虚血再灌流研究のための左前下行冠動脈結紮術:技術改変と品質管理によるモデル改良

Summary

本研究では、急性心筋虚血再灌流研究のためのラットにおける従来の手順を技術的に改変することにより、左前下行冠動脈結紮術の品質管理に焦点を当てたプロトコルを提示する。

Abstract

冠状動脈性心臓病は、世界の主要な死因です。冠動脈の血流が完全に停止すると、ST上昇心筋梗塞(STEMI)を引き起こし、心原性ショックと致命的な不整脈を引き起こし、高い死亡率に関連しています。冠動脈再開通のための一次冠動脈インターベンション(PCI)はSTEMIの転帰を有意に改善するが、ドア・トゥ・バルーン時間の短縮における進歩は院内死亡率を低下させることができず、さらなる治療戦略が必要であることを示唆している。ラットの左前下行冠状動脈(LAD)結紮は、急性心筋IR研究の動物モデルであり、PCIを介した迅速な冠状動脈再開通がSTEMIに使用される臨床シナリオに匹敵します。しかし、PCI誘発性STEMIは、高い死亡率と梗塞サイズの大きな変動に関連する技術的に困難で複雑な手術です。LAD結紮の理想的な位置を特定し、スネアループを制御するガジェットを作成し、修正された外科的操作をサポートして組織の損傷を軽減し、ラットの信頼性が高く再現性のある急性心筋虚血再灌流(IR)研究プロトコルを確立しました。これは非生存手術です。また、その後の生化学的分析の精度を判断するための重要なステップである研究結果の質を検証する方法を提案します。

Introduction

虚血性心疾患は、世界の主要な死因です^1,2。冠状動脈性心臓病の発症を予防するための修正可能な危険因子の制御に加えて、急性冠症候群の治療戦略が決定的に必要とされています^3,4。急性ST上昇型心筋梗塞(STEMI)における心原性ショックと致命的な不整脈は、院内死亡の可能性を高めることがわかっています5,6,7,8。一次経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は、STEMI ^9,10,11の好ましい治療法です。ただし、ドアからバルーンまでの時間が<90分^12,13の場合、治療効果には上限があります。疾患の臨床転帰をさらに改善するためには、追加の戦略が必要である^14、15、^{16、17、18、19}。

ラットの左前下行動脈(LAD)結紮を伴う急性心筋虚血再灌流(IR)実験は、STEMI患者が虚血性損傷から心臓を救うために短いドアからバルーンまでの時間が必要である臨床シナリオに匹敵する動物モデルの1つです。しかし、小動物における手術誘発性STEMIは、高い死亡率と梗塞サイズの変動が大きいことに関連する複雑な手術であるため、技術的に困難なことがよくあります^20、21、22、^23、24。本研究では、技術的課題を克服するために、ラット(マウスよりも大きいため)で包括的かつ効果的な動物モデルを開発し、技術的修正を通じて信頼性が高く再現性のある急性心筋IR研究プロトコルを確立しました。提案されたプロトコルは、手術中の外科的合併症、組織損傷、および死亡の可能性を減らします。さらに、梗塞のサイズとリスクのある面積(AAR)を測定し、研究結果の質を検証するための手順が使用されました。提案されたプロトコルを使用して、急性心筋IRストレスの病態生理学的プロセスを調査し、損傷に対する新しい治療戦略を開発できます。

Protocol

すべての動物実験は、米国国立衛生研究所が発行した実験動物の世話と使用のためのガイド(NIH出版物第85-23号、1996年改訂)に従って実施されました。研究プロトコルは、フージェンカトリック大学の施設動物管理および使用委員会のガイドラインによって承認され、それに従って承認されました。

