Summary
Qui presentiamo un protocollo incentrato sul controllo di qualità della legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra modificando tecnicamente la procedura tradizionale nei ratti per la ricerca acuta sull'ischemia-riperfusione miocardica.
Abstract
La malattia coronarica è la principale causa di morte a livello globale. La completa cessazione del flusso sanguigno nelle arterie coronarie provoca infarto miocardico con elevazione del segmento ST (STEMI), con conseguente shock cardiogeno e aritmia fatale, che sono associati ad alta mortalità. L'intervento coronarico primario (PCI) per la ricanalizzazione dell'arteria coronaria migliora significativamente i risultati di STEMI, ma i progressi compiuti nel ridurre il tempo da porta a palloncino non sono riusciti a ridurre la mortalità ospedaliera, suggerendo che sono necessarie ulteriori strategie terapeutiche. La legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) nei ratti è un modello animale per la ricerca IR miocardica acuta paragonabile allo scenario clinico in cui viene utilizzata la rapida ricanalizzazione coronarica attraverso PCI per STEMI; tuttavia, lo STEMI indotto da PCI è un'operazione tecnicamente impegnativa e complicata associata a un'elevata mortalità e a grandi variazioni nelle dimensioni dell'infarto. Abbiamo identificato la posizione ideale per la legatura LAD, creato un gadget per controllare un anello di rullante e supportato una manovra chirurgica modificata, riducendo così il danno tissutale, per stabilire un protocollo di ricerca sull'ischemia-riperfusione miocardica acuta (IR) affidabile e riproducibile per i ratti. Questo è un intervento chirurgico di non sopravvivenza. Proponiamo anche un metodo per convalidare la qualità dei risultati dello studio, che è un passo fondamentale per determinare l'accuratezza delle successive analisi biochimiche.
Introduction
La cardiopatia ischemica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo 1,2. Oltre al controllo dei fattori di rischio modificabili per prevenire lo sviluppo di malattia coronarica, le strategie terapeutiche sono necessarie in modo cruciale per la sindrome coronarica acuta 3,4. È stato riscontrato che lo shock cardiogeno e l'aritmia fatale nell'infarto miocardico acuto con elevazione del tratto ST (STEMI) aumentano la probabilità di mortalità ospedaliera 5,6,7,8. L'intervento coronarico percutaneo primario (PCI) è il trattamento preferito per STEMI 9,10,11; Tuttavia, gli effetti terapeutici hanno un limite quando il tempo door-to-balloon è <90 min12,13. Sono necessarie ulteriori strategie per migliorare ulteriormente gli esiti clinici della malattia 14,15,16,17,18,19.
Un esperimento acuto di ischemia-riperfusione miocardica (IR) che coinvolge la legatura dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD) nei ratti è uno dei modelli animali paragonabili allo scenario clinico in cui sono necessari brevi tempi door-to-balloon per i pazienti con STEMI per salvare il cuore dal danno ischemico. Tuttavia, lo STEMI indotto dalla chirurgia nei piccoli animali è spesso tecnicamente impegnativo perché è un'operazione complessa associata ad alta mortalità e alta variazione delle dimensioni dell'infarto 20,21,22,23,24. Per superare la sfida tecnica, il presente studio ha sviluppato un modello animale completo ed efficace nei ratti (perché sono più grandi dei topi) per stabilire un protocollo di ricerca IR miocardica acuta affidabile e riproducibile attraverso modifiche tecniche. Il protocollo proposto si traduce in un minor numero di complicanze chirurgiche, meno danni ai tessuti e meno probabilità di mortalità durante l'intervento chirurgico. Inoltre, è stata utilizzata una procedura per misurare le dimensioni dell'infarto e l'area a rischio (AAR) e, quindi, verificare la qualità dei risultati dello studio. Il protocollo proposto può essere utilizzato per studiare i processi fisiopatologici dello stress IR miocardico acuto per sviluppare nuove strategie terapeutiche contro il danno.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 1996). Il protocollo di studio è stato approvato e in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università cattolica Fu-Jen.
1. Preparazione prima dell'intervento chirurgico
- Preparazione di batuffoli di cotone bagnati salini
- Indossare una maschera chirurgica e guanti.
- Pizzica una piccola porzione di cotone sterile e arrotolala per formare una palla. Ripetere questa procedura.
- Immergere i batuffoli di cotone in soluzione salina sterile allo 0,9% e spremere la soluzione salina in eccesso.
- Conservare i batuffoli di cotone in una scatola pulita sterilizzata con etanolo al 75%.
- Preparazione di ganci di tenuta.
- Indossare una maschera chirurgica e guanti.
- Sterilizzare clip e elastici con etanolo al 75%.
- Piegare le clip a forma di gancio per la parete toracica e il tessuto.
- Collegare le clip piegate con uno, due o tre elastici per garantire che la tensione dalla ferita della finestra chirurgica sia abbastanza ampia per la legatura LAD.
- Preparare e conservare almeno cinque ganci fatti in casa in una scatola pulita sterilizzata con etanolo al 75%.
- Preparazione di un anello di legatura.
- Posizionare il centro di un punto di seta 7-0 nell'occhio a molla di dimensione 1/2 cerchio 3 di un ago chirurgico affusolato non avvolto.
- Preparazione di un controller ad anello rullante
- Tagliare un tubo di polietilene (PE)-10 da 5 mm usando le forbici.
- Riscaldare e ammorbidire il tubo sotto la fiamma per levigare entrambi i bordi.
- Preparare i ratti
- Seleziona ratti maschi di Sprague-Dawley di 8 settimane con un peso minimo di 250 g.
- Ospitare e mantenere i ratti sotto un ciclo luce/buio di 12 ore a temperatura controllata (21 °C ± 2 °C) con libero accesso al cibo, pellet standard di topo e acqua di rubinetto.
- Anestetizzare i ratti con pentobarbital (50 mg/kg, somministrato per via intraperitoneale).
NOTA: Un anestetico aggiuntivo (pentobarbital, 30 mg/kg) deve essere somministrato dopo ogni ora. - Controlla i riflessi dei ratti pizzicando la coda e le zampe posteriori per assicurarti che l'animale sia sufficientemente anestetizzato.
- Aprire il tessuto tra due anelli di cartuccia sotto la glottide usando le forbici e inserire un tubo PE-10 di 3 cm per agire come un tubo endotracheale25.
- Collegare manualmente il tubo endotracheale a un ventilatore.
- Ispezionare il movimento toracico dell'animale sincronizzato con il ciclo respiratorio per assicurarsi che i polmoni siano adeguatamente ventilati.
- Aprire la regione del collo e cannulare la vena giugulare26.
2. Legatura LAD
- Indossare una maschera chirurgica e guanti.
- Tocca il torace e trova il manubrio e l'angolo sternale (la giunzione del corpo del manubrio e dello sterno).
- Identifica la costola sul lato sinistro che si collega con l'angolo sternale (costola A) toccando manualmente.
- Identificare lo spazio intercostale immediatamente sotto la costola A. Utilizzare una pinza a punta fine per sollevare delicatamente la pelle vicino allo spazio intercostale, quindi utilizzare un bisturi chirurgico con una lama per creare un'incisione obliqua di 1 cm lungo le linee di tensione della pelle dal punto a circa 5 mm a sinistra del corpo sternale.
- Utilizzare una pinza curva per separare delicatamente la pelle e gli strati muscolari dall'incisione. Agganciare gli strati muscolari all'esterno della parete toracica anteriore sinistra verso il basso con clip piegate per esporre le costole sottostanti.
- Identificare la costola sotto la costola A (costola B). Tagliare la costola B con una forbice smussata dal centro della cartilagine della costola (circa 2-3 mm dal corpo sternale). Toccare delicatamente e comprimere la ferita con un batuffolo di cotone bagnato salino per diversi secondi se si verifica sanguinamento.
- Aprire il torace con attenzione dal taglio della costola B con quattro clip piegate. Ogni clip piegata dovrebbe agganciare il muscolo intercostale e le costole per allargare delicatamente la parete toracica in quattro direzioni (vale a dire, superiore poi sinistra, superiore poi destra, sinistra verso il basso e destra verso il basso) e creare una finestra chirurgica rettangolare.
- Aggancia delicatamente contro il polmone sinistro e altri tessuti adiacenti che coprono il pericardio con un'altra clip piegata per prevenire danni accidentali ai tessuti durante la procedura.
- Esporre il cuore rimuovendo delicatamente il pericardio sottile con una pinza. Identificare il 1 ° ramo dell'arteria coronaria principale sinistra (LMCA), che di solito si trova tra l'arteria polmonare e il padiglione auricolare sinistro. LMCA e LAD si presentano come una linea rossa brillante superficiale che corre dal bordo del padiglione auricolare sinistro verso l'apice.
- Utilizzare l'ago chirurgico preparato per creare un anello di legatura aperto inserendo e passando il punto di seta sotto il LAD in una posizione immediatamente distale al 1 ° ramo del LMCA nella direzione da sinistra verso il lato destro del LAD per evitare di perforare accidentalmente il padiglione auricolare sinistro. Con una singola sutura, viene creato il ciclo aperto. Tamponare delicatamente la superficie del cuore per visualizzare le arterie coronarie se il LAD è invisibile a causa del liquido o del sangue che copre la superficie del cuore.
- Tenere un lato della sutura e separare delicatamente l'ago dalla sutura usando un portaaghi.
- Inserire le due estremità della sutura di seta su un lato dell'anello aperto nel cerchio sull'altro lato per formare un anello di rullante.
- Inserire le due estremità della sutura di seta dell'anello rullante nel controller del rullante preparato prima di chiudere l'anello.
- Far scorrere il controller del rullante lungo la sutura della seta mentre si allunga delicatamente la seta per chiudere l'anello del rullante. Interrompere il flusso coronarico del LAD per indurre ischemia miocardica temporanea per 1 ora.
- Tenere la seta per fissare la posizione del controller del rullante con una pinza Kelly una volta che il cappio è stato legato saldamente. Posizionare l'altra estremità della pinza Kelly sul lettino chirurgico durante la legatura LAD.
- Coprire la finestra chirurgica con batuffoli di cotone bagnati salini durante la legatura LAD.
- Apri la pinza Kelly.
- Rilasciare il controller del loop del rullante per la riperfusione del flusso coronarico per 2 ore.
- Resecare il cuore lungo la base e i bordi vascolari con attenzione ed evitare di afferrare il tessuto.
NOTA: Eutanasia del ratto con CO2 ad una portata del 40% del volume della gabbia/min.
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Representative Results
Al termine dell'ischemia miocardica e della riperfusione, la qualità della legatura del LAD deve essere valutata prima di ulteriori analisi biochimiche o molecolari.
La sufficienza dell'occlusione di LAD attraverso la legatura è stata determinata iniettando 1 mL di colorante blu di Evan al 2% attraverso il catetere venoso centrale. Quindi, il miocardio con perfusione coronarica è stato colorato di blu rispetto alla regione non perfusa, che è rimasta rossa (Figura 1A). La regione rossa è l'AAR dell'infarto miocardico.
L'accuratezza della posizione per la legatura LAD è stata ulteriormente valutata quantificando la variazione della percentuale di AAR tra gli animali in studio. Dopo che il cuore è stato tagliato orizzontalmente, la percentuale di AAR è stata determinata dividendo l'AAR per l'intera massa miocardica (Figura 1B). Una bassa variazione nella percentuale di AAR tra gli animali in studio ha indicato una posizione accurata della legatura LAD.
La dimensione dell'infarto miocardico è il risultato primario nella ricerca IR miocardica acuta. Per quantificare questo parametro, le sezioni cardiache affettate sono state incubate in cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) all'1% in soluzione salina normale a 37 °C per 30 minuti e poi in formaldeide al 10% per 3 giorni. L'area dell'infarto era bianca. La percentuale di dimensione dell'infarto è stata calcolata come rapporto tra l'area dell'infarto e l'AAR (Figura 2).
Figura 1: Convalida della qualità della legatura LAD con il blu di Evan. (A) L'AAR per l'infarto miocardico era la massa miocardica non perfusa che rimaneva rossa anche dopo l'iniezione del blu di Evan, confermando così la legatura sicura del LAD. (B) La percentuale di AAR è stata calcolata dividendo l'AAR (area rossa) per l'intera massa miocardica (area rossa e blu); una bassa variazione nella percentuale di AAR tra gli animali in studio ha dimostrato una posizione accurata della legatura LAD. Una dimensione dell'infarto più piccola è stata dimostrata nei gruppi trattati con farmaci rispetto ai gruppi non trattati. AAR, area a rischio; LAD, arteria discendente anteriore sinistra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Quantificazione della dimensione dell'infarto miocardico nel trattamento TTC. La dimensione dell'infarto è stata stimata come il rapporto tra l'area dell'infarto (area bianca) e l'AAR (area rossa) nel gruppo di legatura LAD. AAR, area a rischio; TTC, cloruro di trifeniltetrazolio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il protocollo proposto ha diverse caratteristiche distintive, come l'identificazione della posizione esatta per la legatura LAD, la creazione di un gadget per controllare un anello di rullante in una singola sutura e il supporto di una manovra chirurgica modificata per ridurre il danno tissutale, consentendo così ai ricercatori di legare il LAD in modo accurato, sicuro e coerente, nonché di controllare istantaneamente lo stato del loop del rullante per la ricerca IR miocardica acuta.
