attraverso le varie fasi di analisi tramite un'interfaccia grafica e fornisce un ampio output dei risultati in formato foglio di calcolo.
- Normalizzare la posizione delle strutture sinaptiche in un sistema di coordinate 3D definito dall'estensione del singolo IHC sull'asse pilastro-modiolare e sull'asse cocleare apicale-basale e sull'asse superiore (piastra cuticolare) dell'IHC verso il basso (polo sinaptico).
NOTA: I volumi degli elementi sinaptici (sia pre- che postsinaptici, e il volume combinato di sinapsi funzionali) sono forniti in μm3 e normalizzati al rispettivo valore mediano3.
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Representative Results
Le coclee sono state raccolte dopo perfusione cardiovascolare con fissativo dell'intero animale o rapidamente sezionate dopo l'eutanasia dell'animale e fissate per immersione. Con quest'ultimo metodo, gli IHC sono rimasti in posizione durante la dissezione, mentre, in caso di perfusione infruttuosa e quindi tessuto non sufficientemente fissato, l'epitelio sensoriale è stato spesso distrutto. Si noti che gli autori hanno riscontrato casi in cui la fissazione delle coclee dopo la perfusione transcardica era insufficiente mentre la fissazione del cervello era ancora adeguata. Il tessuto da una perfusione inferiore potrebbe ancora essere salvato aprendo fori nell'apice e nella base cocleare e postfiggendo le coclee per immersione in PFA al 4% per 2 giorni.
La determinazione della lunghezza dell'intera coclea è stata condotta secondo Müller25 per valutare le IHC e le loro sinapsi in posizioni cocleari specifiche, equivalenti a frequenze caratteristiche distinte (Tabella 1). Per questo, le posizioni cocleari desiderate sono state calcolate come percentuali di lunghezza della membrana basilare dalla base cocleare. La lunghezza cocleare mediana di 13 coclee da gerbilli giovani adulti era di 11,3 mm (intervallo interquartile: 11,02-11,52 mm). La lunghezza cocleare mediana di 24 coclee da gerbilli invecchiati era di 11,5 mm (intervallo interquartile: 11,24-11,73 mm). Non c'era alcuna differenza significativa tra la lunghezza delle coclee giovani adulte e quelle anziane ( U-test di Mann-Whitney: U = -1,62, p = 0,105); la mediana complessiva era di 11,48 mm. Si potrebbe sostenere che questa variazione nella lunghezza delle singole coclee era piccola e l'uso di posizioni a lunghezza fissa (in mm) è adeguato. Tuttavia, la funzione luogo-frequenza non è lineare. Pertanto, una deviazione dalla lunghezza mediana causa un errore maggiore per le posizioni cocleari basali rispetto alle posizioni cocleari relativamente più apicali. Ad esempio, per la posizione cocleare equivalente a una frequenza di 1 kHz, calcolata in base alla lunghezza cocleare mediana (cioè 11,48 mm), la frequenza corrispondente variava da 1,16 kHz a 0,91 kHz rispettivamente per la coclea più corta (10,36 mm) e la coclea più lunga (12,28 mm) in questo campione. Per una frequenza localizzata basalmente (ad esempio, 32 kHz), la gamma di frequenza era da 51,62 kHz a 23,97 kHz, rispettivamente per la coclea più corta e più lunga. Pertanto, è consigliabile calcolare le singole posizioni su ciascuna coclea, in particolare quando si esaminano le posizioni cocleari basali.
La Figura 1 illustra le proiezioni di dimensioni z di intensità massima delle coclee di un giovane adulto (10 mesi, Figura 1A) e di un gerbillo invecchiato (38 mesi, Figura 1B), che sono esempi di immunolabel ideali. Nell'immagine raffigurante la coclea del gerbillo giovane adulto, gli IHC marcati myoVIIa, qui mostrati in blu, sono in netto contrasto con lo sfondo nero. Pertanto, i singoli IHC sono facilmente rilevabili. Le strutture pre- e postsinaptiche sono chiaramente visibili come elementi verdi e rossi, rispettivamente. Si presume che formino una sinapsi funzionale ogni volta che si trovano in stretta giustapposizione (Figura 1A',B'). Raramente c'erano strutture presinaptiche spaiate (nastri orfani) evidenti nelle coclee di gerbilli invecchiati. La coclea del vecchio gerbillo (Figura 1B) è stata trattata con il quencher ad autofluorescenza. L'etichetta IHC appare più debole, anche se la potenza laser utilizzata in questo campione era tre volte superiore a quella utilizzata per la coclea dal gerbillo giovane adulto. Tuttavia, gli IHC sono ancora distinti dallo sfondo. Le strutture pre e postsinaptiche sono chiaramente visibili e la potenza laser utilizzata per entrambi i canali era simile o addirittura inferiore a quella del giovane esemplare adulto. Il tessuto di animali anziani in genere mostrava un segnale fluorescente significativamente più non specifico. Pertanto, la principale differenza nel protocollo per il materiale giovane adulto e invecchiato è il trattamento con un quencher ad autofluorescenza. Si noti che ciò è stato effettuato dopo l'immunocolorazione con anticorpi marcati con fluorescenza e potrebbe, in linea di principio, influenzare anche l'etichetta anticorpale prevista. Tuttavia, il trattamento ha ridotto efficacemente la fluorescenza estranea di origine non specifica, lasciando un segnale sufficiente dell'etichetta specifica delle strutture di interesse (confrontare la Figura 1B con la Figura 2B). I risultati preliminari hanno indicato, tuttavia, che, nella stria vascolare, la fluorescenza estranea non si è manifestata in campioni di gerbilli invecchiati.
Esempi di stack che sono stati elaborati in modo non ottimale sono illustrati nella Figura 2. La Figura 2A illustra la proiezione z di massima intensità di una pila da un vecchio gerbillo (36 mesi), in cui gli IHC, che erano anche piegati in modo innaturale o strappati, non sono stati scansionati nella loro interezza. Di conseguenza, solo i poli apicali e basali degli IHC sono visibili in questa scansione. Non si può escludere che più sinapsi si trovassero nella parte centrale mancante degli IHC e, pertanto, non è possibile un'analisi affidabile. Pertanto, è fondamentale che tutti gli IHC valutati vengano scansionati completamente nella pila confocale. La Figura 2B mostra la proiezione z di intensità massima di una pila campionata in un gerbillo invecchiato (38 mesi). La fluorescenza di origine poco chiara è elevata in quanto il quencher di autofluorescenza non è stato utilizzato in questo caso. Tuttavia, la fluorescenza estranea era in gran parte limitata al canale (rosso) associato all'etichetta GluA2, che è abbastanza tipica. In questi casi, potrebbe essere ancora possibile contare le sinapsi funzionali se l'etichetta CtBP2 dei nastri è relativamente pulita e specifica. La Figura 2C illustra la proiezione z di intensità massima di una pila ottenuta da un gerbillo invecchiato (42 mesi). Qui, le sinapsi non possono essere assegnate a singoli IHC poiché gli IHC sono stati in gran parte disintegrati; in effetti, è difficile essere sicuri di quanti IHC siano rappresentati. Nell'esempio mostrato nella Figura 3A, un telefono cellulare è stato utilizzato in prossimità del microscopio confocale durante la scansione. Le strisce sono visibili nel canale blu (etichetta IHC). Fortunatamente, in questo caso, questo non ha influenzato i canali sinaptici e ha interessato solo la parte superiore degli IHC, quindi un'analisi era ancora praticabile.
La Figura 3 mostra le proiezioni z di intensità massima di pile prelevate dallo stesso pezzo di coclea da un gerbillo giovane adulto, acquisite 3 mesi (Figura 3A,A') e 29,5 mesi (Figura 3B,B') dopo l'immunocolorazione. Per rimanere comparabili, le immagini non sono state prese dalla stessa identica posizione (che potrebbe aver subito lo sbiancamento dalla scansione precedente) ma dallo stesso pezzo cocleare. Per la scansione effettuata nel momento successivo, la potenza del laser doveva essere aumentata da ~ 2 a 3 volte. Tuttavia, le strutture etichettate sono ancora chiare. Il rapporto segnale-rumore era diminuito, specialmente nei canali che mostravano strutture postsinaptiche e IHC, mentre il canale con l'etichetta presinaptica era meno influenzato. La quantificazione delle sinapsi funzionali per IHC è ancora possibile.
I risultati tipici per l'analisi del volume e della posizione delle sinapsi sull'IHC sono illustrati nella Figura 4, utilizzando lo stack confocale mostrato nella Figura 1A. Gli IHC definiti individualmente vengono visualizzati graficamente come ricostruzioni di griglie in diversi colori, con o senza le sinapsi funzionali (definite dalla colocalizzazione delle etichette pre- e postsinaptiche) assegnate a ciascuna. Questo display può essere ruotato liberamente in 3D per ottenere vari angoli di visione (Figura 4A,B). Gli IHC possono anche essere individuati per la visualizzazione grafica (Figura 4B). Viene prodotta una grande varietà di grafici di dati, che illustrano diversi aspetti della distribuzione dei volumi sinaptici all'interno del sistema di coordinate centrato su IHC (esempi nella Figura 4C-E). I dati quantitativi grezzi per ogni IHC e ogni elemento sinaptico sono disponibili anche come fogli di calcolo che possono, ad esempio, essere combinati su diversi stack confocali per ulteriori analisi statistiche.
Figura 1: Esempi di coclee elaborate con successo. Proiezioni z di intensità massima di pile confocali da (A) un gerbillo giovane adulto (10 mesi), ottenuto in una posizione cocleare corrispondente a 1 kHz, e (B) un gerbillo invecchiato (38 mesi, pannello B), ottenuto in una posizione cocleare equivalente a 500 Hz. Le IHC sono state colorate con un anticorpo contro la mioVIIa (blu), i nastri presinaptici sono stati etichettati con anti-CtBP2 (verde), e i cerotti postsinaptici di glutammato sono stati etichettati con anti-GluA2 (rosso). La coclea del gerbillo invecchiato è stata trattata con un quencher di autofluorescenza dopo l'immunocolorazione. Per chiarezza, i contorni degli IHC sono indicati da linee tratteggiate. I pannelli (A') e (B') mostrano un ingrandimento delle aree delineate dai quadrati nelle coclee corrispondenti dai pannelli (A) e (B). Le punte di freccia gialle puntano a sinapsi funzionali. I canali che mostravano le strutture pre- e postsinaptiche (ma non il canale IHC) subirono la deconvoluzione. Barre di scala = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). Abbreviazioni: IHC = cellula ciliata interna; myoVIIa = miosina VIIa; CtBP2 = proteina legante C-terminale 2; GluA2 = recettore ionotropico del glutammato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempi di coclee trattate in modo non ottimale. Proiezioni z di intensità massima di pile confocali per le quali l'elaborazione non era ottimale, da gerbilli che avevano (A) 36 mesi e (B, C) 38 mesi e da posizioni cocleari corrispondenti rispettivamente a 16 kHz, 8 kHz e 32 kHz. I gerbilli da cui sono state derivate le coclee nei pannelli (A) e (C) sono stati perfusi transcardialmente e la coclea dal pannello (C) è stata inoltre postfissa per 3 giorni nel 4% di PFA. La coclea da (B) è stata fissata per immersione in PFA al 4% per 2 giorni. Le coclee di (A) e (C) sono state trattate con il quencher ad autofluorescenza. Gli IHC sono stati colorati con un anticorpo contro la mioVIIa (blu), i nastri presinaptici sono stati etichettati con anti-CtBP2 (verde) e i cerotti postsinaptici di glutammato sono stati etichettati con anti-GluA2 (rosso). Tutti i canali sono stati deconvolti. Luminosità e contrasto sono stati ulteriormente regolati dopo la scansione confocale. Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: PFA = paraformaldeide; IHC = cellula ciliata interna; myoVIIa = miosina VIIa; CtBP2 = proteina legante C-terminale 2; GluA2 = recettore ionotropico del glutammato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Stabilità dell'immunolabel dopo una conservazione prolungata. Proiezioni z di massima intensità di pile confocali da un gerbillo giovane adulto (10 mesi), prese nella posizione cocleare a 16 kHz, (A) 3 mesi dopo la colorazione e (B) in una posizione cocleare leggermente più basale sullo stesso pezzo cocleare 29,5 mesi dopo la colorazione. La coclea è stata fissata per immersione in PFA al 4% per 2 giorni. Per chiarezza, (A') e (B') ingrandiscono solo alcune sinapsi funzionali dalle aree indicate dai quadrati rispettivamente in (A) e (B). Gli IHC sono stati colorati con un anticorpo contro la mioVIIa (blu), i nastri presinaptici sono stati etichettati con anti-CtBP2 (verde) e i cerotti postsinaptici di glutammato sono stati etichettati con anti-GluA2 (rosso). La potenza laser per i canali IHC è stata dell'1,3% e del 3%, per i canali presinaptici dello 0,4% e dell'1,1% e per i canali postsinaptici dell'1,1% e del 2% in (A) e (B), rispettivamente. Si noti che in (A), le strisce blu sono visibili nella parte superiore degli IHC, che derivano dall'uso di un telefono cellulare nelle immediate vicinanze del microscopio confocale. Barre di scala = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Abbreviazioni: PFA = paraformaldeide; IHC = cellula ciliata interna; myoVIIa = miosina VIIa; CtBP2 = proteina legante C-terminale 2; GluA2 = recettore ionotropico del glutammato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi della quantificazione del volume delle sinapsi. (A) Dieci IHC mostrati come ricostruzioni di griglie di colore diverso basate sulla myoVIIa immunolabel. Le loro sinapsi funzionali associate, definite da elementi colocalizzati CtBP2-(verde) e GluA2-labeled (rosso), sono visualizzate insieme agli IHC, e anche separatamente sotto, per chiarezza. Si noti che l'angolo di visione è stato scelto per essere perpendicolare all'asse lungo degli IHC e quindi differisce dall'immagine confocale originale (Figura 1A). (B) Uno degli IHC individuati e mostrati ruotava di 90°. Il piano nero è stato definito manualmente dall'utente e taglia in due l'IHC lungo il suo asse pilastro-modiolare. (C) Grafico a bolle che mostra la posizione di tutte le sinapsi funzionali in questa pila confocale, rispetto ai tre assi normalizzati dei rispettivi IHC. la dimensione dei simboli è proporzionale al volume dell'elemento presinaptico. Si noti che l'angolo di visione è stato scelto per essere simile al pannello (B). (D) Boxplot dei volumi normalizzati di elementi sinaptici, separatamente per i partner presinaptici (a sinistra 2 caselle) e postsinaptici (a destra 2 scatole) di sinapsi funzionali e ulteriormente separati in base alla loro posizione nella metà modiolare o pilastro dei rispettivi IHC (colori diversi). Le caselle rappresentano intervalli interquartili, con le mediane indicate da linee. I baffi tratteggiati indicano 1,5 volte l'intervallo interquartile e le croci indicano valori periferici oltre a questo. (E) Grafico a dispersione dei volumi normalizzati dei partner pre- vs. postsinaptici delle sinapsi funzionali. Simboli diversi indicano la posizione nella metà modiolare o pilastro del rispettivo IHC. Abbreviazioni: IHC = cellula ciliata interna; myoVIIa = miosina VIIa; CtBP2 = proteina legante C-terminale 2; GluA2 = recettore ionotropico del glutammato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Distanze dall'apice equivalenti a specifiche frequenze target in coclee di diversa lunghezza. Le migliori frequenze equivalenti sono state calcolate sulla base dell'equazione data da Müller25. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Con il metodo delineato in questo protocollo, è possibile immunostare IHC e strutture sinaptiche nelle coclee da gerbilli giovani adulti e anziani, identificare presunte sinapsi funzionali mediante co-localizzazione di elementi pre- e postsinaptici, assegnarle a singoli IHC e quantificare il loro numero, volume e posizione. Gli anticorpi utilizzati in questo approccio hanno anche etichettato le cellule ciliate esterne (OHC; mioVIIa) e i loro nastri presinaptici. Inoltre, una valida alternativa per l'immunolabeling sia delle IHC che delle OHC è un anticorpo contro l'otoferlina, con le OHC che appaiono molto più deboli delle IHC.
La perfusione può essere effettuata utilizzando due diverse configurazioni. 1) Un sistema a goccia alimentato a gravità in cui un singolo biberon che alimenta una linea di gocciolamento commerciale è sospeso su una ruota della puleggia a circa 1,5 m sopra l'animale. I fluidi vengono introdotti successivamente dopo aver abbassato la bottiglia, che è aperta nella parte superiore. 2) Un sistema che utilizza una pompa peristaltica digitale a velocità variabile, con un tubo sottile e lungo aperto a un'estremità per assorbire il fluido e un ago che può essere facilmente fissato all'altra estremità. Entrambi funzionano ugualmente bene, e le sottili differenze non saranno elaborate qui. Gli autori raccomandano specificamente, tuttavia, un banco da lavoro in stile bozza, con l'animale su una piattaforma perforata e i fumi prelevati sotto. Ciò consente un buon accesso all'area chirurgica senza compromettere la funzione di scarico (a differenza del lavoro in un armadio dei fumi aperto).
La corretta fissazione del tessuto è di fondamentale importanza, poiché altrimenti l'epitelio sensoriale si stacca e si disintegra durante la dissezione. Nel gerbillo, è necessaria un'esposizione più prolungata al fissativo rispetto a quella comunemente usata (ad esempio, per topi 17,27,13 o porcellini d'India 28). Il metodo preferito per i gerbilli è l'estrazione rapida della coclea dopo la morte dell'animale e la fissazione per immersione per almeno 1,5 giorni. Se si preferisce la perfusione cardiovascolare, è fondamentale che la fissazione si instauri entro pochi minuti e proceda bene. Poiché può essere difficile valutare in definitiva la qualità della fissazione durante la perfusione, si consiglia di postfissare regolarmente le coclee come descritto.
È importante rispettare le fasi di lavaggio, per cui l'ultima fase di lavaggio (passaggio 2.7) è la più importante. Se non adeguatamente lavato, il tessuto è appiccicoso e aderisce agli strumenti di dissezione, il che rende difficile la dissezione. Si raccomanda inoltre di utilizzare un quencher ad autofluorescenza nelle coclee raccolte da gerbilli invecchiati per ridurre la fluorescenza non specifica. L'autofluorescenza potrebbe provenire dalla lipofuscina, che è comune nei tessuti di animali anziani 29,30,31, e sembra essere ampiamente eccitata e ampiamente emettitrice. Quando eccitata con una lunghezza d'onda nello spettro UV (λ = 364 nm), la lipofuscina ha un ampio intervallo di emissione (λ = 400-700 nm, con un massimo a ~λ = 568 nm)32. Nel tessuto miocardico umano, la lipofuscina è visibile con un'eccitazione di λ = 555 nm ed emissione di λ = 605 nm33. Allo stesso modo, negli IHC dei gerbilli, gli autori hanno notato un aumento della fluorescenza non specifica in modo più prominente nel canale utilizzato per l'anticorpo AF568, che suggerisce l'autofluorescenza dai granuli di lipofuscina. Una raccomandazione generale quando si lavora con tessuti di animali è quindi quella di utilizzare la larghezza di banda di eccitazione intorno a 550-600 nm per l'immunolabel meno critico.
La misurazione della lunghezza cocleare totale e la corretta identificazione di specifiche posizioni cocleari è possibile solo se viene preservata la sua intera lunghezza. Se parti dell'epitelio sensoriale vengono perse nella dissezione, si consiglia di montare ancora la parte rimanente o anche solo il pezzo di ganglio a spirale e tenere note dettagliate. Di solito è quindi possibile stimare la sezione mancante con ragionevole precisione. Se le porzioni apicali della coclea sono completamente conservate, ma manca l'estremità basale, specifiche posizioni cocleari sulla parte apicale potrebbero essere definibili calcolando le posizioni in base alla lunghezza cocleare mediana all'interno della popolazione di gerbillo utilizzata perché la deviazione dal valore reale è piccola.
