Summary
Her rapporterer vi en protokoll for kvantifisering og differensiering av myokardiale B-lymfocytter basert på deres plassering i det intravaskulære eller endotelialrommet ved hjelp av flowcytometri.
Abstract
En økende mengde bevis viser at B-lymfocytter spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardfysiologi og myokardtilpasning til skade. Litteraturen rapporterer imidlertid kontrasterende data om forekomsten av myokard-B-celler. B-celler har blitt rapportert å være både blant de mest utbredte immuncellene i gnagerhjertet eller å være til stede, men med en markant lavere prevalens enn myeloide celler, eller å være ganske sjeldne. Tilsvarende har flere grupper beskrevet at antall myokard-B-celler øker etter akutt iskemisk myokardskade, men én gruppe rapporterte ingen endringer i antall B-celler i det skadde myokard. Implementering av en felles, reproduserbar metode for å vurdere forekomsten av myokardiale B-celler er avgjørende for å harmonisere observasjoner fra ulike forskningsgrupper og dermed fremme utviklingen av studiet av B-celle myokardinteraksjoner. Basert på vår erfaring stammer de tilsynelatende kontrasterende observasjonene som er rapportert i litteraturen sannsynligvis fra det faktum at murine myokard-B-celler for det meste er intravaskulære og koblet til det mikrovaskulære endotelet. Derfor er antall B-celler gjenvunnet fra et murine hjerte utsøkt følsomt for perfusjonsbetingelsene som brukes til å rense orgelet og til fordøyelsesmetoden som brukes. Her rapporterer vi en optimalisert protokoll som tar hensyn til disse to kritiske variablene på en bestemt måte. Denne protokollen muliggjør reproduserbar, flowcytometribasert analyse av antall murine myokardiale B-celler og lar forskere skille ekstravaskulære vs. intravaskulære myokardiale B-celler.
Introduction
B-lymfocytter er høyt spesialiserte immunceller som spiller en viktig rolle i både adaptive og medfødte immunresponser1. Det er to hovedpopulasjoner av B-celler: en mindre populasjon av B1-celler som hovedsakelig produseres under embryonalt liv, og en overveiende populasjon av B2-celler som produseres i voksenlivet i benmargen1. Etter modning i benmargen migrerer B-celler til primære og sekundære lymfoide organer. Derfra resirkulerer de kontinuerlig mellom lymfoide organer som beveger seg gjennom blodkar og lymfekar2. B-celler uttrykker spesifikke antistoffer på overflaten, som fungerer som reseptorer. Når B-celler møter et antigen som binder seg til reseptoren, kan et aktiveringssignal utløses. Aktiverte B-celler migrerer enten til vevet der antigenet ble funnet eller går tilbake til benmargen hvor de kan modnes til antistoffproduserende plasmaceller 3,4.
Nylig har det blitt verdsatt at hjertet har en betydelig populasjon av B-celler. Studier på gnagere har vist at B-celler koloniserer hjertet tidlig under embryonal utvikling5, og at myokardassosierte B-celler for det meste er intravaskulære, naive B2-celler som holder seg til endotelet6,7, med en liten prosentandel av B1-celler7. Det er fortsatt mange usikkerhetsområder, men tilgjengelige data indikerer at B-celler spiller en viktig rolle både i det naive hjertet og i sammenheng med myokardtilpasning til skade.
Studier i det naive murine hjertet har vist at ved baseline myokardiale B-celler hovedsakelig er lokalisert i det intravaskulære rommet, festet til endotelet (>95% av murine hjerte B-celler ble funnet å være lokalisert i det intravaskulære rommet). Disse B-cellene ble funnet å ha genuttrykksmønstre som er forskjellige fra sirkulerende B-celler isolert fra perifert blod. Analyse av naive hjerter fra B-cellefattige dyr og syngeneiske kontroller fant at dyr som manglet B-celler hadde mindre hjerter og høyere ejeksjonsfraksjon6. Alt dette beviset tyder på at B-celler kan modulere myokardvekst og / eller myokardfunksjon, og at ikke bare interstitielle, men også intravaskulære B-celler kan være ansvarlige for slike observasjoner. B-celler ble også funnet å modulere fenotypen av myokardiale bosatt makrofager8.
Flere studier har vist at B-celler spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardtilpasning til skade 8,9,10,11,12,13. B-celler akkumuleres forbigående i det skadede hjertet, sannsynligvis gjennom en CXCL13-CXCR5-avhengig mekanisme11,13. Derfra fremmer B-celler ugunstig hjerteombygging gjennom flere mekanismer som inkluderer cytokinmediert monocytrekruttering 9,12. I tillegg kan B-celler produsere antistoffer mot hjerteproteiner som kan fremme forlengelse av hjerteskader og ugunstig hjerteombygging gjennom flere mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan også utøve beskyttende effekter på det skadede hjertet gjennom utskillelsen av IL-1010.
Etter hvert som antall grupper som undersøker B-cellenes rolle i det naive og skadede hjertet vokser, blir det mer og mer viktig å definere delte protokoller for å kvantifisere og vurdere myokardiale B-celler på riktig måte og dermed unngå inkonsekvenser som allerede har begynt å vises i litteraturen. Så langt har B-celler faktisk både blitt rapportert å være en av de mest utbredte immuncellene i gnagerhjertet7 og å være til stede ved en markant lavere prevalens enn myeloide celler26,27, eller å være ganske sjeldne 28. Tilsvarende har flere grupper beskrevet at antall myokard-B-celler øker etter akutt iskemisk myokardskade 7,9,13, men en gruppe rapporterte ingen endringer i antall B-celler i det skadde myokardiet29. Studier på hjerteimmunceller gir sjelden detaljer om perfusjonsforhold, og det er ingen konsensus om fordøyelsesforholdene. Siden en stor andel B-celler i gnagerhjertet er intravaskulære og ekstraksjon av immunceller fra myokardiet er svært avhengig av fordøyelsesmetoden som brukes, kan forskjellene rapportert i litteraturen være et resultat av forskjeller i organperfusjon og vevsfordøyelse.
Presentert her er en detaljert metode for flowcytometribasert kvantifisering av murine myokardiale B-celler som maksimerer utbyttet av B-celleutvinning ved å optimalisere perfusjons- og fordøyelsesforhold og tillater diskriminering av intravaskulære vs. ekstravaskulære myokard-B-celler6. Denne protokollen er en tilpasning og optimalisering av andre lignende protokoller som skiller mellom intravaskulære og interstitielle immunceller 28,30,31.
I denne protokollen standardiserer vi myokardperfusjon for å eliminere B-celler som flyter i det intravaskulære rommet uten å fjerne biologisk relevante B-celler festet til det mikrovaskulære endotelet. Videre, ved å bygge på tidligere protokoller som har beskrevet bruken av intravenøs injeksjon av antistoffer for å skille intravaskulære fra interstitielle immunceller32, og dra nytte av det faktum at B-celler uttrykker overflatemarkøren B22033, demonstrerer vi hvordan man skiller intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardiale B-celler gjennom intravaskulær injeksjon av et B220-spesifikt antistoff umiddelbart før dyreofring og hjerteperfusjon. Denne protokollen er relevant for forskningen til enhver forsker som er interessert i å inkludere analysen av myokardiale B-celler i det naive og skadede hjertet. Den utbredte implementeringen av denne protokollen vil redusere uoverensstemmelser mellom forskningsgrupper, vil tillate analyse av endringer i intravaskulære og ekstravaskulære myokardiale B-cellebassenger, og vil dermed styrke utviklingen av funn innen hjerteimmunologi.
Oppsummert representerer protokollen en optimalisert arbeidsflyt for å kvantifisere og analysere myokardiale B-celler via flowcytometri, og samtidig skille mellom celler lokalisert i det ekstravaskulære rommet og det intravaskulære rommet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet ble utført med godkjenning av IACUC ved Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Forberedelser
- Klargjør FACS-bufferen, som beskrevet i tabell 1.
- Sørg for at det er nok CO2 til å avlive dyrene.
- Forbered disseksjonsplassen (plasser benkputen og plasser tape- og disseksjonsverktøyene i nærheten).
- Merk 15 ml rørene, sett 3 ml HBSS med kalsium og magnesium i hvert rør (se materialtabell) og legg dem på is (ett rør per hjerte og et ekstra for referansegruppen / flowcytometrikontrollene). Fyll også de små (35 mm) petriskålene med HBSS.
- Slå på den temperaturkontrollerte shakeren, sett den til 37 °C, og forkjøl sentrifugen ved en temperatur på 4 °C.
- Klargjør sprøytepumpen og sett strømningshastigheten til 3 ml/min. Fyll en 20 ml sprøyte med HBSS, fyll rørlinjen med buffer og fjern eventuelle bobler.
2. Intravaskulær B-cellefarging (in vivo)
- Vei en 12 uker gammel hannmus av C57BL/6J-stammen. Legg i en 3/10 cc insulinsprøyte med 100 μL av B220 antistofffortynningen (1:10, i PBS). Dekk sprøyten med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys.
- Bedøv en mus.
- Påfør en intraperitoneal injeksjon på 2% 2,2,2-tribromoetanol med en dose på 400 mg / kg og vent 10-20 min.
MERK: Overvåk musens pust og bevegelse. Når musen slutter å bevege seg, stimulere smerte ved å klemme tåen; Fraværet av en tilbaketrekningsrefleks indikerer tilstrekkelig anestesi. - Dersom adekvat anestesi ikke oppnås i løpet av 20 minutter, kan det gis en tilleggsdose bedøvelse på 100 mg/kg, og det bør gjøres en vurdering av musekinetikk, seponeringsrefleks og respirasjon hvert 5. minutt.
- Påfør en intraperitoneal injeksjon på 2% 2,2,2-tribromoetanol med en dose på 400 mg / kg og vent 10-20 min.
- Plasser musen på laboratoriebenken på en benkpute skrått mot den ene siden, trekk forsiktig ned huden på ryggen, og trykk kroppen litt mot benken for å få øyet til å stikke ut.
- Injiser det fortynnede B220 antistoffet fra trinn 2.1 ved retroorbital injeksjon.
- Stikk sprøyten inn i øyet ved 45° fra sagittalplanet på musens hode. Injiser oppløsningen langsomt. Hvis du føler motstand, fjern sprøyten og gå inn igjen. Vent i 2 min.
MERK: Langvarig inkubasjonstid vil sette evnen til å diskriminere intra-vaskulære vs ekstra-vaskulære B-celler i fare, da det ville gi tid til det injiserte antistoffet for å diffundere utenfor vaskulaturen.
- Stikk sprøyten inn i øyet ved 45° fra sagittalplanet på musens hode. Injiser oppløsningen langsomt. Hvis du føler motstand, fjern sprøyten og gå inn igjen. Vent i 2 min.
- Avlive musen i henhold til IACUC-regelverket.
- Åpne CO2-strømmen til eutanasikammeret med en hastighet på 0,5 l / min, eller den anbefalte strømningshastigheten basert på størrelsen på kammeret ditt.
- Plasser musen i kammeret i anbefalt tid, og sørg for at den ikke lenger puster. Fjern det og utfør cervikal dislokasjon som en sekundær metode for eutanasi.
- Når musen er avlivet, fortsett straks til organhøsting og perfusjon.
3. Hjerte samling
- Bryståpning.
- Hold musens hud med tang på det epigastriske området. Lag en 2 mm åpning i huden ved hjelp av saks og bruk tangen til å skrelle huden bort for å avsløre fascialaget, et skinnende gjennomsiktig lag, av brystet og magen. Klipp ved epigastrium gjennom fascia og peritoneum for å åpne bukveggen og avsløre xiphoidprosessen. Klem xiphoidprosessen ved hjelp av hemostatiske tang.
- Med saksen gjør du et vertikalt kutt gjennom brystveggen på nivået med den midtklavikulære linjen på hver side og løft den fremre brystveggen for å avsløre mediastinuminnholdet, ved hjelp av hemostatisk tang som en vekt for å opprettholde åpningen.
- Hjerteperfusjon og ekstraksjon.
- Bruk tang, fjern fett eller tymisk vev som omgir hjertet.
- Hold aorta sikkert bakfra ved hjelp av tang. Stikk sprøytekanylen (25 G) inn i toppen av hjertet. Perfuse med 3 ml HBSS med en hastighet på 3 ml / min.
MERK: Overvåk perfusjonen. Leveren skal fylles, og blod i koronarbeinene skal fjernes helt. Bruk av en sprøytepumpe kalibrert til 1 ml/minutt anbefales for å opprettholde en jevn gjennomstrømning. - Klipp aorta med saks og ta ut hjertet. Vask hjertet i petriskålen med HBSS for å fjerne eventuelt gjenværende blod. Bruk saks og tang, fjern fett, bindevev og tymus, og tørk hjertet. Vei det isolerte hjertet og noter vekten i milligram. Hakk hjertet ved romtemperatur i små biter (1-2 mm) med et blad.
MERK: Voksne musehjerter kan veie mellom 0,090-0,210 mg. - Mål massen av hjertevev og plasser 60 mg av hakket hjerte som skal fordøyes i et 15 ml rør med 3 ml HBSS. Behold det gjenværende hjertevevet og legg det i et rør merket "Referansekontrollvev"; Dette vil bli brukt til kompensasjonskontroll for levende-dødt signal og autofluorescens.
4. Hjertefordøyelse og cellefarging
- Tilsett enzymer i hvert rør som inneholder hakket vev (se tabell 1). Tilsett 0,5 μL/mg DNase 1 (300 enheter for 60 mg hjertevev), 0,5 μL/mg kollagenase II (625 enheter for 60 mg hjertevev) og 0,2 μL/mg hyaluronidase (50 enheter for 60 mg hjertevev) til røret.
- Plasser fordøyelsesreaksjonen i shakeren i 30 minutter ved 300 o / min. Juster shakerstativet til ca. 25° stigning.
- Tilsett 7 ml HBSS til hvert av de 15 ml reaksjonsrørene og sentrifugen ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C med akselerasjon og brudd satt til moderat eller sakte. Dekanter supernatanten og resuspendere hver pellet i 5 ml ACK lysebuffer for å fjerne røde blodlegemer. Inkuber i ACK-lysebufferen i 5 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 10 ml PBS til hvert rør, bland og filtrer deretter inn i et 50 ml rør med en 40 μm sil. Sørg for at alt rusk er inne i filterkammeret. Knus eventuelle rester på filteret med et sprøytestempel til det er helt suspendert i filterkammeret.
- Tilsett PBS gjennom filteret til volumet når 25 ml per hjerte; Dette vil tillate de suspenderte cellene å passere gjennom filteret. Tilsett ytterligere 25 ml PBS i referansekontrollrøret og del volumet i forskjellige rør (25 ml hver). Merk en av rørene "Unstained" og den andre som "Live-dead". Sentrifuge ved 250 x g i 5 min ved 4 °C.
MERK: På dette tidspunktet forbereder du fortynningen for den levende døde flekken (fortynning: 1:500 i 1x PBS). - Dekanter supernatanten, resuspend pelleten i det ufargede røret i 100 μL PBS og hver av de andre pellets i 100 μL av den levende døde flekkfortynningen. Inkuber på is i 30 minutter i mørket, og dekk isbøtta med aluminiumsfolie.
- Tilsett 500 μL FACS-buffer til hver prøve og overfør den til et merket FACS-rør gjennom et 40 μm filter. Sentrifuger FACS-rørene ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten. Resuspend pelleten i 500 μL FACS buffer.
- Tilsett 50 μL Fc-blokkeringsløsning (se tabell 1) til hvert rør, bortsett fra de ufargede og levende døde rørene. Bland og inkuber i 5 min.
- Tilsett 50 μL antistoffblandingsløsning (se tabell 1) til hvert rør, bortsett fra de ufargede og levende døde rørene, og inkuber i 30 minutter i mørket, og dekk isbøtta med aluminiumsfolie.
- Tilsett 2 ml FACS-buffer i hvert rør og sentrifuger ved 250 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og resuspend i 300-500 μL FACS-buffer.
5. Flowcytometri
- Innstillinger for instrumentkontroll.
MERK: I denne protokollen analyseres prøven med et 4 lasere Cytek Aurora flowcytometer. Et annet passende flowcytometer kan brukes til å oppdage markørene av interesse.- Åpne instrumentkontrollprogramvaren (se Materialtabell). Øverst i vinduet velger du fanen Anskaffelse og klikker på Ny +. Et vindu som heter Opprett nytt eksperiment vises.
- I Bibliotek-delen, i feltet Skriv inn for å filtrere, skriver du PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 og Zombie Aqua, og klikker Legg til etter å ha skrevet hver. Fluorofornavnene bør sees til høyre. Klikk deretter neste for å fortsette til gruppe fanen.
- I kategorien Gruppe klikker du symbolet med et rør for å legge til hjertet for analysen.
- Klikk på + Referanse-gruppen og et vindu vises. I fluorescerende tag-kolonnen velger du Zombie Aqua, og i kolonnen kontrolltype velger du Celler, og deretter klikker du Lagre.
- Klikk på Neste > Markører-fanen ; Et bord vises med navnene på fluoroforene. Skriv inn den tilsvarende cellemarkøren i den første raden i hver fluoroforkolonne, og skriv inn Enter: CD45 for PerCP-Cy5.5; CD19 for BV421; CD11b for Alexa Fluor 700; B220 for PE; og levende død for Zombie Aqua.
- Klikk Neste to ganger for å gå til Anskaffelse-fanen . I Hendelser som skal registreres i eksperimentgruppen skriver du inn 10 000 000 og i samme felt for referansegruppelinjen type 200 000. Klikk Lagre og åpne. De andre innstillingene skal forbli som standard, Stopptid til 10 000 og Stoppvolum til 3 000.
- Klikk på Instrumentkontroll nederst til venstre. Sett spenning til FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Velg deretter Anskaffelseskontroll. For alternativet Strømningshastighet velger du Høy fra rullegardinmenyen.
- Få referanseprøver med et cytometer og unmix i programvare.
- Vortex det ufargede hjerterøret og plasser det sikkert på prøveinjeksjonsporten (SIP). Kontroller at den grønne indikatorpilen peker mot riktig prøve, og klikk deretter på Start i kontrollpanelet for anskaffelse i cytometerprogramvaren og vent til hendelsene er registrert. Gjør det samme for Live-dead-farget hjertevev.
- Velg Opphev miksing-menyen , og angi følgende kontroller:
- Merk av i avmerkingsboksene for PE, PerCP-Cy5.5, BV421 og Alexa Fluor 700 i kolonnen fra biblioteket. Forsikre deg om at Zombie Aqua ikke er merket av i samme kolonne. Nederst, sjekk alternativet Autofluorescence som en fluorescerende tag.
- Klikk Neste for å gå videre til fanen Identifiser positive/negative populasjoner . I denne kategorien vises et plott av FSC-A vs. SSC-B-A. Klikk og dra punktene i polygonen for å velge et område mellom 1,0 M og 4,0 M på FSC-A-aksen, og mellom 0,2 M og 3,0 M på SSC-B-A-aksen.
- I neste plott til høyre vises V5-A på X-aksen. Flytt portene for å velge halvparten av toppen helt til høyre som positiv og en region på venstre side av tomten som negativ. I plottet med tittelen Referansegruppe - Unstained, velg en populasjon i et lignende område. For dette må det uberørte ikke noe positivt-negativt settes.
- Oppnå eksperimentelle prøver.
- For hvert rør som inneholder en prøve for en individuell mus, virvle røret og plasser det sikkert på SIP. Kontroller at den grønne indikatorpilen peker mot riktig prøve, klikk deretter på Start i kontrollpanelet i cytometerprogramvaren, og vent til hendelsene er registrert.
- Gating strategi.
- Velg kategorien Standard ublandet regneark . Opprett et FSC-A vs. SSC-A-plott ved hjelp av Punktplott-verktøyet øverst. Velg hendelser som er høyere enn 0,4 M på FSC-A-aksen og høyere enn 0,8 M på SSC-A-aksen ved hjelp av mangekantmarkeringsverktøyet. Dobbeltklikk i dette valget og et nytt plott vises.
- Fra det nyopprettede plottet høyreklikker du på X-akseetiketten og velger AF-A; høyreklikk på Y-akseetiketten og velg Levende død flekk. Klikk på rektangelmarkeringsverktøyet øverst og velg alle hendelsene under 105 på live-dead-aksen som tilsvarer det nedre live-dead-signalet. Dobbeltklikk i dette valget og et nytt plott vises.
- I det nye plottet høyreklikker du for å velge PerCP-Cy5.5-A for X-aksen og SSC-A for Y-aksen . Bruk rektangelmarkeringsverktøyet til å merke hendelsene som er høyere enn 104 på PerCP-Cy5.5-A-aksen som tilsvarer CD45-positive celler. Dobbeltklikk på utvalget og et nytt plott vises.
- På det nye plottet høyreklikker du for å velge FSC-A for X-aksen og FSC-H for Y-aksen . Bruk mangekantmarkeringsverktøyet til å velge hendelsene som følger en trend der FSC-A-verdien og SSC-A-verdien er de samme. med dette vil celledublettene bli fjernet, og populasjonen i utvalget vil bli referert til som CD45+-populasjonen. Dobbeltklikk på utvalget for å vise et nytt plott med CD45+-populasjonen.
- Fra populasjonsplottet CD45+ høyreklikker du for å velge BV421 på X-aksen kontra SSC-A på Y-aksen. Bruk mangekantmarkeringsverktøyet til å merke populasjonen til høyre på BV421-aksen . Dette er B-cellepopulasjonen. Dobbeltklikk to ganger i denne populasjonen for å opprette to nye plott med B-cellepopulasjonen.
- Høyreklikk for å konfigurere det første B-celleplottet med PE-A på X-aksen og BV421-A på Y-aksen. Populasjonen til høyre tilsvarer de intravaskulære B-cellene, og populasjonen til venstre representerer de interstitielle B-cellene. Bruk mangekantverktøyet til å velge begge deler.
- Høyreklikk for å sette opp det andre B-celleplottet med Alexa Fluor 700-A på X-aksen og SSC-A på Y-aksen . Populasjonen til venstre tilsvarer CD11b-cellene, og hendelsene til høyre (hvis noen) tilsvarer CD11b+-cellene.
- Høyreklikk på hvert valg, og klikk deretter Gate Properties. Klikk på Antall og % foreldre for å vise størrelser og prosenter. Registrer antall hendelser og prosentandeler for videre dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når innsamlingen er fullført og alle hendelsene er samlet inn, skal dataene analyseres i henhold til standard flowcytometripraksis. Fokuset på analysen vil variere avhengig av det individuelle målet for hvert eksperiment. I dette tilfellet ble kvantifisering av intravaskulære og ekstravaskulære B-celler forfulgt, og det ble uttrykt som antall celler per mg vev.
Når du bruker et spektralt cytometer, anbefales det å starte analysen med en innledende gating for å fjerne rusk med størrelser som ikke er i et område som tilsvarer immunceller, etterfulgt av fjerning av det levende døde flekken + -signalet. Dette gjør det mulig å påvise en ren populasjon av CD45-positive celler tilsvarende leukocytter (figur 1). Etter fjerning av dubletter, i et naivt ubesudlet hjerte, forventes det at ca. 20% av CD45+-cellene vil være CD19+ B-celler (figur 2A, 18,1% B-celler i dette representative eksperimentet). Av disse cellene er i gjennomsnitt 5,5% lokalisert i interstitialrommet, mens 94,5% befinner seg i det intravaskulære rommet (figur 2B). Fra hele B-cellepopulasjonen som finnes i hjertet, tilsvarer bare ca. 1,6% B1-celler basert på overflatemarkøren CD11b (som vanligvis anses som tilstrekkelig til å klassifisere en murine CD19+-celle som en B1-celle med høy grad av konfidens 1,34,35), og de andre 98,4% tilsvarer B2-celler (figur 2C).
Figur 1: Flowcytometri gating strategi brukt til å oppdage og karakterisere myokardassosierte B-celler. (A) FSC-A vs. SSC-A: Plottet viser alle hendelsene samlet, og det valgte området er tegnet for å berike analysen med hendelser som er i størrelsesområdet for leukocytter. (B) Autofluorescens vs. levende-død farging: Det valgte området tilsvarer det nedre levende-døde signalet. Porten som trekkes fjerner døde celler og noen andre cellerester som binder seg til den levende døde fargingen. (C) CD45-signal vs. SSC-A: Det valgte området tilsvarer CD45+-cellene (dvs. myokardiale leukocytter). (D) FSC-A vs. FSC-H: Denne porten er trukket for å fjerne celledubletter (ikke-valgte hendelser). (E) CD19-signal vs. SSC-A: Det valgte området tilsvarer myokardiale B-celler. (F) B220 vs. CD19: Området inne i den svarte firkanten tilsvarer de intramyokardiale B-cellene (CD19+, B220-), og området inne i den røde firkanten tilsvarer den intravaskulære B-cellepopulasjonen. (G) CD11b vs. SSC-A: Området inne i den svarte sirkelen tilsvarer CD11b+ (B1-celler), og området inne i den røde sirkelen tilsvarer CD11b- (B2-cellene). Prosentsatsene som vises i hvert panel, representerer den gjennomsnittlige prosentdelen som populasjonen som vises, representerer fra foreldrepopulasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative plott som rapporterer gjennomsnittlig antall B-celler per milligram myokardvev. (A) Gjennomsnittlig antall CD45+- og CD19+-celler/mg murine myokardvev. Prosentandelen som vises, tilsvarer prosentandelen av celler fra foreldrepopulasjonen (CD45+). (B) Gjennomsnittlig antall CD19+-celler og prosentandelen av B-cellene som er i det interstitielle (ekstravaskulære) rommet i intravaskulære rom. (C) Absolutt antall og prosentandel av myokardiale B-celler som uttrykker markører for B1- eller B2-celler. Feilfelt tilsvarer standardfeilen til gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1 Denne tabellen inneholder løsningene og reagensene som trengs for prosedyren. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En økende mengde bevis indikerer at B-celler spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardfysiologi og myokardremodellering / tilpasning til skade 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometri er et utmerket verktøy for å studere immuncellepopulasjoner i ethvert vev og nesten et obligatorisk verktøy for enhver studie som fokuserer på B-celler i hjertet.
Den fremvoksende litteraturen om B-celler og hjertet rapporterer allerede kontrasterende funn på svært grunnleggende aspekter, for eksempel antall B-celler i hjertet og endringer i hjerteinfarkt B-cellenummer med skade. B-celler har blitt rapportert som den mest utbredte immuncellen i gnagerhjerter7. Imidlertid evaluerte andre studier deres relative prevalens sammenlignet med andre myeloide celler og viste markant lavere tall26,27. Pinto et al.26 fant at B-celler utgjorde rundt 9% av de totale leukocyttene, mens Yu et al.27 rapporterte 10%. Adamo et al.7 rapporterte at gjennomsnittlig prosentandel av B-celler i forhold til leukocyttall var rundt 20%, noe som er svært nær 18,1% rapportert i dette manuskriptet. Andre studier har rapportert at B-celler har svært lav forekomst i myokard28.
Flere kritiske eksperimentelle trinn kan forklare variasjonene i B-celletall rapportert i litteraturen. Forskjeller i perfusjon av hjertet, vevsreduksjon og fordøyelse kan nemlig påvirke antall B-celler som gjenvinnes per mg hjertevev. Perfusjon med buffere som inneholder kalsiumchelaterende midler og ikke kalsium, eller perfusjon med høyere volum eller perfusjonshastighet, kan løsne B-cellene festet til endotelet og redusere gjenvinningsutbyttet. Overdreven finvevsreduksjon kan føre til overfordøyelse av vevet og tap av cellens levedyktighet. En reduksjon i cellens levedyktighet kan også være et resultat av fordøyelse i lengre tid eller med høyere enzymkonsentrasjoner.
Prosentandelen CD45+-celler som tilsvarer B-celler, kan ligge i et område mellom 15%-30% i en villmus. Avhengig av musestammen som brukes, alderen og den genetiske bakgrunnen, kan denne verdien variere. Prosentandelen bør imidlertid forbli lik i den studerte gruppen. Stor variasjon i antall og prosentandel av B-celler mellom mus som tilhører samme gruppe antyder at en eksperimentell feil kan oppstå. Lave prosentandeler kan indikere et overskudd i perfusjonsstyrke og tid. Global reduksjon i CD45+-celler kan tyde på at vevet blir overfordøyd.
Protokollen beskrevet her er optimalisert for å gi et konsistent utbytte av B-celler fra fordøyd murine hjerte og for å tillate diskriminering av intravaskulære vs ekstravaskulære B-celler6. Diskriminering av intravaskulære vs. ekstravaskulære B-celler oppnås ved intravaskulær injeksjon av et antistoff umiddelbart før ofring. Antistoffet injisert intravaskulært diffunderer lett gjennom hele vaskulaturen og møter alle de intravaskulære B-cellene. Hvis dyret ofres raskt nok og hjertet høstes omgående, har antistoffet ikke tid til å diffundere i det ekstravaskulære rommet og flekke ekstravaskulære B-celler. Siden tiden mellom intravaskulær injeksjon av antistoffet og organhøsting er kritisk, anbefales det å inokulere med antistoffet og samle ett enkelt musehjerte om gangen. Intravaskulær injeksjon av antistoffer kan utelates dersom diskriminering av intravaskulære vs. ekstravaskulære B-celler ikke er av interesse. Gating-strategien som vises i figur 1 vil forbli den samme bortsett fra det siste trinnet, noe som ikke ville være mulig på grunn av mangel på B220-merking. Avhengig av eksperimentell design, kan enhver fluorofor fra panelet som vises, endres til en farge som passer til panelet som brukes. Det er også viktig å vurdere at valget av overflatemarkørene kan endres i henhold til behovene til gruppen som utfører det; For eksempel, hvis det i eksperimentell design antas at CD11b-uttrykk på B1-celler kan reduseres, anbefales tillegg av forskjellige markører, for eksempel IgM, IgD og CD537.
Vær oppmerksom på at det kan være nødvendig å behandle et hjerte bare for å kjøre kompensasjonskontroller for flowcytometri. Dette anbefales første gang eksperimentet optimaliseres. I de følgende forsøkene kan det være tilstrekkelig å lagre noe vev i øyeblikket av hjerteinnsamling, da det vil gi tilstrekkelige celler til å kjøre en negativ "unstained" kontroll og en positiv "levende-død" flekkkontroll. Individuelle kontroller for de andre fargene kan enten importeres fra tidligere eksperimenter eller genereres ved hjelp av perler.
Noen trinn i protokollen kan endres uten å endre resultatene av eksperimentet. For eksempel kan anestesimetoden endres for en foretrukket, avhengig av forskerens erfaring; Bruk av isofluran i stedet for 2,2,2-tribromoetanol kan redusere tiden mellom anestesiadministrasjon og hjerteinnsamling. Perfusjonen av hjertet kan også gjøres manuelt uten bruk av en sprøytepumpe så lenge den utføres sakte, forsiktig og konsekvent.
Til tross for den nøyaktige utførelsen av protokollen, kan uerfarne operatører støte på høy variabilitet mellom prøver innenfor samme eksperimentelle økt eller mellom forskjellige eksperimentelle økter. Basert på erfaring forsvinner denne variasjonen når forskeren har hatt muligheten til å bli fullt kjent med arbeidsflyten. Det anbefales derfor at alle som ønsker å implementere denne protokollen vurderer reproduserbarheten i to til tre prøvekjøringer før de samler inn viktige data om sine forskningsprosjekter.
Oppsummert vurderer eksisterende metoder for å isolere immunceller fra hjertet og analysere dem via flowcytometri vanligvis ikke immunsystemets evne til å feste seg til endotelet, og enten ikke standardisere perfusjon eller implementere omfattende perfusjon, med antagelsen om at enhver immuncelle i det intravaskulære rommet er en forurensning som må renses. Dette ignorerer forestillingen om at intravaskulære immunceller som er festet til endotelet har biologisk relevans. Protokollen som presenteres her er optimalisert for å maksimere utvinningen av myokardimmunceller med spesiell oppmerksomhet på myokardiale B-celler, intravaskulære og ekstravaskulære. Vi forventer at denne protokollen vil være av interesse for alle de forskerne som jobber innen hjerteimmunologi og er interessert i å utforske funksjonen som B-celler kan spille i friske og skadede hjerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Luigi Adamo er medstifter av i-Cordis, LLC, et selskap fokusert på utvikling av immunmodulerende molekyler for behandling av hjertesvikt, med en spesiell interesse for derivater av B-cellemodulerende legemiddel pirfenidon. De resterende forfatterne har ingen konflikter å erklære.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av NHLBI-tilskudd 5K08HLO145108-03 og 1R01HL160716-01 tildelt Luigi Adamo.
Aurora Flow Cytometer som ble brukt til å utvikle denne studien ble finansiert av NIH Grant S10OD026859. Vi anerkjenner støtten fra JHU Ross Flow Cytometry Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
- Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
- Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
- Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
- Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
- Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
- Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
- Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
- Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
- Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
- Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
- Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
- Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
- Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
- Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
- Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
- Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
- Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
- Ludwig, R. J., et al.
- Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
- Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
- Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
- Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
- Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
- Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
- Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
- Pinto, A. R., et al.
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
- Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
- Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
- Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).
