Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר תאים דמויי אפיתל דמויי אפיתל פלוריפוטנטיים מסוג 2 המושרים על ידי בני אדם (iAT2s). תאים אלה יכולים להיות מתורבתים ככדורים המתחדשים בעצמם בתרבית תלת-ממדית או מותאמים לתרבית ממשק אוויר-נוזלי (ALI).
Abstract
בריאה, אפיתל הנאדיות הוא מחסום פיזי מגירויים סביבתיים וממלא תפקיד חיוני בהומאוסטזיס ובמחלות. תאי אפיתל מסוג 2 (AT2s) הם האבות הפקולטיביים של אפיתל הריאה הדיסטלית. תפקוד לקוי ופציעה של AT2s יכולים לנבוע ולתרום למחלות ריאה שונות. הבנה משופרת של ביולוגיה של AT2 היא, אם כן, קריטית להבנת הביולוגיה והמחלות של הריאות; עם זאת, בדרך כלל קשה לבודד AT2 אנושיים ראשוניים והם מוגבלים באספקה. כדי להתגבר על המגבלות הללו, תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) שמקורם בתאי אפיתל מסוג 2 (iAT2s) יכולים להיווצר באמצעות פרוטוקול התמיינות מכוונת המשחזר את התפתחות הריאות in vivo . iAT2s גדלים בתנאים נטולי הזנה, חולקים תוכנית תעתיק עם AT2 ראשוניים למבוגרים אנושיים, ומבצעים פונקציות מפתח של AT2 כגון ייצור, אריזה והפרשת חומרים פעילי שטח. פרוטוקול זה מפרט את השיטות לשמירה על iAT2s המתחדשים בעצמם באמצעות מעבר סדרתי בתרבית תלת-ממדית (3D) או התאמת iAT2s לתרבית ממשק אוויר-נוזלי (ALI). תרחיף חד-תאי של iAT2s נוצר לפני הציפוי במטריצת קרום מרתף תלת-ממדית (להלן "מטריצה"), שם הם מרכיבים את עצמם לכדורי אפיתל חד-שכבתיים. iAT2s בתרבית תלת-ממדית יכולים להיות מנותקים באופן סדרתי לתרחיפים חד-תאיים כדי לעבור או לצלוח אותם בתרבית ALI דו-ממדית. בתרבות ALI, iAT2s יוצרים חד-שכבתי מקוטב כאשר המשטח האפי חשוף לאוויר, מה שהופך את הפלטפורמה הזו לניתנת לביצוע בקלות לחשיפות סביבתיות. לפיכך, פרוטוקול זה מייצר אספקה בלתי נדלית של iAT2s, המייצרת למעלה מ-1 x 1030 תאים לכל תא קלט במשך 15 מעברים תוך שמירה על תוכנית AT2 המסומנת על ידי ביטוי SFTPCtdTomato . התאים המתקבלים מייצגים פלטפורמה ניתנת לשחזור ורלוונטית שניתן ליישם כדי לחקור מוטציות גנטיות, למודל חשיפות סביבתיות או לסנן תרופות.
Introduction
בריאה, דרכי הנשימה ותאי האפיתל הנאדיים הם הראשונים שנתקלים בחשיפות סביבתיות בשאיפה, כולל פתוגנים המועברים באמצעות אירוסולים בשאיפה וגירויים רעילים כמו עשן סיגריות. תאי אפיתל נאדיים מסוג 2 (AT2s) חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס של הריאות מכיוון שהם האבות הפקולטיביים של אפיתל הריאה הדיסטלי, מייצרים חומרים פעילי שטח כדי להקל על מתח פני השטח של הנאדיות, ומעלים את התגובה החיסונית המולדת לחשיפות בשאיפה 1,2. עם זאת, תפקוד לקוי של AT2 יכול לנבוע מפציעות ריאה או מוטציות בגנים המתבטאים באופן סלקטיבי ב-AT2s, כגון SFTPC, SFTPB ו-ABCA3 3,4,5. גישות קודמות לחקר המוטציות הגנטיות הללו הסתמכו על מודלים של עכברים6 או על וקטורים מהונדסים המכילים מוטציות שהוכנסו לקווי תאים מונצחים7. לכן, יש צורך בפלטפורמות שיכולות לדגום את ההשפעות של הפרעות גנטיות וסביבתיות על AT2 בסוגי התאים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ובמערכת חוץ גופית פרודוקטיבית כדי להבין עוד יותר את התפקיד ש-AT2 ממלאים בבריאות ובמחלות.
במונחים של מידול חשיפות הנישאות באוויר, תרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) של תאי אפיתל ראשוניים בדרכי הנשימה נוצלו בהצלחה כדי לחשוף תגובות מולקולריות מרכזיות לעשן סיגריות8 ולדגום זיהום בדרכי הנשימה 9,10. מערכת תרבית ALI דומה לאפיתל הנאדי, אתר מפתח של זיהום או פציעה במחלה, מפותחת הרבה פחות בהשוואה למערכת מודל האפיתל של דרכי הנשימה. קווי תאים מונצחים עברו תרבית ב-ALI כפרוקסי לאפיתל הנאדי11,12, אך קווי תאים אלה נבדלים מבחינה תעתיקית מתאי אפיתל נאדיים ראשוניים13 וחסרים מנגנונים תאיים מרכזיים, כגון היכולת להפריש חומרים פעילי שטח או ליצור צמתים הדוקים ב-ALI12. ניתן לתרבת AT2 אנושיים ראשוניים בתחום התלת-ממדי בנוכחות פיברובלסטים 1,14, אך הם כפופים למגבלות, כולל הנגישות המוגבלת מריאות אקספלנט ונטייתן לסנס או לאבד פנוטיפ תאי ברוב התרביות עד כה. מאפיינים אלה מציבים מחסומים לאימוץ נרחב של מחקרי AT2 ראשוניים במבחנה, אם כי לאחרונה הושגה התקדמות באופטימיזציה של תרבויות תלת-ממד ללא מזינים להרחבת AT2s ראשוניים 15,16,17,18.
פרוטוקולי התמיינות מכוונת פותחו כדי לשחזר אבני דרך התפתחותיות in vivo כדי ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בבני אדם (iPSC) שמקורם בתאי אפיתל מסוג 2 (iAT2s)19. iAT2s גדלים ככדורים המתחדשים בעצמם בתרבית תלת-ממדית ללא סרום בתווך מוגדר המכיל CHIR99021, KGF, דקסמתזון, cAMP ו-3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX), המכונה "CK + DCI"19, בהיעדר מזינים פיברובלסטים וניתן לתרבת אותם עבור >20 מעברים20,21. יתר על כן, iAT2s חולקים תוכנית תעתיק עם AT2 ראשוניים בוגרים אנושיים, יוצרים גופים למלריים ומייצרים ואורזים חומרים פעילי שטח 19,21,22. פרוטוקול זה מפרט את המעבר הטורי של iAT2s על ידי ניתוק התאים לתרחיף של תא יחיד. בשלב זה, iAT2s ניתן לצבוע מחדש ולהרחיב עוד יותר בתרבות התלת-ממדית אומצופה בתרבות 23 ALI דו-ממדית. שיטות אלה יכולות לשמש כדי לחקור את הביולוגיה הפנימית של AT2s בהומאוסטזיס ומחלות20,22 ולחקור את ההשפעות של תרכובות או גירויים בפלטפורמה ניתנת להרחבה ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית23,24, כפי שהוכח בעבר.
Protocol
כל הניסויים שכללו הבחנה של קווי iPSC אנושיים בוצעו בהתאם למועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת בוסטון (פרוטוקול H33122). הפיברובלסטים העוריים, שנרכשו לצורך תכנות מחדש ל-iPSCs, התקבלו מתורם בהסכמה מדעת בכתב, באישור המשרד להגנת המחקר האנושי של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס, מיזורי.
1. דיסוציאציה אלוואולוספירה
- הכינו מדיית הבחנה מלאה ללא סרום (cSFDM) לפי ההרכב המוזכר בטבלה 1.
- הכן מדיה CK + DCI בבסיס cSFDM המוכן לפי טבלה 2.
- הפשרה דו-ממדית (מוסמכת לתאי גזע עובריים אנושיים) ו/או מטריצה תלת-ממדית (מופחתת גורם גדילה) על קרח כנדרש לצרכי הניסוי.
- שאפו את כל מדיום ה-CK + DCI באמצעות פיפטה או פיפטה שאפתנית עם ואקום מטיפות המטריצה התלת-ממדיות המכילות אלוואולוספירה, הנגזרת מהתמיינות מכוונת19, בלוחית בעלת 12 בארות.
- מוסיפים 1 מ"ל של דיספנס (2 מ"ג/מ"ל) לכל טיפה. פיפט בעדינות את הטיפה לתוך הדיספוזה באמצעות פיפטה P1000. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, צנרת למעלה ולמטה פעם אחת לאחר 30 דקות.
- העבר את האורגנואידים המנותקים (משלב 1.5) מטיפת מטריצה אחת בדיספוזה לצינור חרוטי של 15 מ"ל. כדי לשטוף, הוסיפו 10 מ"ל של המדיום המתוקן של דולבקו של Iscove (IMDM, ראו טבלת חומרים).
- צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף את supernatant באמצעות פיפטה או פיפטה שואפת עם ואקום, ולהשאיר כמה שפחות סופרנאטנט ככל האפשר.
הערה: חשוב להסיר את כל הדיספירציות מכיוון שכל דיספוזה שנותרה עלולה להמיס את המטריצה שהתאים ייזרעו לתוכה לאחר מכן. אם רואים אובך ברור מעל הכדור, הדיספוזה לא המיסה לחלוטין את המטריצה, וניתן להוסיף עוד דיספוזה לכדורית עוד 20-30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. - משחזרים את התאים ב-1 מ"ל של 0.05% טריפסין לכל טיפה ומעבירים בחזרה לצלחת של 12 בארות. אינקובציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-15 דקות. שימו לב לדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ. הימנעו מצנרת יתר של התאים בשלב זה.
הערה: בסוף הדגירה, התאים צריכים להשיג תרחיף של תא יחיד לאחר צנרת 3-5 פעמים עם פיפטה P1000. עבור העברת iAT2s ל-ALI (שלב 3), יש למזער את זמן הטריפסיניזציה (מקסימום 12 דקות), כך שהתאים יהיו בגושים של 2-3 תאים ולא בתרחיף של תא בודד כאשר הם מוכנים לציפוי על תוסף תרבית התאים. - עצור את הפעולה של טריפסין עם נפח שווה של מדיום המכיל FBS (10% FBS מוסמך ES ב- DMEM). צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של IMDM. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- בצעו החייאה של התאים בנפח מתאים לספירה, ולאחר מכן ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (ראו טבלת חומרים).
הערה: מתוך טיפת מטריצה אחת של 50 μL שנזרעה ב-400 תאים/μL, התשואה הצפויה היא 500,000 עד 1.5 x 106 תאים לכל טיפה. - השתמש בתרחיף החד-תאי של תאי iAT2 כדי ליצור נאדיות על ידי ציפוי במטריצה התלת-ממדית (שלב 2) ו/או ציפוי על תוספות תרביות תאים עבור תרבית ALI (שלב 3).
ציפוי 2.3D של iAT2s
- לאחר הספירה (שלב 1.11), קבעו את מספר התאים הרצויים לשחזור במטריצה התלת-ממדית (400 תאים/μL של המטריצה עם 50-100 μL של טיפות מטריצה תלת-ממדיות לכל באר של לוחית 12 באר). צנטריפוגה של התאים ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר כמה שיותר סופרנאטנט באמצעות פיפטה.
- החייאת התאים במטריצה התלת-ממדית. יש לבצע החייאה מהירה ועל קרח, במידת הצורך, כדי למנוע את פולימריזציה של המטריצה (המתרחשת כאשר היא חמה).
- השתמשו בפיפטה P200 כדי לחלק טיפת מטריצה תלת-ממדית אחת לכל באר לתוך צלחת 12 בארות שחוממה מראש. פיפטה מקפידה להימנע מיצירת בועות בטיפת המטריצה. אין לאפשר למתלה התא להתיישב בעת חלוקת טיפות מרובות.
- הניחו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לאפשר לטיפות המטריצה להתפלמר.
- הוסף 1 מ"ל של CK + DCI + 10 μM של Y-27632 בינוני (ראה טבלת חומרים) לכל באר כדי לכסות את טיפת המטריצה.