Un'importante limitazione della quantificazione del volume delle sinapsi è che i volumi assoluti risultanti non sono comparabili tra diversi stack confocali. Il passaggio critico che determina i volumi risultanti di elementi sinaptici è la scelta della soglia di intensità per il rilevamento iniziale. Tuttavia, la scelta di questa soglia di intensità è fatta soggettivamente dall'utente nel protocollo corrente e molti altri 3,27,34. Inoltre, la luminosità dell'immunofluorescenza nell'immagine confocale dipende da molti fattori, che sono molto difficili da standardizzare tra i campioni, come lo spessore del tessuto, l'orientamento del tessuto rispetto al percorso ottico, la durata dell'esposizione laser e le precise impostazioni confocali e di deconvoluzione. Tutti questi avvertimenti sono esacerbati se il materiale raro viene acquisito per un considerevole periodo di tempo, come è tipico per i gerbilli invecchiati. Insieme, ciò significa che i pregiudizi sono molto difficili da escludere nei dati in pool e lo scenario migliore è un set di dati con un'elevata varianza. Si raccomanda quindi di normalizzare regolarmente i volumi sinaptici al rispettivo volume mediano della singola pila confocale, come introdotto da Liberman et al.3. L'ovvio svantaggio è che i volumi sinaptici sono quindi comparabili solo all'interno di un determinato stack di immagini, ad esempio tra diverse posizioni sull'IHC ma non tra diverse posizioni cocleari o età degli esemplari.
La doppia etichettatura delle strutture pre e postsinaptiche e il requisito della co-localizzazione consentono una stima più affidabile del numero di sinapsi funzionali rispetto all'utilizzo di entrambe le etichette da sole. Se è possibile una sola etichetta, si consiglia di utilizzare l'anti-CtBP2 presinaptico, accoppiato a AF488 o tag fluorescenti con specifiche di lunghezza d'onda simili, per due motivi. In primo luogo, i nastri orfani, cioè gli elementi etichettati CtBP2 senza un'etichetta postsinaptica co-localizzata, sembrano essere rari17, e gli autori lo hanno confermato per i gerbilli invecchiati. Pertanto, l'errore introdotto dal non essere in grado di verificare la co-localizzazione con un partner postsinaptico è piccolo. Va notato, tuttavia, che questo diventa un problema più significativo quando si esaminano le orecchie esposte al rumore (ad esempio, 28). In secondo luogo, nei casi con segnale ad alta fluorescenza di origine non chiara, il rumore in genere influenzava il canale utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione intorno a 568 nm nella massima misura (esempio nella Figura 2B, che rappresenta l'etichetta GluA2). Almeno una parte di questo rumore può, nei tessuti di animali anziani, essere autofluorescenza della lipofuscina. Pertanto, per massimizzare la possibilità di un'etichetta anti-CtBP2 singola e pulita, è consigliabile evitare questo canale di lunghezza d'onda. Infine, è stato dimostrato che, con adeguate condizioni di conservazione fredda e buia, l'immunolabeling qui utilizzato è stabile per lunghi periodi di tempo, fino ad almeno 2,5 anni (Figura 3B), il che rende possibile la rivalutazione di tessuti preziosi, come i gerbilli invecchiati.
La quantificazione del numero di sinapsi afferenti IHC è diventata una metrica importante per valutare lo stato del sistema uditivo periferico in molti contesti, tra cui la perdita dell'udito legata all'età. Ci sono vari protocolli pubblicati ora (ad esempio, gerbilli21, topi17,13, porcellini d'India10,28 e umani35). Il metodo qui delineato è, nei suoi dettagli, specifico per i gerbilli giovani adulti e anziani, ma sono state derivate alcune raccomandazioni generali che potrebbero essere utili anche in altre specie.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono Lichun Zhang per aver contribuito a stabilire il metodo e l'unità di servizio di microscopia a fluorescenza, Carl von Ossietzky University di Oldenburg, per l'uso delle strutture di imaging. Questa ricerca è stata finanziata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) nell'ambito della strategia di eccellenza della Germania -EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
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