La posizione della legatura LAD influenza l'area e le dimensioni dell'infarto miocardico. La legatura è generalmente suggerita ad una certa distanza sul LAD prossimale27,28. Trascurare la varianza nei modelli di ramificazione delle arterie coronarie può aumentare la variabilità nell'infarto miocardico23,24. In questo studio, il LAD è stato legato immediatamente distalmente al 1 ° ramo del LMCA, prevenendo così la legatura accidentale dell'arteria circonflessa sinistra o dell'arteria settale e portando a dimensioni infartuali consistenti e una minore probabilità di aritmia fatale 29,30,31.
La legatura sicura del LAD è essenziale per l'occlusione di LAD. Gli esperti hanno raccomandato che il LAD dovrebbe essere legato con legato per creare da uno a tre nodi o con un piccolo pezzo di tubo per comprimere l'arteria coronaria 32,33,34,35,36. In questo articolo, suggeriamo un gadget controllabile con un anello rullante per legare il LAD in una singola sutura; questo approccio consente una legatura sicura del LAD e un controllo istantaneo della chiusura e del rilascio dell'ansa, prevenendo la lacerazione dei tessuti, il sanguinamento e la rottura della forza della sutura durante la puntura miocardica ripetuta, la legatura arteriosa e il rilascio della legatura. L'approccio è, quindi, utile per le procedure sperimentali e di validazione nella ricerca IR miocardica acuta.
Riconoscere le caratteristiche anatomiche e le proprietà istologiche durante l'intervento chirurgico è utile per ridurre il danno tissutale e migliorare la replica dello studio. Per quanto riguarda l'apertura del torace, gli studiosi hanno suggerito di separare i muscoli pettorali e il 3 ° o 4 ° muscolo intercostale usando forbici, un divaricatore, una pinza, pinzette smussate o punti per allontanare i muscoli toracici e la gabbia toracica 32,33,35,37,38. Il presente studio suggerisce un'incisione lungo le linee di tensione cutanea (la struttura del tessuto connettivo della pelle)39,40, tagliando la cartilagine di una singola costola, che contiene tessuto connettivo flessibile avascolare41, e agganciando il muscolo toracico e le gabbie toraciche per aprire la parete toracica. Questo approccio aiuta a mantenere l'integrità dei tessuti e riduce il rischio di sanguinamento. Inoltre, iniziare l'approccio identificando produttori di superfici affidabili attraverso il tatto significa che la procedura chirurgica che utilizza un'incisione cutanea è altamente ripetibile e coerente.
Confermare la qualità dell'infarto miocardico indotto dalla legatura LAD è un passo fondamentale prima dello studio dei cambiamenti fisiopatologici nella ricerca IR miocardica acuta. In letteratura, l'insorgenza di infarto miocardico dopo legatura LAD è confermata osservando un improvviso pallore regionale del miocardio28,33; un segmento ST acuto di elevazione dell'elettrocardiogramma dal basale33; elevati livelli sierici di enzimi cardiaci come CK-MB, troponina I e troponina T 28,32,42; o regioni infartuate macroscopicamente42. La consistenza della legatura LAD dovrebbe essere ulteriormente convalidata determinando l'AAR per l'infarto utilizzando Phthalo o il colorante blu di Evan32,35,37,38. La bassa variabilità nella percentuale di AAR tra i campioni dimostra la coerenza e la qualità della procedura per la ricerca IR miocardica acuta. Inoltre, l'area dell'infarto può essere distinta dall'AAR delimitando le regioni dell'infarto miocardico con TTC28,36. La doppia colorazione blu di Evans/TTC è stata precedentemente impiegata per valutare la qualità di uno studio IR miocardico ex vivo37. Rispetto al requisito nelle valutazioni ex vivo che il cuore isolato sia perfuso sotto l'apparato di Langendorff, questo studio supporta il protocollo animale di valutazione in vivo in cui si ottengono i risultati e la qualità dello studio viene convalidata istantaneamente e direttamente.
Ancora più importante, l'uso del blu di Evan e del TTC per definire l'area dell'infarto all'AAR preclude l'uso del miocardio infartuato per le analisi biochimiche, che è un requisito per escludere fattori confondenti e ottenere risultati accurati nella ricerca IR miocardica acuta.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.
Acknowledgments
Questo modello è stato sviluppato con il sostegno finanziario del Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 109-2320-B-030-006-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evan’s blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Forceps | Shinva | ||
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Scalpel blades | Shinva | s2646 | |
| Scalpel handles | Shinva | ||
| Silk sutures | SharpointTM | DC-2150N | |
| Surgical needle | AnchorTM | ||
| Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution | Solarbio | T8170-1 | |
| Ventilator | Harvard Rodent Ventilator |
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