Summary
يصف هذا البروتوكول الخلايا الظهارية السنخية المستحثة بالإنسان والمستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات من النوع 2 (iAT2s). يمكن استزراع هذه الخلايا كمجالات ذاتية التجديد في ثقافة 3D أو تكييفها مع ثقافة واجهة الهواء السائل (ALI).
Abstract
في الرئة ، الظهارة السنخية هي حاجز مادي من المحفزات البيئية وتلعب دورا أساسيا في التوازن والمرض. الخلايا الظهارية السنخية من النوع 2 (AT2s) هي السلف الاختياري لظهارة الرئة البعيدة. يمكن أن ينتج الخلل الوظيفي والإصابة في AT2s عن أمراض الرئة المختلفة ويساهم فيها. وبالتالي ، فإن تحسين فهم بيولوجيا AT2 أمر بالغ الأهمية لفهم بيولوجيا الرئة والمرض. ومع ذلك ، فإن AT2s البشرية الأولية يصعب عزلها بشكل عام ومحدودة العرض. للتغلب على هذه القيود ، يمكن إنشاء الخلايا الظهارية السنخية من النوع 2 (iAT2s) المستحثة من قبل الإنسان من خلال بروتوكول تمايز موجه يلخص تطور الرئة في الجسم الحي . تنمو iAT2s في ظروف خالية من التغذية ، وتشارك برنامجا نسخيا مع AT2s الأولية للبالغين من البشر ، وتنفذ الوظائف الرئيسية ل AT2s مثل الإنتاج والتعبئة والتغليف وإفراز الفاعل بالسطح. يفصل هذا البروتوكول طرق الحفاظ على iAT2s ذاتية التجديد من خلال المرور التسلسلي في الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) أو تكييف iAT2s مع ثقافة الواجهة السائلة الهوائية (ALI). يتم إنشاء تعليق أحادي الخلية ل iAT2s قبل الطلاء في مصفوفة غشاء قبو ثلاثي الأبعاد (يشار إليها فيما يلي باسم "المصفوفة") ، حيث يتم تجميعها ذاتيا في مجالات ظهارية أحادية الطبقات. يمكن فصل iAT2s في ثقافة 3D بشكل متسلسل إلى معلقات أحادية الخلية ليتم تمريرها أو طلاؤها في ثقافة ALI ثنائية الأبعاد. في ثقافة ALI ، تشكل iAT2s طبقة أحادية مستقطبة مع تعرض السطح القمي للهواء ، مما يجعل هذه المنصة قابلة بسهولة للتعرضات البيئية. وبالتالي ، يولد هذا البروتوكول إمدادا لا ينضب من iAT2s ، حيث ينتج ما يزيد عن 1 × 1030 خلية لكل خلية إدخال عبر 15 ممرا مع الحفاظ على برنامج AT2 المشار إليه بتعبير SFTPCtdTomato . تمثل الخلايا الناتجة منصة قابلة للتكرار وذات صلة يمكن تطبيقها لدراسة الطفرات الجينية أو نماذج التعرض البيئي أو أدوية الفحص.
Introduction
في الرئة ، يكون مجرى الهواء والخلايا الظهارية السنخية أول من يواجه التعرض البيئي المستنشق ، بما في ذلك مسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الهباء الجوي المستنشق والمحفزات الضارة مثل دخان السجائر. الخلايا الظهارية السنخية من النوع 2 (AT2s) ضرورية للحفاظ على توازن الرئة لأنها السلف الاختياري لظهارة الرئة البعيدة ، وتنتج مواد فاعلة بالسطح لتخفيف التوتر السطحي السنخي ، وتركيب الاستجابة المناعية الفطرية للتعرض المستنشق 1,2. ومع ذلك ، يمكن أن ينتج خلل AT2 عن إصابات الرئة أو الطفرات في الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل انتقائي في AT2s ، مثل SFTPC و SFTPB و ABCA3 3,4,5. اعتمدت الأساليب السابقة لدراسة هذه الطفرات الجينية على نماذج الفئران6 أو النواقل الهندسية المحتوية على الطفرات التي تم إدخالها في خطوط الخلايا الخالدة7. لذلك ، هناك حاجة إلى منصات يمكنها نمذجة آثار الاضطرابات الجينية والبيئية على AT2s في أنواع الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وفي نظام منتج في المختبر لفهم الدور الذي تلعبه AT2s في الصحة والمرض.