- לאחר 72 שעות, שנה את המדיום ל- CK + DCI ללא 10 μM של Y-27632.
- החלף את המדיום ב- CK + DCI טרי כל 48-72 שעות.
הערה: בדרך כלל יהיה צורך להעביר iAT2s בערך כל 10-14 יום, בהתאם לקו התא ולצפיפות הציפוי.
3. העברת iAT2s ל-ALI
- הכן תרבית תאים מצופה 6.5 מ"מ מצופה טרי 1 שעה לפני השימוש על ידי דילול המטריצה הדו-ממדית בתערובת הנשרים המהונדסים של Dulbecco Medium/Nutrient Blend F-12 (DMEM/F12) לתמיסת עבודה לפי הוראות היצרן עבור המטריצה הדו-ממדית (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, הוסף 100 μL של המטריצה המדוללת לכל תוספת תרבית תאים של 6.5 מ"מ. אפשר למטריצה להתפלמר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- שאפו את המטריצה העודפת מתרבית התאים באמצעות פיפטה או פיפטה שאפתנית עם ואקום ושטפו פעם אחת עם DMEM/F12. שאפו לשטוף את הכביסה הזו מיד לפני הוספת התאים.
- לאחר הספירה, קבעו את מספר התאים הנדרשים כדי לזרוע את מספר התאים הרצוי בתוספות התרבית (520,000 תאים חיים/ס"מ2, שווה ערך ל-172,000 תאים חיים לכל תוספת תרבית תאים של 6.5 מ"מ). צנטריפוגה של התאים ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר כמה שיותר סופרנטנט.
- החייאת התאים בנפח המתאים לזרע עם 100 μL של CK + DCI + 10 μM Y-27632 לכל תוספת תרבית תאים (תרחיף התא צריך להיות 1,720 תאים / μL ). הוסף 100 μL לתא האפיקלי של תוספת תרבית התא. התסיסו בעדינות את הצלחת בתבנית צולבת כדי להבטיח התפלגות שווה של תאים על פני תרבית התאים, ואשרו זאת על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ בזווית של פי 4.
הערה: צפיפות הזריעה היא קריטית ועשויה לדרוש אופטימיזציה, הנעה בין 160,000-300,000 תאים לכל תוספת תרבית תאים של 6.5 מ"מ. ניתן להוסיף לתאים צבע ירוק קלצין (ראו טבלת חומרים) הניתן להוספה של צבע חדיר לתאים ולצפות בו במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לדמיין את התאים לאחר הזריעה. - הוסף 500 μL של CK + DCI + 10 μM של Y-27632 לתא הבסולטרלי של כל תוספת תרבית תאים.
- לשאוף CK אפיקלי + DCI + 10 μM של Y-27632 בינוני 48 שעות לאחר זריעה באמצעות פיפטה כדי ליזום ALI (המכונה "הרמת אוויר").
הערה: התאים צריכים להיות 100% מפגש בשלב זה. אם התאים אינם נפגשים ב-100%, עדיין יש לבצע את שלבים 3.7-3.8 בנקודות הזמן שצוינו; היווצרותם של חד-שכבתיים של תאי מפגש עשויה להימשך זמן רב יותר. - שנה את ה- CK + DCI + 10 μM של Y-27632 בינוני לאחר 72 שעות ל- CK + DCI ללא 10 μM Y-27632.
הערה: צריכה להיות מינימלית אם בכלל, "דליפה" של בינוני לצד האפיקלי. עם זאת, אם זה אכן קורה בימים הראשונים, המשיכו לשאוף לצד האפי מדי יום עד שלא תהיה דליפה נוספת. - החלף את המדיום הבזולטרלי ב- CK + DCI טרי כל 48-72 שעות.
הערה: ה- iAT2s המשמשים בתרבויות ALI מבשילים באופן מקסימלי 5-14 ימים לאחר הציפוי. - שמרו על התאים עם ניטור קפדני עד 28 ימים לאחר הציפוי, במידת הצורך, לניסויים ממושכים יותר.
הערה: סימנים גלויים של כשל ALI, כגון קילוף התאים מקצה התוספת או היווצרות חורים בחד-שכבתי, עשויים להיות נצפים לאחר זמן ממושך יתר על המידה בתרבית, ובשלב זה ה-ALI כבר אינו שמיש לניסויים.
Representative Results
ה-iAT2s הועברו לתרחיף של תא יחיד ולאחר מכן צולוחו מחדש במטריצה תלת-ממדית או בדו-ממד על תוספות תרביות תאים עבור תרבית ALI (איור 1). לאחר דיסוציאציה של תאים בודדים, ה-iAT2s נותחו על ידי ציטומטריית זרימה. בקצרה, התאים שהוחזקו ב-1% סרום בקר עוברי (FBS) ב-1% תמיסת מלח עם חציצה בפוספט (PBS) עם צבע הכדאיות הכחול של קלצין (1:1000) נותחו על ציטומטר זרימה, תוך שימוש ב-n-fragments, סינגלטים ו-tdTomato. הנה, כדוגמה, קו SPC2 (שיבוט SPC2-ST-B220), שיש לו כתב tdTomato המיועד למוקד SFTPC האנדוגני כדי להקל על ההדמיה והמעקב של תוכנית AT2 לאורך זמן בתרבות (איור 2A). הביטוי iAT2 SFTPC-tdTomato נשמר כאשר הוא צופה מחדש במטריצה התלת-ממדית ככדורים (איור 2B) וכאשר הוא מצופה על תוספות תרביות תאים (איור 2C). ניתן למדוד עמידות חשמלית טרנס-אפיתליאלית (TEER) כדי לקבוע את שלמותה של תרבית ALI (איור 2D). כדי למדוד TEER, נעשה שימוש בוולטוהמטר (ראה טבלת חומרים), עם 100 μL של מדיום CK + DCI שנוספו לתא האפיקלי. תוספות תרביות התאים המצופים במטריגל בהיעדר תאים שנזרעו טופלו כחסרים. הקריאות צולמו בשלושה מוקדים בכל באר.
איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות מייצגות של הפרוטוקול. (A) תוצאות ציטומטריה של זרימה מייצגת עבור SFTPC-tdTomato בתאים דמויי אפיתל פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מסוג 2 (iAT2s) בתרבית בתלת-ממד. הבקרה השלילית המוצגת היא אנדודרם שאינו ריאה (CD47lo). (B) הדמיה מייצגת של תאים חיים של iAT2s בתרבית בתלת-ממד בימים שונים לאחר המעבר (dpp) (SFTPC-tdTomato, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). (C) הדמיה מייצגת של תאים חיים של iAT2s המצופה בממשק אוויר-נוזל (SFTPC-tdTomato, סרגל קנה מידה = 500 ננומטר). (D) התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל מייצגת של iAT2s המצופה בממשק אוויר-נוזל. n = 3, פסי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| ריאגנטים | נפח עבור 500 מ"ל | ריכוז סופי |
| המדיום המתוקן של דולבקו של Iscove (IMDM) | 375 מ"ל | 75% |
| תערובת החומרים המזינים F-12 של בשר חזיר (F12) | 125 מ"ל | 25% |
| תוסף B-27 (עם RA) | 5 מ"ל | 1% |
| תוסף N-2 | 2.5 מ"ל | 0.50% |
| BSA (7.5% מניה) | 3.3 מ"ל | 0.05% |
| פרימוצין (ציר של 50 מ"ג/מ"ל) | 1 מ"ל | 100 מיקרוגרם/מ"ל |
| גלוטמקס (מלאי 100x) | 5 מ"ל | 1x |
| חומצה אסקורבית (ציר של 50 מ"ג/מ"ל) | 500 μL | 50 מיקרוגרם/מ"ל |
| 1-תיוגליצרול (MTG) (מ-26 מיקרול ב-2 מ"ל IMDM) | 1.5 מ"ל | 4.5 x 10-4 מטר |
טבלה 1: הרכב מדיית ההבחנה המלאה ללא סרום (cSFDM).
| מגיב | ריכוז סופי |
| CHIR99021 | 3 מיקרומטר |
| rhKGF | 10 ננוגרם/מ"ל |
| דקסמתזון | 50 ננומטר |
| 8-ברומואדנוזין 30,50-מחזורי מונופוספט מלח נתרן (cAMP) | 0.1 מ"מ |
| 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין (IBMX) | 0.1 מ"מ |
טבלה 2: יצירות של המדיה CK + DCI.
Discussion
AT2s שומרים על הומאוסטזיס של הריאות, ותפקוד לקוי של תאי נאדיות מרכזיים אלה יכול גם לגרום וגם לגרום למחלות ריאה שונות. בשל הקושי לגשת ולבודד AT2s אנושיים ראשוניים, iAT2s נוצרים. על ידי יישום שיטות ההבחנה המכוונות המתוארות במקום אחר25 וההתפשטות וזריעת התאים המתוארים כאן, ניתן להבדיל בין iPSCs הנוצרים מכל אדם ל-iAT2 המתחדשים באופן חזק, ובכך לספק תאים ספציפיים לחולה למחקר ביו-רפואי, כולל מחקרים התפתחותיים בסיסיים של מחקר ביו-רפואי, מידול מחלות, טיפולים מבוססי תאים או מסכי תרופות. הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה לניתוק iAT2s לתרחיף חד-תאי, אשר לאחר מכן ניתן לצלוח אותו מחדש במטריגל תלת-ממדי כדי ליצור נאדיות להרחבת התא או לצלוח מחדש בתרבית ALI דו-ממדית לניסויים נוספים.
לפרוטוקול יש מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח מעבר מוצלח ותכנון מחדש הן בתרבויות תלת-ממד והן בתרביות ALI. יש למזער את הטריטורציה המכנית, שכן צנרת מוגזמת עלולה לפגוע בכדאיות התאים. בנוסף, צפיפות הזריעה של iAT2s הן בתרביות 3D והן בתרביות ALI דו-ממדיות היא קריטית; עבור תרבית תלת-ממדית, באופן כללי, 400 תאים/μL של מטריגל תלת-ממדי הוא אופטימלי עבור רוב קווי ה-iPSC. עם זאת, טווח של צפיפויות של 100-500 תאים/μL הצליח, לעיתים, וייתכן שיידרש אופטימיזציה של הצפיפות עבור קווי תאים שונים. עבור תרבית ALI, אופטימיזציה של צפיפות הזריעה של iAT2s על תוספות תרביות התאים חיונית גם כדי להשיג חד-שכבתית מפגשית של תאים 48 שעות לאחר הזריעה (כלומר, ביום של הרמה אווירית). קווי iAT2 מסוימים דורשים יותר תאים לכל תוספת; לפיכך, אם נדרש פתרון בעיות, מומלץ לבצע טווח בין 160,000-300,000 תאים/הוספה עבור תוספות תרביות תאים של 24 בארות. ניתן גם לשנות את קנה המידה של תרביות תלת-ממד ללוחות באר של 24 ו-48 על-ידי שמירה על צפיפות הזריעה ב-400 תאים/μL של מטריצה תלת-ממדית והקטנת גודל טיפות המטריצה ל-25 μL ו-20 μL, בהתאמה. ניתן לשנות את קנה המידה של תרביות ALI לתרביות תאים של 96 בארות על ידי ציפוי כל תוסף ב-30 μL של המטריצה, ציפוי 80,000 תאים ב-30 μL לכל תוספת, והזנה עם 150 μL של מדיה בזולטרלית לכל באר. יש לשנות את צפיפות הזריעה ואת נפחי המטריצה והמדיה ולהתאים אותם בהתאם לפורמטים אחרים של לוחות.
מגבלה של פרוטוקול זה היא שהתאים המשמשים לציפוי ALI צריכים להיות מטוהרים מספיק כדי להיות NKX2-1+ ו- SFTPC+19,20,21,23 כדי ליצור ALIs iAT2, והיווצרות תרבית ALI עשויה להשתנות מקו לקו. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר הרחבה ויצירה של תרביות AT2 בלבד, ומספק מערכת מודל רדוקציוניסטית המבוססת על סוג תא נאדי מפתח יחיד. חשוב לציין שסוגים רלוונטיים אחרים של תאי נאדיות, כגון תאים מסוג alveolar Type 1, היו חסרים בפלטפורמות אלה. קבוצות אחרות הצליחו לגדל AT2 אנושיים ראשוניים כספרואידים או תרביות אורגנוטיפיות עם או בלי פיברובלסטים 1,14,15,16,17; עם זאת, AT2 אנושיים ראשוניים נוטים לאבד את הביטוי שלהם של פעילי שטח מרכזיים כאשר הם מתורבתים בתרבות דו-ממדית רגילה ללא תנאי ALI26. יתר על כן, עבודות אחרונות הראו כי iAT2s מבטאים סמנים שגשוג גבוהים יותר וסמני התבגרות AT2 נמוכים יותר מאשר AT2s ראשוניים אנושיים טריים ולא תרבותיים27. למרות ההבדלים הללו בין iAT2s לבין AT2s אנושיים ראשוניים טריים, מצאנו שאפילו AT2 ראשוניים מתורבתים הציגו הבדלים תעתיקיים בין AT2s27 ראשוניים טריים ולא תרבותיים, ובכך הגענו למסקנה שלדגמים אלה במבחנה יש עוצמות ומגבלות שונות למידול ביולוגיה של ריאות in vivo.
ניתן ליישם את פלטפורמת iAT2 כדי לחקור מוטציות גנטיות מתוך iPSCsשמקורם בחולה 19,20. ניתן גם להגדיל את המערכת באופן משמעותי כדי להתאים לבדיקת סמים בתפוקה גבוהה. בנוסף, iAT2 ALIs מתאימים לחשיפות סביבתיות כגון זיהום ויראלי או חיידקי או חשיפה לעשן סיגריות, אדי סיגריות אלקטרוניות או אירוסולים אחרים23. לסיכום, פרוטוקול זה ליצירת תרביות 3D ו-2D ALI של iAT2s מאפשר תרבית ארוכת טווח של סוג תא רלוונטי למחלה ומספק פלטפורמה פיזיולוגית ניתנת להרחבה המאפשרת שימוש בתאים אלה ביישומים רבים.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים בכנות לחברי מעבדות וילסון, קוטון והוקינס על הדיונים המועילים שלהם. אנו גם מודים מאוד לגרג מילר (מנהל מעבדת CReM) ולמריאן ג'יימס (מנהלת הליבה של iPSC) על תמיכתם שלא תסולא בפז. אנו מודים לבריאן טילטון ולליבת הציטומטריה של BUMC Flow על הסיוע הטכני שלהם במיון תאים (נתמך על ידי מענק NIH #1S10OD021587-01A1). עבודה זו נתמכה על ידי מלגת CJ Martin לקריירה מוקדמת מהמועצה הלאומית האוסטרלית לבריאות ומחקר רפואי שהוענקה ל- RBW; מענק NIH F30HL147426 ל- KMA; פרס I.M. Rosenzweig לחוקר זוטר מטעם הקרן לפיברוזיס ריאתי ופרס מענק פיילוט משולב באמצעות המכון למדע קליני ותרגומי של אוניברסיטת בוסטון (1UL1TR001430) ל- KDA; הקרן הלאומית למדע של שווייץ (P2ELP3_191217) ל-ABA; NIH מעניק את U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 ו- R01HL095993 ל- DNK; ומעניקי NIH U01TR001810, R01DK101510 ו-R01DK117940 שהוענקו ל-AAW; תחזוקה, בנקאות ושיתוף של iPSC נתמכים על ידי מענק NIH NO1 75N92020C00005. איור 1 נוצר באמצעות Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | For CKDCI |
| 12 Well Cell Culture Plate | Corning | 3513 | Plates for culturing |
| 1-Thioglycerol (MTG) | M6145 | Sigma | For CKDCI |
| 2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 8774552 | To coat ALI Transwells |
| 3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel | Corning | 356230 | To grow iAT2 spheres in |
| 8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP) | Sigma | B7880 | For CKDCI |
| Ascorbic Acid | A4544 | Sigma | For CKDCI |
| B27 w/out retinoic acid | Life Technologies | 12587-010 | For CKDCI |
| Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | For CKDCI |
| Calcein blue | Life Technologies | C1429 | For live/dead discrimination in flow cytometry |
| Calcein green | Life Technologies | C1430 | Optional visualisation of cells on cell culture insert |
| Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size | Millipore-Sigma | CLS3470-48EA | ALI transwells |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | For CKDCI |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | For CKDCI |
| Dispase (2 mg/mL) | Thermo Fisher | 354235 | To dissolve matrigel |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11995 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher | A4192002 | To wash |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190 | For flow cytometric analyses |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized) | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM) |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | For CKDCI |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12) | Cellgro | 10-080-CV | For CKDCI |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | For cell counting |
| Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL) | Fisher Scientific | NC9392943 | For CKDCI |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | For CKDCI |
| Millicell ERS-2 Voltohmeter | Millipore | MERS00002 | To measure trans-epithlial electrical resistance |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | For CKDCI |
| Recombinant human KGF | R&D Systems | 251-KG-010 | For CKDCI |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | For CKDCI |
| Trypan blue | Thermo Fisher | 15250061 | For cell count during passaging |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25-300-062 | To dissociate iAT2 spheres |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Add to cells after passaging |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. American Review of Respiratory Disease. 115 (6), Pt 2 81-91 (1977).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein C gene associated with familial interstitial lung disease. New England Journal of Medicine. 344 (8), 573-579 (2001).
- Nogee, L. M., et al. A mutation in the surfactant protein B gene responsible for fatal neonatal respiratory disease in multiple kindreds. Journal of Clinical Investigation. 93 (4), 1860-1863 (1994).
- Shulenin, S., et al. ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency. New England Journal of Medicine. 350 (13), 1296-1303 (2004).
- Nureki, S. I., et al. Expression of mutant Sftpc in murine alveolar epithelia drives spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 4008-4024 (2018).
- Katzen, J., et al. An SFTPC BRICHOS mutant links epithelial ER stress and spontaneous lung fibrosis. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (6), 126125 (2019).
- Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (7), 489-503 (2013).
- Purkayastha, A., et al. Direct exposure to SARS-CoV-2 and cigarette Smoke increases infection severity and alters the stem cell-derived airway repair response. Cell Stem Cell. 27 (6), 869-875 (2020).
- Matrosovich, M. N., Matrosovich, T. Y., Gray, T., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4620-4624 (2004).
- Tollstadius, B. F., Silva, A. C. G. d, Pedralli, B. C. O., Valadares, M. C. Carbendazim induces death in alveolar epithelial cells: A comparison between submerged and at the air-liquid interface cell culture. Toxicology in Vitro. 58, 78-85 (2019).
- Winton, H. L., et al. Cell lines of pulmonary and non-pulmonary origin as tools to study the effects of house dust mite proteinases on the regulation of epithelial permeability. Clinical and Experimental Allergy. 28 (10), 1273-1285 (1998).
- Kanagaki, S., et al. Hydroxypropyl cyclodextrin improves amiodarone-induced aberrant lipid homeostasis of alveolar cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 64 (4), 504-514 (2021).
- Sucre, J. M. S., et al. Successful establishment of primary type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).
- Kobayashi, Y., et al. Persistence of a regeneration-associated, transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis. Nature Cell Biology. 22, 934-946 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904 (2020).
- Jacob, A., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).
- Alysandratos, K. -D., et al. Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease. Cell Reports. 36 (9), 109636 (2021).
- Hurley, K., et al. Reconstructed single-cell fate trajectories define lineage plasticity windows during differentiation of human PSC-derived distal lung progenitors. Cell Stem Cell. 26 (4), 593-608 (2020).
- Sun, Y. L., et al. Heterogeneity in human iPSC-derived alveolar epithelial type II cells revealed with ABCA3/SFTPC reporters. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 65 (4), 442-460 (2021).
- Abo, K. M., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar type 2 cells mature and respond to environmental exposures in air-liquid interface culture. Journal of Clinical Investigation Insight. 7 (6), (2022).
- Huang, J., et al. SARS-CoV-2 infection of pluripotent stem cell-derived human lung alveolar type 2 cells elicits a rapid epithelial-intrinsic inflammatory response. Cell Stem Cell. 27 (6), 962-973 (2020).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Beers, M. F., Moodley, Y. When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).
- Alysandratos, K. D., et al. Impact of cell culture on the transcriptomic programs of primary and iPSC-derived human alveolar type 2 cells. bioRxiv. , (2022).