1.手術前の準備

1. 生理食塩水ウェットコットンボールの調製
   1. サージカルマスクと手袋を着用してください。
   2. 滅菌綿のごく一部をつまんで転がしてボールを形成します。この手順を繰り返します。
   3. コットンボールを滅菌済みの0.9%生理食塩水に浸し、余分な生理食塩水を絞り出します。
   4. コットンボールは、75%エタノールで滅菌したクリーンボックスに保管してください。
2. 保持フックの準備。
   1. サージカルマスクと手袋を着用してください。
   2. クリップと輪ゴムを75%エタノールで滅菌します。
   3. クリップを胸壁とティッシュ用のフックの形に曲げます。
   4. 曲がったクリップを1つ、2つ、または3つの輪ゴムで接続して、手術窓の傷からの張力がLAD結紮に十分な幅になるようにします。
   5. 少なくとも5つの自家製フックを準備し、75%エタノールで滅菌したクリーンボックスに保管します。
3. ライゲーションループの調製。
   1. 7-0シルクステッチの中央を、テーパー状の非スエージ手術針の1/2サークルサイズ3スプリングアイに配置します。
4. スネアループコントローラの準備
   1. はさみを使用して5 mmポリエチレン(PE)-10チューブを切り取ります。
   2. 炎の下でチューブを加熱して柔らかくし、両方の端を滑らかにします。
5. ラットの準備
   1. 最小体重250 gの8週齢のSprague-Dawley雄ラットを選択します。
   2. 制御された温度(21°C±2°C)で12時間の明暗サイクル下でラットを飼育および維持し、餌、標準的なマウスペレット、および水道水に自由にアクセスできるようにします。
   3. ラットをペントバルビタール(50 mg / kg、腹腔内投与)で麻酔します。.
      注:追加の麻酔薬(ペントバルビタール、30 mg / kg)は、1時間ごとに投与する必要があります。.
   4. 尻尾と後ろ足をつまんでラットの反射神経をチェックし、動物が十分に麻酔をかけられていることを確認します。
   5. はさみを使用して声門の下の2つのカートリッジリングの間の組織を開き、気管内チューブ²⁵として機能するように3cmPE−10チューブを挿入します。
   6. 気管内チューブを人工呼吸器に手動で接続します。
   7. 呼吸周期と同期した動物の胸部の動きを調べて、肺が適切に換気されていることを確認します。
   8. 頸部を開き、頸静脈²⁶をカニューレ挿入する。

