Summary
Aquí presentamos un protocolo para la cuantificación y diferenciación de linfocitos B miocárdicos en función de su ubicación en el espacio intravascular o endotelial mediante citometría de flujo.
Abstract
Un creciente cuerpo de evidencia muestra que los linfocitos B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la adaptación miocárdica a la lesión. Sin embargo, la literatura informa datos contrastantes sobre la prevalencia de las células B del miocardio. Se ha informado que las células B se encuentran entre las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores o que están presentes, pero con una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides, o que son bastante raras. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado. La implementación de un método compartido y reproducible para evaluar la prevalencia de las células B miocárdicas es fundamental para armonizar las observaciones de diferentes grupos de investigación y, por lo tanto, promover el avance del estudio de las interacciones miocárdicas de las células B. Según nuestra experiencia, las observaciones aparentemente contrastantes reportadas en la literatura probablemente se derivan del hecho de que las células B miocárdicas murinas son en su mayoría intravasculares y están conectadas al endotelio microvascular. Por lo tanto, el número de células B recuperadas de un corazón murino es exquisitamente sensible a las condiciones de perfusión utilizadas para limpiar el órgano y al método de digestión utilizado. Aquí informamos de un protocolo optimizado que da cuenta de estas dos variables críticas de una manera específica. Este protocolo permite el análisis reproducible basado en citometría de flujo del número de células B miocárdicas murinas y permite a los investigadores distinguir las células B miocárdicas extravasculares de las intravasculares.
Introduction
Los linfocitos B son células inmunes altamente especializadas que desempeñan un papel importante en las respuestas inmunes adaptativas e innatas1. Hay dos poblaciones principales de células B: una población más pequeña de células B1 que se producen principalmente durante la vida embrionaria, y una población preponderante de células B2 que se producen en la vida adulta en la médula ósea1. Después de madurar en la médula ósea, las células B migran a los órganos linfoides primarios y secundarios. Desde allí recirculan continuamente entre los órganos linfoides viajando a través de los vasos sanguíneos y linfáticos2. Las células B expresan anticuerpos específicos en su superficie, que funcionan como receptores. Cuando las células B encuentran un antígeno que se une a su receptor, se puede activar una señal de activación. Las células B activadas migran al tejido donde se encontró el antígeno o regresan a la médula ósea, donde pueden madurar y convertirse en células plasmáticas productoras de anticuerpos 3,4.
Recientemente, se ha apreciado que el corazón alberga una población considerable de células B. Estudios en roedores han demostrado que las células B colonizan el corazón temprano durante el desarrollo embrionario5, y que las células B asociadas al miocardio son en su mayoría células B2 intravasculares, ingenuas, adheridas al endotelio6,7, con un pequeño porcentaje de células B17. Todavía hay muchas áreas de incertidumbre, pero los datos disponibles indican que las células B desempeñan un papel importante tanto en el corazón ingenuo como en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión.
Los estudios en el corazón murino naïve han demostrado que, al inicio del estudio, las células B miocárdicas se encuentran principalmente en el espacio intravascular, adheridas al endotelio (se encontró que el >95% de las células B cardíacas murinas se encontraban en el espacio intravascular). Se encontró que estas células B tienen patrones de expresión génica diferentes de los de las células B circulantes aisladas de la sangre periférica. El análisis de corazones ingenuos de animales deficientes en células B y controles singénicos encontró que los animales que carecían de células B tenían corazones más pequeños y una mayor fracción de eyección6. Toda esta evidencia sugiere que las células B podrían modular el crecimiento miocárdico y / o la función miocárdica, y que no solo las células B intersticiales sino también las intravasculares podrían ser responsables de tales observaciones. También se encontró que las células B modulan el fenotipo de los macrófagos residentes del miocardio8.
Varios estudios han demostrado que las células B juegan un papel importante en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión 8,9,10,11,12,13. Las células B se acumulan transitoriamente en el corazón lesionado, probablemente a través de un mecanismo dependiente de CXCL13-CXCR511,13. A partir de ahí, las células B promueven la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos que incluyen el reclutamiento de monocitos mediados por citoquinas 9,12. Además, las células B pueden producir anticuerpos contra proteínas cardíacas que pueden promover la extensión del daño cardíaco y la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Las células B también pueden ejercer efectos protectores sobre el corazón lesionado a través de la secreción de IL-1010.
A medida que crece el número de grupos que investigan el papel de las células B en el corazón ingenuo y lesionado, cada vez es más importante definir protocolos compartidos para cuantificar y evaluar adecuadamente las células B del miocardio y así evitar inconsistencias que ya han comenzado a aparecer en la literatura. Hasta ahora, se ha informado que las células B son una de las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores7 y están presentes en una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides26,27, o que son bastante raras 28. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda 7,9,13, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado29. Los estudios sobre las células inmunes cardíacas rara vez dan detalles sobre las condiciones de perfusión y no hay consenso sobre las condiciones de digestión. Dado que en el corazón de roedor una gran proporción de células B son intravasculares y la extracción de células inmunes del miocardio depende en gran medida del método de digestión utilizado, las diferencias reportadas en la literatura podrían ser el resultado de diferencias en la perfusión de órganos y la digestión de tejidos.
Aquí se presenta un método detallado para la cuantificación basada en citometría de flujo de células B miocárdicas murinas que maximiza el rendimiento de la recuperación de células B al optimizar las condiciones de perfusión y digestión y permite la discriminación de células B miocárdicas intravasculares vs. extravasculares6. Este protocolo es una adaptación y optimización de otros protocolos similares que distinguen entre células inmunes intravasculares e intersticiales 28,30,31.
En este protocolo, estandarizamos la perfusión miocárdica para eliminar las células B que flotan en el espacio intravascular sin eliminar las células B biológicamente relevantes adheridas al endotelio microvascular. Además, basándonos en protocolos previos que han descrito el uso de inyección intravenosa de anticuerpos para distinguir las células inmunes intravasculares de las intersticiales32, y aprovechando el hecho de que las células B expresan el marcador de superficie B22033, demostramos cómo distinguir las células B miocárdicas intravasculares frente a las extravasculares a través de la inyección intravascular de un anticuerpo específico B220 inmediatamente antes del sacrificio del animal y la perfusión cardíaca. Este protocolo es relevante para la investigación de cualquier científico interesado en incluir el análisis de células B miocárdicas en el corazón ingenuo y lesionado. La implementación generalizada de este protocolo reducirá las inconsistencias entre los grupos de investigación, permitirá el análisis de los cambios en los grupos de células B miocárdicas intravasculares y extravasculares y, por lo tanto, reforzará el avance de los descubrimientos en el campo de la inmunología cardíaca.
En resumen, el protocolo representa un flujo de trabajo optimizado para cuantificar y analizar las células B del miocardio a través de la citometría de flujo, y al mismo tiempo distinguir entre las células ubicadas en el espacio extravascular y el espacio intravascular.
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Protocol
Todos los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron con la aprobación del IACUC en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins.
1. Preparativos
- Prepare el búfer del sistema de control de los bienes sobre el terreno, como se describe en el cuadro 1.
- Asegúrese de que haya suficienteCO2 para sacrificar a los animales.
- Prepare el espacio de disección (coloque la almohadilla de banco y coloque la cinta y las herramientas de disección cerca).
- Etiquete los tubos de 15 ml, coloque 3 ml de HBSS con calcio y magnesio en cada tubo (consulte la Tabla de materiales) y colóquelos en hielo (un tubo por corazón y uno adicional para el grupo de referencia/controles de citometría de flujo). Además, llene las placas de Petri pequeñas (35 mm) con HBSS.
- Encienda el agitador con control de temperatura, configúrelo a 37 °C y enfríe previamente la centrífuga a una temperatura de 4 °C.
- Prepare la bomba de jeringa y ajuste el caudal a 3 ml/min. Llene una jeringa de 20 ml con HBSS, prepare la línea de tubos con tampón y elimine cualquier burbuja.
2. Tinción intravascular de células B (in vivo)
- Pesar un ratón macho de 12 semanas de edad de la cepa C57BL/6J. Cargue una jeringa de insulina de 3/10 cc con 100 μL de dilución de anticuerpos B220 (1:10, en PBS). Cubra la jeringa con papel de aluminio para protegerla de la luz.
- Anestesiar a un ratón.
- Aplicar una inyección intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol al 2% con una dosis de 400 mg/kg y esperar 10-20 min.
NOTA: Controle la respiración y el movimiento del ratón. Una vez que el ratón deja de moverse, estimule el dolor pellizcando el dedo del pie; La ausencia de un reflejo de abstinencia indica una anestesia adecuada. - Si no se logra una anestesia adecuada en el transcurso de 20 min, se puede administrar una dosis adicional de anestésico a 100 mg / kg, y se debe realizar una evaluación de la cinética del ratón, el reflejo de abstinencia y la respiración cada 5 minutos.
- Aplicar una inyección intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol al 2% con una dosis de 400 mg/kg y esperar 10-20 min.
- Coloque el mouse en el banco de laboratorio en una almohadilla inclinada hacia un lado, tire suavemente hacia abajo de la piel de la espalda y presione ligeramente el cuerpo contra el banco para que el ojo sobresalga.
- Inyecte el anticuerpo B220 diluido del paso 2.1 mediante inyección retroorbitaria.
- Introducir la jeringa en el ojo a 45° del plano sagital de la cabeza del ratón. Inyecte lentamente la solución. Si se siente resistencia, retire la jeringa y vuelva a entrar. Espere 2 min.
NOTA: El tiempo de incubación prolongado pondría en peligro la capacidad de discriminar las células B intravasculares frente a las extravasculares, ya que daría tiempo al anticuerpo inyectado para difundirse fuera de la vasculatura.
- Introducir la jeringa en el ojo a 45° del plano sagital de la cabeza del ratón. Inyecte lentamente la solución. Si se siente resistencia, retire la jeringa y vuelva a entrar. Espere 2 min.
- Eutanasia del ratón según las regulaciones de IACUC.
- Abra el flujo deCO2 a la cámara de eutanasia a una velocidad de 0,5 L / min, o el caudal recomendado según el tamaño de su cámara.
- Coloque el ratón en la cámara durante el tiempo recomendado, asegurándose de que ya no respira. Retirarlo y realizar la luxación cervical como método secundario de eutanasia.
- Una vez que el ratón es sacrificado, proceda rápidamente a la sustracción de órganos y la perfusión.
3. Colección de corazones
- Abertura del pecho.
- Sostenga la piel del ratón con fórceps en el área epigástrica. Haga una abertura de 2 mm en la piel con tijeras y use los fórceps para pelar la piel para revelar la capa de fascia, una capa translúcida brillante, del pecho y el abdomen. Corte en el epigastrio a través de la fascia y el peritoneo para abrir la pared abdominal y revelar el proceso xifoide. Sujete el proceso xifoide con pinzas hemostáticas.
- Con las tijeras, haga un corte vertical a través de la pared torácica al nivel de la línea clavicular media a cada lado y levante la pared torácica anterior para revelar el contenido del mediastino, utilizando fórceps hemostáticos como peso para mantener la abertura.
- Perfusión y extracción del corazón.
- Con fórceps, elimine cualquier grasa o tejido tímico que rodee el corazón.
- Sostenga la aorta de forma segura desde atrás con fórceps. Introduzca la aguja de la jeringa (25 G) en el ápice del corazón. Perfundir con 3 mL de HBSS a una velocidad de 3 mL/min.
NOTA: Monitoree la perfusión. El hígado debe llenarse y la sangre en los vasos coronarios debe eliminarse por completo. Se recomienda el uso de una bomba de jeringa calibrada a 1 ml / minuto para mantener un flujo constante. - Cortar la aorta con tijeras y sacar el corazón. Lave el corazón en la placa de Petri con HBSS para eliminar cualquier resto de sangre. Usando tijeras y fórceps, retire la grasa, el tejido conectivo y el timo, y seque el corazón. Pese el corazón aislado y anote el peso en miligramos. Picar el corazón a temperatura ambiente en trozos pequeños (1-2 mm) con una cuchilla.
NOTA: Los corazones de ratón adultos pueden pesar entre 0.090-0.210 mg. - Mida la masa de tejido cardíaco y coloque 60 mg del corazón picado para digerir en un tubo de 15 ml con 3 ml de HBSS. Retener el tejido cardíaco restante y colocarlo en un tubo etiquetado como "Tejido de control de referencia"; Esto se utilizará para el control de compensación para señales vivas muertas y autofluorescencia.
4. Digestión del corazón y tinción celular
- Agregue enzimas a cada tubo que contenga tejido picado (ver Tabla 1). Agregue 0.5 μL/mg de DNasa 1 (300 unidades para 60 mg de tejido cardíaco), 0.5 μL/mg de colagenasa II (625 unidades para 60 mg de tejido cardíaco) y 0.2 μL/mg de hialuronidasa (50 unidades para 60 mg de tejido cardíaco) al tubo.
- Coloque la reacción de digestión en el agitador durante 30 minutos a 300 rpm. Ajuste la rejilla agitadora a unos 25° de inclinación.
- Añadir 7 ml de HBSS a cada uno de los tubos de reacción de 15 ml y centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C con la aceleración y la ruptura ajustadas a moderadas o lentas. Decantar el sobrenadante y resuspender cada gránulo en 5 ml de tampón de lisis ACK para eliminar los glóbulos rojos. Incubar en el tampón de lisis ACK durante 5 min a temperatura ambiente.
- Agregue 10 ml de PBS a cada tubo, mezcle y luego filtre en un tubo de 50 ml con un filtro de 40 μm. Asegúrese de que todos los residuos estén dentro de la cámara del filtro. Aplaste cualquier residuo en el filtro con un émbolo de jeringa hasta que esté completamente suspendido dentro de la cámara del filtro.
- Agregue PBS a través del filtro hasta que el volumen alcance los 25 ml por corazón; Esto permitirá que las celdas suspendidas pasen a través del filtro. Agregue 25 ml adicionales de PBS al tubo de tejido de control de referencia y divida el volumen en diferentes tubos (25 ml cada uno). Etiquete uno de los tubos como "Sin manchas" y el otro como "Vivo-muerto". Centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C.
NOTA: En este punto, prepare la dilución para la tinción de muertos vivos (dilución: 1:500 en 1x PBS). - Decantar el sobrenadante, resuspender el pellet en el tubo sin teñir en 100 μL de PBS y cada uno de los otros pellets en 100 μL de la dilución de tinción de muertos vivos. Incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad, cubriendo el cubo de hielo con papel de aluminio.
- Añadir 500 μL de tampón FACS a cada muestra y transferirlo a un tubo FACS marcado a través de un filtro de 40 μm. Centrifugar los tubos FACS a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en 500 μL de tampón FACS.
- Añadir 50 μL de solución bloqueadora Fc (ver Tabla 1) a cada tubo, excepto para los tubos sin teñir y muertos vivos. Mezclar e incubar durante 5 min.
- Agregue 50 μL de solución de mezcla de anticuerpos (ver Tabla 1) a cada tubo, excepto los tubos sin teñir y muertos vivos, e incubar durante 30 minutos en la oscuridad, cubriendo el cubo de hielo con papel de aluminio.
- Añadir 2 ml de tampón FACS a cada tubo y centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y resuspender en 300-500 μL de tampón FACS.
5. Citometría de flujo
- Configure los ajustes de control del instrumento.
NOTA: En este protocolo la muestra se analiza con un citómetro de flujo Cytek Aurora de 4 láseres. Otro citómetro de flujo apropiado podría usarse para detectar los marcadores de interés.- Abra el software de control del instrumento (consulte Tabla de materiales). En la parte superior de la ventana, seleccione la pestaña Adquisición y haga clic en Nuevo +. Aparecerá una ventana llamada Crear nuevo experimento .
- En la sección Biblioteca, en el campo Tipo para filtrar, escriba PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 y Zombie Aqua, haga clic en Agregar después de escribir cada uno. Los nombres de los fluoróforos deben verse a la derecha. A continuación, haga clic en Siguiente para pasar a la pestaña Grupo .
- En la pestaña Grupo , haga clic en el símbolo con un tubo para agregar el corazón para el análisis.
- Haga clic en el grupo + Referencia y aparecerá una ventana. En la columna de etiqueta fluorescente, seleccione Zombie Aqua y, en la columna de tipo de control, seleccione Celdas y, a continuación, haga clic en Guardar.
- Haga clic en la pestaña Siguiente > Marcadores ; Se mostrará una tabla con los nombres de los fluoróforos. Escriba el marcador de celda correspondiente en la primera fila de cada columna de fluoróforos y escriba Entrar: CD45 para PerCP-Cy5.5; CD19 para BV421; CD11b para Alexa Fluor 700; B220 para PE; y muertos vivientes para Zombie Aqua.
- Haga clic en Siguiente dos veces para ir a la pestaña Adquisición . En Eventos para registrar del grupo de experimento, escriba 10.000.000 y en el mismo campo para la línea del grupo de referencia escriba 200.000. Haga clic en Guardar y abrir. Las otras configuraciones deben permanecer como predeterminadas, Tiempo de detención a 10.000 y Detención de volumen a 3.000.
- En la parte inferior izquierda, haga clic en Control de instrumentos. Ajuste el voltaje a FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. A continuación, seleccione Control de adquisición. Para la opción Caudal , seleccione Alto en el menú desplegable.
- Adquiera muestras de referencia con un citómetro y desmezcle en software.
- Vortex el tubo cardíaco sin teñir y colóquelo firmemente en el puerto de inyección de la muestra (SIP). Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta, luego haga clic en Inicio en el panel Control de adquisición del software del citómetro y espere hasta que se registren los eventos. Haga lo mismo para el tejido cardíaco manchado de muertos vivos.
- Seleccione el menú Desmezclar y defina los siguientes controles:
- Seleccione las casillas de verificación de PE, PerCP-Cy5.5, BV421 y Alexa Fluor 700 en la columna de la biblioteca. Asegúrese de que Zombie Aqua no esté marcado en la misma columna. En la parte inferior, marque la opción de Autofluorescencia como etiqueta fluorescente.
- Haga clic en Siguiente para ir a la pestaña Identificar poblaciones positivas/negativas . En esta pestaña, se mostrará un gráfico de FSC-A vs. SSC-B-A. Haga clic y arrastre los puntos del polígono para seleccionar un área entre 1,0 M y 4,0 M en el eje FSC-A, y entre 0,2 M y 3,0 M en el eje SSC-B-A.
- En el siguiente gráfico a la derecha, V5-A se mostrará en el eje X. Mueva las puertas para seleccionar la mitad del pico en el extremo derecho como positivo y una región en el lado izquierdo de la gráfica como negativa. En la gráfica titulada Grupo de referencia - Sin teñir, seleccione una población en un rango similar. Para esto no se tiene que establecer lo no manchado positivo-negativo.
- Adquirir muestras experimentales.
- Para cada tubo que contenga una muestra para un ratón individual, voltice el tubo y colóquelo firmemente en el SIP. Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta, luego haga clic en Inicio en el panel Control de adquisición del software del citómetro y espere hasta que se registren los eventos.
- Estrategia de compuertas.
- Seleccione la pestaña Hoja de cálculo predeterminada sin mezclar . Cree un gráfico FSC-A vs. SSC-A utilizando la herramienta Diagrama de puntos en la parte superior. Seleccione eventos superiores a 0,4 M en el eje FSC-A y superiores a 0,8 M en el eje SSC-A mediante la herramienta de selección de polígonos. Haga doble clic en esta selección y se mostrará un nuevo gráfico.
- En el gráfico recién creado, haga clic con el botón derecho en la etiqueta del eje X y seleccione AF-A; haga clic con el botón derecho en la etiqueta del eje Y y seleccione Mancha de muertos vivos. Haga clic en la herramienta de selección de rectángulo en la parte superior y seleccione todos los eventos por debajo de 105 en el eje de muertos vivos que correspondan a la señal de muertos vivos inferior. Haga doble clic en esta selección y se mostrará un nuevo gráfico.
- En la nueva gráfica, haga clic con el botón derecho para seleccionar PerCP-Cy5.5-A para el eje X y SSC-A para el eje Y. Con la herramienta de selección de rectángulos, seleccione los eventos superiores a 104 en el eje PerCP-Cy5.5-A que correspondan a las células CD45 positivas. Haga doble clic en la selección y se mostrará un nuevo gráfico.
- En el nuevo gráfico, haga clic con el botón derecho para seleccionar FSC-A para el eje X y FSC-H para el eje Y. Utilizando la herramienta de selección de polígonos, seleccione los eventos que siguen una tendencia en la que el valor FSC-A y el valor SSC-A son los mismos; con esto se eliminarán los dobletes celulares y la población en la selección se denominará población CD45+. Haga doble clic en la selección para mostrar una nueva gráfica con la población CD45+.
- En la gráfica de población CD45+, haga clic con el botón derecho para seleccionar BV421 en el eje X frente a SSC-A en el eje Y. Con la herramienta de selección de polígonos, seleccione la población a la derecha en el eje BV421 . Esta es la población de células B. Haga doble clic dos veces en esta población para crear dos nuevas gráficas con la población de células B.
- Haga clic con el botón derecho para configurar la primera gráfica de células B con PE-A en el eje X y BV421-A en el eje Y. La población de la derecha corresponde a las células B intravasculares, y la población de la izquierda representa las células B intersticiales. Utilice la herramienta de selección de polígonos para realizar una selección de ambos.
- Haga clic derecho para configurar la segunda gráfica de células B con Alexa Fluor 700-A en el eje X y SSC-A en el eje Y. La población de la izquierda corresponde a las células CD11b-, y los eventos a la derecha (si los hay) corresponden a las células CD11b+.
- Haga clic con el botón derecho en cada selección y, a continuación, haga clic en Propiedades de la puerta. Haga clic en Count y % Parent para mostrar los tamaños y porcentajes. Registre el número de eventos y porcentajes para un análisis posterior de los datos.
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Representative Results
Una vez que se completa la adquisición y se recopilan todos los eventos, los datos deben analizarse de acuerdo con la práctica estándar de citometría de flujo. El enfoque del análisis variará dependiendo del objetivo individual de cada experimento. En este caso, se buscó la cuantificación de células B intravasculares y extravasculares, y se expresó como el número de células por mg de tejido.
Cuando se utiliza un citómetro espectral, se recomienda comenzar el análisis con una activación inicial para eliminar los residuos con tamaños que no están en un rango correspondiente a las células inmunes, seguido de la eliminación de la señal de tinción muerta viva +. Esto permite la detección de una población limpia de células CD45 positivas correspondientes a leucocitos (Figura 1). Después de la eliminación de dobletes, en un corazón ingenuo no lesionado, se espera que alrededor del 20% de las células CD45+ sean células B CD19+ (Figura 2A, 18,1% de células B en este experimento representativo). De estas células, en promedio el 5,5% se localizan en el espacio intersticial, mientras que el 94,5% se localizan en el espacio intravascular (Figura 2B). De toda la población de células B encontrada en el corazón, solo alrededor del 1,6% corresponde a células B1 basadas en el marcador de superficie CD11b (que generalmente se considera suficiente para clasificar una célula CD19+ murina como una célula B1 con un alto grado de confianza 1,34,35), y el otro 98,4% corresponde a células B2 (Figura 2C).
Figura 1: Estrategia de activación por citometría de flujo utilizada para detectar y caracterizar células B asociadas al miocardio. (A) FSC-A vs. SSC-A: El gráfico muestra todos los eventos recopilados, y el área seleccionada se dibuja para enriquecer el análisis con eventos que están en el rango de tamaño de los leucocitos. (B) Autofluorescencia vs. tinción de muertos vivos: El área seleccionada corresponde a la señal de muerte viva inferior. La puerta dibujada elimina las células muertas y algunos otros restos celulares que se unen a la tinción de muertos vivos. (C) Señal CD45 vs. SSC-A: El área seleccionada corresponde a las células CD45+ (es decir, leucocitos miocárdicos). (D) FSC-A vs. FSC-H: Esta puerta se dibuja para eliminar dobletes de celda (eventos no seleccionados). (E) Señal CD19 vs. SSC-A: El área seleccionada corresponde a las células B del miocardio. (F) B220 vs. CD19: El área dentro del cuadrado negro corresponde a las células B intramiocárdicas (CD19+, B220-), y el área dentro del cuadrado rojo corresponde a la población intravascular de células B. (G) CD11b vs. SSC-A: El área dentro del círculo negro corresponde al CD11b+ (células B1), y el área dentro del círculo rojo corresponde al CD11b- (células B2). Los porcentajes que se muestran en cada panel representan el porcentaje promedio que representa la población mostrada de la población parental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Gráficos representativos que informan el número promedio de células B por miligramo de tejido miocárdico. (A) Número promedio de células CD45+ y CD19+/mg de tejido miocárdico murino. El porcentaje mostrado corresponde al porcentaje de células de la población parental (CD45+). (B) Número promedio de células CD19+ y el porcentaje de células B que se encuentran en el espacio intersticial (extravascular) de los espacios intravasculares. (C) Número absoluto y porcentaje de células B miocárdicas que expresan marcadores de células B1 o B2. Las barras de error corresponden al error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Esta tabla contiene las soluciones y reactivos necesarios para el procedimiento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Un creciente cuerpo de evidencia indica que las células B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la remodelación/adaptación miocárdica a la lesión 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometría de flujo es una excelente herramienta para estudiar poblaciones de células inmunes en cualquier tejido y casi una herramienta obligatoria para cualquier estudio que se centre en las células B en el corazón.
La literatura emergente sobre las células B y el corazón ya informa hallazgos contrastantes en aspectos muy básicos, como el número de células B en el corazón y los cambios en el número de células B del miocardio con lesión. Las células B han sido reportadas como la célula inmune más prevalente en corazones de roedores7. Sin embargo, otros estudios evaluaron su prevalencia relativa en comparación con otras células mieloides y mostraron números marcadamente más bajos26,27. Pinto et al.26 encontraron que las células B comprendían alrededor del 9% del total de leucocitos, mientras que Yu et al.27 reportaron 10%. Adamo et al.7 informaron que el porcentaje promedio de células B en relación con el número de leucocitos fue de alrededor del 20%, que está muy cerca del 18,1% reportado en este manuscrito. Otros estudios han relatado que las células B tienen una prevalencia muy baja en el miocardio28.
Varios pasos experimentales críticos podrían explicar las variabilidades en el número de células B reportadas en la literatura. Es decir, las diferencias en la perfusión del corazón, la picadura de tejido y la digestión pueden afectar significativamente el número de células B recuperadas por mg de tejido cardíaco. La perfusión con tampones que contienen agentes quelantes de calcio y sin calcio, o la perfusión con un mayor volumen o velocidad de perfusión, podría desprender las células B unidas al endotelio y reducir el rendimiento de recuperación. La picadura excesivamente fina del tejido podría conducir a una digestión excesiva del tejido y a la pérdida de viabilidad celular. Una reducción en la viabilidad celular también podría ser el resultado de la digestión durante un tiempo prolongado o con concentraciones enzimáticas más altas.
El porcentaje de células CD45+ que corresponden a las células B podría estar en un rango entre 15% -30% en un ratón de tipo salvaje. Dependiendo de la cepa de ratón utilizada, la edad y los antecedentes genéticos, este valor puede variar. Sin embargo, el porcentaje debe permanecer similar en el grupo estudiado. La gran variabilidad en el número y porcentaje de células B entre ratones pertenecientes al mismo grupo sugiere que puede estar ocurriendo un error experimental. Los porcentajes bajos podrían indicar un exceso en la fuerza de perfusión y el tiempo. La reducción global de las células CD45+ podría indicar que el tejido está siendo sobredigerido.
El protocolo descrito aquí ha sido optimizado para proporcionar un rendimiento consistente de células B del corazón murino digerido y para permitir la discriminación de células B intravasculares vs. extravasculares6. La discriminación de las células B intravasculares frente a las extravasculares se logra mediante la inyección intravascular de un anticuerpo inmediatamente antes del sacrificio. El anticuerpo inyectado intravascularmente se difunde fácilmente por toda la vasculatura y encuentra todas las células B intravasculares. Si el animal se sacrifica lo suficientemente pronto y el corazón se cosecha rápidamente, el anticuerpo no tiene tiempo para difundirse en el espacio extravascular y teñir las células B extravasculares. Dado que el tiempo entre la inyección intravascular del anticuerpo y la recolección de órganos es crítico, se recomienda inocular con el anticuerpo y recolectar un corazón de ratón individual a la vez. La inyección intravascular de anticuerpos puede omitirse si la discriminación de las células B intravasculares frente a las extravasculares no es de interés. La estrategia de cierre que se muestra en la Figura 1 seguiría siendo la misma, excepto por el último paso, que no sería posible debido a la falta de etiquetado B220. Dependiendo del diseño experimental, cualquier fluoróforo del panel mostrado puede modificarse a un color que se ajuste al panel utilizado. Asimismo, es importante considerar que la selección de los marcadores superficiales podría modificarse de acuerdo a las necesidades del grupo que la realiza; por ejemplo, si en el diseño experimental se cree que la expresión de CD11b en las células B1 podría reducirse, se recomienda la adición de diferentes marcadores, como IgM, IgD y CD537.
Tenga en cuenta que puede ser necesario procesar un corazón solo para ejecutar controles de compensación para la citometría de flujo. Esto se recomienda la primera vez que se optimiza el experimento. En los siguientes experimentos, salvar algo de tejido en el momento de la recolección del corazón podría ser suficiente, ya que proporcionaría suficientes células para ejecutar un control negativo "no manchado" y un control positivo de manchas "vivo-muerto". Los controles individuales para los otros colores podrían importarse de experimentos anteriores o generarse utilizando cuentas.
Algunos pasos del protocolo se pueden modificar sin alterar los resultados del experimento. Por ejemplo, el método de anestesia podría cambiarse por uno preferido dependiendo de la experiencia del investigador; El uso de isoflurano en lugar de 2,2,2-tribromoetanol podría reducir el tiempo transcurrido entre la administración de anestesia y la recolección del corazón. Además, la perfusión del corazón podría hacerse manualmente sin el uso de una bomba de jeringa, siempre y cuando se realice de manera lenta, suave y consistente.
A pesar de la ejecución precisa del protocolo, los operadores inexpertos podrían encontrar una alta variabilidad entre muestras dentro de la misma sesión experimental o entre diferentes sesiones experimentales. Según la experiencia, esta variabilidad desaparece una vez que el científico ha tenido la oportunidad de familiarizarse completamente con el flujo de trabajo. Por lo tanto, se recomienda que cualquier persona que quiera implementar este protocolo evalúe su reproducibilidad en dos o tres ejecuciones de prueba antes de recopilar datos cruciales sobre sus proyectos de investigación.
En resumen, los métodos existentes para aislar las células inmunes del corazón y analizarlas a través de la citometría de flujo generalmente no consideran la capacidad de las células inmunes para unirse al endotelio, y no estandarizan la perfusión o implementan la perfusión extensa, con la suposición de que cualquier célula inmune en el espacio intravascular es un contaminante que debe ser purgado. Esto ignora la noción de que las células inmunes intravasculares adheridas al endotelio tienen relevancia biológica. El protocolo aquí presentado ha sido optimizado para maximizar la recuperación de las células inmunes del miocardio con atención específica a las células B miocárdicas, intravasculares y extravasculares. Esperamos que este protocolo sea de interés para todos aquellos científicos que trabajan en el campo de la inmunología cardíaca y están interesados en explorar la función que las células B podrían desempeñar en corazones sanos y lesionados.
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Disclosures
Luigi Adamo es cofundador de i-Cordis, LLC, una compañía enfocada en el desarrollo de moléculas inmunomoduladoras para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, con un interés específico en los derivados del fármaco modulador de células B pirfenidona. Los autores restantes no tienen conflictos que declarar.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado por las subvenciones del NHLBI 5K08HLO145108-03 y 1R01HL160716-01 otorgadas a Luigi Adamo.
El citómetro de flujo Aurora utilizado para desarrollar este estudio fue financiado por la subvención S10OD026859 de los NIH. Reconocemos el apoyo del JHU Ross Flow Cytometry Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
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