Summary
Protokol, bir doku temizleme yöntemi olan ScaleSF kullanılarak beyin diliminde ayrıntılı bir nöronal görüntüleme yöntemi sağlar. Protokol, beyin dokusu hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dilimlerin işlenmesi ve nöronal yapıların mezoskopikten mikroskobik seviyelere kadar konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntülemesini içerir.
Abstract
Burada beyin dokularında mezoskopik seviyelerden mikroskobik seviyelere kadar nöronal yapıları görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Nöral devrelerden hücre altı nöronal yapılara kadar değişen nöronal yapılar, ScaleSF ile optik olarak temizlenmiş fare beyin dilimlerinde görselleştirilir. Bu temizleme yöntemi, ScaleS'nin modifiye edilmiş bir versiyonudur ve güçlü temizleme kabiliyetinin yanı sıra floresan sinyallerinin ve yapısal bütünlüğün yüksek düzeyde korunmasını sağlayan doku dilimleri için hidrofilik bir doku temizleme yöntemidir. Özelleştirilebilir üç boyutlu (3D) baskılı görüntüleme odası, temizlenmiş beyin dokularının güvenilir bir şekilde monte edilmesi için tasarlanmıştır. Gelişmiş yeşil floresan protein geni taşıyan adeno ilişkili bir virüs vektörü ile enjekte edilen fare beyinleri,% 4 paraformaldehit ile sabitlendi ve titreşen bir doku dilimleyici ile 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesildi. Beyin dilimleri, Sca l eS0 çözeltisi, fosfat tampon salin (-) ve ScaleS4 çözeltisi olmak üzere üç çözeltide sıralı inkübasyonları içeren temizleme protokolü izlenerek toplam 10.5-14.5 saat boyunca temizlendi. Temizlenmiş beyin dilimleri görüntüleme odasına monte edildi ve ScaleS4D25 (0) çözeltisinde çözünmüş% 1.5 agaroz jeline gömüldü. Dilimlerin 3D görüntü alımı, uzun bir çalışma mesafesine sahip çok daldırmalı objektif bir lens ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak gerçekleştirildi. Mezoskopik nöronal görüntüleme ile başlayarak, optik olarak temizlenmiş beyin dilimlerinde dendritik dikenler ve aksonal butonlar gibi ince hücre altı nöronal yapıları görselleştirmeyi başardık. Bu protokol, devreden hücre altı bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıların anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Doku temizleme yöntemleri, biyolojik ve klinik örneklerin ışık mikroskobu ile derinlikten bağımsız görüntülenmesini geliştirerek bozulmamış dokular üzerindeki yapısal bilgilerin çıkarılmasına olanak sağlamıştır 1,2. Optik temizleme teknikleri de potansiyel olarak hızlanabilir ve histolojik analiz maliyetini azaltabilir. Şu anda, üç ana temizleme yaklaşımı mevcuttur: hidrofilik, hidrofobik ve hidrojel bazlı yöntemler 1,2. Hidrofilik yaklaşımlar floresan sinyallerini ve doku bütünlüğünü korumada aşar ve diğer iki yaklaşıma kıyasla daha az toksiktir 3,4.
Bir hidrofilik temizleme yöntemi olan ScaleS, yapısal ve moleküler bütünlüğün korunmasının yanı sıra güçlü temizleme kabiliyeti (temizleme-koruma spektrumu) ile ayırt edici bir konuma sahiptir5. Önceki bir çalışmada, Sca l eS6'nın temizleme prosedürünü değiştirerek doku dilimleri (~ 1 mm kalınlığında) için hızlı ve izometrik bir temizleme protokolü olan ScaleSF'yi geliştirdik. Bu temizleme protokolü, beyin dilimlerinin 10.5-14.5 saat boyunca üç çözeltide sıralı inkübasyonunu gerektirir. Yöntem, elektron mikroskobu (EM) analizi (Ek Şekil 1) ile bile uyumlu olan ve doğru sinyal rekonstrüksiyonu ile çok ölçekli yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) görüntülemeye izin veren yüksek bir temizleme-koruma spektrumu ile donatılmıştır6. Bu nedenle, ScaleSF, özellikle nöronal hücrelerin muazzam uzunlukta coşkulu süreçleri detaylandırdığı ve bilgi iletmek ve almak için uzmanlaşmış ince hücre altı yapıları düzenlediği beyinde etkili olmalıdır. Nöronal hücreler üzerinde devreden hücre altı seviyelere kadar olan ölçeklerle yapısal bilginin çıkarılması, beyin fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması için oldukça yararlıdır.
Burada, ScaleSF kullanarak mezoskopik / devreden mikroskobik / hücre altı seviyeye kadar ölçeklerle nöronal yapıları görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, doku hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dokuların işlenmesi ve temizlenmiş dokuların konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) görüntülemesini içerir. Protokolümüz, devreden hücre altı bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıları sorgulamaya odaklanmaktadır. Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerinin fare beyinlerine çözeltilerinin hazırlanması ve stereotaksik enjeksiyonu için ayrıntılı bir prosedür için, sırasıyla Miyawaki ve ark. 20167 ve Okamoto ve ark. 20218'e bakınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Juntendo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (Onay No. 2021245, 2021246) tarafından onaylanmış ve Japonya Bilim Konseyi (2006) tarafından Hayvan Deneylerinin Uygun Şekilde Yürütülmesi için Temel Kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Burada, gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) geni taşıyan AAV vektörü enjekte edilen erkek C57BL/6J fareler ve parvalbümin (PV)/miristoilasyon-EGFP-düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü C-terminal bakteriyel yapay kromozom (BAC) transgenik fareler (PV-FGL fareler)9 kullanılmıştır. PV-FGL fareler C57BL/6J arka planda tutuldu. Bu çalışma ile ilgili olarak cinsiyete dayalı herhangi bir farklılık bulunmamıştır.
1. Doku hazırlığı
- Perfüzyon fiksasyonu
NOT: Paraformaldehit'e (PFA) maruz kalmayı sınırlamak için duman başlığında 1.1.1 ile 1.1.3 arasındaki adımları uygulayın.- Yetişkin erkek fareleri (8-16 haftalık) aşırı dozda sodyum pentobarbital (200 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Ayak parmağını sıkıştırma geri çekilmesi ve göz kırpma reflekslerinin yokluğu ile anestezinin yeterliliğini onaylayın.
- Göğüs boşluğunu açın ve sağ atriyal uzantıyı cerrahi makasla kesin. 20 mL'lik bir şırıngaya bağlı 23 G'lik bir iğne kullanarak fareleri 20 mL buz gibi soğuk fosfat tampon salini (PBS) ile perfüze edin, ardından başka bir 20 mL şırınga kullanılarak 0.1 M fosfat tamponunda (PB) 20 mL buz soğuk% 4 PFA'nın perfüzyonu ile perfüzyon yapın.
DİKKAT: PFA toksik ve teratojeniktir. Solumaktan veya cilt, göz ve mukoza zarı ile temastan kaçının. - Beyin dokularını kafatasından cımbızla çıkarın. Beyin dokularını 0.1 M PB'de% 4 PFA içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın, örnekleri ışıktan koruyun ve 50-100 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de gece boyunca hafifçe sallayın.
- NOT: Hasat edilen beyin dokuları, 4 ° C'de PBS'de% 0.02 sodyum azid (NaN3) içinde birkaç hafta saklanabilir.
DİKKAT: NaN3 toksiktir. Solumaktan veya cilt, göz ve mukoza zarı ile temastan kaçının. Bir duman başlığının içinde tutun.
- Beyin dilimi hazırlama
- 50 mL PBS'ye 2 g agar ekleyerek PBS'de% 4 agar hazırlayın. Agar tamamen çözünene kadar karışımı mikrodalgada pişirin. Çözeltiyi 40-45 °C'ye soğumaya bırakın.
NOT: Agarın önemli bir bileşeni olan agaropektin tarafından sağlanan viskoz özellik, doku dilimlerinin kesilmesini kolaylaştırır. - 6 delikli bir kültür plakasına 10 mL agar çözeltisi ekleyin. Forseps kullanarak beyin dokusunu agar çözeltisine batırın. Agarın buz üzerinde katılaşmasına izin verin.
- Gömülü beyin dokusunu kuyudan çıkarın ve agar'ı bir tıraş bıçağı ile kesin. Agar bloğunu vibratom banyosunun dibine süper yapıştırıcı ile sabitleyin ve tampon tepsisine 0,1 M PB dökün.
- Etanol içine batırılmış tüy bırakmayan bir kağıt mendil kullanarak başka bir tıraş bıçağını temizleyin ve bıçağı titreşimli doku dilimleyicinin bıçak tutucusuna takın.
- Kesit hızını 1,4 mm genlikle 0,14 mm / s'ye ve frekansı 75-77 Hz'ye ayarlayın. beyin dokusunu 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesin ve dilimleri PBS içeren 6 delikli bir hücre kültürü plakasında toplayın.
NOT: Beyin dilimleri birkaç hafta boyunca PBS'de 4 °C'de% 0.02 NaN3'te saklanabilir.
- 50 mL PBS'ye 2 g agar ekleyerek PBS'de% 4 agar hazırlayın. Agar tamamen çözünene kadar karışımı mikrodalgada pişirin. Çözeltiyi 40-45 °C'ye soğumaya bırakın.
2. Doku berraklaştırma
NOT: Kullanılan ScaleS çözümlerinin bileşimleri Tablo 1'de listelenmiştir. Numuneler bir folyo ile kaplanarak ışıktan korunmalıdır. Temizleme adımları Şekil 1A'da gösterilmiştir.
- 6 delikli hücre kültürü plakasının bir ocağına 8 mL Sca l eS0 çözeltisi ekleyin ve plakanın başka bir kuyucuğuna 8mLScaleS4 çözeltisi ekleyin ve bir inkübatörde 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
- Beyin dilimlerini bir spatula ile önceden ısıtılmış ScaleS0 çözeltisine aktarın ve 90 rpm'de sallanan bir inkübatörde 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin.
- Geçirgenleştirilmiş beyin dilimlerini 8 mL PBS (-) içinde 6 delikli bir hücre kültürü plakasına spatula ile aktarın ve 40-60 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda tutarak 15 dakika boyunca yıkayın. Bunu iki kez tekrarlayın.
- Beyin dilimlerini önceden ısıtılmış 8 mL ScaleS4 çözeltisine bir spatula ile aktarın ve 37 ° C'de 8-12 saat boyunca 90 rpm'de çalkalayıcı bir inkübatörde inkübe ederek temizleyin. Temizlenmiş bir beyin dilimleri Şekil 1'de görülebilir.
3. Beyin dilimi montajı
NOT: Temizlenmiş beyin dilimlerinin güvenilir montajı için özelleştirilebilir bir görüntüleme odası kullanılır (Şekil 2)6. Oda, hazne çerçevesi ve alt kapak kaymasından oluşur. Mikroskop aşaması adaptörleri ayrıca görüntüleme odasını doğrudan mikroskop aşamalarına monte etmek için tasarlanmıştır (Şekil 2A, B). Oda çerçevesi ve mikroskop sahne adaptörleri, şirket içi veya dış kaynaklı 3D baskı hizmetleri kullanılarak 3D yazdırılabilir. Görüntüleme odasının 3D bilgisayar destekli tasarım (CAD) verileri Furuta et al. 20226'da verilmiştir.
- Hazne hazırlığı için, oda çerçevesini basınca duyarlı bir yapıştırıcı kullanarak bir kapak kapağına takın.
- Bir şişedeki çözeltinin 100 mL'sine 1,5 g agaroz ekleyerek Sca l eS4D25 (0) çözeltisinde (ScaleS4 jel) %1,5 agaroz hazırlayın. Agaroz tamamen çözünene kadar çözeltiyi karıştırarak ve mikrodalgada pişirerek çözeltiyi iyice karıştırın. İşiniz bittiğinde, çözeltinin 37 ° C'ye soğumasını bekleyin.
- Temizlenmiş beyin dilimini bir spatula ile görüntüleme odasının alt kapağına monte edin. Temizlenmiş dilimdeki fazla çözeltiyi temiz bir tüy bırakmayan mendil kağıdı kullanarak silin.
- ScaleS4 jelini, görüntüleme odasını doldurmak için bir mikropipet kullanarak beyin dilimine ekleyin. Forseps ile üstüne başka bir örtü parçası yerleştirin ve bu sırayla kapak kapağına bir parça tüy bırakmayan kağıt mendil ve bir cam slayt yerleştirin.
- Görüntüleme odasını 4 °C'de bir buzdolabına aktarın. Metal ağırlıkları cam slaytın üzerine yerleştirin ve 30 dakika bekletin.
- Metal ağırlıkları, cam kızağı, tüy bırakmayan kağıt mendili ve kapak kaymasını görüntüleme odasından çıkarın ve fazla jeli silin (Şekil 2A, B).
- Görüntüleme odasını 60 mm'lik cam Petri kabına yerleştirin ve görüntüleme odasının kenarını macun benzeri basınca duyarlı bir yapıştırıcı ile kabağa takın. Odayı Petri kabına birden fazla noktadan takın.
- ScaleS4 çözeltisini tabağa dökün ve 40-60 rpm'de bir yörüngesel çalkalayıcı üzerinde 20-25 ° C'de 1 saat boyunca hafifçe çalkalayın. Taze çözelti ile değiştirin ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yüzeyi nazikçe kazıyarak jel yüzeyindeki hava kabarcıklarını giderin. Daldırılmış görüntüleme odasını mikroskop aşamasına monte edin (Şekil 2C).
4. CLSM görüntüleme
- Uzun çalışma mesafesine (WD) sahip çok daldırmalı objektif lensle donatılmış bir CLSM kullanarak görüntüler elde edin (16x/0,60 sayısal diyafram açıklığı [NA], WD = 2,5 mm).
NOT: Yüksek NA objektif lensler yüksek kırınım sınırlı çözünürlük sağlayabilir. - İlgili tüm görüntüleme ekipmanlarını (iş istasyonu, mikroskop, tarayıcı, lazerler ve cıva lambası) açın ve bir CLSM görüntüleme yazılımı başlatın.
- Çok daldırmalı objektif lensin düzeltme yakasını 1,47'ye ayarlayın. ScaleS4 çözeltisi yaklaşık 1.47 5,7 kırılma indisine (RI) sahiptir. RI uyumsuzluğuna bağlı sapmalar görüntü oluşumunu bozabilir (Şekil 3).
- Objektif lensi çözeltiye daldırın ve dilime yavaşça yaklaşmasına izin verin. Objektif lensin ucunda sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarın. Epifloresan kullanarak temizlenmiş dokulardaki ilgi alanlarını (ROI'ler) bulun.
- Uygun ayarları test ederek görüntü alma parametrelerini ayarlayın.
- Görüntü yakalama için bit derinliğini belirleyin. Görüntünün veri boyutu bit derinliği ile birlikte artar.
- Algılama dalga boyunu ayarlayın. Dedektör için uygun kapıyı emisyon spektrumuna göre ayarlayın. Algılama dalga boyunun herhangi bir lazer çizgisini kapsamadığından emin olun.
- xy çözünürlüğünü ayarlayın. Daha büyük formatlar daha iyi xy çözünürlükleri sağlar, ancak görüntülerin toplanması daha uzun zaman alır.
- Tarama hızını ayarlayın. Daha yavaş bir tarama hızı, yüksek sinyal-gürültü oranı sağlar. Bununla birlikte, piksel bekleme süresini ve fotobeyazlatma riskini de artırır. Buna göre seçim yapın.
- İğne deliği boyutunu ayarlayın. İğne deliği boyutu optik bölüm kalınlığını kontrol eder. Daha küçük bir iğne deliği boyutu daha ince bir optik bölüm oluşturur ve böylece daha iyi z çözünürlüğü sağlar, ancak floresan sinyalini azaltır. İğne deliği boyutunu büyütmek, daha güçlü floresan sinyaline sahip daha kalın bir optik bölüm sağlar.
- Lazer gücünü, dedektör / amplifikatör kazancını ve ofseti ayarlayın. Uygun bir görüntü elde edilene kadar lazer gücünü ve dedektör/amplifikatör kazancını kademeli olarak artırın. Yüksek lazer gücü fotobeyazlatma riski taşır. Yüksek sinyal-gürültü oranı elde etmek için ofseti (kontrastı) uygun şekilde ayarlayın.
- Yatırım getirisinin boyutuna bağlı olarak gereken döşeme alanını belirleyin. Yatırım getirisinin tüm uzunluğunun ve genişliğinin yakalandığından emin olun.
- Tüm düzlemlerde temizlenmiş dokularda gezinin ve yığının başlangıç ve bitiş noktalarını ayarlayın. Z-adım boyutunu istenen z-çözünürlüğüne göre ayarlayın.
- Görüntü alma ayarlarından memnun kaldığınızda görüntüleri toplayın ve yakalanan görüntüleri kaydedin. Bir görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntüleri işleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak 1 mm kalınlığında bir fare beyin diliminin optik olarak temizlenmesi sağlandı. Şekil 1B, temizleme işleminden önce ve sonra bir fare beyin diliminin iletim görüntülerini temsil eder. Doku temizleme yöntemi, 1 mm kalınlığında bir fare beyin dilimini şeffaf hale getirdi. Temizleme çözeltisinde 12 saat boyunca inkübasyondan sonra beyin dilimlerinin son boyutlarında hafif bir genişleme bulundu (doğrusal genişleme: % 102.5 ±% 1.3). PV-FGL farelerde floresan ve dokuların yapısal bütünlüğünün korunması, plazma membranında hedeflenen EGFP ekspresyonu ile değerlendirildi (Şekil 1C). Bu farelerde, somatodendritik membran hedefli EGFP, PV-pozitif nöronlarda eksprese edilir9. Tedavi sonrası somatodendritik bölgedeki plazma membranını hedef alan EGFP ekspresyonu korundu (Şekil 1C). Ek olarak, önceki EM çalışması, ScaleSF ile temizlenen beyin dokularında iyi korunmuş yapısal bütünlük göstermektedir (Ek Şekil 1)6.
RI uyumsuzluğuna bağlı sapmalar, görüntü parlaklığı ve çözünürlüğünde gözle görülür bir kayba neden oldu (Şekil 3). PV-FGL farenin 1 mm kalınlığında bir beyin dilimi temizlendi ve uzun bir WD'nin çok daldırmalı objektif lensi ile donatılmış bir CLSM altında görüntülendi. objektif lensin düzeltme yakasının su konumuna (RI 1.33) ayarlanması, düşük parlaklık ve düşük kontrast nedeniyle 400 μm ve 800 μm derinliklerinde bulunan EGFP pozitif nöronların net bir şekilde görselleştirilmesini engelledi. (Şekil 3A,C). Bu nöronlar, düzeltme tasması ScaleS4 çözeltisine uyacak şekilde ayarlandığında aynı CLSM ile açıkça görselleştirildi (RI 1.47; Şekil 3B,D). Daldırma sıvısı ve objektif lens arasındaki RI eşleşmesi, optik olarak temizlenmiş dokularda doğru 3D görüntüleme için kritik öneme sahiptir.
Son olarak, protokolün fizibilitesini göstermek için fare neokortikal nöronları kullanıldı. Primer somatosensoriyel kortekste (S1) AAV2/1-SynTetOff-EGFPvektörü 10 ile enjekte edilen bir fare beyni, 0.1 M PB'de% 4 PFA ile sabitlendi. Beyinden titreşimli doku dilimleyici ile 1 mm kalınlığında koronal dilimler hazırlandı. Görüntüleme odasına temizleme ve montaj yapıldıktan sonra neokortikal nöronları hedef alan nöronal görüntüleme yapıldı (Şekil 4). 1 mm kalınlığındaki beyin dilimindeki EGFP etiketli nöronların 3B rekonstrüksiyonu Şekil 4A'da gösterilmiştir. Daha yüksek bir büyütme görüntüsü, dendritik dikenlerle süslenmiş bireysel dendritik direkleri göstermektedir (Şekil 4B). Ayrıca kontralateral kortekste akson terminal arborizasyonları ve aksonal butonlar gösterildi (Şekil 4C).
Şekil 1: 1 mm kalınlığındaki fare beyin dilimlerinin optik olarak temizlenmesi. (A) ScaleSF doku temizleme programı. (B) 1 mm kalınlığındaki beyin dilimlerinin tedaviden önce (solda) ve sonra (sağda) iletim görüntüleri. (C) Bir PV-FGL farenin serebral korteksinin doku temizleme yöntemi kullanılarak temizlenen 3D hacimli görüntüsü. (D,E) 250 μm (D) ve 750 μm (E) derinliklerinde (C) içindeki xy görüntüleri. (F,G) (D) ve (E)'de özetlenen dikdörtgenlerin genişletilmiş görünümü. (C-G) içinde görünen görüntüler, oluşturma işleminden önce dekonvolüleştirilir. Kısaltmalar: pia = pia mater, WM = beyaz madde. Ölçek çubuğu: 2 mm in (B), 500 μm in (C), 200 μm in (D,E) ve 40 μm in (F,G). Bu rakam Furata ve ark. 20226'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Doku dilimi görselleştirmesi için özelleştirilebilir 3B baskılı görüntüleme odası. (A,B) Özelleştirilebilir 3B baskılı görüntüleme odasının şema çizimi (A) ve resmi (B). Görüntüleme odası bir oda çerçevesi, bir alt kapak kayması ve mikroskop sahne adaptörlerinden oluşur. Temizlenmiş doku dilimleri alt kapak kapağına yerleştirilir ve ScaleS4 jeline gömülür. Hazne çerçevesi, alt kapak kayması ve mikroskop aşaması adaptörleri, doku dilimlerinin boyutuna ve kalınlığına göre özelleştirilebilir. (C) Görüntüleme odasına sahip bir görüntüleme düzeneği. Görüntüleme odası, bir Petri kabındaki ScaleS4 çözeltisine daldırılır ve dik bir CLSM aşamasına monte edilir. Bu rakam Furata ve ark. 20226'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Objektif lens ile ScaleS4 çözeltisi arasındaki RI uyumsuzluğunun neden olduğu tehlikeye atılmış derin görüntüleme. (A-D) PV-FGL farenin serebral korteksinin 400 μm (A,B) ve 800 μm (C,D) derinliklerinde xy görüntüleri. Çok daldırmalı objektif lensin yakasının düzeltilmesi 1,33 inç (A,C) ve 1,47 inç (B,D) olarak ayarlanır. Görüntüler, objektif lensin RI'ları dışında aynı parametrelerle elde edilir. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ScaleSF ile temizlenmiş 1 mm kalınlığında bir fare beyin diliminde nöronal görüntüleme. (A) S1'deki EGFP etiketli fare neokortikal nöronlarının 3D hacim oluşturması. Neokortikal nöronlar AAV2/1 SynTetOff-EGFP vektörü ile etiketlenmiştir. (B) EGFP etiketli neokortikal nöronların dendritik arborsları. 39 μm ila 48 μm derinlikten maksimum yoğunlukta projeksiyon (MIP) görüntüsü temsil edilir. Ok uçları dendritik dikenleri gösterir. (C) Kontralateral korteksteki EGFP etiketli akson terminalleri. 481,5 μm ila 513 μm derinlikten bir MIP görüntüsü temsil edilir. Ok uçları aksonal butononları gösterir. (B) ve (C)'de görünen görüntüler devolüe edilir. Ölçek çubukları: 300 μm in (A) ve 10 μm in (C). (C) içindeki çubuk (B) için de geçerlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: ScaleSF, CUBIC ve PACT ile temizlenen beyin dilimlerindeki ultrayapı. (A-C) ScaleSF (A), KÜBIK (B) ve PACT (C) ile temizlenen fare serebral korteksinin EM görüntüleri iletir. Fare beyinleri% 1 glutaraldehit içeren% 4 PFA ile sabitlenir. Ultra ince kesitler temizlenmiş beyin dilimlerinden hazırlanır. KÜBİK (B) ve PACT (C) ile temizlenen beyin dilimlerinde membran yapıları ciddi hasar görür. Ok uçları postsinaptik membranları gösterir. Ölçek çubuğu: 500 nm. Bu rakam Furata ve ark. 20226'dan değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
| ScaleS çözümleri için cips | |
| ScaleS0 çözümü | |
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| D-sorbitol | %20 (w/d) |
| Gliserol | %5 (w/d) |
| Metil-β-siklodekstrin | 1 mM |
| γ-siklodekstrin | 1 mM |
| Dimetil sülfoksit | %3 (d/d) |
| 10x PBS(–) | 1 adet |
| ScaleS4 çözümü | |
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| Üre | 4 milyon |
| D-sorbitol | %40 (w/d) |
| Gliserol | %10 (w/d) |
| Triton X-100 | %0,2 (w/d) |
| Dimetil sülfoksit | %25 (d/d) |
| ScaleS4D25(0) çözümü | |
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| Üre | 4 milyon |
| D-sorbitol | %40 (w/d) |
| Gliserol | %10 (w/d) |
| Dimetil sülfoksit | %25 (d/d) |
Tablo 1: Üç ScaleS çözeltisinin bileşimi. Sca l eS0, Sca l eS4 veScaleS4D25(0) çözümlerinin bileşimleri listelenir. Bu çözümlerin hazırlanması için ayrıntılı bir prosedür için, Miyawaki et al. 20167'ye bakınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol içindeki kritik adımlar
Protokolde, anlamlı sonuçlar elde etmek için azami dikkatle yürütülmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Numunelerin düzgün bir şekilde sabitlenmesi, büyük ölçekli dokularda 3D görüntüleme için zorunludur. Objektif lens, numune ve daldırma sıvısı eşleşen RI'ya sahip olmalıdır. Aralarındaki RI-uyumsuzluğu, temizlenmiş beyin dilimleri içindeki EGFP eksprese eden hücrelerin oldukça rahatsız edici görüntülenmesine yol açacaktır (Şekil 3). Objektif lensin daldırma sıvısına düzeltme tasması ayarı, 3D görüntülemede sinyali, kontrastı ve uzamsal çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için derinliğe bağlı küresel sapmaları en aza indirir. Hazırlanan çözeltilerin RI'ları refraktometre kullanılarak ölçülebilir.
Tekniğin sorun giderme
Çözeltilerin daha uzun süre depolanması, temizleme kabiliyetini ve floresan sinyallerinin ve yapısal bütünlüğün korunması kapasitesini etkileyebilir. Taze hazırlanmış çözeltiler kullanılmalıdır. Bu çözeltiler 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir. İzometriklik, doğru sinyal rekonstrüksiyonu ile etkili ve verimli nöronal görüntüleme için kritik öneme sahiptir. Kübasyondan sonra 12 saat boyunca numune boyutlarında hafif bir genişleme gözlenmesine rağmen (Şekil 1B), inkübasyon süresi 8-12 saat arasında azaltılarak genişleme kontrol edilebilir. Daha doğru 3D derinlik görüntüleme için, derinlik kaynaklı küresel sapma nedeniyle düzeltme tasmasının belirli bir düzlemde ayarlanması gerekebilir.
Tekniğin modifikasyonları
Bu çalışmada, protokolün fizibilitesini göstermek için fare beyin dokularını kullandık. Ancak burada açıklanan protokol, primatlar gibi büyük beyinli hayvanlar için de kullanılabilir. Gerçekten de, bu protokol ortak marmoset (Callithrix jacchus) beyin dokularında kullanılmış ve kortikotriyal devrelerinin nöral devresinin ve hücre altı yapılarının eşzamanlı olarak görselleştirilmesini başarmıştır6. Mikroskop evre adaptörleri, görüntüleme odasını mikroskop aşamalarına doğrudan monte etmek üzere tasarlanmıştır6 (Şekil 2A,B). Temizlenmiş doku dilimleri, görüntüleme odasının alt kapak kayması boyunca ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak gözlemlenebilir. Temizlenmiş beyin dokularının PBS(-) (deScaling)5,11 ile restorasyonunu takiben, ScaleSF (rezeksiyon)6 ile temizlenen beyin dokularından 20-μm ila 50-μm kalınlığında doku kesitleri hazırlayabiliriz. Temizlenmiş dokularda yakalanan hücre altı yapılar, kısa bir WD'nin yüksek NA objektif lensi ile reseksiyonlarda tekrar görüntülenebilir. glutaraldehit içeren fiksatif ile perfüze edilmiş beyin dilimlerinin temizlenmesi, bu protokol kullanılarak üstün ultrayapı koruması sağlanarak sağlanmıştır6. ScaleSF, optik olarak temizlenmiş dokularda EM analizine izin veren yüksek düzeyde bir ultrayapı koruması sağlar6 (Ek Şekil 1). Bu yöntemin EM uyumluluğu özellikle makroskopik seviyeden nanoskopik seviyeye kadar ölçeklerle yapıların görüntülenmesinde yararlıdır.
Tekniğin sınırlamaları
Burada açıklanan protokol, nöronal yapıları devreden hücre altı ölçeklere kadar 1 mm kalınlığındaki beyin dilimlerinde görselleştirmemizi sağlar. Ancak, protokolde üç sınırlama kalmaktadır. Birincisi, takas protokolünün takas kabiliyetidir. ScaleSF, tüm beyin için değil, beyin dilimleri için bir temizleme protokolüdür. Her ne kadar 1 mm kalınlığındaki beyin dilimleri dendritik ve lokal aksonal arbors12 hakkında iyi bilgi sağlayabilse de, tüm beyni kapsayan aksonal projeksiyonlar hakkındaki bilgiler13,14,15,16 dilimlerinde parçalı ve eksiktir. İkincisi ise görüntüleme çözünürlüğüdür. Burada açıklanan protokolü kullanarak, dendritik dikenler ve aksonal butonlar gibi hücre altı nöronal yapıları, optik olarak temizlenmiş bir beyin diliminde görselleştirmeyi başardık (Şekil 4). Bununla birlikte, bu çalışmada kullanılan objektif lensin çözünürlüğü, 400-750 nm'lik xy çözünürlüğü, nöronal hücrelerin daha ince yapılarını çözmek için yeterli değildir. Yüksek NA objektif lenslerin tipik olarak yağa daldırma (RI 1.52) için tasarlandığı göz önüne alındığında, çözeltilerle RI uyumsuzluğu (RI 1.47) bu objektif lenslerle yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi önleyebilir. Üçüncüsü, nöronal hücrelerin floresan protein etiketlemesidir. Etiketleme yöntemi, görüntüleme tekniğimizin geniş uygulamalarını sınırlar. Doku bütünlüğünü korurken büyük ölçekli dokuları etiketleyen histokimyasal ve / veya immünohistokimyasal teknikler, burada sağlanan protokolü önemli ölçüde ilerletecektir.
Mevcut yöntemler ve tekniğin gelecekteki uygulamaları açısından önemi
Bu çalışmada, ScaleSF doku temizliği kullanılarak mezoskopik yapılardan mikroskobik yapılara nöronal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Burada açıklanan protokol, nöronal yapıların devreden hücre altı seviyelere kadar özel ekipman olmadan makul bir süre içinde görselleştirilmesini mümkün kılarak, devreden bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıların anlaşılmasını kolaylaştırır. Nöronlar, muazzam uzunlukta coşkulu süreçleri detaylandırır ve bilgi iletmek ve almak için özel ince yapılar düzenler. Bu nedenle, nöronal görüntüleme, hem büyük hem de küçük ölçekli yapıların eşzamanlı olarak görselleştirilmesi için güçlü temizleme kabiliyeti ve yüksek düzeyde doku koruma sağlayan bir doku temizleme yöntemi gerektirir. Bununla birlikte, yüksek temizleme yeteneklerine sahip doku temizleme yöntemleri, geniş doku berraklaştırmasıiçin lipitleri ve pigmentleri agresif bir şekilde uzaklaştırır 3,4, doku bütünlüğünü tehlikeye atar 5,6,17 (Ek Şekil 1). Bu, burada kullanılan ve yüksek düzeyde bir yapı korumasağlayan temizleme protokolünün tam tersidir 6 (Ek Şekil 1). Bu nedenle, ScaleSF doku temizleme, doğru sinyal rekonstrüksiyonu ile çok ölçekli yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme gerektiren etkili ve verimli nöronal görüntülemeye izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, AAV vektör üretimi için Yoko Ishida'ya (Juntendo Üniversitesi) ve teknik yardım için Kisara Hoshino'ya (Juntendo Üniversitesi) teşekkür eder. Bu çalışma JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 için T.F.; JP20K07743 için M.K.; JP21H02592 için H.H.) ve Yenilikçi Alan "Rezonans Biyosu" Üzerine Bilimsel Araştırma (JP18H04743 ila H.H.). Bu çalışma aynı zamanda Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (AMED) (JP21dm0207112'den T.F. ve H.H.'ye), Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı'ndan (JST) Moonshot Ar-Ge'si (JPMJMS2024'ten H.H.'ye), JST'den Yıkıcı Bilim ve Teknoloji için Füzyon Odaklı Araştırma (FOREST) (JPMJFR204D'den H.H.'ye), Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Yaşlılık Hastalıkları Araştırma Enstitüsü'nden Yardım-Hibeler (X2016'dan K.Y.'ye; X2001'den H.H.'ye) ve Özel Okul Markalaşma Projesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