2. LAD結紮

1. サージカルマスクと手袋を着用してください。
2. 胸に触れて、マニュブリウムと胸骨角度(マニュブリウムと胸骨体の接合部)を見つけます。
3. 手動で触れて、胸骨角(肋骨A)に接続する左側の肋骨を特定します。
4. 肋骨Aのすぐ下の肋間腔を特定します。 細い先端の鉗子を使用して肋間腔に近い皮膚を静かに持ち上げ、次に刃付きの外科用メスを使用して、胸骨体の左側約5 mmのポイントから皮膚の緊張線に沿って1 cmの斜めの切開を作成します。
5. 湾曲した鉗子を使用して、皮膚と筋肉の層を切開部からそっと分離します。左前胸壁の外側の筋肉層を曲げたクリップで下向きに引っ掛けて、下の肋骨を露出させます。
6. リブA(リブB)の下のリブを特定します。肋骨軟骨の中央(胸骨体から約2〜3 mm)から鈍いハサミで肋骨Bを切り取ります。出血が発生した場合は、生理食塩水で濡れた綿球で傷口に数秒間そっと触れて圧迫します。
7. 4つの曲がったクリップで肋骨Bのカットから胸部を慎重に開きます。曲がった各クリップは、肋間筋と肋骨を引っ掛けて、胸壁を4方向(つまり、上→左、上→右、左下、右下)にそっと広げ、長方形の手術窓を作成する必要があります。
8. 手術中の偶発的な組織損傷を防ぐために、左肺および心膜を覆う他の隣接する組織に別の曲がったクリップで穏やかに引っ掛けます。
9. 鉗子で薄い心膜をそっと取り除き、心臓を露出させます。通常、肺動脈と左耳介の間にある左主冠状動脈(LMCA)の第1枝を特定します。LMCAとLADは、左耳介の端から頂点に向かって走る表面的な真っ赤な線として存在します。
10. 準備した手術針を使用して、LMCAの第1枝のすぐ遠位の場所でLADの下にシルクステッチを挿入してLADの左側から右側に向かって挿入し、誤って左耳介に穴を開けないようにすることで、開結紮ループを作成します。単一の縫合糸で、オープンループが作成されます。心臓の表面を軽く拭いて視覚化します心臓の表面を覆っている液体または血液のためにLADが見えない場合は、冠状動脈。
11. 縫合糸の片側を持ち、針ホルダーを使用して針を縫合糸からそっと分離します。
12. 開いたループの片側のシルク縫合糸の両端を反対側の円に挿入して、スネアループを形成します。
13. ループを閉じる前に、スネアループのシルク縫合糸の両端を準備したスネアコントローラーに挿入します。
14. スネアループコントローラーをシルク縫合糸に沿ってスライドさせ、シルクを静かに伸ばしてスネアループを閉じます。LADの冠状動脈の流れを停止して、一時的な心筋虚血を1時間誘発します。
15. ループがしっかりと結ばれたら、シルクを持ってスネアループコントローラーの位置をケリー鉗子で固定します。LAD結紮中にケリー鉗子のもう一方の端を手術台に置きます。
16. LAD結紮中に生理食塩水で湿った綿球で手術窓を覆います。
17. ケリー鉗子を開きます。
18. スネアループコントローラーを解放して、冠状動脈流を2時間再灌流します。
19. 基部と血管の境界に沿って心臓を慎重に切除し、組織をつかまないようにしてください。
    注:ラットを_CO2で40%ケージ容量/分の流速で安楽死させます。

Representative Results

心筋虚血および再灌流の終わりに、さらなる生化学的または分子分析の前にLAD結紮の質を評価する必要があります。

結紮によるLAD閉塞の十分性は、中心静脈カテーテルを通して1mLの2%エバンの青色染料を注入することによって決定されました。そして、冠動脈灌流を伴う心筋は、赤色のままであった非灌流領域と比較して青色に染色された(図1A)。赤色の領域は心筋梗塞のAARです。

LAD結紮のための位置の精度は、研究動物間のAARパーセンテージの変動を定量化することによってさらに評価された。心臓を水平にスライスした後、AARを心筋質量全体で割ることによってAARパーセンテージを決定しました(図1B)。研究動物間のAARパーセンテージの変動が低いことは、LAD結紮の正確な位置を示しました。

心筋梗塞のサイズは、急性心筋IR研究の主要な結果です。このパラメータを定量化するために、スライスした心臓切片を、1%2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)中で37°Cの生理食塩水中で30分間インキュベートし、次いで10%ホルムアルデヒド中で3日間インキュベートしました。梗塞領域は白かった。梗塞サイズ百分率は、AARに対する梗塞領域の比率として算出した(図2)。

図1:エバンズブルーによるLAD結紮品質の検証 。 (A)心筋梗塞のAARは、エバンズブルーを注入した後も赤色のままである非灌流心筋腫瘤であり、安全なLAD結紮が確認された。(B)AARパーセンテージは、AAR(赤い領域)を心筋質量全体(赤と青の領域)で割ることによって計算されました。研究動物間のAARパーセンテージの低い変動は、LAD結紮の正確な位置を示しました。薬物治療群では、非治療群と比較して、より小さな梗塞サイズが実証された。AAR、危険にさらされている地域。LAD、左前下行動脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:TTC治療における心筋梗塞サイズの定量化。 梗塞サイズは、LAD結紮群におけるAAR(赤色領域)に対する梗塞領域(白色領域)の比率として推定した。AAR、危険にさらされている地域。TTC、トリフェニルテトラゾリウムクロリド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

提案されたプロトコルには、LAD結紮の正確な位置の特定、単一の縫合糸でスネアループを制御するガジェットの作成、組織の損傷を軽減するための修正された外科的操作のサポートなど、いくつかの特徴的な機能があり、研究者はLADを正確、安全、一貫して結紮し、急性心筋IR研究のためにスネアループの状態を即座に制御できます。

LAD結紮の位置は、心筋梗塞の面積と大きさに影響を与えます。結紮は一般に、近位^LAD27,28上の特定の距離で示唆される。冠状動脈分岐パターンの変動を見落とすと、心筋梗塞の変動性が増大する可能性があります^23,24。この研究では、LADはLMCAの第1枝のすぐ遠位に結紮されたため、左回旋動脈または中隔動脈の偶発的な結紮を防ぎ、一貫した梗塞サイズと致命的な不整脈の可能性の低下につながりました29,30,31。

LADの閉塞には安全なLADライゲーションが不可欠です。専門家は、LADを結紮することを推奨しています 結紮する1〜3ノットを作成するか、冠状動脈を圧縮するためのチューブの小片で結紮します32,33,34,35,36。この論文では、単一の縫合糸でLADを結紮するためのスネアループを備えた制御可能なガジェットを提案します。このアプローチにより、心筋穿刺、動脈結紮、結紮糸解除を繰り返す際の組織の裂傷、出血、縫合糸の強度の破壊を防ぎながら、安全なLAD結紮とループの閉鎖と放出の即時制御が可能になります。したがって、このアプローチは、急性心筋IR研究における実験および検証手順に有用です。

手術中に解剖学的特徴と組織学的特性を認識することは、組織の損傷を減らし、研究の複製を改善するのに役立ちます。胸郭の開口部に関して、学者たちは、はさみ、開創器、鉗子、鈍いピンセット、またはステッチを使用して胸筋と胸郭を脇に引っ張ることによって、胸筋と第3または第4肋間筋を分離することを提案しています32,33,35,37,38。本研究は、皮膚張力線(皮膚の結合組織フレームワーク)^39,40に沿って切開し、無血管の柔軟な結合組織⁴¹を含む単一の肋骨軟骨を切断し、胸筋と胸郭を引っ掛けて胸壁を開くことを示唆しています。このアプローチは、組織の完全性を維持し、出血のリスクを軽減するのに役立ちます。さらに、タッチで信頼できる表面メーカーを特定することからアプローチを開始することは、皮膚切開を利用した外科的処置が非常に再現性があり、一貫性があることを意味します。

LAD結紮によって誘発される心筋梗塞の質を確認することは、急性心筋IR研究における病態生理学的変化の調査前の重要なステップです。文献では、LAD結紮後の心筋梗塞の発生は、心筋の突然の局所的蒼白を観察することによって確認される^28,33;ベースライン³³からの心電図上昇の急性STセグメント;CK-MB、トロポニンI、およびトロポニンT ^28,32,42などの血清心臓酵素レベルの上昇;または巨視的に梗塞領域⁴²。LAD結紮の一貫性は、フタロまたはエバンの青色色素32,35,37,38を使用して梗塞のAARを決定することによってさらに検証する必要があります。サンプル間のAARパーセンテージの変動性が低いことは、急性心筋IR研究の手順の一貫性と品質を証明しています。また、心筋梗塞領域をTTC^28,36で画定することにより、梗塞領域をAARと区別することができる。エバンスブルー/ TTC二重染色は、心筋IR研究のex^vivo37の品質を評価するために以前に使用されました。単離された心臓をランゲンドルフ装置の下で灌流するというex vivo評価の要件と比較して、この研究は、結果が得られるin vivo評価の動物プロトコルをサポートし、研究の質は即座に直接検証されます。

さらに重要なことに、AARの梗塞領域を定義するためにEvanの青とTTCを使用すると、交絡因子を排除し、急性心筋IR研究で正確な結果を得るための要件である生化学的分析に梗塞した心筋を使用できなくなります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator