Vänster främre fallande kranskärlsligering för ischemi-reperfusionsforskning: Modellförbättring via tekniska modifieringar och kvalitetskontroll

Summary

Här presenterar vi ett protokoll som fokuserar på kvalitetskontroll av vänster främre nedåtgående kranskärlsligering genom att tekniskt modifiera det traditionella förfarandet hos råttor för akut myokardischemi-reperfusionsforskning.

Abstract

Koronar hjärtsjukdom är den ledande dödsorsaken globalt. Fullständigt upphörande av blodflödet i kransartärer orsakar ST-segmenthöjning hjärtinfarkt (STEMI), vilket resulterar i kardiogen chock och dödlig arytmi, som är förknippade med hög dödlighet. Primär koronarintervention (PCI) för rekanalisering av kransartären förbättrar signifikant resultaten av STEMI, men framsteg som gjorts för att förkorta dörr-till-ballongtiden har misslyckats med att minska dödligheten på sjukhus, vilket tyder på att ytterligare terapeutiska strategier krävs. Vänster främre nedåtgående kranskärl (LAD) ligering hos råttor är en djurmodell för akut myokardiell IR-forskning som är jämförbar med det kliniska scenariot där snabb koronar rekanalisering genom PCI används för STEMI; PCI-inducerad STEMI är dock en tekniskt utmanande och komplicerad operation förknippad med hög dödlighet och stor variation i infarktstorlek. Vi identifierade den ideala positionen för LAD-ligering, skapade en gadget för att styra en virvelslinga och stödde en modifierad kirurgisk manöver och därigenom minskade vävnadsskador för att upprätta ett tillförlitligt och reproducerbart forskningsprotokoll för akut myokardischemi-reperfusion (IR) för råttor. Detta är en icke-överlevnadsoperation. Vi föreslår också en metod för att validera kvaliteten på studieresultat, vilket är ett kritiskt steg för att bestämma noggrannheten i efterföljande biokemiska analyser.

Introduction

Ischemisk hjärtsjukdom är en ledande dödsorsak över hela världen ^1,2. Förutom kontrollen av modifierbara riskfaktorer för att förhindra utvecklingen av kranskärlssjukdom krävs terapeutiska strategier avgörande för akut koronart syndrom ^3,4. Kardiogen chock och dödlig arytmi vid akut hjärtinfarkt med ST-segmenthöjning (STEMI) har visat sig öka sannolikheten för dödlighet på sjukhus 5,6,7,8. Primär perkutan koronar intervention (PCI) är den föredragna behandlingen för STEMI 9,10,11; De terapeutiska effekterna har dock ett tak när dörr-till-ballongtiden är <90 min^12,13. Ytterligare strategier krävs för att ytterligare förbättra de kliniska resultaten av sjukdomen 14,15,16,17,18,19.

Ett akut myokardischemi-reperfusionsexperiment (IR) som involverar vänster främre nedåtgående artär (LAD) ligering hos råttor är en av djurmodellerna som kan jämföras med det kliniska scenariot där korta dörr-till-ballongtider krävs för patienter med STEMI för att rädda hjärtat från ischemisk skada. Kirurgiinducerad STEMI hos små djur är dock ofta tekniskt utmanande eftersom det är en komplex operation förknippad med hög dödlighet och hög variation i infarktstorlek 20,21,22,23,24. För att övervinna den tekniska utmaningen utvecklade den aktuella studien en omfattande och effektiv djurmodell hos råttor (eftersom de är större än möss) för att etablera ett tillförlitligt och reproducerbart akut myokardiellt IR-forskningsprotokoll genom teknisk modifiering. Det föreslagna protokollet resulterar i färre kirurgiska komplikationer, mindre vävnadsskada och mindre sannolikhet för dödlighet under operationen. Dessutom användes en procedur för att mäta infarktstorlek och riskområde (AAR) och därmed verifiera kvaliteten på studieresultaten. Det föreslagna protokollet kan användas för att undersöka de patofysiologiska processerna vid akut myokardiell IR-stress för att utveckla nya terapeutiska strategier mot skadan.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publicerad av US National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, reviderad 1996). Studieprotokollet godkändes av och i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee vid Fu-Jen Catholic University.