من حيث نمذجة التعرضات المحمولة جوا ، تم استخدام مزارع واجهة الهواء السائل (ALI) للخلايا الظهارية الأولية في مجرى الهواء بنجاح للكشف عن الاستجابات الجزيئية الرئيسية لدخان السجائر8 ونمذجة عدوى مجرى الهواء 9,10. نظام زراعة ALI مماثل للظهارة السنخية ، وهو موقع رئيسي للعدوى أو الإصابة في المرض ، أقل تطورا بكثير مقارنة بنظام النموذج الظهاري في مجرى الهواء. تم استزراع خطوط الخلايا الخالدة في ALI كوكيل للظهارة السنخية11,12 ، ولكن هذه الخطوط الخلوية متميزة نسخيا عن الخلايا الظهارية السنخية الأولية 13 وتفتقر إلى الآلات الخلوية الرئيسية ، مثل القدرة على إفراز المواد الخافضة للتوتر السطحي أو تشكيل تقاطعات ضيقة في ALI 12. يمكن استزراع AT2s البشري الأولي في مجالات ثلاثية الأبعاد في وجود الخلايا الليفية 1,14 ولكنها تخضع لقيود ، بما في ذلك محدودية إمكانية الوصول من الرئتين الخارجيتين وميلها إلى الشيخوخة أو فقدان النمط الظاهري الخلوي في معظم الثقافات حتى الآن. تمثل هذه الخصائص حواجز أمام الاعتماد الواسع النطاق ل AT2 الأولي في الدراسات المخبرية ، على الرغم من إحراز تقدم حديث في تحسين الثقافات ثلاثية الأبعاد الخالية من التغذية لتوسيع AT2s الأولية15،16،17،18.
تم تطوير بروتوكولات التمايز الموجهة لتلخيص المعالم التنموية في الجسم الحي لتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستمدة من الإنسان (iPSC) من النوع 2 من الخلايا الظهارية السنخية (iAT2s)19. تنمو iAT2s كمجالات ذاتية التجديد في ثقافة خالية من المصل ثلاثي الأبعاد في وسط محدد يحتوي على CHIR99021 و KGF و dexamethasone و cAMP و 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) ، يطلق عليه "CK + DCI"19 ، في حالة عدم وجود مغذيات الخلايا الليفية ويمكن استزراعه لمدة >20 مقطع20,21. علاوة على ذلك ، تشترك iAT2s في برنامج النسخ مع AT2s الأولية للبالغين ، وتشكل أجساما صفائحية ، وتنتج وتعبئتها الفاعل بالسطح19،21،22. يفصل هذا البروتوكول المرور التسلسلي ل iAT2s عن طريق فصل الخلايا إلى تعليق أحادي الخلية. في هذه المرحلة ، يمكن إعادة طلاء iAT2s وتوسيعها بشكل أكبر في ثقافة 3D أو طلائها في ثقافة 2D ALI23. يمكن استخدام هذه الطرق لدراسة البيولوجيا الجوهرية ل AT2s في التوازن والمرض20,22 ولاستجواب آثار المركبات أو المحفزات في منصة قابلة للتطوير وذات صلة فسيولوجية 23,24 ، كما هو موضح سابقا.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب التي تنطوي على تمايز خطوط iPSC البشرية وفقا لمجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بوسطن (البروتوكول H33122). تم الحصول على الخلايا الليفية الجلدية ، التي تم شراؤها لإعادة برمجتها إلى iPSCs ، من متبرع بموافقة خطية مستنيرة ، بموجب موافقة مكتب حماية البحوث البشرية في كلية الطب بجامعة واشنطن ، سانت لويس ، MO. تم إنشاء iPSCs المعاد برمجتها في مركز الطب التجديدي في جامعة بوسطن ومركز بوسطن الطبي ، بوسطن ، ماساتشوستس.
1. تفكك الأسناخ
- إعداد وسائط تمايز كاملة خالية من المصل (cSFDM) وفقا للتكوين المذكور في الجدول 1.
- قم بإعداد وسائط CK + DCI في قاعدة cSFDM المعدة وفقا للجدول 2.
- ذوبان 2D (الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المؤهلة) و / أو 3D (انخفاض عامل النمو) مصفوفة على الجليد كما هو مطلوب للاحتياجات التجريبية.
- استنشاق كل وسط CK + DCI باستخدام ماصة أو ماصة شفط مع فراغ من قطرات مصفوفة 3D التي تحتوي على alveolospheres ، مشتقة من التمايز الموجه 19 ، في لوحة12 بئر.
- أضف 1 مل من الديسباز (2 ملغم/مل) لكل قطرة. قم بماصة القطيرة بلطف في التباعد باستخدام ماصة P1000. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، وسحب لأعلى ولأسفل مرة واحدة بعد 30 دقيقة.
- انقل المواد العضوية المنفصلة (من الخطوة 1.5) من قطرة مصفوفة واحدة في التباعد إلى أنبوب مخروطي 15 مل. للغسيل ، أضف 10 مل من وسط دولبيكو المعدل من Iscove (IMDM ، انظر جدول المواد).
- جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط supernatant باستخدام ماصة أو ماصة شفط مع فراغ ، وترك أقل قدر ممكن من supernatant.
ملاحظة: من المهم إزالة كل dispase لأن أي dispase المتبقية قد تذوب المصفوفة التي سيتم زرع الخلايا في وقت لاحق. إذا شوهد ضباب واضح فوق الكريات ، فإن dispase لم يذوب المصفوفة تماما ، ويمكن إضافة المزيد من dispase إلى الكريات لمدة 20-30 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية. - أعد تعليق الخلايا في 1 مل من 0.05٪ من التربسين لكل قطرة ونقلها مرة أخرى إلى لوحة 12 بئرا. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12-15 دقيقة. مراقبة الانفصال تحت المجهر. تجنب الإفراط في سحب الخلايا في هذه المرحلة.
ملاحظة: في نهاية الحضانة ، تحتاج الخلايا إلى تحقيق تعليق أحادي الخلية بعد السحب 3-5 مرات باستخدام ماصة P1000. لتمرير iAT2s إلى ALI (الخطوة 3) ، يجب تقليل وقت التربسين (بحد أقصى 12 دقيقة) ، بحيث تكون الخلايا في كتل من 2-3 خلايا بدلا من تعليق خلية واحدة عندما تكون جاهزة للطلاء على إدراج مزرعة الخلية. - أوقف عمل التربسين بحجم متساو من الوسط المحتوي على FBS (10٪ FBS المؤهل ES في DMEM). جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الخلايا ب 10 مل من IMDM. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب للعد، ثم عد الخلايا باستخدام مقياس خلايا الدم (انظر جدول المواد).
ملاحظة: من قطرة مصفوفة واحدة 50 ميكرولتر ملتبسة عند 400 خلية / ميكرولتر ، يكون العائد المتوقع هو 500000 إلى 1.5 × 106 خلايا لكل قطرة. - استخدم التعليق أحادي الخلية لخلايا iAT2 لتوليد الأرجل عن طريق الطلاء في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (الخطوة 2) و / أو الطلاء على إدراج زراعة الخلايا لثقافة ALI (الخطوة 3).
2.3D طلاء iAT2s
- بعد العد (الخطوة 1.11) ، حدد عدد الخلايا المطلوبة لإعادة تدويرها في المصفوفة ثلاثية الأبعاد (400 خلية / ميكرولتر من المصفوفة مع 50-100 ميكرولتر من قطرات المصفوفة ثلاثية الأبعاد لكل بئر من لوحة 12 بئر). جهاز طرد مركزي للخلايا عند 300 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الفائقة باستخدام ماصة.
- إعادة تعليق الخلايا في مصفوفة 3D. أعد التعليق بسرعة وعلى الجليد ، إذا لزم الأمر ، لمنع المصفوفة من البلمرة (التي تحدث عندما تكون دافئة).
