Summary
Som svar på den allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi utvecklades ett laboratorieprotokoll för att testa den virala desinfektionseffekten av varmvattentvätt av tygbeläggningar, bomullsskrubbar och jeansbyxor. Phi6-viruset (bakteriofag) användes som organism för att testa desinfektionseffekten.
Abstract
Detta protokoll ger ett exempel på en laboratorieprocess för att genomföra tvättstudier som genererar data om viral desinfektion. Medan protokollet utvecklades för forskning under coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi, är det avsett att vara ett ramverk som kan anpassas till andra virusdesinfektionsstudier; Det visar stegen för att förbereda testviruset, ympa testmaterialet, bedöma visuella och integritetsförändringar i de tvättade föremålen på grund av tvättprocessen och kvantifiera minskningen av virusbelastningen. Dessutom beskriver protokollet de nödvändiga kvalitetskontrollproverna för att säkerställa att experimenten inte är partiska av kontaminering och mätningar / observationer som bör registreras för att spåra materialintegriteten hos personlig skyddsutrustning (PPE) efter flera tvättcykler. De representativa resultaten som presenteras med protokollet använder Phi6-bakteriofagen inokulerad på bomullsskrubb, denim och bomullsansiktstäckande material och indikerar att tvätt- och torkningsprocessen för varmt vatten uppnådde över en 3-log (99.9%) minskning av virusbelastningen för alla prover (en 3-log-reduktion är desinfektionsprestandamåttet i US Environmental Protection Agency's Product Performance Test Guideline 810.2200). Minskningen av virusbelastningen var enhetlig på olika platser på PPE-artiklarna. Resultaten av detta protokoll för virusdesinfektionseffektivitet bör hjälpa det vetenskapliga samfundet att utforska effektiviteten av hemtvätt för andra typer av testvirus och tvättprocedurer.
Introduction
Coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi orsakade oöverträffade globala störningar i leveranskedjan och ledde till en kritisk brist på många artiklar, inklusive viktig personlig skyddsutrustning (PPE)1,2,3. De i högriskyrken var tvungna att anpassa sig med hjälp av rekommenderade kriskapacitetsstrategier och allmänheten antog användningen av icke-specialiserade föremål som ansiktsbeläggningar av tygmaterial främst för källkontroll, men också för att ge vissa andningsskydd för bärare. I USA reserverades specialiserade andningsskydd (dvs. filtrering av andningsskydd för ansiktsmasker (FFR) som N95) för några av dessa högriskyrken (t.ex. sjukvård) under leveransbrist4. När lite var känt om överföring av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-Cov-2), betraktades också en mängd andra typer av klädmaterial som barriärskydd tidigt i pandemin5. Med mångfalden av tyger som används för bärarskydd uppstod frågor om användning, återanvändning och desinfektion / dekontaminering av dessa föremål. Medan det i USA var allmänt accepterat att rutinmässig tvättning av ansiktsskydd och andra klädesplagg gjorde virus på dessa ytor icke-infektiösa, fanns det få data för att validera detta påstående, och det saknades publicerade laboratorieprotokoll för testning. Syftet med forskningsprotokollet som presenteras här är att ge ett exempel på en laboratorieprocess för att genomföra tvättstudier som genererar data om virusdesinfektion. Medan protokollet utvecklades för forskning under COVID-19-pandemin, är det avsett att vara ett ramverk som kan anpassas till andra virusdesinfektionsstudier.
Klädernas roll i sjukdomsöverföring är ett svårt begrepp att kvantifiera. International Scientific Forum on Home Hygiene försökte denna utmanande uppgift genom att genomföra en översyn av klädernas roll i spridningen av infektionssjukdomar i kombination med en riskbedömning av hemhygienpraxis6. Inkluderat i detta arbete var granskningen av flera vetenskapliga studier som undersökte överlevnaden av olika virusstammar på olika typer av tyger som ull och bomull 7,8,9,10,11. Varje studie fokuserade på en annan typ av virus inklusive vaccinia, poliovirus, respiratoriskt syncytialvirus, herpesvirus och influensavirus. Överlevnadstiderna för de olika virusen på tygerna varierade från 30 min till 5 månader beroende på kombinationen virus och material. Flera av studierna visade också på överföring av viruskontaminering från materialet till händerna. Som en del av publikationen diskuterades effektiv tvätt som en viktig hanteringsteknik för att minska överföringen men insåg att storleken på tvättens inverkan på att minska sjukdomsbördan var beroende av den specifika virusföroreningen och svår att kvantifiera 7,8,9,10,11.
Tvättprocessen förstör mikroorganismer med hjälp av kemiska, fysiska och termiska behandlingsprocesser. Till exempel kan tvålar och tvättmedel separera jordar och kan ge viss kemiskt medierad antimikrobiell verkan. Fysiskt kan utspädning och omrörning hjälpa till att minska virusbelastningen. En studie som undersökte uthålligheten hos humant coronavirus HCoV-OC43 på bomullsprover med industriella och hushållstvättcykler med och utan temperatur och tvättmedel fann inget detekterbart virus vid tvätt i ouppvärmt vatten utan tvättmedel, men att i närvaro av en jordbelastning (konstgjord saliv) krävde tvättcykler tvättmedel för att prover skulle ha icke-detekterande virusbelastningar12. Varmt vatten i sig kan också ge ett effektivt sätt att förstöra vissa mikroorganismer13,14.
I en nyligen publicerad publikation som sammanfattade tillståndet för nuvarande tvättpraxis identifierades många faktorer som tygsammansättning, lagringsförhållanden, smutsbelastning, tvätttemperatur och tid och torktemperatur som varierande i globala metoder för tvätt15. Även om tvätt är en vanlig rengöringsmetod för en stor andel av befolkningen, gör denna stora variation i befintliga metoder att utfärda detaljerad vägledning för hur man gör detta säkert och effektivt, när ett föremål kan vara förorenat av ett virus, utmanande och gles. Under COVID-19-pandemin utfärdade United States Centers for Disease Control and Prevention (CDC) vägledning om hur man tvättar föremål för husägare16,17. Mycket av denna tvättvägledning baserades på flera äldre studier om bakteriell desinfektion18,19 och stöddes av flera bänkstudier som har funnit höljeförsedda virus inaktiverade i vatten med tvättmedel20,21. Vägledningen kan sammanfattas som 1) följ tillverkarens instruktioner för tvättmedlet, 2) använd den varmaste lämpliga vatteninställningen och 3) torka föremål helt. Motiveringen till dessa rekommendationer var att tvätt på den varmaste möjliga cykeln med tvättmedel i kombination med torkning helt (med värme om möjligt) kommer att döda SARS-CoV-2-viruset.
Det stora antalet möjliga variationer i tvättprocessen kräver ett enhetligt protokoll, som presenteras här, för att kunna isolera variabler och testa virusdesinfektionseffekten hos specifika processer. Avsikten med detta protokoll i kombination med en instruktionsvideo är att demonstrera en laboratoriebaserad varmvattentvättprocess för replikering i andra forskningsstudier. Dessutom bör resultaten av denna virusdesinfektionseffektivitetstestning bygga konsumenternas förtroende för effektiviteten av hemtvätt under virusbaserade pandemier.
Protocol
Phi6 mottogs från ett samarbetslaboratorium som en ~1 ml fryst alikvot och lagrades vid -80 °C tills den användes. Det användes ursprungligen för att sprida fler viruslager som sedan lagrades vid -80 ° C tills de användes. Phi6 valdes som demonstrationsvirus eftersom det vanligtvis används som ett modellhöljevirus, kan spridas till höga titrar och kräver ett laboratorium med låg biosäkerhetsnivå för att utföra testningen22,23,24.
1. Förbered virusstamlösning
- Föröka bakteriofag Phi6 i bakteriell värd Pseudomonas spruta med hjälp av en modifierad tryptisk soja agar media preparat och mjuk agar overlay metod som beskrivs nedan.
- Förbered modifierad tryptisk sojaagar genom att väga ut och blanda ingredienserna från tabell 1 i avjoniserat vatten.
- Bered en nattkultur av P. syringae genom att tillsätta en alikvot på 1 ml P. syringae med en optisk densitet (OD 600) mellan 0,9 och 1,5 till100 ml modifierad tryptisk sojabuljong (tabell 1) och inkubera i en skakande inkubator vid ~260 rpm vid rumstemperatur (20–26 °C).
- Förbered mjuka agarrör genom att placera modifierad tryptisk sojaagar (~ 6 ml) i provrör och täcka med ett autoklaverbart lock. Förvaras vid 4 °C tills det används. Autoklav mjuka agarrör vid 121 °C i 15 minuter för att smälta agar. Håll vid 48 °C tills plätering. Jämvikt vid 48 °C är viktigt annars kan viruset inaktiveras i analysen.
- Tillsätt 1 ml outspädd koncentrerad virusalikvot till mjuk agar och 100 μl av en loggfas (OD600 mellan 0,9 och 1,5) P. syringae-odling. Häll mjuk agar på ytan av en stelnad 100 mm diameter modifierad tryptisk sojaagarplatta. För att förhindra bubblor och/eller spill, virvla plattorna försiktigt för att jämnt fördela den mjuka agarn över den fasta agarytan och inkubera över natten vid rumstemperatur.
- Skrapa försiktigt 25 innehållet i de tre plattorna med en steril cellspridare i ett sterilt 50 ml koniskt rör som innehåller15 ml SM-buffert. Virvelrör vid maximal inställning i 1-2 min för att bryta upp agar och sedan centrifugera vid 7 000 x g i 15 min.
- Ta bort supernatanten och filtrera genom ett 0,2 μm sprutfilter. Förvara 1 ml alikvoter i kryovialer vid -80 °C tills de används.
2. Utför visuell bedömning före provning av personlig skyddsutrustning
- Placera varje personlig skyddsutrustning på en ren, slät yta (t.ex. en laboratoriebänk täckt med ett engångspapper). Bedöm varje PPE-artikel i tre exemplar.
- Se till att belysningen är korrekt under undersökningen av personlig skyddsutrustning. Mät och registrera längden och bredden på de otvättade föremålen på olika platser (figur 1).
Figur 1. Mätplatser för bedömning av personlig skyddsutrustning före provning. Denim-, skrubb- och ansiktstäckande platser där längden registrerades för att spåra materialändringar från tvättprocessen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Förbered kuponger
- Gör 2 cm x 4 cm testkuponger genom att klippa PPE, förbered två kuponger per ansiktsskydd (tre ansiktsbeläggningar testades), fem kuponger per jeansbyxa (tre jeansbyxor testades) och tre kuponger per skrubbskjorta (tre scrubs testades).
- Förbered en uppsättning med 2 cm x 4 cm procedurkuponger (en uppsättning för en fullstor PPE-artikel) för varje materialtyp som inte kommer att inokuleras men kommer att tvättas. Förbered två kuponger för varje dag med ansiktstäckande experiment, fem kuponger för varje dag av denimexperiment och tre kuponger för varje dag av skrubbexperiment.
- Förbered en uppsättning 2 cm x 4 cm positiva kontrollkuponger som kommer att inokuleras men inte tvättas. Förbered två kuponger för varje dag av ansiktstäckande experiment (tre ansiktsbeläggningar testades), fem kuponger för varje dag av denimexperiment (tre jeansbyxor testades) och tre kuponger för varje dag av skrubbexperiment (tre scrubs testades) och tre kuponger i rostfritt stål.
OBS: Olika antal replikat valdes baserat på objektets storlek. Till exempel är det fysiskt svårt att fästa fem kuponger på ansiktsskyddet, och två kuponger skulle representera ett begränsat område av jeansbyxorna. Platserna valdes för att maximera täckningen och i zoner som kan vikas under tvätt och vara svårare att rengöra.
4. Utför inokulering
- Bered en 10% nötköttsextraktlösning genom att lösa 1 g nötköttsextrakt i en total volym av 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning. Filtrera sterilisera hela volymen med ett 0,2 μm sprutfilter.
- Tina virusstamlösningen som beretts i sektion 1 vid rumstemperatur. På användningsdagen tillsätt 100 μl av den tinade Phi6-buljongen till 900 μl av 10% nötköttsextraktlösningen.
- Inokulera testkuponger och positiva kontrollkuponger med ~107 PFU/prov genom att pipettera en 10 μl droppe lösning på den personliga skyddsutrustningen och sprida droppen med pipettens spets. Beroende på PPE-materialet kommer dropparna att separeras och reaggregeras annorlunda.
- Låt inokulerade kuponger torka i ett biosäkerhetsskåp. Bestämd torrtid (er) via observation för dina specifika material. För de resultat som presenterades här användes följande tider: scrubs = 30 min torrtid; ansiktsskydd = 60 min torrtid; denim = 30 min torrtid; rostfritt stål = 120 min torrtid.
- Fäst inokulerade kuponger på fullstora personliga skyddsutrustningar enligt figur 2 med hjälp av säkerhetsnålar och aseptiska tekniker.
Figur 2. Testa kupongplatser på denim, scrubs och ansiktsskydd. Bokstäverna A-D motsvarar de unika kupongidentifierarna för alla tvättexperiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Utför tvätt
- Förbered tvättmedel enligt följande.
- Sterilisera kranvatten som ska användas i tvättmaskinen och samla 10 ml autoklaverat vatten för en sterilitetskontroll. För detta protokoll, autoklav 7 L kranvatten på en 60 min vätskecykel.
- Förbered tvättlösning enligt tillverkarens utspädningsanvisningar. För detta protokoll, lös upp 1,54 ml tvättmedel i 3,5 liter sterilt kranvatten. Värm tvättlösningen till 50 °C med en kokplatta och rör om stången. Mät och registrera tvättlösningens pH och temperatur. Samla 10 ml lösning för sterilitetskontroll.
- Häll tvättlösning i en steriliserad bricka (3,25 L). Försterilisera brickor med en 250 ppm-4 h cykel av ångformig väteperoxid mellan testerna.
- Placera PPE-artiklar i en steriliserad bricka. Lägg till en jeansbyxa och en skrubbskjorta per bricka. Lägg till ett inokulerat ansiktsskydd och fyra icke-förorenade fyllningsmasker per bricka; Fill Masks hade inga kuponger bifogade.
- Tvätta PPE-föremål i 18 minuter (två 9 minuters tvättcykler med normal omrörning). Töm brickan och trippelskölj med kranvatten i rumstemperatur (5 L varje gång) för att ta bort skum. Tillsätt steriliserat kranvatten i rumstemperatur i brickan (3,25 L) och utför en 9 minuter lång sköljcykel.
- Flytta PPE-föremålen till brickans rotationssida och snurra i 5 minuter. Flytta den eller de personliga skyddsutrustningarna till torktumlaren och torka i 80 minuter på inställningen för hög värme (93 °C).
- Flytta personlig skyddsutrustning från torktumlare till steril arbetsyta och ta bort kupongerna från varje föremål och placera dem i koniska rör. Förfyll rören med 10 ml 10% Dey-Engley buljongextraktionsbuffert och täck med aluminiumfolie.
6. Extrahera och räkna upp virala belastningar på kuponger
- Extrahera kuponger i 10 ml 10% Dey-Engley neutraliserande buljong genom att virvla i 2 minuter vid maximal inställning av din utrustning.
- Plattextrakt med en konventionell mjuk toppagaröverlagringsmetod26.
- Förbered rör med mjukmodifierad tryptisk sojaagar och en P. syringae-kultur enligt beskrivningen i avsnitt 1. På testdagen autoklaverar du de mjuka agarrören vid 121 °C i 15 minuter för att smälta agar. Håll den mjuka agarn vid 48 °C tills den pläteras. Jämvikt vid 48 °C är viktigt annars kan viruset inaktiveras termiskt i analysen.
- Bered en tiofaldig utspädningsserie i 1x fosfatbuffrad saltlösning för varje testprov som används i tvättningsstudien. Använd både serieutspädda (100 μl) och outspädda (1 ml och 100 μl) alikvoter för plätering.
- Tillsätt alikvoter av testprovet till det mjuka agarröret som innehåller 6 ml mjuk agar och 100 μl av stockfas P. sprutodling (OD600 mellan 0,9-1,5). Häll den mjuka agaren på ytan av en stelnad modifierad tryptisk sojaagarplatta. Fördela den mjuka agaren jämnt över den fasta agarytan genom att virvla plattan.
- Inkubera plattor över natten vid rumstemperatur och räkna upp följande dag manuellt genom att räkna de plackbildande enheterna på varje platta.
7. Utför visuell bedömning efter testet av personlig skyddsutrustning
- Dokumentera följande i de olika personliga skyddsutrustningsartiklar som används för testning: tecken på blekning, missfärgning och/eller skada (t.ex. rivning, sträckning); Lukter; små hål, skär eller tårar (använd en liten ficklampa för att leta efter skador); separering av lager, saknade trådar, områden där bindningen är skadad; skador på sömmar eller blixtlås; mäta och registrera sträckningen av elastiken.
Representative Results
Flera olika typer av kvalitetskontrolldata och resultat genereras efter slutförandet av detta protokoll. Antal plackbildande enheter (PFU) tillsammans med den extraherade provvolymen gör det möjligt att beräkna antalet PFU per testkupong. Tabell 2 är ett exempel på ett dataregistreringsblad för seriella utspädnings-/pläteringsresultat. Med hjälp av utspädningsfaktorn, provvolymen och antalet bakterier från tabell 1 visar tabell 3 representativa virusåterhämtningsresultat för ett ansiktstäckande test. Observera att dessa data inkluderar testkupongerna och kvalitetskontrollproverna för inokulum, kuponger och tvättvatten (med och utan tvättmedel). De processuella blind- och sterilitetskvalitetskontrollproverna är viktiga för att bekräfta att vattenlösningarna och PPE-materialen inte var förorenade med Phi6. Indikation av kontaminering skulle orsaka felaktiga beräkningar av desinfektionseffekten och kräva att testet upprepas. De positiva kontrollproverna är avsedda att verifiera att virusstamlösningen inte bryts ned miljömässigt/naturligt under experimenten och därigenom blåser upp effekten av tvättprocessen vid minskning av virusbelastningen. Dessa prover bör ligga inom 1 log PFU från ympkontrollerna för att godta testkupongresultaten. En stor minskning av PFU för de positiva kontrollproverna indikerar också att alla steg i kuponginokuleringen bör granskas noggrant för att säkerställa att analytikern utför protokollet med korrekt pipettering och spridningstekniker.
Detta protokoll ger också information för att bedöma ändringar av klädesplaggens materialegenskaper på grund av tvätt- och kvalitetskontrollinformation som rör protokollet (tabell 4 och figur 3). Dessa data är användbara av flera skäl. Registrering av trender i mätningarna av personlig skyddsutrustning gör det möjligt att identifiera en artikel med tillverkningsfel. Denna identifiering kan hjälpa till att förklara avvikande mikrobiella data och kontextualisera variationen i produktbeteende. Att anteckna lukt eller skador kan också ge en indikation på om tvättmaskinen eller torktumlaren fungerade suboptimalt under ett experiment och om testerna ska upprepas eller utrustningen servas. Dessutom, om testplanen kräver flera tvättcykler av samma PPE-artikel, kan uppgifterna hjälpa till att avgöra hur länge PPE-artiklarna behåller sin integritet för användning vid tvätt. Att föra ett register över tvättmedelslösningens pH ger en varning om förändringar i vattenkällan eller tvättmedelsprodukten. Att upprätthålla en tidslogg över tvättstegen säkerställer att timern på tvättmaskinen och torktumlaren inte orsakar variationer i experimentprotokollet.
I slutändan används dessa data för att rapportera desinfektionseffekten av varmvattentvättproceduren mot ett surrogat för virala patogener. Tvättdesinfektionseffekten (Eqn. 1) beräknas genom subtraktion av den genomsnittliga log 10-virusåterhämtningen från PPE-testkupongen från de genomsnittliga log10-virusåterhämtningarna från PPE-positiva kontrollresultat (figur 4). För testkupongresultat som inte detekteras används log10 av detektionsgränsen i beräkningen av desinfektionseffekten. Det är vanligt att rapportera desinfektionseffekt som loggvärden för jämförelse med andra virala desinfektionstekniker och standarder.
