Summary
本方案描述了寨卡病毒（ZIKV）在Vero非洲绿猴肾细胞中的繁殖，以及使用基于细胞的比色免疫检测方法以24孔和96孔（高通量）形式对ZIKV进行定量。
Abstract
寨卡病毒（ZIKV）是一种蚊媒病毒，属于 黄病毒属。ZIKV感染与先天性脑部异常有关，并可能与成人的吉兰-巴雷综合征有关。研究寨卡病毒以了解疾病机制对于促进疫苗和治疗开发非常重要。在病毒学领域，量化病毒的方法至关重要。焦点形成测定 （FFA） 是一种病毒定量测定，它使用抗体检测病毒抗原并使用过氧化物酶免疫染色技术鉴定细胞的感染病灶。目前的研究描述了使用 24 孔和 96 孔（高通量）格式的病毒传播和定量方案。与其他类似研究相比，该协议进一步描述了病灶大小优化，可以作为扩大该测定对其他病毒使用范围的指南。首先，ZIKV在Vero细胞中繁殖3天。使用FFA收获并定量含有ZIKV的培养上清液。简而言之，将病毒培养物接种到Vero细胞上并孵育2-3天。然后，在优化的染色过程（包括细胞固定、透化、封闭、抗体结合和与过氧化物酶底物孵育）后确定病灶形成。使用体视显微镜（24孔格式的手动计数）或软件分析仪（96孔格式的自动计数）观察染色的病毒病灶。FFA 提供可重复的、相对较快的结果（3-4 天），适用于不同的病毒，包括非斑块形成病毒。随后，该方案可用于ZIKV感染的研究，并可用于检测其他临床上重要的病毒。
Introduction
寨卡病毒（ZIKV）感染是一种新出现的蚊媒病毒性疾病。1947 年在乌干达首次分离出 ZIKV 1,2;从 1947 年到 2007 年，它仍然被忽视，因为临床症状最常见的是无症状的，其特征是自限性发热性疾病。2007 年，寨卡病毒流行始于雅浦群岛 3,4，随后于 2013 年至 2014 年在太平洋地区（法属波利尼西亚、复活节岛、库克群岛和新喀里多尼亚）发生更大规模的流行病 5,6,7,8，其中首次在成人中报告了严重的神经系统并发症吉兰-巴雷综合征 （GBS）9.在2015年和2016年期间，早在2013年巴西出现亚洲寨卡病毒基因型后，寨卡病毒首次大范围流行席卷美洲10。在这次疫情期间，新生儿中报告了44万至130万例小头畸形和其他神经系统疾病病例11。目前尚无针对寨卡病毒感染的特异性治愈或治疗方法;因此，迫切需要能够预防感染的寨卡病毒疫苗，特别是在怀孕期间。
病毒定量是确定样品中存在的病毒数量的过程。它在研究中发挥着重要作用，学术实验室涉及许多领域，例如医学和生命科学。这一过程在商业领域也很重要，例如病毒疫苗、重组蛋白、病毒抗原或抗病毒药物的生产。许多方法或检测方法可用于病毒定量12。方法或检测方法的选择通常取决于病毒特征、所需的准确度以及实验或研究的性质。通常，定量病毒的方法可分为两类：检测病毒核酸（DNA或RNA）存在的分子测定和体外测量病毒感染性的测定12。定量聚合酶链反应（qPCR，用于DNA）或定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR，用于RNA）13和数字液滴PCR14是用于定量给定样品中病毒核酸的常用分子技术的例子15。然而，这些高度灵敏的分子技术无法区分活病毒和非活病毒15。因此，使用上述分子技术无法完成需要生物学特征信息的研究，例如病毒对细胞的感染性;需要能够测量和确定活病毒存在的检测方法。测量病毒传染性的检测方法包括斑块形成试验 （PFA）、50% 组织培养感染剂量 （TCID50）、荧光焦点试验和透射电子显微镜 （TEM）12。
PFA 由 Renato Dulbecco 于 1952 年开发，是最常用的病毒滴定方法之一，包括 ZIKV16。它用于直接测定传染性裂解病毒粒子的病毒浓度。该方法基于裂解病毒在病毒感染后在接种的细胞单层中产生细胞病变效应（CPEs;细胞死亡区或斑块，被未感染细胞包围的感染区域）的能力。然而，该测定存在一些影响其效用的缺点。该检测非常耗时（大约需要 7-10 天，具体取决于病毒），依赖于 CPE，并且容易出错。在本研究中，我们报告了一种免疫比色技术，即焦点形成测定 （FFA），用于检测和定量 24 孔板和 96 孔板形式的 ZIKV。
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Protocol
1. 病毒传播
- 细胞制备
- 在含有 12 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的 75 cm2 细胞培养瓶中培养 Vero 细胞，补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 2 mM L-谷氨酰胺（参见 材料表）。在37°C的细胞培养箱中用5%CO2孵育细胞。
- 在显微镜下监测细胞;一旦细胞达到70%-90%的汇合度，它们就可以使用了（图1A）。
注意：Vero细胞大约每24小时翻一番17。1：10 的稀释度需要 3 到 4 天才能在 75 cm2 烧瓶中达到 80%-90% 的汇合度。每天或每隔一天监测细胞。
- 细胞单层感染
- 使用 10 mL 血清移液管从细胞培养瓶中取出生长培养基。使用 5 mL 血清移液管用 3 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （dPBS） 冲洗烧瓶 2 次。
注意： 必须准备一个装有 10% 次氯酸钠的烧杯，以对烧瓶/板中丢弃的任何感染性液体废物进行消毒。 - 将 2 mL 无血清 DMEM（补充有 2 mM L-谷氨酰胺不含 FBS 的 DMEM）和 20 μL ZIKV 接种物加入细胞培养瓶中。在室温下轻轻摇晃孵育烧瓶1小时，以使病毒吸附。
注意：初始ZIKV原液的滴定将有助于确定ZIKV接种物添加量（步骤2）。
注意：寨卡病毒被归类为生物安全2级（BSL-2）病原体。所有含有ZIKV材料的程序都必须在经过认证的生物安全柜中进行，并遵循所有实验室标准操作程序（SOP）和适当的个人防护设备。
- 使用 10 mL 血清移液管从细胞培养瓶中取出生长培养基。使用 5 mL 血清移液管用 3 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （dPBS） 冲洗烧瓶 2 次。
- 添加覆盖介质
- 孵育 1 小时后，使用 5 mL 血清移液管取出并弃弃稀释的病毒接种物。用 3 mL dPBS 2x 冲洗细胞培养瓶。
- 将 12 mL 维持培养基（补充有 2% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 100 U/mL 青霉素-链霉素的 DMEM）加入细胞培养瓶中以维持感染细胞。
- 将感染的Vero细胞在37°C的细胞培养箱中用5%CO2孵育3天。
注意：每天在显微镜下监测受感染的Vero细胞的CPE。
- 收获含有ZIKV的细胞培养上清液
- 在感染后第 3 天，可以观察到细胞变圆和脱离 （CPE）（图 1B-D）。使用 10 mL 血清移液管将含有 ZIKV 的细胞培养上清液收获到 50 mL 离心管中。
- 使用0.22μm聚醚砜注射器过滤器（参见 材料表）过滤细胞培养上清液。将 500 μL 过滤的细胞培养上清液等分装到 2.0 mL 螺旋盖管中，并在 -80 °C 下储存直至进一步使用。
注意：收获的ZIKV可以储存在-80°C下进行长期储存。
注意： 如果使用注射器针头，必须采取额外的预防措施，因为针头会刺穿皮肤。需要建立实验室SOP。
2. 病毒定量
- 细胞制备
- 将Vero细胞接种在指定的板中（24孔板：0.5mL/孔，7.5×104 个细胞/孔;96孔板：0.1mL/孔，1.5×104 个细胞/孔），并将板在37°C的细胞培养箱中用5%CO2孵育过夜。
注意：有五个不同的时间点要测试（24 孔板：感染后 48 小时、60 小时、72 小时、84 小时和 96 小时;96 孔板：感染后 24 小时、36 小时、48 小时、60 小时和 72 小时）;因此，为每个时间点准备一个盘子。 - 孵育24小时后，一旦细胞达到70%-90%的汇合度（图1E），板就可以进行感染了。在感染细胞单层之前继续制备稀释的病毒原液（步骤2.2）。
- 将Vero细胞接种在指定的板中（24孔板：0.5mL/孔，7.5×104 个细胞/孔;96孔板：0.1mL/孔，1.5×104 个细胞/孔），并将板在37°C的细胞培养箱中用5%CO2孵育过夜。
- 病毒稀释
- 对于 24 孔板和 96 孔板，为每个板准备六个无菌 1.5 mL 微量离心管，以进行 10 倍稀释（10-1 至 10-5），包括阴性对照。对于 24 孔板的实验设置，将 450 μL 无血清 DMEM 加入所有六个微量离心管中。对于 96 孔板的实验设置，将 135 μL 无血清 DMEM 加入 6 个试管中。
注意： 在进行十倍连续稀释之前，清楚地标记每个试管以指示其内容物的稀释程度。 - 为了进行连续稀释，对于 24 孔板实验设置，将从步骤 1 收获的 50 μL ZIKV 原液加入含有 450 μL 无血清 DMEM 的 10-1 管中。对于 96 孔板实验设置，将 15 μL ZIKV 原液加入含有 135 μL 无血清 DMEM 的 10-1 管中。
- 涡旋每个试管以混合病毒和培养基。这是第一次十倍稀释。
注意：需要在每个稀释管中正确混合病毒和培养基，以确保准确的连续稀释。 - 对于 24 孔板实验设置，使用新鲜的移液器吸头重悬 10-1 试管，并将 50 μL 稀释的 ZIKV 转移到 10-2 试管中作为第二次 10 倍稀释。对于 96 孔板实验设置，使用新鲜的移液器吸头重悬 10-1 管，并将 15 μL 稀释的 ZIKV 转移到 10-2 管中作为第二次十倍稀释。
- 重复步骤2.2.4四次，直到第五管（排除阴性对照）。
注意：每个移液步骤后使用新鲜的移液器吸头，以避免交叉污染。
- 对于 24 孔板和 96 孔板，为每个板准备六个无菌 1.5 mL 微量离心管，以进行 10 倍稀释（10-1 至 10-5），包括阴性对照。对于 24 孔板的实验设置，将 450 μL 无血清 DMEM 加入所有六个微量离心管中。对于 96 孔板的实验设置，将 135 μL 无血清 DMEM 加入 6 个试管中。
- 细胞单层感染
- 从每个孔中取出并弃去条件培养基（24 孔板：0.5 mL/孔;96 孔板：0.1 mL/孔）。
- 用 dPBS 2x 冲洗每个孔（24 孔板：300 μL/孔;96 孔板：60 μL/孔）。
- 从最高到最低稀释度工作，将每个连续稀释的病毒接种物加入孔中（24孔板：200μL/孔;96孔板：40μL/孔）。
注意：每次稀释的感染将在重复的孔中进行。保持两个未感染的孔作为阴性对照。清楚地标记板和孔，以避免混淆。在每个移液步骤后更换移液器吸头，以防止交叉污染。 - 在室温下轻轻摇晃孵育板1小时，以允许病毒吸附。
- 添加覆盖细胞培养基
- 孵育1小时后，从最低浓度到最高浓度除去并弃去病毒悬浮液。
- 用dPBS 2x（24孔板：300μL/孔;96孔板：60μL/孔）洗涤感染细胞。
- 用DMEM（补充2%FBS、2mM L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素-链霉素）和1.5%低粘度羧甲基纤维素（CMC;见 材料表）（24孔板：1 mL/孔;96孔板：0.2 mL/孔）覆盖孔。
- 将板在37°C的细胞培养箱中用5%CO2孵育。
注意：在此孵育期间请勿打扰板。 - 从细胞培养箱中取出板在不同时间点进行染色（24孔板：感染后48小时，60小时，72小时，84小时和96小时;96孔板：感染后24小时，36小时，48小时，60小时和72小时）。
3. 染色
- 细胞固定
- 在特定的孵育时间后（24孔板：感染后48小时，60小时，72小时，84小时和96小时;96孔板：感染后24小时，36小时，48小时，60小时和72小时），取出并弃去覆盖培养基，并用1x PBS洗涤细胞3次。对于 96 孔板，取出并弃去覆盖培养基，并用多通道移液管用 60 μL/孔 1x PBS 洗涤细胞 3 次。
- 加入 4% 多聚甲醛固定细胞（24 孔板：300 μL/孔;96 孔板：60 μL/孔）。将板在室温下孵育20分钟。
注意：多聚甲醛是一种固体聚合甲醛。它是一种易燃的固体白色结晶粉末，与水混合或加热时会释放甲醛气体。所有涉及使用多聚甲醛的程序都必须按照特定于含甲醛化学品的实验室标准操作程序，在经过认证的化学品通风橱或经批准的排气外壳中进行。 - 20分钟后，弃去多聚甲醛，用1x PBS洗涤细胞3次。按照步骤 3.2-3.5 进行透化、封闭和抗体孵育。
注意：丢弃 4% 多聚甲醛时，请遵循大学或研究所的废物处理程序。
- 细胞通透性
- 加入1%辛基苯氧基聚乙氧基聚乙氧基乙醇（参见 材料表）使细胞通透（24孔板：200μL/孔;96孔板：40μL/孔）。将板在室温下孵育15分钟。
- 15分钟后，弃去辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，并用1x PBS洗涤细胞3次。
- 阻塞
- 加入 3% 脱脂牛奶以减少样品中的非特异性结合（24 孔板：500 μL/孔;96 孔板：100 μL/孔）。将板在室温下孵育2小时。
- 2小时后，弃去3%脱脂牛奶，用1x PBS洗涤细胞3次。
注意：这是一个停止点。加入3%脱脂牛奶后，在一抗插入前，板可在4°C下储存至2天。
- 一抗孵育
- 加入在1%脱脂牛奶（1：1,000比例）中稀释的抗黄病毒单克隆抗体4G2（克隆D1-4G2-4-15;一抗，参见 材料表）（24孔板：200μL/孔;96孔板：40μL/孔）。将板在37°C孵育1小时。
- 1小时后，除去含有单克隆抗体的溶液，并用1x PBS洗涤细胞3次。
- 二抗孵育
- 加入在1%脱脂牛奶（比例为1：1,000）中稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠IgG二抗（参见 材料表）（24孔板：200μL/孔;96孔板：40μL/孔）。将板在37°C孵育1小时。
- 1小时后，除去含有二抗的溶液，并用1x PBS洗涤细胞3次。
- 底物孵育
- 加入3,3'二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物（参见 材料表），并将板在黑暗中孵育30分钟（24孔板：200μL/孔;96孔板：40μL/孔）。30分钟后，用水清洗井停止反应。
- 将板风干过夜，并在板完全干燥后进行焦点计数。
4.病毒滴度的测定
- 手动焦点计数过程（24 孔规格）
- 病灶可以在体视显微镜下观察。选择产生50-200个病灶的稀释度。
- 计算所选稀释液的每个重复的病灶。计算每种选定稀释液的平均焦点数。
- 使用以下公式计算每个样品的每 mL 病灶形成单位 （FFU/mL）：FFU/mL = 计数的平均病灶数/（稀释度 x 添加的稀释病毒体积）。
- 自动焦点计数过程（96 孔规格）
- 在商业软件分析仪上扫描 96 孔板。
- 双击软件（见 材料表）打开。
- 单击 “切换套件 ”，并确保将该套件切换到任何适用的套件（补充图 1A）。单击 “确定”。
- 单击 “扫描”>“全板扫描 ”（补充图1B）开始扫描。
- 单击 Dashboard 以确保捕获格式为 96 孔格式（补充图 2A）。
- 选择定心模式为“自动预对准用户验证”（补充图 2B）。
- 单击“弹出”（ Eject ） 以加载板。
注意： 打开板盖并将其向上放置，A 行位于顶部（补充图 3A）。 - 输入车牌名称，然后单击 确定。单击 “加载 ”（Load） 以加载板。
- 单击 “开始 ”开始扫描。之后，使用“上、下、左、右”按钮校准 A1、A12 和 H1 的位置，然后单击 确认 （补充图 3B）。
注意：软件将开始扫描每个孔。 - 扫描完成后，将弹出一个概览图像。单击 “关闭”。
- 单击 “返回总机”退出扫描。
- 使用软件对 96 孔板进行计数。
- 单击“ 计数”>“智能计数”。
- 在软件上，它将显示“第 1 步（共 5 步）：选择要计数的板”。单击 负载板。勾选整个文件夹，然后单击 “选择 ”以导入扫描的印版（补充图4A）。
- 在软件上，它将显示“第 2 步（共 5 步）：定义计数参数”。单击 调整参数，将显示参数（漫反射过程;小/正常/大/最大/最大+1;光斑分离;计数面积;背景平衡;纤维去除;门控）。
注意：从一口井开始，来回检查以找到所有井的最佳设置。 - 完成后，单击 “下一步 ”（补充图4B）。
- 在软件上，它将显示“第 3 步（共 5 步）：选择/取消选择孔”。完成要计数的井的选择后，单击 “下一步 ”继续。
注：选择要计数的井将在每口井的右上角显示一个“C”（补充图5A）。 - 在软件上，它将显示“第 4 步（共 5 步）：输出设置”。单击 “查看/修改输出设置 ”以检查设置（例如图像格式）是否合适。单击 “保存”并退出“下一步> （补充图 5B）。
- 在软件上，它将显示“第 5 步（共 5 步）：启动自动计数”。单击 “开始自动计数 ”（补充图 6A）。
- 完成后，单击 “退出自动计数”。
- 在商业软件分析仪上扫描 96 孔板。
- 在商业软件分析仪中执行质量控制 （QC）。
- 在配电盘页面上，单击“ 质量控制”>“添加板”。勾选整个文件夹以导入计数的板，单击 “选择”>“开始 QC ”（补充图 6B）。
- 双击每个孔以审核斑点。单击 “计数 ”以删除任何斑点。软件将开始计数。
注意：确保勾选“斑点：删除”。计数的完成可以通过计数的焦点数来表示，例如“30”（补充图7A）。 - 计数结束后（由计数的焦点数表示，例如“30”），单击“是”以去除斑点（补充图7B）。在要删除的位置单击三次左键。右键单击完成，然后单击 “是”。
- 点击 “精加工板”，QC完成后转到“项目概述” 。
- 使用软件分析仪进行成像。
- 检查扫描、计数和 QC 板图像（图 2）。
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Representative Results
ZIKV可以使用FFA进行量化，如图3所示。对于 24 孔板，将感染的 Vero 细胞固定在感染后 48 小时、60 小时、72 小时、84 小时和 96 小时。结果显示，感染后96小时（4天）后，细胞保持完整（未观察到细胞脱离）（图4和补充图8A-E）。在感染后48小时（2天）首次观察到病毒病灶的出现（图4A-F）。然而，病灶尺寸太小，难以准确计算病灶。在感染后60小时（2.5天）达到最佳病灶大小（图4B）。在后一个时间点（感染后72 h、84 h和96 h），病灶较大，趋于合并或重叠。合并或重叠的病灶随着时间的推移而增加（图4C-E）。因此，选择在感染后60小时（2.5天）形成的病灶来测定24孔板中的ZIKV滴度（图4B）。
对于96孔板，感染的Vero细胞固定在感染后24小时，36小时，48小时，60小时和72小时。结果显示，细胞在感染后72小时（3天）后保持完整（图5A-F和补充图9A-E）。在感染后24小时（1天）首次观察到病毒病灶的出现（图5A）。然而，感染后36小时（1.5天）的病灶大小太小，因此难以准确确定病灶的数量（图5A，B）。在感染后48小时（2天）达到最佳病灶大小（图5C）。在后一个时间点（感染后60小时和72小时），观察到重叠或合并的病灶，并且重叠的病灶数量随着时间的推移而增加（图5D，E）。因此，选择在感染后48小时（2天）形成的病灶来确定ZIKV分离株的病毒滴度（图5C）。可以使用商业软件分析仪作为替代方案来可视化和枚举病灶的形成。
图1：Vero细胞的显微图像。 （A） 在 40 倍放大倍率下，Vero 细胞在 75 cm2 细胞培养瓶中显示出 70%-90% 的汇合度，用于病毒繁殖。（B） 感染后第 1 天以 100 倍放大倍率感染 ZIKV 后 Vero 细胞上的 CPE。（C） 感染后第 2 天以 100 倍放大倍率感染 ZIKV 后对 Vero 细胞进行的 CPE。（D） 感染后第 3 天以 100 倍放大倍率感染 ZIKV 后 Vero 细胞上的 CPE。（E） 在 40 倍放大倍率下，Vero 细胞在 24 孔板中孵育 24 小时后显示 70%-90% 的汇合度用于病毒定量。比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：使用商业软件分析仪扫描、计数和后质量对照板的 96 孔规格图像。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：病灶形成测定的染色工作流程。 染色过程包括细胞固定、透化、封闭、抗体结合和与过氧化物酶底物孵育。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：不同时间点在 24 孔板中 ZIKV P6-740 的病灶形成测定。 （A） 感染后第 2 天（48 小时）病灶不太明显。（B） 在感染后第 2.5 天（60 小时）可以看到最佳病灶大小。（C-E）病灶在感染后第 3 天（72 小时）、第 3.5 天（84 小时）和第 4 天（96 小时）合并。（F） 板的阴性对照。比例尺：1,000 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：不同时间点在 96 孔板中对 ZIKV P6-740 的病灶形成测定。 （A） 感染后第 1 天（24 小时）在商业软件分析仪上计数的病灶不太明显。（B） 在感染后第 1.5 天（36 小时）的商业软件分析仪上计数的病灶不太明显。（C） 在感染后第 2 天（48 小时）可以看到最佳病灶大小。（D，E）病灶在感染后第 2.5 天（60 小时）和第 3 天（72 小时）合并。（F） 板的阴性对照。比例尺：1,000 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1：商业软件分析器启动页面的屏幕截图。 （A） 将套件切换到商业软件分析器上的任何适用套件。完成后单击“确定”。（B） 要在商业软件分析仪上开始扫描，请单击“扫描”，然后单击“全板扫描”。 请点击此处下载此文件。
补充图 2：在商业软件分析仪上查看“捕获格式”和所选定定心模式为“自动预对齐用户验证”的屏幕截图。 （A） 要查看捕获格式，请单击“仪表板”并选择 96 孔格式作为捕获格式。（B） 对于居中模式，选择“自动预对准用户验证”。 请点击此处下载此文件。
补充图 3：商用软件分析仪读板器托盘上的 96 孔板放置，以及校准孔 A1、A12 和 H1 位置的屏幕截图。 （A） 将盘子向上放置，A 行位于顶部。（B） 要校准井 A1、A12 和 H1 的位置，请使用“向上、向下、向左、向右”按钮。完成后，单击“确认”。 请点击此处下载此文件。
补充图 4：用于选择包含扫描板的文件夹的屏幕截图，以便在商业软件分析仪上计数和“第 2 步（共 5 步）：定义计数参数”。 （A） 要计算扫描的板，请单击“装载板”。勾选整个文件夹，然后单击“选择”以导入扫描的印版。（B） 调整计数参数。设置参数后，单击“下一步”。 请点击此处下载此文件。
补充图 5：商业软件分析仪“第 3 步（共 5 步）：选择/取消选择孔”和“第 4 步（共 5 步：输出设置”）的屏幕截图。 （A） 选择和取消选择要计数的井，完成后单击“下一步”。（B） 对于输出设置，单击“查看/修改输出设置”以检查设置是否合适（例如，图像格式）。完成后单击“保存并退出”，然后单击“下一步”。 请点击此处下载此文件。
补充图 6：商业软件分析器“第 5 步（共 5 步：启动自动计数）”和质量控制页面的屏幕截图。 （A） 准备好进行孔板计数后，单击“开始自动计数”。（B） 在质量控制页面，勾选整个文件夹导入计数板，点击“选择”，然后点击“开始质量控制”。 请点击此处下载此文件。
补充图 7：商业软件分析器质量控制页面的屏幕截图。 （A） 双击每口井以审核点。单击“计数”以删除任何斑点。勾选“斑点：删除”。（B） 三次左键单击以去除斑点。右键单击完成，然后单击“是”。 请点击此处下载此文件。
补充图 8：ZIKV P6-740 在不同时间点在 24 孔板中的病灶形成测定。 对 ZIKV P6-740 进行 10 倍连续稀释（10-1 至 10-5），并对 Vero 细胞进行两次感染，包括阴性对照。使用体视显微镜拍摄原始数据图像，比例尺表示 1,000 μm。 （A） 感染后第 2 天（48 小时）。（B） 感染后第 2.5 天（60 小时）。（C） 感染后第 3 天（72 小时）。（D） 感染后第 3.5 天（84 小时）。（E） 感染后第 4 天（96 小时）。 请点击此处下载此文件。
补充图 9：不同时间点在 96 孔板中 ZIKV P6-740 的病灶形成测定。 对 ZIKV P6-740 进行 10 倍连续稀释（10-1 至 10-5），并对 Vero 细胞进行两次感染，包括阴性对照。使用体视显微镜拍摄原始数据图像，比例尺表示 1,000 μm。 （A） 感染后第 1 天（24 小时）。（B） 感染后第 1.5 天（36 小时）。（C） 感染后第 2 天（48 小时）。（D） 感染后第 2.5 天（60 小时）。（E） 感染后第 3 天（72 小时）。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
有几种测定方法可以确定病毒滴度;PFA 具有与 FFA 相似的病毒定量方案，其中病毒接种物被稀释以区分单个斑块或病灶。染色后，每个斑块或病灶指示接种物19中的单个感染性颗粒。PFA用结晶紫染色，以可视化由细胞裂解或死亡引起的斑块形成。因此，PFA更耗时，因为病毒引起CPE需要更长的时间，并且仅限于诱导细胞裂解或死亡的病毒。许多实验室已成功使用 FFA 测定黄病毒的传染性病毒滴度，包括 ZIKV19、20、21、22、23、24、25。FFA 是一种基于细胞的比色免疫检测方法，它用抗体检测病毒抗原，因此使用免疫染色技术识别感染细胞的病灶区域，但不能识别斑块12,26。与PFA相比，FFA为ZIKV提供了一些优势。一个明显的优势是，它基于对病毒成分的抗体识别，没有可辨别的CPE。此外，使用病毒特异性抗体也有助于识别混合人群中的不同病毒或病毒血清型27。因此，FFA 比 PFA 更具特异性，因为它测量所有病毒感染，并且不依赖于导致足够细胞死亡以形成可见斑块的病毒 28。FFA 的潜伏期也比 PFA 短，PFA 需要明显的 CPE，这意味着细胞裂解和死亡。最后，使用 96 孔板，FFA 方法具有使用更多重复和更大稀释度来检测和滴定病毒的优点 27,29。此外，报道的FFA测定可以很容易地用于病毒中和测试和筛选抗病毒化合物的方法。结合商业或免费的自动细胞计数仪器或软件可以进一步提高FFA及其相关方法的可用性（一致性、准确性、通量）。
在比较 24 孔板和 96 孔板时，需要注意的是，24 孔规格需要在单层培养物中生长更多的细胞，以及更多的培养基和病毒原液。因此，24 孔板形式可能不适合用于体积有限的样品。如本文所述，可以使用96孔格式来克服这一限制。首先，96孔规格需要更少的材料，使其成为更具成本效益的选择。此外，96 孔规格的染色病毒病灶自动计数可实现高通量和快速分析，这在需要手动计数的 24 孔规格中无法实现。与手动计数相比，这种自动计数过程还提高了可重复性并降低了主观性，从而使 FFA 的结果更加准确和可靠。因此，对于需要高通量和可靠病毒定量的实验室，强烈推荐使用带有自动成像系统的 96 孔规格。
另一方面，有些人使用免疫荧光焦点测定法来检测 ZIKV25、27、28、30、31。免疫荧光焦点测定与FFA相似，不同之处在于它是通过用荧光染料偶联的特异性抗体对抗原进行免疫染色，然后在荧光显微镜下计数感染病灶25来进行的。该测定使用更昂贵的试剂，需要荧光显微镜才能完成测定。因此，免疫荧光焦点测定仅限于设备更好的实验室，例如转诊实验室。在资源苛刻的环境中使用这种检测并不容易。
尽管FFA有很多优点，但也有一些局限性。与PFA等其他检测方法相比，FFA在染色过程中涉及更多步骤。虽然固定后的步骤是灵活的，允许过夜或更长时间的停顿，但病灶的染色仍然需要更长的时间才能完成。此外，FFA在染色过程中需要特异性或交叉反应的抗体，这限制了其在识别和定量新病毒或新型病毒方面的适用性。此外，与PFA相比，FFA的成本更高，PFA只需要结晶紫进行染色。除此之外，值得注意的是，自动计数过程（96孔格式）只能在配备适当设备的实验室中进行;因此，它不适合没有必要设备的实验室。
总之，我们报告了使用基于细胞的比色免疫检测测定法或 24 孔板和 96 孔板形式的 FFA 对 ZIKV 进行增殖和定量的详细方案。与经典PFA相比，该方法具有许多实际优势。当与用于病灶计数的自动成像系统一起应用时，它速度更快，适用于高通量应用。这项研究的可靠方案的标准化将极大地促进寨卡病毒的研究，也可以广泛地用于量化其他临床上重要的病毒。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
这项研究得到了马来西亚高等教育部的长期研究资助计划（LRGS MRUN Phase 1： LRGS MRUN/F1/01/2018）的支持，并为高等院校卓越中心（HICoE）计划（MO002-2019）提供资金。本研究中的图 3 显示了病灶形成测定的染色工作流程，改编自 BioRender.com （2022） 的“DAB 免疫组织化学”。取自 https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 - 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 - 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 - 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | - | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
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