- استخدم ماصة P200 لتوزيع قطرة مصفوفة ثلاثية الأبعاد واحدة لكل بئر في لوحة 12 بئرا تم تسخينها مسبقا. ماصة بعناية لتجنب خلق فقاعات في قطرة المصفوفة. لا تسمح لتعليق الخلية بالاستقرار أثناء توزيع قطرات متعددة.
- ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة للسماح لقطرات المصفوفة بالبلمرة.
- أضف 1 مل من CK + DCI + 10 ميكرومتر من Y-27632 متوسطة (انظر جدول المواد) لكل بئر لتغطية قطرة المصفوفة.
- بعد 72 ساعة ، قم بتغيير الوسط إلى CK + DCI بدون 10 ميكرومتر من Y-27632.
- استبدل الوسط ب CK + DCI طازج كل 48-72 ساعة.
ملاحظة: ستحتاج iAT2s عادة إلى المرور كل 10-14 يوما تقريبا، اعتمادا على خط الخلية وكثافة الطلاء.
3. تمرير iAT2s إلى ALI
- قم بإعداد مزارع الخلايا المغلفة حديثا بحجم 6.5 مم قبل 1 ساعة من الاستخدام عن طريق تخفيف المصفوفة ثنائية الأبعاد في خليط النسر المتوسط / المغذيات المعدل F-12 (DMEM / F12) من Dulbecco إلى حل العمل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمصفوفة 2D (انظر جدول المواد). ثم أضف 100 ميكرولتر من المصفوفة المخففة لكل إدراج لمزرعة الخلايا 6.5 مم. اسمح للمصفوفة بالبلمرة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- استنشاق المصفوفة الزائدة من إدراج مزرعة الخلايا باستخدام ماصة أو ماصة شفط مع فراغ وشطفها مرة واحدة باستخدام DMEM / F12. استنشق هذا الغسيل مباشرة قبل إضافة الخلايا.
- بعد العد ، حدد عدد الخلايا المطلوبة لزرع العدد المطلوب من الخلايا في إدراج المزرعة (520000 خلية حية / سم2 ، أي ما يعادل 172000 خلية حية لكل إدراج مزرعة خلايا 6.5 مم). جهاز طرد مركزي للخلايا عند 300 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة أكبر قدر ممكن من supernatant.
- أعد تعليق الخلايا في الحجم المناسب للبذر مع 100 ميكرولتر من CK + DCI + 10 μM Y-27632 لكل إدراج مزرعة خلية (يجب أن يكون تعليق الخلية 1720 خلية / ميكرولتر ). أضف 100 ميكرولتر إلى المقصورة القمية لإدراج مزرعة الخلايا. حرك اللوحة بلطف في نمط متقاطع لضمان توزيع متساو للخلايا عبر إدراج مزرعة الخلايا ، وتأكد من ذلك عن طريق التحقق تحت المجهر في هدف 4x.
ملاحظة: كثافة البذر أمر بالغ الأهمية وقد يتطلب تحسينا ، يتراوح بين 160000 و 300000 خلية لكل إدراج لمزرعة الخلايا 6.5 مم. يمكن إضافة صبغة كالسيين الخضراء (انظر جدول المواد) القابلة للنفاذ الخلوي إلى الخلايا وعرضها على مجهر فلورسنت مقلوب لتصور الخلايا بعد البذر. - أضف 500 ميكرولتر من CK + DCI + 10 ميكرومتر من Y-27632 إلى المقصورة القاعدية الجانبية لكل إدراج لمزرعة الخلايا.
- شفط CK + DCI القمي + 10 ميكرومتر من Y-27632 متوسط 48 ساعة بعد البذر باستخدام ماصة لبدء ALI (المعروف باسم "الرفع الجوي").
ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا ملتقية بنسبة 100٪ في هذه المرحلة. إذا لم تكن الخلايا متقاربة بنسبة 100٪ ، فيجب تنفيذ الخطوات 3.7-3.8 في النقاط الزمنية المشار إليها ؛ قد تستغرق الطبقات الأحادية للخلايا المتقاربة وقتا أطول حتى تتشكل. - قم بتغيير CK + DCI القاعدي الجانبي + 10 ميكرومتر من Y-27632 المتوسط بعد 72 ساعة إلى CK + DCI بدون 10 ميكرومتر Y-27632.
ملاحظة: يجب أن يكون هناك الحد الأدنى من "التسرب" إن وجد من الوسط إلى الجانب القمي. ومع ذلك ، إذا حدث هذا في الأيام القليلة الأولى ، فاستمر في شفط الجانب القمي يوميا حتى لا يكون هناك تسرب آخر. - استبدل الوسط القاعدي الجانبي ب CK + DCI طازج كل 48-72 ساعة.
ملاحظة: يتم نضج iAT2s المستخدمة في ثقافات ALI إلى أقصى حد في 5-14 يوما بعد الطلاء. - حافظ على الخلايا مع مراقبة دقيقة لمدة تصل إلى 28 يوما بعد الطلاء ، إذا لزم الأمر ، لإجراء تجارب أطول أمدا.
ملاحظة: يمكن ملاحظة علامات مرئية لفشل ALI ، مثل تقشير الخلايا بعيدا عن حافة الإدراج أو تكوين ثقوب في الطبقة الأحادية ، بعد وقت طويل في الثقافة ، وعند هذه النقطة لم يعد ALI قابلا للاستخدام في التجارب.
Representative Results
تم تمرير iAT2s إلى تعليق أحادي الخلية ثم أعيد طلاؤه في مصفوفة ثلاثية الأبعاد أو في 2D على إدراج زراعة الخلايا لثقافة ALI (الشكل 1). بعد تفكك الخلية الواحدة ، تم تحليل iAT2s عن طريق قياس التدفق الخلوي. باختصار ، تم تحليل الخلايا المعاد تعليقها في مصل بقري جنيني بنسبة 1٪ (FBS) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع صبغة قابلة للحياة زرقاء كالسين (1: 1000) على مقياس تدفق الخلايا ، بوابة لغير الشظايا ، المفردات ، و tdTomato. هنا ، على سبيل المثال ، هو خط SPC2 (SPC2-ST-B2 استنساخ20) ، الذي يحتوي على مراسل tdTomato يستهدف موقع SFTPC الداخلي لسهولة تصور وتتبع برنامج AT2 بمرور الوقت في الثقافة (الشكل 2A). تم الحفاظ على تعبير iAT2 SFTPC-tdTomato عند طلائه في مصفوفة ثلاثية الأبعاد ككرات (الشكل 2B) وعندما تم طلاؤه على إدراج زراعة الخلايا (الشكل 2C). يمكن قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER) لتحديد سلامة ثقافة ALI (الشكل 2D). لقياس TEER ، تم استخدام مقياس الفولتوهممتر (انظر جدول المواد) ، مع إضافة 100 ميكرولتر من وسط CK + DCI إلى الغرفة القمي. تم التعامل مع إدراج مزرعة الخلايا المغلفة ب Matrigel في غياب الخلايا البذرية على أنها فراغات. تم أخذ القراءات في ثلاثة مواقع في كل بئر.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لسير عمل البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: النتائج التمثيلية للبروتوكول. (أ) نتائج قياس التدفق الخلوي التمثيلي ل SFTPC-tdTomato في الخلايا الظاهرية السنخية المستمدة من النوع 2 المستحثة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستمدة من النوع 2 (iAT2s) المستزرعة في 3D. التحكم السلبي الموضح هو الأديم الباطن غير الرئوي (CD47lo). (ب) التصوير التمثيلي للخلايا الحية ل iAT2s المستزرعة في 3D في أيام مختلفة بعد المرور (dpp) (SFTPC-tdTomato، شريط المقياس = 50 ميكرومتر). (ج) التصوير التمثيلي للخلايا الحية ل iAT2s المطلي بواجهة الهواء السائل (SFTPC-tdTomato، شريط المقياس = 500 نانومتر). (د) المقاومة الكهربائية التمثيلية عبر الظهارية ل iAT2s المطلية في واجهة الهواء والسائل. n = 3 ، تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكواشف | حجم ل 500 مل | التركيز النهائي |
| وسيط دولبيكو المعدل من إسكوف (IMDM) | 375 مل | 75% |
| خليط المغذيات F-12 من لحم الخنزير (F12) | 125 مل | 25% |
| B-27 (مع RA) الملحق | 5 مل | 1% |
| N-2 الملحق | 2.5 مل | 0.50% |
| BSA (7.5٪ من الأسهم) | 3.3 مل | 0.05% |
| بريموسين (50 ملغم/مل من المخزون) | 1 مل | 100 ميكروغرام/مل |
| الجلوتاماكس (100x الأسهم) | 5 مل | 1x |
| حمض الأسكوربيك (50 ملغم / مل من المخزون) | 500 ميكرولتر | 50 ميكروغرام/مل |
| 1-ثيوغليسيرول (MTG) (من 26 ميكرولتر في 2 مل IMDM) | 1.5 مل | 4.5 × 10-4 م |
الجدول 1: تكوين وسائط التمايز الكاملة الخالية من المصل (cSFDM).
| الكاشف | التركيز النهائي |
| CHIR99021 | 3 ميكرومتر |
| رهكغف | 10 نانوغرام/مل |
| ديكساميثازون | 50 نانومتر |
| 8-برومو أدينوسين 30,50-دوري ملح الصوديوم أحادي الفوسفات (cAMP) | 0.1 مللي متر |
| 3-إيزوبوتيل-1-ميثيل زانثين (IBMX) | 0.1 مللي متر |
الجدول 2: تركيبات وسائط CK + DCI.
Discussion
يحافظ AT2s على توازن الرئة ، ويمكن أن يسبب خلل هذه الخلايا السنخية الرئيسية وينتج عن أمراض الرئة المختلفة. نظرا لصعوبة الوصول إلى AT2s البشرية الأولية وعزلها ، يتم إنشاء iAT2s. من خلال تطبيق طرق التمايز الموجهة الموضحة في مكان آخر25 والتوسع وبذر الخلايا الموصوفة هنا ، يمكن تمييز iPSCs الناتجة عن أي فرد إلى iAT2s ذاتية التجديد بقوة ، وبالتالي توفير خلايا خاصة بالمريض للبحوث الطبية الحيوية ، بما في ذلك الدراسات التطويرية الأساسية للبحوث الطبية الحيوية ، أو نمذجة الأمراض ، أو العلاجات القائمة على الخلايا ، أو شاشات الأدوية. يفصل البروتوكول الحالي طريقة لفصل iAT2s إلى تعليق أحادي الخلية ، والذي يمكن بعد ذلك إعادة طلائه في 3D Matrigel لتوليد الأسياج الهوائية لتوسيع الخلية أو إعادة طلائها في ثقافة ALI ثنائية الأبعاد لمزيد من التجارب.
يحتوي البروتوكول على العديد من الخطوات الحاسمة لضمان النجاح في تمرير وإعادة الطلاء في كل من ثقافات 3D و ALI. يجب تقليل التتبع الميكانيكي إلى الحد الأدنى ، لأن السحب المفرط يمكن أن يقلل من صلاحية الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن كثافة البذر من iAT2s في كل من ثقافات 3D و 2D ALI أمر بالغ الأهمية. بالنسبة للثقافة ثلاثية الأبعاد ، بشكل عام ، فإن 400 خلية / ميكرولتر من 3D Matrigel هي الأمثل لمعظم خطوط iPSC. ومع ذلك ، فإن مجموعة من الكثافات من 100-500 خلية / ميكرولتر كانت ناجحة في بعض الأحيان ، وقد تكون هناك حاجة إلى تحسين الكثافة لخطوط الخلايا المختلفة. بالنسبة لثقافة ALI ، يعد تحسين كثافة البذر ل iAT2s على إدخالات مزرعة الخلايا أمرا ضروريا أيضا لتحقيق طبقة أحادية متقاربة من الخلايا بعد 48 ساعة من البذر (أي في يوم الرفع الجوي). تتطلب بعض خطوط iAT2 المزيد من الخلايا لكل إدراج. وبالتالي ، إذا كان استكشاف الأخطاء وإصلاحها مطلوبا ، فمن المستحسن نطاق يتراوح بين 160000 و 300000 خلية / إدراج لإدراج مزرعة الخلايا 24 بئرا. يمكن أيضا توسيع نطاق الثقافات ثلاثية الأبعاد إلى لوحات 24 و 48 بئرا من خلال الحفاظ على كثافة البذر عند 400 خلية / ميكرولتر من المصفوفة ثلاثية الأبعاد وتقليل حجم قطرات المصفوفة إلى 25 ميكرولتر و 20 ميكرولتر ، على التوالي. يمكن تحجيم مزارع ALI إلى إدراج 96 بئرا من مزارع الخلايا عن طريق طلاء كل إدراج ب 30 ميكرولتر من المصفوفة ، وطلاء 80000 خلية في 30 ميكرولتر لكل إدراج ، والتغذية ب 150 ميكرولتر من الوسائط القاعدية الجانبية لكل بئر. يجب قياس كثافة البذر وأحجام المصفوفة والوسائط وتحسينها وفقا لتنسيقات الألواح الأخرى.
أحد قيود هذا البروتوكول هو أن الخلايا المستخدمة في طلاء ALI يجب أن تكون منقية بما فيه الكفاية لتكون NKX2-1+ و SFTPC + 19,20,21,23 لتشكيل iAT2 ALIs ، وقد يختلف تكوين ثقافة ALI من سطر إلى آخر. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح هذا البروتوكول بتوسيع وتوليد ثقافات AT2 فقط ، مما يوفر نظاما نموذجيا اختزاليا يعتمد على نوع خلية سنخية رئيسية واحدة. الأهم من ذلك ، كانت أنواع الخلايا السنخية الأخرى ذات الصلة ، مثل الخلايا السنخية من النوع 1 ، مفقودة من هذه المنصات. وقد حققت مجموعات أخرى نجاحا في زراعة AT2s البشرية الأولية ككرويات أو ثقافات نمطية عضوية مع أو بدون الخلايا الليفية 1،14،15،16،17; ومع ذلك ، تميل AT2s البشرية الأولية إلى فقدان تعبيرها عن المواد الخافضة للتوتر السطحي الرئيسية عند استزراعها في ثقافة ثنائية الأبعاد طبيعية دون شروط ALI26. علاوة على ذلك ، أظهرت الأبحاث الحديثة أن iAT2s تعبر عن علامات تكاثر أعلى وعلامات نضج AT2 أقل من AT2s27 الأولية البشرية الجديدة وغير المستزرعة. على الرغم من هذه الاختلافات بين iAT2s و AT2s البشرية الأولية الطازجة ، وجدنا أنه حتى AT2s الأولية المستزرعة أظهرت اختلافات نسخية من AT2s27 الأولية الطازجة وغير المستزرعة ، وبالتالي استنتجنا أن هذه النماذج في المختبر لها نقاط قوة وقيود مختلفة للنمذجة في بيولوجيا الرئة في الجسم الحي.
يمكن تطبيق منصة iAT2 لدراسة الطفرات الجينية من iPSCsالمشتقة من المريض 19,20. ويمكن أيضا توسيع نطاق النظام إلى حد كبير لاستيعاب فحص الأدوية عالي الإنتاجية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن iAT2 ALIs مناسبة للتعرض البيئي مثل العدوى الفيروسية أو البكتيرية أو التعرض لدخان السجائر أو بخار السجائر الإلكترونية أو الهباء الجوي الآخر23. باختصار ، يسمح هذا البروتوكول لتوليد كل من ثقافات 3D و 2D ALI من iAT2s بزراعة طويلة الأجل لنوع خلية ذات صلة بالمرض ويوفر منصة فسيولوجية قابلة للتطوير تمكن من استخدام هذه الخلايا في العديد من التطبيقات.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر بصدق أعضاء مختبرات ويلسون وكوتون وهوكينز على مناقشاتهم المفيدة. كما أننا ممتنون جدا لجريج ميلر (مدير مختبر CReM) وماريان جيمس (مدير iPSC الأساسي) لدعمهما الذي لا يقدر بثمن. نشكر Brian Tilton و BUMC Flow Cytometry Core على مساعدتهم الفنية في فرز الخلايا (بدعم من منحة المعاهد الوطنية للصحة #1S10OD021587-01A1). تم دعم هذا العمل من خلال زمالة CJ Martin Early Career من المجلس الوطني الأسترالي للصحة والبحوث الطبية الممنوحة ل RBW. منح المعاهد الوطنية للصحة F30HL147426 إلى KMA ؛ جائزة I.M. Rosenzweig للباحث المبتدئ من مؤسسة التليف الرئوي وجائزة منحة تجريبية متكاملة من خلال معهد العلوم السريرية والانتقالية بجامعة بوسطن (1UL1TR001430) إلى KDA ؛ المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (P2ELP3_191217) إلى ABA; تمنح المعاهد الوطنية للصحة U01HL148692 و U01HL134745 و U01HL134766 و R01HL095993 إلى DNK ؛ وتمنح المعاهد الوطنية للصحة U01TR001810 و R01DK101510 و R01DK117940 الممنوحة ل AAW ؛ يتم دعم صيانة iPSC والخدمات المصرفية والمشاركة من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة NO1 75N92020C00005. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
| 12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
| 1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
| 2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
| 3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
| 8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
| Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
| B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
| Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
| Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
| Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
| Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
| Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
| Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
| Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
| Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
| Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. American Review of Respiratory Disease. 115 (6), Pt 2 81-91 (1977).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein C gene associated with familial interstitial lung disease. New England Journal of Medicine. 344 (8), 573-579 (2001).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein B gene responsible for fatal neonatal respiratory disease in multiple kindreds. Journal of Clinical Investigation. 93 (4), 1860-1863 (1994).
- Shulenin, S., et al. ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency. New England Journal of Medicine. 350 (13), 1296-1303 (2004).
- Nureki, S. I., et al. Expression of mutant Sftpc in murine alveolar epithelia drives spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 4008-4024 (2018).
- Katzen, J., et al. An SFTPC BRICHOS mutant links epithelial ER stress and spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (6), 126125 (2019).
- Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (7), 489-503 (2013).
- Purkayastha, A., et al. Direct exposure to SARS-CoV-2 and cigarette Smoke increases infection severity and alters the stem cell-derived airway repair response. Cell Stem Cell. 27 (6), 869-875 (2020).
- Matrosovich, M. N., Matrosovich, T. Y., Gray, T., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4620-4624 (2004).
- Tollstadius, B. F., Silva, A. C. G. d, Pedralli, B. C. O., Valadares, M. C. Carbendazim induces death in alveolar epithelial cells: A comparison between submerged and at the air-liquid interface cell culture. Toxicology in Vitro. 58, 78-85 (2019).
- Winton, H. L., et al. Cell lines of pulmonary and non-pulmonary origin as tools to study the effects of house dust mite proteinases on the regulation of epithelial permeability. Clinical and Experimental Allergy. 28 (10), 1273-1285 (1998).
- Kanagaki, S., et al. Hydroxypropyl cyclodextrin improves amiodarone-induced aberrant lipid homeostasis of alveolar cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 64 (4), 504-514 (2021).
- Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
- Kobayashi, Y., et al. Persistence of a regeneration-associated, transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis. Nature Cell Biology. 22, 934-946 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904 (2020).
- Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
- Alysandratos, K. -D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).
- Hurley, K., et al. Reconstructed single-cell fate trajectories define lineage plasticity windows during differentiation of human PSC-derived distal lung progenitors. Cell Stem Cell. 26 (4), 593-608 (2020).
- Sun, Y. L., et al. Heterogeneity in human iPSC-derived alveolar epithelial type II cells revealed with ABCA3/SFTPC reporters. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 65 (4), 442-460 (2021).
- Abo, K. M., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar type 2 cells mature and respond to environmental exposures in air-liquid interface culture. Journal of Clinical Investigation Insight. 7 (6), (2022).
- Huang, J., et al. SARS-CoV-2 infection of pluripotent stem cell-derived human lung alveolar type 2 cells elicits a rapid epithelial-intrinsic inflammatory response. Cell Stem Cell. 27 (6), 962-973 (2020).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
- Alysandratos, K. D., et al. Impact of cell culture on the transcriptomic programs of primary and iPSC-derived human alveolar type 2 cells. bioRxiv. , (2022).