Desinfektionseffekt = Genomsnittlig log 10 (positiva kontroller) - Genomsnittlig logg10 (testkuponger) (Eqn. 1)
Figur 3. Ändring av PPE-dimensioner efter plats. Δ = Mätning före test - mätning efter test. Ett negativt Δ-värde motsvarar objektets sträckning på den angivna platsen och ett positivt värde motsvarar krympning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effekt av varmvattentvätt vid desinfektion av ansiktsbeläggningar, denim och skrubba PPE-material från Phi6. Stjärnor betecknar fullständig desinfektion inträffade (icke-detekter på testkupongerna). Felstaplar indikerar standardavvikelse (n = 3). Platsbokstäver motsvarar den placering som visas i figur 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Lösning recept. Ingredienser och mängder som är nödvändiga för att förbereda tryptisk sojaagar, tryptisk sojabuljong och nötköttsextraktlösningar. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2. Ett exempel på en del av ett resultatblad för seriell utspädning/plätering. Mall för rapportering av råa mikrobiella data. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 3. Ansiktstäckande mikrobiella resultat. Exempel på sammanfattningsblad för bearbetade plackbildande enhetsdata (PFU). Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 4. Skrubbar kvalitetskontroll och materialbedömningslogg. Mall för rapportering av kalibrering av pH-sond, pH i tvättmedelslösning, mätningar före och efter tvätt och tvättcykeltider. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
Detta protokoll utvecklades för att utföra systematiska laboratorietester för att bedöma tvätteffektiviteten av virusdesinfektion från fullstora PPE / klädesplagg. Förfarandena beskriver de kritiska stegen för att förbereda viruset, ympa testmaterialet, bedöma ändringarna av föremålen på grund av tvättprocessen och kvantifiera minskningen av virusbelastningen till följd av tvättprocessen (maskintvätt och torkning). Dessutom beskriver protokollet de nödvändiga kvalitetskontrollproverna för att säkerställa att experimenten inte är partiska av kontaminering och mätningar / observationer som bör registreras för att spåra den personliga skyddsutrustningens materialintegritet efter flera tvättcykler. Resultaten med Phi6 indikerar att varmvattentvättprocessen som används i detta protokoll uppnådde en minskning av virusbelastningen med mer än 3 loggar för alla prover (ansiktsskydd, scrubs och jeansbyxor). Virusbelastningsminskningen var också enhetlig på olika platser på PPE / klädesplagg. För att demonstrera 3-log-reduktion kräver detta protokoll användning av en hög virusbelastning och ett stabiliseringsmedel (nötköttsextrakt) som kanske inte är representativt för markbelastningen för alla situationer.
Minibrickor och kompakta torktumlare valdes för att optimera antalet replikatexperiment som kunde utföras i en utrymmesbegränsad miljö och för att hålla steriliseringen av utrustning och vattenvolym som användes under experimenten hanterbar för laboratoriepersonal. Som ett resultat av att använda minibrickan var sköljstegen manuella jämfört med de flesta hemtvättapplikationer som är helt automatiserade. Det är också viktigt att komma ihåg att maskintvätt dominerar i utvecklade länder, men handtvätt praktiseras fortfarande över hela världen15. Dessutom kanske vissa inte har tillgång till varmt vatten för tvätt, och andra manuellt lufttorkar kläder snarare än maskintorkning. Dessa skillnader i tvättpraxis togs inte upp i detta nuvarande protokoll men kunde lätt undersökas med mindre ändringar som att ersätta tvätt- och torkstegen med att använda en hink och en nära linje
Det har varit minimalt fokus på rengöring/desinficering av virusförorenade ansiktsskydd och gatukläder i den vetenskapliga litteraturen i full skala. Mer vanligt bedömer studier filtreringsprestandan hos ansiktsbeläggningar efter upprepad tvätt och torkning men utvärderar inte viral desinfektionseffekt27,28. utvärderade till exempel anpassad filtreringseffektivitet för tygmasker och modifierade procedurmasker och fann stor variation i prestanda, med enkla modifieringar som gav ökad passform och filtreringseffektivitet29. En annan studie tittade på filtreringseffektiviteten hos fyra tygmasker av olika material30, återigen med fokus på källkontroll eller personligt skydd. Detta kan bero på brist på specialisering för både den mikrobiella delen och mekanisk testning i samma laboratorium. Protokollet som presenteras här ger en utvärdering av desinfektionseffektivitet samt materialnedbrytning.
Det har nyligen publicerats ett antal dekontaminerings-/desinfektionsmetoder för andningsskydd för engångsbruk (främst N95) i den vetenskapliga litteraturen31,32,33. Det primära fokuset på FFR (t.ex. N95s) beror på det kritiska andningsskydd de tillhandahåller för vårdpersonal och andra yrken i frontlinjen. Primär teknik för respiratordekontaminering involverade förångad väteperoxid (VHP), ultraviolett bakteriedödande strålning (UVGI) och fuktig värme (ånga) för virusinaktivering. utvärderade fem dekontamineringsmetoder för FFR och UVGI; etylenoxid och VHP visade sig vara de mest lovande saneringsmetoderna31. utvärderade fyra olika dekontamineringsmetoder - UV-ljus, torr värme, 70% etanol och VHP - för deras förmåga att minska kontaminering med SARS-CoV-2 och deras effekt på N95 andningsfunktion32. Det finns många ytterligare studier om effektiv dekontamineringsteknik för FFR som sammanfattades och publicerades 202033. Dessa specialiserade metoder är dock inte tillgängliga eller utformade för att användas säkert av den genomsnittliga hem- eller småföretagaren.
Detta protokoll utvecklades med hjälp av Phi6, en omsluten bakteriofag som liknar SARS-CoV-2, har spikproteiner och är av liknande storlek (80-100 nm)34, för alla tester. Eftersom Phi6 inte är en känd patogen kan den manipuleras i ett allmänt mikrobiologiskt biosäkerhetsnivå 1 (BSL-1) laboratorium. Effekt mot Phi6 kan indikera effekten av andra höljeförsedda virus, men empirisk verifiering för varje virus av intresse är nödvändig35. Genom att använda ett liknande, icke-patogent virusmedel hoppas man att detta protokoll kan upprepas någon annanstans och användas för att studera framtida virusepidemier / pandemier. Framtida forskning kan inkludera användning av desinfektionsmedel (t.ex. blekmedel) förutom tvättmedel och ett standardiserat protokoll för handtvätt och linjetorkning.
Disclosures
Det finns inga kända intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
U.S. Environmental Protection Agency (EPA) genom sitt kontor för forskning och utveckling ledde den forskning som beskrivs häri under EP-C-15-008 med Jacobs Technology Inc. Den har granskats av byrån men återspeglar inte nödvändigtvis byråns åsikter. Inget officiellt godkännande bör härledas. EPA stöder inte köp eller försäljning av kommersiella produkter eller tjänster. Författarna vill tacka EPA-entreprenörerna Denise Aslett för tillsynen av EPA RTP-mikrobiologin, Brian Ford, Rachael Baartmans och Lesley Mendez Sandoval för deras arbete med detta projekt i EPA RTP-mikrobiologilaboratoriet, Ramona Sherman för att tillhandahålla EPA-kvalitetssäkringsgranskningen och Worth Calfee och Shannon Serre för att tillhandahålla EPA-tekniska recensioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
| Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
| Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
| Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
| SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
| Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
| Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
| Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
| Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
| Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
| Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
| Dextrose | Fisher | BP350 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
| Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
| Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
| Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
| Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
| Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
| pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
| pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
| pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
| Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
| Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
| Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
| Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
| Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
| Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
| Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
| Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
| Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
| Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
| Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
| Washer | Kuppet | KP1040600A | |
| Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
| Yeast extract | Gibco | 212750 |
References
- Emanuel, E. J., et al. Fair allocation of scarce medical resources in the time of Covid-19. The New England Journal of Medicine. 382 (21), 2049-2055 (2020).
- Cohen, J., van der Meulen Rodgers, Y. Contributing factors to personal protective equipment shortages during the COVID-19 pandemic. Preventive Medicine. 141, 106263 (2020).
- Burki, T. Global shortage of personal protective equipment. The Lancet Infectious Diseases. 20 (7), 785-786 (2020).
- Optimizing Personal Protective Equipment (PPE) Supplies. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/ppe-strategy/index.html (2020).
- Livingston, E., Desai, A., Berkwits, M. Sourcing personal protective equipment during the COVID-19 pandemic. Jama. 323 (19), 1912-1914 (2020).
- Bloomfield, S. F., Exner, M., Signorelli, C., Nath, K. J., Scott, E. A. The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry. International Scientific Forum on Home Hygiene. , (2011).
- Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus. Journal of Infectious Diseases. 141 (1), 98-102 (1980).
- Turner, R., Shehab, Z., Osborne, K., Hendley, J. O. Shedding and survival of herpes simplex virus from 'fever blisters'. Pediatrics. 70 (4), 547-549 (1982).
- Bean, B., et al. Survival of influenza viruses on environmental surfaces. Journal of Infectious Diseases. 146 (1), 47-51 (1982).
- Brady, M. T., Evans, J., Cuartas, J. Survival and disinfection of parainfluenza viruses on environmental surfaces. American Journal of Infection Control. 18 (1), 18-23 (1990).
- Sidwell, R. W., Dixon, G. J., Mcneil, E. Quantitative studies on fabrics as disseminators of viruses: I. Persistence of vaccinia virus on cotton and wool fabrics. Applied Microbiology. 14 (1), 55-59 (1966).
- Owen, L., Shivkumar, M., Laird, K. The stability of model human coronaviruses on textiles in the environment and during health care laundering. Msphere. 6 (2), 00316-00321 (2021).
- Sehulster, L., et al. Guidelines for environmental infection control in health-care facilities. Recommendations from CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC). American Society for Healthcare Engineering/American Hospital Association. , (2004).
- Chen, H., et al. Influence of different inactivation methods on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA copy number. Journal of Clinical Microbiology. 58 (8), e00958 (2020).
- Abney, S. E., Ijaz, M. K., McKinney, J., Gerba, C. P. Laundry hygiene and odor control-state of the science. Applied and Environmental Microbiology. 87 (14), 0300220 (2021).
- COVID-19 Cleaning and Disinfecting Your Home. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/disinfecting-you-home.html (2021).
- COVID-19 Your Guide to Masks - How to select, properly wear, clean, and store masks. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/about-face-coverings.html (2021).
- Walter, W. G., Schillinger, J. E.
- Blaser, M. J., Smith, P. F., Cody, H. J., Wang, W. -L. L., LaForce, F. M. Killing of fabric-associated bacteria in hospital laundry by low-temperature washing. Journal of Infectious Diseases. 149 (1), 48-57 (1984).
- Gerhardts, A., et al. Testing of the adhesion of herpes simplex virus on textile substrates and its inactivation by household laundry processes. Journal of Biosciences and Medicines. 4 (12), 111 (2016).
- Heinzel, M., Kyas, A., Weide, M., Breves, R., Bockmühl, D. P. Evaluation of the virucidal performance of domestic laundry procedures. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 213 (5), 334-337 (2010).
- Casanova, L. M., Weaver, S. R. Inactivation of an enveloped surrogate virus in human sewage. Environmental Science & Technology Letters. 2 (3), 76-78 (2015).
- Aquino de Carvalho, N., Stachler, E. N., Cimabue, N., Bibby, K. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environmental Science & Technology. 51 (15), 8692-8700 (2017).
- Ye, Y., Chang, P. H., Hartert, J., Wigginton, K. R. Reactivity of enveloped virus genome, proteins, and lipids with free chlorine and UV254. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7698-7708 (2018).
- Bacteriology Culture Guide. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide (2022).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Bacteriophages. , Springer. 69-76 (2009).
- Sankhyan, S., et al. Filtration performance of layering masks and face coverings and the reusability of cotton masks after repeated washing and drying. Aerosol and Air Quality Research. 21 (11), 210117 (2021).
- Kumar, A., Bhattacharjee, B., Sangeetha, D., Subramanian, V., Venkatraman, B. Evaluation of filtration effectiveness of various types of facemasks following with different sterilization methods. Journal of Industrial Textiles. , (2021).
- Clapp, P. W., et al. Evaluation of cloth masks and modified procedure masks as personal protective equipment for the public during the COVID-19 pandemic. JAMA Internal Medicine. 181 (4), 463-469 (2021).
- Lu, H., Yao, D., Yip, J., Kan, C. -W., Guo, H. Addressing COVID-19 spread: development of reliable testing system for mask reuse. Aerosol and air quality research. 20 (11), 2309-2317 (2020).
- Viscusi, D. J., Bergman, M. S., Eimer, B. C., Shaffer, R. E. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Annals of Occupational Hygiene. 53 (8), 815-827 (2009).
- Fischer, R. J., et al. Effectiveness of N95 respirator decontamination and reuse against SARS-CoV-2 virus. Emerging Infectious Diseases. 26 (9), 2253 (2020).
- Derraik, J. G., Anderson, W. A., Connelly, E. A., Anderson, Y. C. Rapid review of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 viability, susceptibility to treatment, and the disinfection and reuse of PPE, particularly filtering facepiece respirators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (17), 6117 (2020).
- Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Calfee, M. W., et al. Virucidal efficacy of antimicrobial surface coatings against the enveloped bacteriophage Φ6. Journal of Applied Microbiology. 132 (3), 1813-1824 (2022).