1. Förberedelse före operationen

1. Beredning av saltlösning våta bomullsbollar
   1. Sätt på en kirurgisk mask och handskar.
   2. Nyp av en liten del steril bomull och rulla den för att bilda en boll. Upprepa denna procedur.
   3. Doppa bomullstussarna i steril 0,9% saltlösning och pressa ut överflödig saltlösning.
   4. Förvara bomullstussarna i en ren låda steriliserad med 75% etanol.
2. Förberedelse av hållkrokar.
   1. Sätt på en kirurgisk mask och handskar.
   2. Sterilisera klämmor och gummiband med 75% etanol.
   3. Böj klämmorna i form av en krok för bröstväggen och vävnaden.
   4. Anslut de böjda klämmorna med ett, två eller tre gummiband för att säkerställa att spänningen från såret i det kirurgiska fönstret är tillräckligt bred för LAD-ligering.
   5. Förbered och förvara minst fem hemlagade krokar i en ren låda steriliserad med 75% etanol.
3. Förberedelse av en ligeringsslinga.
   1. Placera mitten av en 7-0 silkesöm i 1/2 cirkelstorlek 3 våröga på en avsmalnande icke-svept kirurgisk nål.
4. Förberedelse av en virvelslingregulator
   1. Skär ett 5 mm polyeten (PE)-10-rör med sax.
   2. Värm och mjuka röret under låga för att jämna ut båda kanterna.
5. Förbereda råttorna
   1. Välj 8 veckor gamla Sprague-Dawley hanråttor med en minsta vikt på 250 g.
   2. Stalla och håll råttorna under en 12 timmars ljus/mörk cykel vid en kontrollerad temperatur (21 °C ± 2 °C) med fri tillgång till mat, vanliga muspellets och kranvatten.
   3. Bedöva råttorna med pentobarbital (50 mg/kg, administrerat intraperitonealt).
      OBS: Ytterligare bedövningsmedel (pentobarbital, 30 mg/kg) ska administreras efter varje timme.
   4. Kontrollera råttornas reflexer genom att nypa i svansen och bakfötterna för att säkerställa att djuret är tillräckligt bedövat.
   5. Öppna vävnaden mellan två patronringar under glottis med sax och sätt in ett 3 cm PE-10-rör för att fungera som ett endotrakealt rör²⁵.
   6. Anslut endotrakealtuben till en ventilator manuellt.
   7. Kontrollera djurets bröstkorgsrörelse synkroniserad med andningscykeln för att säkerställa att lungorna är tillräckligt ventilerade.
   8. Öppna nackregionen och cannulate halsvenen²⁶.

2. LAD-ligering

1. Sätt på en kirurgisk mask och handskar.
2. Tryck på bröstet och hitta manubrium och sternal vinkel (korsningen av manubrium och bröstben).
3. Identifiera revbenet på vänster sida som ansluter till bröstvinkeln (revben A) genom att trycka manuellt.
4. Identifiera det interkostala utrymmet omedelbart under revben A. Använd pincett med fin spets för att försiktigt lyfta huden nära det interkostala utrymmet och använd sedan en kirurgisk skalpell med ett blad för att skapa ett 1 cm snett snitt längs hudspänningslinjerna från punkten ca 5 mm till vänster om bröstkroppen.
5. Använd böjda pincett för att försiktigt separera huden och muskellagren från snittet. Haka muskellagren utanför den vänstra främre bröstväggen nedåt med böjda klämmor för att exponera revbenen under.
6. Identifiera revbenet under revben A (revben B). Klipp revben B med en trubbig sax från mitten av revbensbrosket (ca 2-3 mm från bröstkroppen). Rör försiktigt och komprimera såret med en saltlösning våt bomullstuss i flera sekunder om blödning uppstår.
7. Öppna bröstkorgen försiktigt från snittet av revben B med fyra böjda klämmor. Varje böjt klämma ska haka i den interkostala muskeln och revbenen för att försiktigt sprida bröstväggen i fyra riktningar (nämligen övre sedan vänster, övre sedan höger, vänster nedåt och höger nedåt) och skapa ett rektangulärt kirurgiskt fönster.
8. Haka försiktigt mot vänster lunga och andra intilliggande vävnader som täcker perikardiet med en annan böjd klämma för att förhindra oavsiktlig vävnadsskada under proceduren.
9. Exponera hjärtat genom att försiktigt ta bort det tunna perikardiet med pincett. Identifiera den 1: a grenen av vänster huvudkransartär (LMCA), som vanligtvis ligger mellan lungartären och vänster öron. LMCA och LAD presenterar som en ytlig ljusröd linje som löper från kanten av vänster öron mot toppen.
10. Använd den förberedda kirurgiska nålen för att skapa en öppen ligeringsslinga genom att sätta in och passera silkesömmen under LAD på en plats omedelbart distal mot LMCA: s 1: a gren i riktning från vänster mot höger sida av LAD för att undvika oavsiktlig punktering av vänster öron. Med en enda sutur skapas den öppna slingan. Torka försiktigt ytan av hjärtat för att visualiserakransartärerna om LAD är osynlig på grund av vätska eller blod som täcker ytan av hjärtat.
11. Håll ena sidan av suturen och separera försiktigt nålen från suturen med hjälp av en nålhållare.
12. Sätt in de två ändarna av silkesuturen på ena sidan av den öppna slingan i cirkeln på andra sidan för att bilda en virvelslinga.
13. För in de två ändarna av virvelns silkesutur i den förberedda virvelkontrollen innan du stänger slingan.
14. Skjut virvelslingans kontroller längs silkesuturen medan du försiktigt sträcker silket för att stänga virvelslingan. Stoppa LAD: s koronarflöde för att inducera tillfällig myokardischemi i 1 h.
15. Håll i siden för att fixera virvelregulatorns position med Kelly-pincett när öglan har knutits ordentligt. Placera den andra änden av Kelly-pincetten på operationsbordet under LAD-ligering.
16. Täck det kirurgiska fönstret med saltlösning våta bomullsbollar under LAD-ligering.
17. Öppna Kelly-pincetten.
18. Släpp virvelslingans regulator för reperfusion av koronarflödet i 2 timmar.
19. Resektera hjärtat längs basen och kärlgränserna försiktigt och undvik att ta tag i vävnaden.
    OBS: Avliva råttan med CO₂ med en flödeshastighet på 40% burvolym/min.

Representative Results

Vid slutet av myokardischemi och reperfusion bör kvaliteten på LAD-ligering bedömas före ytterligare biokemiska eller molekylära analyser.

Tillräckligheten av LAD-ocklusion genom ligering bestämdes genom att injicera 1 ml 2% Evans blå färgämne genom den centrala venkatetern. Därefter färgades myokardiet med koronar perfusion blått jämfört med den icke-perfuserade regionen, som förblev röd (figur 1A). Den röda regionen är AAR för hjärtinfarkt.

Noggrannheten i platsen för LAD-ligering utvärderades ytterligare genom att kvantifiera variationen i AAR-procent bland försöksdjuren. Efter att hjärtat skurits horisontellt bestämdes AAR-procenten genom att dividera AAR med hela myokardmassan (figur 1B). En låg variation i AAR-procent bland försöksdjuren indikerade korrekt plats för LAD-ligeringen.

Storleken på hjärtinfarkten är det primära resultatet i akut myokardiell IR-forskning. För att kvantifiera denna parameter inkuberades de skivade hjärtsektionerna i 1% 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) i normal saltlösning vid 37 °C i 30 minuter och sedan i 10% formaldehyd i 3 dagar. Infarktområdet var vitt. Infarktstorleksprocenten beräknades som förhållandet mellan infarktarean och den årliga verksamhetsrapporten (figur 2).

Figur 1: Validering av LAD-ligeringskvalitet med Evans blå. (A) AAR för hjärtinfarkt var den icke-perfuserade myokardmassan som förblev röd även efter att Evans blå injicerades, vilket bekräftar säker LAD-ligering. (B) Den årliga verksamhetsrapporten beräknades genom att dividera AAR (rött område) med hela myokardmassan (rött och blått område). en låg variation i AAR-procent bland försöksdjuren visade korrekt lokalisering av LAD-ligeringen. En mindre infarktstorlek visades i läkemedelsbehandlade grupper jämfört med icke-behandlade grupper. AAR, riskområde. LAD, vänster främre nedåtgående artär. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Kvantifiering av hjärtinfarktens storlek vid TTC-behandling. Infarktstorleken uppskattades som förhållandet mellan infarktarean (vitt område) och AAR (rött område) i LAD-ligeringsgruppen. AAR, riskområde. TTC, trifenyltetrazoliumklorid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Det föreslagna protokollet har flera särdrag, såsom att identifiera den exakta positionen för LAD-ligering, skapa en gadget för att styra en virvelslinga i en enda sutur och stödja en modifierad kirurgisk manöver för att minska vävnadsskador, vilket gör det möjligt för forskare att ligera LAD exakt, säkert och konsekvent, samt kontrollera virvelslingans tillstånd direkt för akut myokardiell IR-forskning.

Placeringen av LAD-ligering påverkar området och storleken på hjärtinfarkten. Ligering föreslås i allmänhet på ett visst avstånd på den proximala LAD^27,28. Att förbise variansen i kranskärlsförgreningsmönster kan öka variationen i hjärtinfarkt^23,24. I denna studie ligerades LAD omedelbart distalt till den 1: a grenen av LMCA, vilket förhindrade oavsiktlig ligering av den vänstra cirkumflexartären eller septalartären och ledde till konsekvent infarktstorlek och en lägre sannolikhet för dödlig arytmi 29,30,31.

Säker LAD-ligering är avgörande för LAD-ocklusion. Experter har rekommenderat att LAD bör ligeras med bundenför att skapa en till tre knutar eller med en liten bit slang för att komprimera kransartären 32,33,34,35,36. I det här dokumentet föreslår vi en kontrollerbar gadget med en virvelslinga för att ligera LAD i en enda sutur; Detta tillvägagångssätt möjliggör säker LAD-ligering och omedelbar kontroll av slingstängning och frisättning samtidigt som vävnadslaceration, blödning och brytning av suturens styrka förhindras under upprepad myokardiell punktering, arteriell ligering och ligaturfrisättning. Tillvägagångssättet är således användbart för experimentella och valideringsprocedurer vid akut myokardiell IR-forskning.

Att känna igen anatomiska egenskaper och histologiska egenskaper under operationen är till hjälp för att minska vävnadsskador och förbättra studiereplikationen. När det gäller öppningen av bröstkorgen har forskare föreslagit att separera bröstmusklerna och 3: e eller 4: e interkostala musklerna med hjälp av sax, en retraktor, pincett, trubbig pincett eller stygn för att dra åt sidan bröstmusklerna och bröstkorgen 32,33,35,37,38. Den aktuella studien föreslår ett snitt längs hudens spänningslinjer (hudens bindvävsram)^39,40, skär ett enda revbens brosk, som innehåller avaskulär flexibel bindväv^41, och hakar bröstmuskeln och bröstkorgarna för att öppna bröstväggen. Detta tillvägagångssätt hjälper till att upprätthålla vävnadsintegritet och minskar blödningsrisken. Att starta tillvägagångssättet genom att identifiera pålitliga yttillverkare genom beröring innebär dessutom att det kirurgiska ingreppet som använder ett hudsnitt är mycket repeterbart och konsekvent.

Att bekräfta kvaliteten på hjärtinfarkt inducerad av LAD-ligering är ett kritiskt steg före undersökningen av patofysiologiska förändringar i akut myokardiell IR-forskning. I litteraturen bekräftas förekomsten av hjärtinfarkt efter LAD-ligering genom att observera plötslig regional blekhet i myokardiet^28,33; ett akut ST-segment av EKG-höjning från baslinjen³³; förhöjda serumhjärtenzymnivåer såsom CK-MB, troponin I och troponin T ^28,32,42; eller infarktregioner makroskopiskt⁴². Konsistensen av LAD-ligering bör vidare valideras genom att fastställa AAR för infarkt med hjälp av Phthalo eller Evans blå färgämne^32,35,37,38. Låg variabilitet i AAR-procent bland prover visar konsistensen och kvaliteten på proceduren för akut myokardiell IR-forskning. Dessutom kan infarktområdet särskiljas från AAR genom att avgränsa hjärtinfarktregioner med TTC^28,36. Evans blue/TTC dubbelfärgning användes tidigare för att utvärdera kvaliteten på en myokardiell IR-studie ex vivo³⁷. Jämfört med kravet i ex vivo-utvärderingar att det isolerade hjärtat perfuseras under Langendorff-apparaten, stöder denna studie djurprotokollet för in vivo-utvärdering där resultaten erhålls, och studiens kvalitet valideras omedelbart och direkt.

Ännu viktigare är att användningen av Evans blå och TTC för att definiera infarktområdet till AAR utesluter användningen av det infarkterade myokardiet för biokemiska analyser, vilket är ett krav för att utesluta störfaktorer och få exakta resultat i akut myokardiell IR-forskning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator