קשירת עורקים כליליים יורדת קדמית שמאלית למחקר איסכמיה-רפרפוזיה: שיפור מודל באמצעות שינויים טכניים ובקרת איכות

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתמקד בבקרת האיכות של קשירת העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי על ידי שינוי טכני של ההליך המסורתי בחולדות למחקר איסכמיה חריפה של שריר הלב.

Abstract

מחלת לב כלילית היא סיבת המוות המובילה בעולם. הפסקה מוחלטת של זרימת הדם בעורקים הכליליים גורמת לאוטם שריר הלב בגובה ST-segment (STEMI), וכתוצאה מכך להלם קרדיוגני ולהפרעות קצב קטלניות, הקשורות לתמותה גבוהה. התערבות כלילית ראשונית (PCI) לחידוש העורק הכלילי משפרת באופן משמעותי את התוצאות של STEMI, אך ההתקדמות שנעשתה בקיצור הזמן מדלת לבלון לא הצליחה להפחית את התמותה בבית החולים, דבר המצביע על כך שנדרשות אסטרטגיות טיפוליות נוספות. קשירת עורק כלילי יורד קדמי שמאלי (LAD) בחולדות היא מודל בבעלי חיים למחקר IR חריף של שריר הלב הדומה לתרחיש הקליני שבו נעשה שימוש בהתחדשות כלילית מהירה באמצעות PCI עבור STEMI; עם זאת, STEMI המושרה על ידי PCI הוא ניתוח מאתגר ומסובך מבחינה טכנית הקשור לתמותה גבוהה ושונות גדולה בגודל האוטם. זיהינו את המיקום האידיאלי לקשירת LAD, יצרנו גאדג'ט לשליטה בלולאת סנר, ותמכנו בתמרון כירורגי שונה, ובכך צמצמנו את הנזק לרקמות, כדי לבסס פרוטוקול מחקר אמין וניתן לשחזור של איסכמיה חריפה של שריר הלב (IR) עבור חולדות. זהו ניתוח שאינו הישרדותי. אנו מציעים גם שיטה לאימות איכות תוצאות המחקר, שהיא שלב קריטי לקביעת הדיוק של ניתוחים ביוכימיים עוקבים.

Introduction

מחלת לב איסכמית היא סיבת המוות המובילה בעולם ^1,2. בנוסף לשליטה בגורמי סיכון הניתנים לשינוי למניעת התפתחות מחלת לב כלילית, אסטרטגיות טיפוליות נדרשות באופן מכריע עבור תסמונת כלילית חריפה ^3,4. הלם קרדיוגני והפרעות קצב קטלניות באוטם שריר הלב חריף בסגמנט ST (STEMI) נמצאו כמגבירים את הסבירות לתמותה בבית החולים 5,6,7,8. התערבות כלילית מלעורית ראשונית (PCI) היא הטיפול המועדף עבור STEMI 9,10,11; עם זאת, ההשפעות הטיפוליות יש תקרה כאשר זמן הדלת לבלון הוא <90 דקות^12,13. אסטרטגיות נוספות נדרשות לשיפור נוסף בתוצאות הקליניות של המחלה 14,15,16,17,18,19.

ניסוי איסכמיה חריפה של שריר הלב (IR) הכולל קשירת עורק יורד קדמי שמאלי (LAD) בחולדות הוא אחד המודלים של בעלי חיים הדומים לתרחיש הקליני שבו נדרשים זמנים קצרים מדלת לבלון עבור חולים עם STEMI כדי להציל את הלב מנזק איסכמי. עם זאת, STEMI המושרה על ידי ניתוח בבעלי חיים קטנים הוא לעתים קרובות מאתגר מבחינה טכנית מכיוון שמדובר בניתוח מורכב הקשור לתמותה גבוהה ושונות גבוהה בגודל אוטם 20,21,22,23,24. כדי להתגבר על האתגר הטכני, המחקר הנוכחי פיתח מודל מקיף ויעיל של בעלי חיים בחולדות (מכיוון שהן גדולות יותר מעכברים) כדי לבסס פרוטוקול מחקר IR חריף של שריר הלב באמצעות שינוי טכני. הפרוטוקול המוצע מביא לפחות סיבוכים ניתוחיים, פחות נזק לרקמות ופחות סיכוי לתמותה במהלך הניתוח. בנוסף, נעשה שימוש בהליך כדי למדוד את גודל האוטם ואת השטח בסיכון (AAR), ובכך לאמת את איכות תוצאות המחקר. הפרוטוקול המוצע יכול לשמש לחקר התהליכים הפתופיזיולוגיים של לחץ IR חריף שריר הלב כדי לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד הנזק.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (פרסום NIH מס' 85-23, מתוקן 1996). פרוטוקול המחקר אושר על ידי ובהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הקתולית פו-ג'ן.

1. הכנה לפני הניתוח

1. הכנת כדורי צמר גפן רטובים מלוחים
   1. שימו מסכה כירורגית וכפפות.
   2. צובטים חלק קטן של כותנה סטרילית ומגלגלים אותה ליצירת כדור. חזור על הליך זה.
   3. טובלים את כדורי הצמר גפן במי מלח סטריליים של 0.9% וסוחטים את עודפי המלח.
   4. אחסנו את כדורי הצמר גפן בקופסה נקייה מעוקרת עם 75% אתנול.
2. הכנת ווי החזקה.
   1. שימו מסכה כירורגית וכפפות.
   2. יש לעקר אטבים וגומיות עם 75% אתנול.
   3. כופפו את האטבים לצורה של וו לקיר החזה ולרקמה.
   4. חבר את האטבים המכופפים עם גומייה אחת, שתיים או שלוש כדי להבטיח שהמתח מהפצע של חלון הניתוח רחב מספיק לקשירת LAD.
   5. הכינו ואחסנו לפחות חמישה ווים תוצרת בית בקופסה נקייה מעוקרת עם 75% אתנול.
3. הכנת לולאת קשירה.
   1. מניחים את אמצע תפר משי 7-0 בעיגול בגודל 1/2 עין קפיץ 3 של מחט כירורגית מחודדת ללא תנופה.
4. הכנת בקר לולאת snare
   1. חותכים צינור פוליאתילן 5 מ"מ (PE)-10 באמצעות מספריים.
   2. מחממים ומרככים את הצינור מתחת ללהבה כדי להחליק את שני קצותיו.
5. הכנת החולדות
   1. בחר חולדות זכרים Sprague-Dawley בן 8 שבועות עם משקל מינימלי של 250 גרם.
   2. בית ותחזק את החולדות תחת מחזור אור / חושך של 12 שעות בטמפרטורה מבוקרת (21 ° C ± 2 ° C) עם גישה חופשית למזון, כדורי עכבר סטנדרטיים ומי ברז.
   3. מרדימים את החולדות עם pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג, מנוהל intraperitoneally).
      הערה: יש לתת חומר הרדמה נוסף (פנטוברביטל, 30 מ"ג/ק"ג) לאחר כל שעה.
   4. בדוק את הרפלקסים של החולדות על ידי צביטת הזנב והרגליים האחוריות כדי לוודא שהחיה מורדמת מספיק.
   5. פתח את הרקמה בין שתי טבעות מחסנית מתחת לגלוטיס באמצעות מספריים והכנס צינור PE-10 בקוטר 3 ס"מ כדי לשמש כצינור אנדוטרכאלי²⁵.
   6. חבר את הצינור האנדוטרכאלי למכונת הנשמה באופן ידני.
   7. בדוק את תנועת בית החזה של בעל החיים המסונכרנת עם מחזור הנשימה כדי לוודא שהריאות מאווררות כראוי.
   8. פתח את אזור הצוואר ו cannulate את הווריד jugular²⁶.

2. קשירת LAD

1. שימו מסכה כירורגית וכפפות.
2. גע בחזה ומצא את זווית המנובריום ועצם החזה (צומת גוף המנובריום ועצם החזה).
3. זהה את הצלע השמאלית המתחברת לזווית עצם החזה (צלע A) על ידי נגיעה ידנית.
4. זהה את החלל הבין-קוסטלי מתחת לצלע A. השתמש במלקחיים עדינים כדי להרים בעדינות את העור קרוב לחלל הבין-קוסטלי, ולאחר מכן השתמש באזמל כירורגי עם להב כדי ליצור חתך אלכסוני של 1 ס"מ לאורך קווי מתח העור מהנקודה כ -5 מ"מ משמאל לגוף עצם החזה.
5. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי להפריד בעדינות את שכבות העור והשרירים מהחתך. חברו את שכבות השרירים מחוץ לדופן החזה הקדמית השמאלית כלפי מטה בעזרת קליפסים מכופפים כדי לחשוף את הצלעות שמתחת.
6. זהה את הצלע מתחת לצלע A (צלע B). חותכים צלע B במספריים קהים מאמצע סחוס הצלעות (כ-2-3 מ"מ מגוף עצם החזה). גע בעדינות ודחוס את הפצע עם כדור צמר גפן רטוב מלוחים במשך מספר שניות אם מתרחש דימום.
7. פתח את בית החזה בזהירות מהחתך של צלע B עם ארבעה קליפסים כפופים. כל קליפס כפוף צריך לחבר את השריר והצלעות הבין-קוסטליים כדי לפזר בעדינות את דופן החזה לארבעה כיוונים (כלומר, עליון ואז שמאל, עליון ואז ימינה, שמאל כלפי מטה וימין כלפי מטה) וליצור חלון ניתוח מלבני.
8. וו בעדינות כנגד הריאה השמאלית ורקמות סמוכות אחרות המכסות את קרום הלב עם קליפס כפוף נוסף כדי למנוע נזק מקרי לרקמות במהלך ההליך.
9. חשוף את הלב על ידי הסרה עדינה של קרום הלב הדק עם מלקחיים. זהה את הענף הראשון של העורק הכלילי הראשי השמאלי (LMCA), שנמצא בדרך כלל בין עורק הריאה לאוריקל השמאלי. ה-LMCA וה-LAD מוצגים כקו אדום בוהק שטחי העובר מקצה האאוריקל השמאלי לכיוון הקודקוד.
10. השתמש במחט הכירורגית המוכנה כדי ליצור לולאת קשירה פתוחה על ידי החדרה והעברה של תפר המשי מתחת ל- LAD במיקום דיסטלי מיידי לענף הראשון של LMCA בכיוון משמאל לכיוון הצד הימני של ה- LAD כדי למנוע ניקוב בטעות של האוריקל השמאלי. בתפר יחיד נוצרת הלולאה הפתוחה. ספוג בעדינות את פני השטח של הלב כדי לדמייןאת העורקים הכליליים אם LAD הוא בלתי נראה בגלל נוזל או דם מכסה את פני השטח של הלב.
11. החזיקו צד אחד של התפר והפרידו בעדינות את המחט מהתפר באמצעות מחזיק מחט.
12. הכנס את שני הקצוות של תפר המשי בצד אחד של הלולאה הפתוחה לתוך העיגול בצד השני כדי ליצור לולאת סנר.
13. הכנס את שני הקצוות של תפר המשי של לולאת הסנר לבקר הסנר המוכן לפני סגירת הלולאה.
14. החלק את בקר לולאת הסנר לאורך תפר המשי תוך מתיחת המשי בעדינות כדי לסגור את לולאת הסנר. להפסיק את הזרימה הכלילית של LAD כדי לגרום איסכמיה שריר הלב זמני במשך 1 שעות.
15. החזק את המשי כדי לקבע את מיקום בקר לולאת הסנר עם מלקחיים קלי לאחר שהלולאה נקשרה היטב. הניחו את הקצה השני של מלקחיים קלי על שולחן הניתוחים במהלך קשירת LAD.
16. כסו את חלון הניתוח בכדורי צמר גפן רטובים מלוחים במהלך קשירת LAD.
17. פתח את מלקחיים קלי.
18. שחררו את בקר לולאת הסנר לזילוח מחדש של הזרימה הכלילית למשך שעתיים.
19. יש לסדר את הלב לאורך הבסיס ואת גבולות כלי הדם בזהירות ולהימנע מתפיסת הרקמה.
    הערה: הרדימו את החולדה עם_CO2 בקצב זרימה של 40% נפח הכלוב לדקה.

Representative Results

בסוף איסכמיה שריר הלב ורפרפוזיה, יש להעריך את איכות קשירת LAD לפני ניתוחים ביוכימיים או מולקולריים נוספים.

הספיקה של חסימת LAD באמצעות קשירה נקבעה על ידי הזרקת 1 מ"ל של 2% צבע כחול של אוון דרך קטטר ורידי מרכזי. לאחר מכן, שריר הלב עם זילוח כלילי היה מוכתם בכחול בהשוואה לאזור הלא מחורר, שנשאר אדום (איור 1A). האזור האדום הוא AAR של אוטם שריר הלב.

הדיוק של מיקום קשירת LAD הוערך עוד יותר על ידי כימות השונות באחוז AAR בקרב חיות המחקר. לאחר שהלב נחתך אופקית, אחוז ה-AAR נקבע על-ידי חלוקת ה-AAR בכל מסת שריר הלב (איור 1B). שונות נמוכה באחוז ה-AAR בקרב חיות המחקר הצביעה על מיקום מדויק של קשירת LAD.

גודל אוטם שריר הלב הוא התוצאה העיקרית במחקר IR חריף של שריר הלב. כדי לכמת פרמטר זה, קטעי הלב החתוכים הודגרו ב-1% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) במי מלח רגילים ב-37°C למשך 30 דקות ולאחר מכן ב-10% פורמלדהיד במשך 3 ימים. אזור האוטם היה לבן. אחוז גודל האוטם חושב כיחס בין אזור האוטם ל-AAR (איור 2).

איור 1: אימות איכות קשירת LAD עם הכחול של אוון. (A) ה-AAR לאוטם שריר הלב היה מסת שריר הלב הלא מחוררת שנשארה אדומה גם לאחר הזרקת הכחול של אוון, ובכך אישרה קשירת LAD בטוחה. (B) אחוז ה-AAR חושב על ידי חלוקת ה-AAR (האזור האדום) בכל מסת שריר הלב (אזור אדום וכחול); שונות נמוכה באחוז AAR בקרב חיות המחקר הדגימה מיקום מדויק של קשירת LAD. גודל אוטם קטן יותר הודגם בקבוצות שטופלו בתרופות בהשוואה לקבוצות שלא טופלו. AAR, אזור בסיכון; LAD, עורק יורד קדמי שמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: כימות גודל אוטם שריר הלב בטיפול ב-TTC. גודל האוטם הוערך כיחס בין אזור האוטם (האזור הלבן) ל-AAR (האזור האדום) בקבוצת קשירת ה-LAD. AAR, אזור בסיכון; TTC, triphenyltetrazolium כלוריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

לפרוטוקול המוצע מספר תכונות ייחודיות, כגון זיהוי המיקום המדויק לקשירת LAD, יצירת גאדג'ט לשליטה בלולאת סנר בתפר יחיד, ותמיכה בתמרון כירורגי שונה כדי להפחית את הנזק לרקמות, ובכך לאפשר לחוקרים לקשור את ה- LAD בצורה מדויקת, מאובטחת ועקבית, כמו גם לשלוט במצב לולאת הסנר באופן מיידי למחקר IR חריף של שריר הלב.

המיקום של קשירת LAD משפיע על האזור והגודל של אוטם שריר הלב. קשירה מוצעת בדרך כלל במרחק מסוים על LAD פרוקסימלי^27,28. התעלמות מהשונות בדפוסי הסתעפות העורקים הכליליים עשויה להגדיל את השונות באוטם שריר הלב^23,24. במחקר זה, LAD היה קשור באופן דיסטלי מיידי לענף הראשון של LMCA, ובכך מנע קשירה בשוגג של עורק הסירקומפלקס השמאלי או עורק המחיצה והוביל לגודל אוטם עקבי וסבירות נמוכה יותר להפרעות קצב קטלניות 29,30,31.

קשירת LAD מאובטחת חיונית לחסימת LAD. מומחים המליצו כי LAD צריך להיות קשור עם קשורכדי ליצור אחד עד שלושה קשרים או עם חתיכה קטנה של צינורות כדי לדחוס את העורק הכלילי ^{32,33,34,35,36}. במאמר זה, אנו מציעים גאדג'ט נשלט עם לולאת snare כדי ligate את LAD בתפר יחיד; גישה זו מאפשרת קשירת LAD מאובטחת ובקרה מיידית של סגירת הלולאה ושחרורה תוך מניעת חתך רקמות, דימום ושבירת חוזק התפר במהלך ניקוב חוזר של שריר הלב, קשירת עורקים ושחרור רצועות. הגישה היא, אם כן, שימושית עבור הליכי ניסוי ותיקוף במחקר IR שריר הלב חריף.

זיהוי מאפיינים אנטומיים ותכונות היסטולוגיות במהלך הניתוח מועיל להפחתת נזק לרקמות ולשיפור שכפול המחקר. לגבי פתיחת בית החזה, חוקרים הציעו להפריד את שרירי החזה והשרירים הבין-קוסטליים ה-3 או ה-4 על ידי שימוש במספריים, מחזיר, מלקחיים, פינצטה קהה או תפרים כדי למשוך הצידה את שרירי החזה וכלוב הצלעות ^{32,33,35,37,38}. המחקר הנוכחי מציע חתך לאורך קווי מתח העור (מסגרת רקמת החיבור של העור)^39,40, חיתוך סחוס של צלע בודדת^, המכיל רקמת חיבור גמישה ⁴¹, וחיבור שרירי בית החזה וכלובי הצלעות לפתיחת דופן בית החזה. גישה זו מסייעת לשמור על שלמות הרקמה ומפחיתה את הסיכון לדימום. בנוסף, התחלת הגישה על ידי זיהוי יצרני משטחים אמינים באמצעות מגע פירושה שההליך הכירורגי באמצעות חתך בעור הוא מאוד חוזר ועקבי.

אישור האיכות של אוטם שריר הלב המושרה על ידי קשירת LAD הוא צעד קריטי לפני חקירת שינויים פתופיזיולוגיים במחקר IR שריר הלב חריף. בספרות, התרחשות אוטם שריר הלב לאחר קשירת LAD מאושרת על ידי התבוננות חיוורון אזורי פתאומי של שריר הלב^28,33; קטע ST חריף של העלאת אלקטרוקרדיוגרמה מקו הבסיס³³; רמות גבוהות של אנזימי לב בסרום כגון CK-MB, טרופונין I וטרופונין T ^28,32,42; או אזורים אוטמים באופן מקרוסקופי⁴². העקביות של קשירת LAD צריכה להיות מאומתת עוד יותר על ידי קביעת AAR עבור אוטם באמצעות Phthalo או צבע כחול של אוון^32,35,37,38. שונות נמוכה באחוז AAR בין הדגימות מוכיחה את עקביות ואיכות ההליך למחקר IR חריף של שריר הלב. יתר על כן, ניתן להבחין בין אזור האוטם לבין ה- AAR על ידי תיחום אזורי אוטם שריר הלב עם TTC^28,36. צביעה כפולה כחולה/TTC של אוונס שימשה בעבר להערכת האיכות של מחקר IR שריר הלב ex vivo³⁷. בהשוואה לדרישה בהערכות ex vivo כי הלב המבודד יהיה מחורר תחת מנגנון לנגנדורף, מחקר זה תומך בפרוטוקול החייתי של הערכת in vivo שבו מתקבלות התוצאות, ואיכות המחקר מתוקפת באופן מיידי וישיר.

חשוב מכך, השימוש בכחול של אוון וב- TTC כדי להגדיר את אזור האוטם ל- AAR מונע את השימוש בשריר הלב האוטם לניתוחים ביוכימיים, שהיא דרישה להוציא גורמים מבלבלים ולקבל תוצאות מדויקות במחקר IR חריף של שריר הלב.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator