Summary
Protokollen gir en detaljert metode for nevronal avbildning i hjerneskive ved hjelp av en vevsryddingsmetode, ScaleSF. Protokollen inkluderer hjernevevsforberedelse, vevsavklaring, håndtering av ryddede skiver og konfikal laserskanning av mikroskopisk avbildning av nevronstrukturer fra mesoskopisk til mikroskopisk nivå.
Abstract
En detaljert protokoll er gitt her for å visualisere nevronstrukturer fra mesoskopisk til mikroskopisk nivå i hjernevev. Nevronale strukturer som spenner fra nevrale kretser til subcellulære nevronstrukturer visualiseres i musehjerneskiver optisk ryddet med ScaleSF. Denne avregningsmetoden er en modifisert versjon av ScaleS og er en hydrofil vevsryddingsmetode for vevsskiver som oppnår potent clearing evne samt et høyt nivå av bevaring av fluorescenssignaler og strukturell integritet. Et tredimensjonalt (3D)-trykt bildekammer som kan tilpasses, er utformet for pålitelig montering av renset hjernevev. Musehjerner injisert med en adeno-assosiert virusvektor med forbedret grønt fluorescerende proteingen ble festet med 4% paraformaldehyd og kuttet i skiver med 1 mm tykkelse med en vibrerende vevsskive. Hjerneskivene ble ryddet ved å følge clearingprotokollen, som inkluderer sekvensielle inkubasjoner i tre løsninger, nemlig ScaleS0-løsning, fosfatbuffers saltløsning (–) og ScaleS4-løsning, i totalt 10,5–14,5 timer. De ryddede hjerneskivene ble montert på bildekammeret og innebygd i 1,5% agarose gel oppløst i ScaleS4D25 (0) løsning. 3D-bildeanskaffelsen av skivene ble utført ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop utstyrt med en multi-nedsenking objektiv linse med lang arbeidsavstand. Fra og med mesoskopisk nevronal avbildning lyktes vi i å visualisere fine subcellulære nevronstrukturer, som dendritiske spines og axonale boutons, i de optisk ryddede hjerneskivene. Denne protokollen vil lette forståelsen av nevronstrukturer fra krets til subcellulære komponentskalaer.
Introduction
Vevsryddingsmetoder har forbedret dybdeuavhengig avbildning av biologiske og kliniske prøver med lett mikroskopi, noe som muliggjør utvinning av strukturell informasjon om intakt vev 1,2. Optiske clearingteknikker kan også potensielt øke hastigheten, og redusere kostnadene for histologisk analyse. For tiden er tre store clearing tilnærminger tilgjengelige: hydrofile, hydrofobe og hydrogelbaserte metoder 1,2. Hydrofile tilnærminger overgår i å bevare fluorescenssignaler og vevsintegritet og er mindre giftige sammenlignet med de to andre tilnærmingene 3,4.
En hydrofil clearingmetode, ScaleS, har en særegen posisjon med bevaring av strukturell og molekylær integritet samt potent clearing evne (clearing-bevaring spektrum)5. I en tidligere studie utviklet vi en rask og isometrisk clearingprotokoll, ScaleSF, for vevsskiver (~ 1 mm tykkelse) ved å endre clearingprosedyren til ScaleS6. Denne clearingprotokollen krever sekvensielle inkubasjoner av hjerneskiver i tre løsninger i 10,5-14,5 timer. Metoden er omtalt med et høyt clearing-konserveringsspekter, som er kompatibelt selv med elektronmikroskopianalyse (EM) (Supplementary Figure 1), noe som muliggjør tredimensjonal (3D) bildebehandling med høy oppløsning med nøyaktig signalrekonstruksjon6. Dermed bør ScaleSF være effektiv spesielt i hjernen, hvor nevronceller utarbeider sprudlende prosesser av enorm lengde, og ordner spesialiserte fine subcellulære strukturer for overføring og mottak av informasjon. Å trekke ut strukturell informasjon med skalaer fra krets til subcellulære nivåer på nevronceller er ganske nyttig for bedre forståelse av hjernefunksjoner.
Her gir vi en detaljert protokoll for å visualisere nevronstrukturer med skalaer fra mesoskopisk / krets til mikroskopisk / subcellulært nivå ved hjelp av ScaleSF. Protokollen inkluderer vevsforberedelse, vevsavklaring, håndtering av ryddet vev og konfikal laserskanning av mikroskopi (CLSM) avbildning av ryddet vev. Vår protokoll fokuserer på å forhøre nevronstrukturer fra krets til subcellulære komponentskalaer. For en detaljert prosedyre for fremstilling av løsninger og stereotaxisk injeksjon av adeno-assosierte virus (AAV) vektorer i musehjerner, se Miyawaki et al. 20167 og Okamoto et al. 20218, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees ved Juntendo University (Godkjenning nr. 2021245, 2021246) og utført i samsvar med grunnleggende retningslinjer for riktig gjennomføring av dyreforsøk av Science Council of Japan (2006). Her ble mannlige C57BL/6J-mus injisert med AAV-vektor med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP)-gen og parvalbumin (PV)/myristoylering-EGFP-lipoproteinreseptor med lav tetthet C-terminal bakteriellt kromosom (BAC) transgene mus (PV-FGL mus)9 brukt. PV-FGL mus ble opprettholdt i C57BL / 6J bakgrunn. Det ble ikke funnet kjønnsbaserte forskjeller med hensyn til denne studien.
1. Vev forberedelse
- Reparasjon av perfusjon
MERK: Utfør trinn 1.1.1 til og med 1.1.3 i en avtrekkshette for å begrense eksponeringen for paraformaldehyd (PFA).- Bedøv voksne hannmus (8–16 uker gamle) ved en intraperitoneal injeksjon av overdosering av natrium pentobarbital (200 mg/kg). Bekreft tilstrekkelighet av anestesi ved fravær av tå-klype abstinens og øye-blink reflekser.
- Åpne thoraxhulen og kutt høyre atrievedheng med kirurgisk saks. Perfuse musene med 20 ml iskald fosfatbuffer saltvann (PBS) ved hjelp av en 23 G nål festet til en 20 ml sprøyte, etterfulgt av perfusjon på 20 ml iskald 4% PFA i 0,1 M fosfatbuffer (PB) ved hjelp av en annen 20 ml sprøyte.
FORSIKTIG: PFA er giftig og teratogen. Unngå innånding eller kontakt med hud, øyne og slimhinne. - Fjern hjernevev fra skallen med pinsett. Overfør hjernevevet til et 15 ml rør som inneholder 4% PFA i 0,1 M PB, beskytt prøvene mot lys og rock forsiktig over natten ved 4 °C på en shaker ved 50–100 o/min.
- MERK: Det høstede hjernevevet kan lagres i flere uker i 0,02% natriumazid (NaN3) i PBS ved 4 °C.
FORSIKTIG: NaN3 er giftig. Unngå innånding eller kontakt med hud, øyne og slimhinne. Håndter den inne i en avtrekkshette.
- Forberedelse av hjerneskiver
- Forbered 4% agar i PBS ved å legge til 2 g agar til 50 ml PBS. Mikrobølgeovn blandingen til agaren er helt oppløst. La oppløsningen avkjøles til 40-45 °C.
MERK: Den viskøse egenskapen levert av agaropectin, en viktig komponent i agar, forbedrer enkel kutting av vev skiver. - Tilsett 10 ml av agarløsningen til en 6-brønns kulturplate. Senk hjernevevet ned i agarløsningen ved hjelp av tang. La agaren størkne på is.
- Fjern det innebygde hjernevevet fra brønnen og trim agaren med et barberblad. Fest agarblokken på bunnen av vibratombadet med superlim og hell 0,1 M PB i bufferbrettet.
- Rengjør et annet barberblad med et lofritt vevspapir gjennomvåt i etanol og fest bladet til bladholderen på den vibrerende vevsskiven.
- Sett seksjonshastigheten til 0,14 mm/s med 1,4 mm amplitude og frekvensen til 75–77 Hz. Skjær hjernevevet i 1 mm tykke skiver og samle skivene i en 6-brønns cellekulturplate som inneholder PBS.
MERK: Hjerneskivene kan lagres i flere uker i 0,02 % NaN3 i PBS ved 4 °C.
- Forbered 4% agar i PBS ved å legge til 2 g agar til 50 ml PBS. Mikrobølgeovn blandingen til agaren er helt oppløst. La oppløsningen avkjøles til 40-45 °C.
2. Vev avklaring
MERK: Sammensetningene av ScaleS-løsninger som brukes er oppført i tabell 1. Prøver bør beskyttes mot lys ved å dekke med en folie. Avregningstrinnene vises i figur 1A.
- Tilsett 8 ml ScaleS0-oppløsning til en brønn av en 6-brønns cellekulturplate og tilsett 8 ml ScaleS4-oppløsning til en annen brønn av platen og forvarm til 37 °C i en inkubator.
- Overfør hjerneskivene til den forvarmede ScaleS0-løsningen med en spatel og inkuber i 2 timer ved 37 °C i en ristende inkubator ved 90 o/min.
- Overfør de permeabiliserte hjerneskivene i 8 ml PBS(–) i en 6-brønns cellekulturplate med en slikkepott og vask i 15 minutter ved å holde i en orbital shaker ved 40-60 rpm. Gjenta dette to ganger.
- Overfør hjerneskivene i den forvarmede 8 ml ScaleS4-oppløsningen med en slikkepott og fjern dem ved å inkubere i en ristende inkubator ved 90 o/min i 8–12 timer ved 37 °C. En ryddet hjerneskive kan ses i figur 1.
3. Montering av hjerneskiver
MERK: Et bildekammer som kan tilpasses, brukes til pålitelig montering av klarerte hjerneskiver (figur 2)6. Kammeret består av kammerrammen og bunndekslene. Mikroskoptrinnadapterne er også designet for å montere bildekammeret direkte på mikroskopstadier (figur 2A,B). Kammerrammen og mikroskoptrinnadapterne kan 3D-printes ved hjelp av interne eller outsourcede 3D-utskriftstjenester. 3D dataassistert design (CAD) av bildekammeret er gitt i Furuta et al. 20226.
- For kammerforberedelse, fest kammerrammen til en dekslelip ved hjelp av et trykkfølsomt lim.
- Forbered 1,5% agarose i ScaleS4D25(0) oppløsning (ScaleS4 gel) ved å tilsette 1,5 g agarose til 100 ml av oppløsningen i en flaske. Bland løsningen godt ved omrøring og mikrobølgeovn løsningen til agarose er helt oppløst. Når du er ferdig, la løsningen avkjøles til 37 °C.
- Monter den ryddede hjerneskiven på bunndekslene på bildekammeret med en slikkepott. Tørk bort overflødig løsning fra den ryddede skiven ved hjelp av et rent lofritt papir.
- Tilsett ScaleS4 gel på hjerneskiven ved hjelp av en mikropipette for å fylle bildekammeret. Legg en annen deksleslip på toppen med tang og legg et stykke lofritt vevspapir og et glasssklie på dekslene i denne rekkefølgen.
- Overfør bildekammeret til kjøleskap ved 4 °C. Plasser metallvekter på glasssklie og la dem stå i 30 min.
- Fjern metallvektene, glasssklie, lofritt vevspapir og deksler fra bildekammeret, og tørk bort overflødig gel (figur 2A,B).
- Legg bildekammeret i en Petri-tallerken på 60 mm glass og fest kanten av bildekammeret til parabolen med et kittlignende trykkfølsomt lim. Fest kammeret på flere punkter til Petri-parabolen.
- Hell ScaleS4-oppløsningen i parabolen og rist forsiktig i 1 time ved 20-25 °C på en orbital shaker ved 40-60 o/min. Erstatt med fersk løsning og fjern luftbobler på geloverflaten ved å skrape overflaten forsiktig ved hjelp av en 200 μL pipettespiss. Monter det nedsenkede bildekammeret på et mikroskop (figur 2C).
4. CLSM-avbildning
- Skaff bilder ved hjelp av en CLSM utstyrt med et objektivt objektivt objektiv med flere innlevelser med lang arbeidsavstand (WD) (16x/0,60 numerisk blenderåpning [NA], WD = 2,5 mm).
MERK: Objektive objektive objektiver med høy NA kan gi begrenset oppløsning med høy diffraksjon. - Slå på alt relevant bildeutstyr (arbeidsstasjon, mikroskop, skanner, lasere og kvikksølvlampe) og start en CLSM-bildebehandlingsprogramvare.
- Sett korreksjonskragen på objektivlinsen for multi-nedsenking til 1,47. ScaleS4-oppløsning har en brytningsindeks (RI) på rundt 1,47 5,7. RI-uoverensstemmelser kan forstyrre bildedannelsen (figur 3).
- Senk den objektive linsen ned i løsningen, og la den nærme seg skiven sakte. Fjern eventuelle luftbobler som er fanget på spissen av objektivlinsen. Finn interesseområder (ROIer) i det ryddede vevet ved hjelp av epifluorescens.
- Angi parametere for bildeanskaffelse ved å teste riktige innstillinger.
- Bestem bitdybden for bildeanskaffelse. Datastørrelsen på bildet øker med bitdybden.
- Still inn deteksjonsbølgelengden. Juster riktig port for detektoren i henhold til utslippsspekteret. Kontroller at deteksjonsbølgelengden ikke dekker noen laserledninger.
- Angi xy-oppløsningen . Større formater gir bedre xy-oppløsninger , men det tar lengre tid å samle bildene.
- Still inn skannehastigheten. En lavere skannehastighet gir et høyt signal-til-støy-forhold. Imidlertid øker det også pikselboetiden og risikoen for fotobleaching. Velg deretter.
- Juster pinhole-størrelsen. Pinhole størrelse styrer optisk seksjon tykkelse. En mindre pinhole-størrelse skaper en tynnere optisk seksjon, og dermed bedre z-oppløsning , men reduserer fluorescenssignal. Å gjøre pinhole-størrelsen større gir en tykkere optisk seksjon med sterkere fluorescenssignal.
- Still inn lasereffekten, detektoren/forsterkerforsterkningen og forskjøvet. Øk laserkraften og detektoren/forsterkerforsterkningen gradvis til et passende bilde er oppnådd. En høy lasereffekt medfører risiko for fotobleking. Juster forskyvningen (kontrasten) riktig for å oppnå et høyt signal-til-støy-forhold.
- Bestem vippeområdet som trengs basert på størrelsen på avkastningen. Kontroller at hele lengden og bredden på avkastningen er fanget opp.
- Naviger i det ryddede vevet i alle plan, og angi start- og sluttpunktene for stabelen. Still inn z-trinnstørrelsen i henhold til ønsket z-oppløsning.
- Samle inn bilder når du er fornøyd med innstillingene for bildeanskaffelse, og ta opp innspilte bilder. Behandle bildene ved hjelp av en programvare for bildeanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optisk rydding av en musehjerneskive med 1 mm tykkelse ble oppnådd ved hjelp av denne protokollen. Figur 1B representerer overføringsbilder av en musehjerneskive før og etter ryddingsbehandlingen. Vevsryddingsmetoden gjorde en 1 mm tykk musehjerneskive gjennomsiktig. En liten utvidelse i endelige størrelser av hjerneskiver ble funnet etter inkubasjonen i clearingløsningen i 12 timer (lineær ekspansjon: 102,5% ± 1,3%). Bevaring av fluorescens og strukturell integritet i vevet ble vurdert med målrettet EGFP-uttrykk i plasmamembranen hos PV-FGL-mus (figur 1C). I disse musene uttrykkes somatodendritisk membran-målrettet EGFP i PV-positive nevroner9. EGFP-uttrykk rettet mot plasmamembranen i den somatodendrittiske regionen ble opprettholdt etter behandlingen (figur 1C). I tillegg viser den forrige EM-studien godt bevart strukturell integritet i hjernevev ryddet med ScaleSF (Tilleggs figur 1)6.
RI-uoverensstemmelser forårsaket merkbart tap av bildelysstyrke og oppløsning (figur 3). En 1 mm tykk hjerneskive med PV-FGL-mus ble ryddet og avbildet under en CLSM utstyrt med en multi-nedsenking objektiv linse av en lang WD. Justering av korreksjonskragen til objektivlinsen til vannposisjonen (RI 1,33) hindret klar visualisering av EGFP-positive nevroner plassert på dybden av 400 μm og 800 μm på grunn av lav lysstyrke og lav lysstyrke. (Figur 3A,C). Disse nevronene ble tydelig visualisert med samme CLSM, da korreksjonskragen ble justert for å matche ScaleS4-løsningen (RI 1.47; Figur 3B;D). RI-matching mellom en nedsenkningsvæske og objektiv linse er avgjørende for nøyaktig 3D-avbildning i optisk klarert vev.
Til slutt ble mus neokortiske nevroner brukt til å demonstrere muligheten for protokollen. En musehjerne injisert med AAV2/1-SynTetOff-EGFP vektor10 i den primære somatosensoriske cortex (S1) ble løst med 4% PFA i 0,1 M PB. Koronaskiver med 1 mm tykkelse ble tilberedt fra hjernen med en vibrerende vevsskive. Etter rydding og montering på bildekammeret ble det utført nevronal avbildning rettet mot neokortiske nevroner (figur 4). En 3D-rekonstruksjon av EGFP-merkede nevroner i den 1 mm tykke hjerneskiven er representert i figur 4A. Et bilde med høyere forstørrelse viser individuelle dendrittiske arbors dekorert med dendrittiske spines (figur 4B). Vi viste videre axon terminal arborizations og axonal boutons i contralateral cortex (Figur 4C).
Figur 1: Optisk rydding av musehjerneskiver med 1 mm tykkelse. (A) Tidsplanen for ScaleSF-vevsrydding. (B) Overføre bilder av en 1 mm tykk hjerneskive før (venstre) og etter (høyre) behandling. (C) En 3D-volumgjengivelse av hjernebarken til en PV-FGL-mus ryddet ved hjelp av vevsryddingsmetoden. (D,E) xy bilder i (C) på dybden av 250 μm (D) og 750 μm (E). (F,G) Forstørret visning av rektanglene som er beskrevet i (D) og (E). Bilder som vises i (C-G), dekonvoluteres før gjengivelsesprosessen. Forkortelser: pia = pia mater, WM = hvit materie. Skalastang: 2 mm inn (B), 500 μm tommer (C), 200 μm tommer (D, E) og 40 μm tommer (F, G). Denne figuren er endret fra Furata et al. 20226. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Et 3D-trykt bildekammer som kan tilpasses for visualisering av vevsstykker. (A,B) En skjemategning (A) og bilde (B) av et 3D-trykt bildekammer som kan tilpasses. Bildekammeret består av en kammerramme, en bunndeksler og mikroskoptrinnadaptere. Rensede vevsskiver plasseres på bunndekslene og er innebygd i ScaleS4 gel. Kammerrammen, bunndekslene og mikroskoptrinnadapterne kan tilpasses i henhold til størrelsen og tykkelsen på vevskiver. (C) Et bildeoppsett med bildekammeret. Bildekammeret er nedsenket i ScaleS4-oppløsning i en Petri-tallerken og montert på et stadium av en oppreist CLSM. Denne figuren er endret fra Furata et al. 20226. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kompromittert dyp bildebehandling forårsaket av en RI-uoverensstemmelse mellom en objektiv linse og ScaleS4-løsning. (A-D) xy bilder av hjernebarken til en PV-FGL-mus på dybder på 400 μm (A, B) og 800 μm (C, D). Korreksjonen av kragen til et objektivt objektiv med flere nedsenkinger justeres til 1,33 tommer (A, C) og 1,47 tommer (B, D). Bilder er anskaffet med de samme parametrene bortsett fra RIer av objektivet. Skalalinje: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Neuronal avbildning i en 1 mm tykk musehjerneskive ryddet med ScaleSF. (A) Gjengivelse av 3D-volum av EGFP-merkede mus neokortiske nevroner i S1. Neokortiske nevroner er merket med AAV2/1 SynTetOff-EGFP-vektoren. (B) Dendritiske arbors av EGFP-merkede neokortiske nevroner. Et bilde med maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) fra en dybde på 39 μm til 48 μm er representert. Pilspisser angir dendrittiske ryggrader. (C) EGFP-merkede axonterminaler i kontralateral cortex. Et MIP-bilde fra en dybde på 481,5 μm til 513 μm er representert. Pilspisser indikerer axonale boutons. Bilder som vises i (B) og (C), er dekonvoluterte. Skalastenger: 300 μm i (A) og 10 μm i (C). Baren i (C) gjelder også for (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Ultrastruktur i hjerneskiver som er fjernet med ScaleSF, CUBIC og PACT. (A-C) Transmission EM bilder av musen cerebral cortex ryddet med ScaleSF (A), CUBIC (B) og PACT (C). Musehjerner er festet med 4% PFA som inneholder 1% glutaraldehyd. Ultratynne seksjoner fremstilles fra rensede hjerneskiver. Membranstrukturer er alvorlig skadet i hjerneskiver som er fjernet med CUBIC (B) og PACT (C). Pilspisser indikerer postsynaptiske membraner. Vektstang: 500 nm. Denne figuren er endret fra Furata et al. 20226. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Recipies for ScaleS-løsninger | |
| ScaleS0-løsning | |
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| D-sorbitol | 20 % (m/v) |
| Glyserol | 5 % (m/v) |
| Metyl-β-cyclodextrin | 1 mM |
| γ-cyclodextrin | 1 mM |
| Dimetylsulfoksid | 3 % (v/v) |
| 10x PBS(–) | 1x |
| ScaleS4-løsning | |
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| Urea | 4 M |
| D-sorbitol | 40 % (med/v) |
| Glyserol | 10 % (med/v) |
| Triton X-100 | 0,2 % (med/v) |
| Dimetylsulfoksid | 25% (v/v) |
| ScaleS4D25(0)-løsning | |
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| Urea | 4 M |
| D-sorbitol | 40 % (med/v) |
| Glyserol | 10 % (med/v) |
| Dimetylsulfoksid | 25% (v/v) |
Tabell 1: Sammensetningen av de tre ScaleS-løsningene. Sammensetningene av ScaleS0, ScaleS4 og ScaleS4D25(0) løsninger er oppført. For en detaljert prosedyre for utarbeidelse av disse løsningene, se Miyawaki et al. 20167.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Det er noen få kritiske trinn i protokollen som bør utføres med største forsiktighet for å oppnå meningsfulle resultater. Ensartet fiksering av prøver er avgjørende for 3D-avbildning i store vev. Objektivlinsen, prøven og nedsenkningsvæsken skal ha matchende RI. RI-mismatch blant dem vil føre til svært forstyrret avbildning av EGFP-uttrykkende celler i de ryddede hjerneskivene (figur 3). Justeringen av korreksjonskragen til objektivet til nedsenkningsvæsken minimerer dybdeinduserte sfæriske avvik for å maksimere signalet, kontrasten og romlig oppløsning i 3D-avbildning. RIene til de forberedte løsningene kan måles ved hjelp av et refraktometer.
Feilsøking av teknikken
Lengre lagring av løsningene kan påvirke avregningsevnen, og dens evne til bevaring av fluorescenssignaler og strukturell integritet. Nylagde løsninger bør brukes. Disse løsningene kan lagres opptil 1 måned ved 4 °C. Isometriskhet er avgjørende for effektiv nevronal avbildning med nøyaktig signalrekonstruksjon. Selv om en liten utvidelse i prøvestørrelser ble observert etter inkubasjon i 12 timer (figur 1B), kan utvidelsen kontrolleres ved å redusere inkubasjonsperioden mellom 8-12 timer. For mer nøyaktig 3D-dybdeavbildning kan det hende at korreksjonskragen må justeres ved et gitt plan på grunn av dybdeindusert sfærisk avvik.
Modifikasjoner av teknikken
I den nåværende studien brukte vi musehjernevev for å demonstrere muligheten for protokollen. Likevel kan protokollen som er beskrevet her også brukes til storhjernede dyr, for eksempel primater. Faktisk har denne protokollen blitt brukt i vanlige marmoset (Callithrix jacchus) hjernevev, og lyktes i samtidig visualisering av nevralkrets og subcellulære strukturer av sine korticostriatal kretser6. Mikroskoptrinnadapterne er designet for å montere bildekammeret på mikroskopstadier direkte6 (figur 2A,B). Rensede vevsskiver kan observeres ved hjelp av et invertert mikroskop gjennom bunndekslene i bildekammeret. Etter restaurering av renset hjernevev med PBS(-) (deScaling)5,11, kan vi forberede vevsseksjoner på 20-μm til 50-μm tykkelse fra hjernevev som ble ryddet med ScaleSF (re-seksjonering)6. Subcellulære strukturer fanget i ryddet vev kan igjen avbildes på re-seksjoner med en høy NA objektiv linse av en kort WD. Rydding av hjerneskiver perfused med fikseringer som inneholder glutaraldehyd har blitt oppnådd ved hjelp av denne protokollen, noe som gir overlegen ultrastruktur bevaring6. ScaleSF oppnår et høyt nivå av ultrastrukturell bevaring som muliggjør EM-analyse i optisk ryddet vev6 (Supplerende figur 1). EM-kompatibiliteten til denne metoden er spesielt nyttig for avbildningsstrukturer med skalaene fra makroskopisk til nanoskopisk nivå.
Begrensninger av teknikken
Protokollen beskrevet her lar oss visualisere nevronale strukturer fra krets til subcellulære skalaer i hjerneskiver med 1 mm tykkelse. Det gjenstår imidlertid tre begrensninger i protokollen. Den første er tømmingsfunksjonen til clearingprotokollen. ScaleSF er en renseprotokoll for hjerneskiver, ikke for hele hjernen. Selv om hjerneskiver med 1 mm tykkelse kan gi god kunnskap om dendritiske og lokale axonal arbors12, er informasjon om axonale projeksjoner som spenner over hele hjernen fragmentarisk og ufullstendig i skivene 13,14,15,16. Den andre er bildeoppløsningen. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, lyktes vi i å visualisere subcellulære nevronstrukturer, for eksempel dendritiske spines og axonale boutons, i en optisk ryddet hjerneskive (figur 4). Imidlertid er oppløsningen av objektivlinsen som brukes i denne studien, xy oppløsning på 400-750 nm, ikke tilstrekkelig til å løse mer fine strukturer av nevronceller. Gitt høye NA objektive linser er vanligvis designet for olje-nedsenking (RI 1.52), RI-mismatch med løsningene (RI 1.47) kan hindre høyoppløselig bildebehandling med disse objektive linser. Den tredje er fluorescerende proteinmerking av nevronceller. Merkemetoden begrenser brede anvendelser av bildeteknikken vår. Histokjemiske og/eller immunhiistokjemiske teknikker som merker store vev, samtidig som vevsintegritet opprettholdes betydelig, vil fremme protokollen som er gitt her.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder og fremtidige anvendelser av teknikken
I den nåværende studien beskriver vi en detaljprotokoll for nevronal avbildning fra mesoskopisk til mikroskopisk konstruksjon ved hjelp av ScaleSF vevsrydding. Protokollen beskrevet her gjør det mulig å visualisere nevronale strukturer fra krets til subcellulære nivåer på rimelig tid uten spesialisert utstyr, noe som letter forståelsen av nevronstrukturer fra krets til komponentskalaer. Nevroner utarbeider sprudlende prosesser av enorm lengde og ordner spesialiserte fine strukturer for overføring og mottak av informasjon. Dermed krever nevronal avbildning en vevsryddingsmetode som utøver potent clearing evne samt et høyt nivå av vevsbevaring for samtidig visualisering av både store og småskala strukturer. Vevsryddingsmetoder som er omtalt med høye clearingegenskaper, fjerner imidlertid aggressivt lipider og pigmenter for omfattende vevsavklaring 3,4, noe som kompromitterer vevsintegriteten 5,6,17 (Supplerende figur 1). Dette står i sterk kontrast til clearingprotokollen som brukes her, og som oppnår et høyt nivå av strukturbevaring6 (Tilleggsfigur 1). Derfor gir ScaleSF vevsrydding mulighet for effektiv nevronal avbildning som krever flerskala høyoppløselig 3D-avbildning med nøyaktig signalrekonstruksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Yoko Ishida (Juntendo University) for AAV vektorproduksjon og Kisara Hoshino (Juntendo University) for teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av JSPS KAKENHI (JP20K07231 til K.Y.; JP21H03529 til T.F.; JP20K07743 til M.K.; JP21H02592 til H.H.) og vitenskapelig forskning på innovativt område "Resonance Bio" (JP18H04743 til H.H.). Denne studien ble også støttet av Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 til T.F. og H.H.), Moonshot R&D fra Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 til H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) fra JST (JPMJFR204D til H.H.), Grants-in-Aid fra Research Institute for Diseases of Old Age ved Juntendo University School of Medicine (X2016 til K.Y.; X2001 til H.H.), og Private School Branding Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
