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Immunology and Infection

Virusvermehrung und zellbasierte kolorimetrische Quantifizierung

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vermehrung des Zika-Virus (ZIKV) in Nierenzellen von Vero-Afrikanischen Grünen Meerkatzen und die Quantifizierung von ZIKV unter Verwendung zellbasierter kolorimetrischer Immundetektionsmethoden in 24-Well- und 96-Well-Formaten (Hochdurchsatz).

Abstract

Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein von Stechmücken übertragenes Virus der Gattung Flavivirus. Eine ZIKV-Infektion wurde mit angeborenen Hirnanomalien und möglicherweise dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen in Verbindung gebracht. Die Erforschung des ZIKV zum Verständnis der Krankheitsmechanismen ist wichtig, um die Entwicklung von Impfstoffen und Therapien zu erleichtern. Die Methode zur Quantifizierung von Viren ist im Bereich der Virologie von entscheidender Bedeutung. Der Fokusformungstest (FFA) ist ein Virusquantifizierungstest, der das virale Antigen mit Antikörpern nachweist und die Infektionsherde von Zellen mit Hilfe der Peroxidase-Immunfärbetechnik identifiziert. Die aktuelle Studie beschreibt das Protokoll zur Ausbreitung und Quantifizierung des Virus sowohl im 24-Well- als auch im 96-Well-Format (hoher Durchsatz). Im Vergleich zu anderen ähnlichen Studien hat dieses Protokoll die Optimierung der Foci-Größe weiter beschrieben, was als Leitfaden dienen kann, um die Verwendung dieses Assays auf andere Viren auszuweiten. Zunächst wird die ZIKV-Vermehrung in Vero-Zellen für 3 Tage durchgeführt. Der ZIKV-haltige Kulturüberstand wird geerntet und mit Hilfe der FFA quantifiziert. Kurz gesagt, die Viruskultur wird auf Vero-Zellen inokuliert und für 2-3 Tage inkubiert. Die Foci-Bildung wird dann nach optimierten Färbeprozessen bestimmt, einschließlich Zellfixierung, Permeabilisierung, Blockierung, Antikörperbindung und Inkubation mit Peroxidase-Substrat. Die gefärbten Virusherde werden mit einem Stereomikroskop (manuelle Zählung im 24-Well-Format) oder Software-Analysator (automatische Zählung im 96-Well-Format) visualisiert. Die FFA liefert reproduzierbare, relativ schnelle Ergebnisse (3-4 Tage) und eignet sich für den Einsatz bei verschiedenen Viren, einschließlich nicht-plaquebildender Viren. In der Folge ist dieses Protokoll nützlich für die Untersuchung von ZIKV-Infektionen und könnte zum Nachweis anderer klinisch wichtiger Viren verwendet werden.

Introduction

Die Infektion mit dem Zika-Virus (ZIKV) ist eine neu auftretende, durch Stechmücken übertragene Viruserkrankung. Die erste Isolierung des ZIKV fand 1947 in Uganda statt 1,2; Sie blieb von 1947 bis 2007 vernachlässigt, da die klinischen Symptome meist asymptomatisch und durch eine selbstlimitierende fieberhafte Erkrankung gekennzeichnet sind. Im Jahr 2007 begann die Zika-Epidemie auf den Yap-Inseln 3,4, gefolgt von größeren Epidemien in den pazifischen Regionen (Französisch-Polynesien, Osterinseln, Cookinseln und Neukaledonien) von 2013 bis 2014 5,6,7,8, wo erstmals die schwere neurologische Komplikation Guillain-Barré-Syndrom (GBS) bei Erwachsenen berichtet wurde9. In den Jahren 2015 und 2016 breitete sich die erste weit verbreitete ZIKV-Epidemie über den amerikanischen Kontinent aus, nachdem bereits 2013 der asiatische Genotyp des ZIKV in Brasilien aufgetreten war. Während dieses Ausbruchs wurden 440.000 bis 1,3 Millionen Fälle von Mikrozephalie und anderen neurologischen Erkrankungen bei Neugeborenen gemeldet11. Derzeit gibt es keine spezifische Heilung oder Behandlung für die ZIKV-Infektion. Daher besteht ein dringender medizinischer Bedarf an ZIKV-Impfstoffen, die in der Lage sind, Infektionen insbesondere während der Schwangerschaft zu verhindern.

Die Virusquantifizierung ist ein Verfahren, um die Anzahl der in einer Probe vorhandenen Viren zu bestimmen. Sie spielt eine wichtige Rolle in der Forschung, und akademische Laboratorien umfassen viele Bereiche, wie z. B. Medizin und Biowissenschaften. Dieser Prozess ist auch in kommerziellen Bereichen wichtig, wie z. B. bei der Herstellung von viralen Impfstoffen, rekombinanten Proteinen, viralen Antigenen oder antiviralen Wirkstoffen. Viele Methoden oder Assays können für die Virusquantifizierung verwendet werden12. Die Wahl der Methoden oder Assays hängt in der Regel von den Eigenschaften des Virus, dem gewünschten Genauigkeitsgrad und der Art des Experiments oder der Forschung ab. Im Allgemeinen können Methoden zur Quantifizierung von Viren in zwei Kategorien unterteilt werden: molekulare Assays, die das Vorhandensein von viraler Nukleinsäure (DNA oder RNA) nachweisen, und Assays, die die Virusinfektiosität in vitro messen 12. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR, für DNA) oder die quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR, für RNA)13 und die digitale Tröpfchen-PCR14 sind Beispiele für gängige molekulare Techniken, die zur Quantifizierung der viralen Nukleinsäure in einer bestimmten Probe verwendet werden15. Diese hochempfindlichen molekularen Techniken können jedoch nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Viren unterscheiden15. Daher können Forschungsarbeiten, die Informationen über biologische Merkmale wie die Infektiosität von Viren auf Zellen erfordern, nicht mit den oben genannten molekularen Techniken abgeschlossen werden. Es werden Assays benötigt, die das Vorhandensein lebensfähiger Viren messen und bestimmen können. Zu den Assays, die die Virusinfektiosität messen, gehören der Plaque-bildende Assay (PFA), die infektiöse Dosis von 50 % der Gewebekultur (TCID50), der Fluoreszenz-Fokus-Assay und die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)12.

Die PFA, die 1952 von Renato Dulbecco entwickelt wurde, ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Virustitration, auch für ZIKV16. Es wird verwendet, um die Viruskonzentrationen für infektiöse lytische Virionen direkt zu bestimmen. Die Methode basiert auf der Fähigkeit eines lytischen Virus, zytopathische Effekte (CPEs; Zelltodzonen oder Plaques, ein Infektionsbereich, der von nicht infizierten Zellen umgeben ist) in einer inokulierten Zellmonoschicht nach einer Virusinfektion hervorzurufen. Der Assay hat jedoch mehrere Nachteile, die sich auf seinen Nutzen auswirken. Der Assay ist zeitaufwändig (dauert ca. 7-10 Tage, je nach Viren), CPE-abhängig und fehleranfällig. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine immunkolorimetrische Technik, den Focus Forming Assay (FFA), zum Nachweis und zur Quantifizierung von ZIKV in 24-Well-Platten- und 96-Well-Plattenformaten.

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Protocol

1. Virusvermehrung

  1. Vorbereitung der Zellen
    1. Züchten Sie Vero-Zellen in einem 75cm großen 2-Zellkulturkolben, der 12 ml modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco enthält, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 2 mM L-Glutamin (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2.
    2. Überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop; Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 90 % erreicht haben, sind sie einsatzbereit (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Die Vero-Zellen verdoppeln sich etwa alle 24 Stunden17. Verdünnungen von 1:10 sollten 3 bis 4 Tage dauern, um eine Konfluenz von 80 % bis 90 % in einem 75 cm2-Kolben zu erreichen. Überwachen Sie die Zellen täglich oder jeden zweiten Tag.
  2. Infektion der Zellmonoschicht
    1. Entnehmen Sie das Wachstumsmedium mit einer serologischen 10-ml-Pipette aus dem Zellkulturkolben. Spülen Sie den Kolben mit 3 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (dPBS) von Dulbecco 2x mit einer serologischen Pipette von 5 ml.
      HINWEIS: Ein Becherglas mit 10 % Natriumhypochlorit muss vorbereitet werden, um weggeworfene infektiöse flüssige Abfälle aus Kolben/Platten zu desinfizieren.
    2. 2 ml serumfreies DMEM (DMEM ergänzt mit 2 mM L-Glutamin ohne FBS) und 20 μl ZIKV-Inokulum in den Zellkulturkolben geben. Der Kolben wird 1 h lang bei Raumtemperatur mit leichtem Schaukeln inkubiert, um die Virusadsorption zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die Titration des ZIKV-Ausgangsbestands ist hilfreich, um das Volumen der ZIKV-Inokulum-Zugabe zu bestimmen (Schritt 2).
      ACHTUNG: ZIKV ist als Erreger der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) eingestuft. Alle Verfahren mit ZIKV-haltigen Materialien müssen in einer zertifizierten Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden und alle Standardarbeitsanweisungen (SOPs) des Labors mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung befolgen.
  3. Zugabe des Overlay-Mediums
    1. Nach der 1-stündigen Inkubation wird das verdünnte Virusinokulum mit einer serologischen 5-ml-Pipette entnommen und verworfen. Spülen Sie den Zellkulturkolben 2x mit 3 ml dPBS aus.
    2. Geben Sie 12 ml Erhaltungsmedien (DMEM ergänzt mit 2 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin) in den Zellkulturkolben, um die infizierten Zellen zu erhalten.
    3. Inkubieren Sie die infizierten Vero-Zellen für 3 Tage in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2.
      HINWEIS: Überwachen Sie täglich unter dem Mikroskop auf das CPE infizierter Vero-Zellen.
  4. Gewinnung von ZIKV-haltigem Zellkulturüberstand
    1. Am Tag 3 nach der Infektion kann eine Zellrundung und -ablösung (CPE) beobachtet werden (Abbildung 1B-D). Entnehmen Sie den Zellkulturüberstand, der das ZIKV enthält, mit einer serologischen 10-ml-Pipette in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
    2. Verwenden Sie einen 0,22 μm Polyethersulfon-Spritzenvorsatz (siehe Materialtabelle), um den Zellkulturüberstand zu filtrieren. 500 μl des filtrierten Zellkulturüberstandes in 2,0-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss aliquotieren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Geerntetes ZIKV kann bei -80 °C gelagert werden, um eine langfristige Lagerung zu ermöglichen.
      VORSICHT: Bei der Verwendung einer Spritzennadel müssen zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, da die Nadel die Haut durchstechen kann. Es müssen SOPs für das Labor festgelegt werden.

2. Quantifizierung des Virus

  1. Vorbereitung der Zellen
    1. Besiedeln Sie Vero-Zellen in dafür vorgesehenen Platten (24-Well-Platte: 0,5 ml/Well, 7,5 x 104 Zellen/Well; 96-Well-Platte: 0,1 ml/Well, 1,5 x 104 Zellen/Well) und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
      HINWEIS: Es gibt fünf verschiedene Zeitpunkte, die getestet werden müssen (24-Well-Platte: 48 Stunden, 60 Stunden, 72 Stunden, 84 Stunden und 96 Stunden nach der Infektion; 96-Well-Platte: 24 Stunden, 36 Stunden, 48 Stunden, 60 Stunden und 72 Stunden nach der Infektion); Bereiten Sie daher für jeden Zeitpunkt einen Teller vor.
    2. Nach der 24-stündigen Inkubation und sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 90 % erreicht haben (Abbildung 1E), ist die Platte bereit für die Infektion. Fahren Sie mit der Vorbereitung des verdünnten Virusbestands (Schritt 2.2) fort, bevor Sie die Zellmonoschicht infizieren.
  2. Verdünnung des Virus
    1. Bereiten Sie für 24- und 96-Well-Platten sechs sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Platte vor, um eine zehnfache Verdünnung (10-1 bis 10-5) durchzuführen, einschließlich einer Negativkontrolle. Für den Versuchsaufbau für eine 24-Well-Platte werden 450 μl serumfreies DMEM in alle sechs Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Für den Versuchsaufbau für eine 96-Well-Platte geben Sie 135 μl serumfreies DMEM in sechs Röhrchen.
      HINWEIS: Beschriften Sie jedes Röhrchen deutlich, um die Verdünnung seines Inhalts anzugeben, bevor Sie die zehnfache serielle Verdünnung durchführen.
    2. Um eine serielle Verdünnung durchzuführen, geben Sie für den 24-Well-Plattenversuchsaufbau 50 μl ZIKV-Stamm, der aus Schritt 1 geerntet wurde, in das 10-1-Röhrchen , das 450 μl serumfreies DMEM enthält. Für den 96-Well-Plattenversuchsaufbau geben Sie 15 μl ZIKV-Stamm in das 10-1-Röhrchen , das 135 μl serumfreies DMEM enthält.
    3. Wirbeln Sie jedes Röhrchen, um das Virus und das Medium zu vermischen. Dies ist die erste zehnfache Verdünnung.
      HINWEIS: Eine ordnungsgemäße Mischung von Virus und Kulturmedium in jedem Verdünnungsröhrchen ist erforderlich, um eine genaue serielle Verdünnung zu gewährleisten.
    4. Verwenden Sie für den 24-Well-Plattenversuchsaufbau eine frische Pipettenspitze, um das 10-1-Röhrchen zu resuspendieren, und überführen Sie 50 μl verdünntes ZIKV als zweite zehnfache Verdünnung in das 10-2-Röhrchen . Verwenden Sie für den 96-Well-Plattenversuchsaufbau eine frische Pipettenspitze, um das 10-1-Röhrchen zu resuspendieren und 15 μl verdünntes ZIKV als zweite zehnfache Verdünnung in das 10-2-Röhrchen zu überführen.
    5. Schritt 2.2.4 viermal bis zum fünften Röhrchen wiederholen (Negativkontrolle ausschließen).
      HINWEIS: Verwenden Sie nach jedem Pipettierschritt eine frische Pipettenspitze, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
  3. Infektion der Zellmonoschicht
    1. Entfernen und entsorgen Sie das konditionierte Medium aus jeder Vertiefung (24-Well-Platte: 0,5 ml/Well; 96-Well-Platte: 0,1 ml/Well).
    2. Spülen Sie jede Vertiefung 2x mit dPBS (24-Well-Platte: 300 μl/Well; 96-Well-Platte: 60 μl/Well).
    3. Arbeiten Sie von der höchsten zur niedrigsten Verdünnung und geben Sie jedes seriell verdünnte Virusinokulum in die Vertiefung (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μl/Well).
      HINWEIS: Die Infektion jeder Verdünnung wird in duplizierten Vertiefungen durchgeführt. Behalten Sie zwei nicht infizierte Vertiefungen als Negativkontrolle bei. Beschriften Sie die Platte und die Vertiefungen deutlich, um Verwechslungen zu vermeiden. Wechseln Sie die Pipettenspitzen nach jedem Pipettierschritt, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
    4. Inkubieren Sie die Platte mit leichtem Schaukeln für 1 h bei Raumtemperatur, um eine Virusadsorption zu ermöglichen.
  4. Zugabe des Overlay-Zellkulturmediums
    1. Nach 1 Stunde Inkubation wird die Virussuspension von der niedrigsten zur höchsten Konzentration entfernt und verworfen.
    2. Waschen Sie die infizierten Zellen 2x mit dPBS (24-Well-Platte: 300 μl/Well; 96-Well-Platte: 60 μL/Well).
    3. Überlagern Sie die Vertiefung mit DMEM (ergänzt mit 2 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin) und 1,5 % niedrigviskoser Carboxymethylcellulose (CMC; siehe Materialtabelle) (24-Well-Platte: 1 ml/Well; 96-Well-Platte: 0,2 ml/Well).
    4. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2.
      HINWEIS: Stören Sie die Platte während dieser Inkubationszeit nicht.
    5. Nehmen Sie die Platte aus dem Zellkultur-Inkubator, um sie zu verschiedenen Zeitpunkten zu färben (24-Well-Platte: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h und 96 h nach der Infektion; 96-Well-Platte: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h und 72 h nach der Infektion).

3. Färbung

  1. Zell-Fixierung
    1. Nach den spezifischen Stunden der Inkubation (24-Well-Platte: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h und 96 h nach der Infektion; 96-Well-Platte: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h und 72 h nach der Infektion) entfernen und verwerfen Sie das Overlay-Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 1x PBS. Für die 96-Well-Platte entfernen und entsorgen Sie das Overlay-Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 60 μl/Well von 1x PBS mit einer Mehrkanalpipette.
    2. Fügen Sie 4 % Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen zu fixieren (24-Well-Platte: 300 μl/Well; 96-Well-Platte: 60 μL/Well). Die Platte bei Raumtemperatur 20 Minuten lang inkubieren.
      ACHTUNG: Paraformaldehyd ist ein festes polymerisiertes Formaldehyd. Es ist ein brennbares, festes, weißes kristallines Pulver, das Formaldehydgas freisetzt, wenn es mit Wasser gemischt oder erhitzt wird. Alle Verfahren, bei denen Paraformaldehyd verwendet wird, müssen in einem zertifizierten chemischen Abzug oder in zugelassenen abgesaugten Gehäusen gemäß den für formaldehydhaltige Chemikalien spezifischen Labor-SOPs durchgeführt werden.
    3. Nach 20 min das Paraformaldehyd entsorgen und die Zellen 3x mit 1x PBS waschen. Führen Sie Permeabilisierung, Blockierung und Antikörperinkubationen gemäß den Schritten 3.2 bis 3.5 durch.
      HINWEIS: Wenn Sie 4% Paraformaldehyd entsorgen, befolgen Sie das Abfallentsorgungsverfahren der Universität oder des Instituts.
  2. Permeabilisierung von Zellen
    1. Fügen Sie 1 % Octylphenoxy-Poly(ethylenoxy)ethanol hinzu (siehe Materialtabelle), um die Zellen zu permeabilisieren (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μL/Well). Die Platte bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubieren.
    2. Nach 15 min wird das Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol verworfen und die Zellen 3x mit 1x PBS gewaschen.
  3. Blockierend
    1. Fügen Sie 3 % Magermilch hinzu, um die unspezifische Bindung in der Probe zu verringern (24-Well-Platte: 500 μl/Well; 96-Well-Platte: 100 μL/Well). Die Platte 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Nach 2 h die 3%ige Magermilch entsorgen und die Zellen 3x mit 1x PBS waschen.
      HINWEIS: Dies ist ein Haltepunkt. Nach Zugabe von 3 % Magermilch können die Platten bis zu 2 Tage vor der Insertion des Primärantikörpers bei 4 °C gelagert werden.
  4. Inkubation von Primärantikörpern
    1. Der monoklonale Anti-Flavivirus-Antikörper 4G2 (Klon D1-4G2-4-15; Primärantikörper, siehe Materialtabelle) wird in 1 %iger Magermilch (Verhältnis 1:1.000) verdünnt (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μl/Well) zugegeben. Die Platte 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Nach 1 h wird die Lösung, die den monoklonalen Antikörper enthält, entnommen und die Zellen 3x mit 1x PBS gewaschen.
  5. Inkubation von Sekundärantikörpern
    1. Sekundärer Anti-Maus-IgG-Antikörper gegen Ziegen, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) (siehe Materialtabelle), verdünnt in 1 % Magermilch (Verhältnis 1:1.000) (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μl/Well). Die Platten 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Nach 1 h wird die Lösung, die den sekundären Antikörper enthält, entnommen und die Zellen 3x mit 1x PBS gewaschen.
  6. Substrat-Inkubation
    1. Fügen Sie 3,3'Diaminobenzidin (DAB)-Peroxidase-Substrat hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μL/Well). Nach 30 Minuten stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Vertiefungen mit Wasser waschen.
    2. Lassen Sie die Platten über Nacht an der Luft trocknen und fahren Sie mit der Schwerpunktzählung fort, nachdem die Platten vollständig getrocknet sind.

4. Bestimmung des Virustiters

  1. Manueller Foci-Zählprozess (24-Well-Format)
    1. Die Herde können unter dem Stereomikroskop sichtbar gemacht werden. Wählen Sie die Verdünnung, die 50-200 Foci ergibt.
    2. Zählen Sie die Herde für jede Wiederholung der ausgewählten Verdünnung. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Brennpunkte für jede der ausgewählten Verdünnungen.
    3. Berechnen Sie die focibildende Einheit pro ml (FFU/ml) für jede Probe mit der folgenden Formel: FFU/ml = durchschnittliche Anzahl der gezählten Herde/(Verdünnung x Volumen des zugegebenen verdünnten Virus).
  2. Automatisierter Foci-Zählprozess (96-Well-Format)
    1. Scannen Sie die 96-Well-Platte mit einem kommerziellen Software-Analysator.
      1. Doppelklicken Sie auf die Software (siehe Materialtabelle), um sie zu öffnen.
      2. Klicken Sie auf Switch Suites und stellen Sie sicher, dass die Suite auf eine anwendbare Suite umgestellt wird (Ergänzende Abbildung 1A). Klicken Sie auf OK.
      3. Beginnen Sie den Scan, indem Sie auf Scan > Vollständiger Plattenscan klicken (Ergänzende Abbildung 1B).
      4. Klicken Sie auf Dashboard , um sicherzustellen, dass es sich bei dem Erfassungsformat um das 96-Well-Format handelt (Ergänzende Abbildung 2A).
      5. Wählen Sie den Zentrierungsmodus als "Automatische Vorausrichtung, benutzerverifiziert" (ergänzende Abbildung 2B).
      6. Klicken Sie auf Auswerfen , um die Platte zu laden.
        HINWEIS: Öffnen Sie den Deckel der Platte und legen Sie sie mit Reihe A nach oben (Ergänzende Abbildung 3A).
      7. Geben Sie den Kennzeichennamen ein und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Laden , um die Platte zu laden.
      8. Klicken Sie auf Start , um den Scan zu starten. Kalibrieren Sie anschließend die Positionen für A1, A12 und H1 mit den Schaltflächen "Oben, Unten, Links, Rechts" und klicken Sie auf Bestätigen (Ergänzende Abbildung 3B).
        HINWEIS: Die Software beginnt mit dem Scannen der einzelnen Vertiefungen.
      9. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, wird ein Übersichtsbild angezeigt. Klicken Sie auf Schließen.
      10. Beenden Sie den Scan, indem Sie auf Zurück zur Übersicht klicken.
    2. Zählen Sie die 96-Well-Platte mit der Software.
      1. Klicken Sie auf Anzahl > Smart Count.
      2. In der Software wird "Schritt 1 von 5: Zu zählende Platten auswählen" angezeigt. Klicken Sie auf Platte(n) laden. Markieren Sie den gesamten Ordner und klicken Sie auf Auswählen , um die gescannte Platte zu importieren (ergänzende Abbildung 4A).
      3. In der Software wird "Schritt 2 von 5: Zählparameter definieren" angezeigt. Klicken Sie auf Parameter anpassen, und die Parameter werden angezeigt (diffuser Prozess; klein/normal/groß/größte/größter +1; Punkttrennung; gezählte Fläche; Hintergrundbalance; Faserentfernung; Gating).
        HINWEIS: Beginnen Sie mit einer Vertiefung und schauen Sie hin und her, um die besten Einstellungen für alle Vertiefungen zu finden.
      4. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Weiter (Ergänzende Abbildung 4B).
      5. In der Software wird "Schritt 3 von 5: Auswählen/Abwählen von Wells" angezeigt. Sobald die Auswahl der zu zählenden Vertiefung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Weiter , um fortzufahren.
        HINWEIS: Die Wells, die für die Zählung ausgewählt wurden, werden mit einem "C" in der oberen rechten Ecke jedes Wells angezeigt (Ergänzende Abbildung 5A).
      6. In der Software wird "Schritt 4 von 5: Ausgabeeinstellungen" angezeigt. Klicken Sie auf Ausgabeeinstellungen anzeigen/ändern , um zu überprüfen, ob die Einstellungen (z. B. Bildformat) geeignet sind. Klicken Sie auf Speichern und beenden > Weiter (ergänzende Abbildung 5B).
      7. In der Software wird "Schritt 5 von 5: AutoCount starten" angezeigt. Klicken Sie auf AutoCount starten (ergänzende Abbildung 6A).
      8. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf AutoCount beenden.
  3. Führen Sie eine Qualitätskontrolle (QC) im kommerziellen Software-Analysator durch.
    1. Klicken Sie auf der Übersichtsseite auf Qualitätskontrolle > Platte(n) hinzufügen. Kreuzen Sie den gesamten Ordner an, um die gezählte Platte zu importieren, klicken Sie auf Auswählen > QC starten (ergänzende Abbildung 6B).
    2. Doppelklicken Sie auf jede Vertiefung, um die Stellen zu überprüfen. Klicken Sie auf Zählen , um alle Flecken zu entfernen. Die Software beginnt mit der Zählung.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass "Flecken: Entfernen" aktiviert ist. Der Abschluss der Zählung kann durch die gezählte Anzahl der Brennpunkte angezeigt werden, z.B. "30" (Ergänzende Abbildung 7A).
    3. Sobald die Zählung beendet ist (angezeigt durch die Anzahl der gezählten Herde, z. B. "30"), klicken Sie auf "Ja", um Flecken zu entfernen (Ergänzende Abbildung 7B). Klicken Sie dreimal mit der linken Maustaste auf die Stelle, die entfernt werden soll. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um den Vorgang abzuschließen, und klicken Sie dann auf Ja.
    4. Klicken Sie auf Platte fertigstellen und gehen Sie zur Projektübersicht, sobald die Qualitätskontrolle abgeschlossen ist.
  4. Führen Sie die Bildgebung mit dem Software-Analysator durch.
    1. Überprüfen Sie das gescannte, gezählte und QC-Plattenbild (Abbildung 2).

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Representative Results

ZIKV kann mit Hilfe der FFA quantifiziert werden, wie in Abbildung 3 schematisch dargestellt. Für die 24-Well-Platte wurden die infizierten Vero-Zellen 48 h, 60 h, 72 h, 84 h und 96 h nach der Infektion fixiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen auch 96 h (4 Tage) nach der Infektion intakt blieben (es wurde keine Zellablösung beobachtet) (Abbildung 4 und ergänzende Abbildung 8A-E). Das Auftreten von Virusherden wurde erstmals 48 h (2 Tage) nach der Infektion beobachtet (Abbildung 4A-F). Die Foci-Größe war jedoch zu klein, was es schwierig machte, die Foci genau zu zählen. Die optimale Herdgröße wurde 60 h (2,5 Tage) nach der Infektion erreicht (Abbildung 4B). Zu den späteren Zeitpunkten (72 h, 84 h und 96 h nach der Infektion) waren die Herde größer und neigten dazu, zu verschmelzen oder sich zu überlappen. Die verschmolzenen oder überlappenden Herde nahmen im Laufe der Zeit zu (Abbildung 4C-E). Daher wurden Herde, die sich 60 h (2,5 Tage) nach der Infektion bildeten, ausgewählt, um den ZIKV-Titer in einer 24-Well-Platte zu bestimmen (Abbildung 4B).

Für die 96-Well-Platte wurden die infizierten Vero-Zellen 24 h, 36 h, 48 h, 60 h und 72 h nach der Infektion fixiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen nach 72 h (3 Tage) nach der Infektion intakt blieben (Abbildung 5A-F und ergänzende Abbildung 9A-E). Das Auftreten von Virusherden wurde erstmals 24 Stunden (1 Tag) nach der Infektion beobachtet (Abbildung 5A). Bis zu 36 Stunden (1,5 Tage) nach der Infektion war die Herde jedoch zu klein, was es schwierig machte, die Anzahl der Herde genau zu bestimmen (Abbildung 5A,B). Die optimale Herdgröße wurde 48 h (2 Tage) nach der Infektion erreicht (Abbildung 5C). Zu den späteren Zeitpunkten (60 h und 72 h nach der Infektion) wurden überlappende oder verschmolzene Herde beobachtet, und die Anzahl der überlappenden Herde nahm im Laufe der Zeit zu (Abbildung 5D,E). Daher wurden Herde, die sich 48 h (2 Tage) nach der Infektion bildeten, ausgewählt, um den Virustiter von ZIKV-Isolaten zu bestimmen (Abbildung 5C). Die Herdebildung kann alternativ mit kommerziellen Software-Analysatoren visualisiert und gezählt werden.

Figure 1
Abbildung 1: Mikroskopische Aufnahme von Vero-Zellen. (A) Vero-Zellen zeigten in 40-facher Vergrößerung eine 70%-90%ige Konfluenz in einem 75 cm2 Zellkulturkolben für die Virusvermehrung. (B) CPE auf Vero-Zellen nach Infektion mit ZIKV am Tag 1 nach der Infektion bei 100-facher Vergrößerung. (C) CPE auf Vero-Zellen nach Infektion mit ZIKV am Tag 2 nach der Infektion bei 100-facher Vergrößerung. (D) CPE auf Vero-Zellen nach Infektion mit ZIKV am Tag 3 nach der Infektion bei 100-facher Vergrößerung. (E) Vero-Zellen zeigten bei 40-facher Vergrößerung eine Konfluenz von 70%-90% in einer 24-Well-Platte nach 24 h Inkubation zur Virusquantifizierung. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Bild einer gescannten, gezählten und mit einem kommerziellen Software-Analysator überprüften Kontrollplatte im 96-Well-Format. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ablauf der Färbung für den focibildenden Assay. Die Färbeprozesse umfassen Zellfixierung, Permeabilisierung, Blockierung, Antikörperbindung und Inkubation mit Peroxidase-Substrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Foci-bildender Assay für ZIKV P6-740 in 24-Well-Platten zu verschiedenen Zeitpunkten. (A) Die Foci sind am Tag 2 (48 h) nach der Infektion weniger ausgeprägt. (B) Die optimale Herdgröße ist am Tag 2,5 (60 h) nach der Infektion zu sehen. (C-E) Die Herde sind an Tag 3 (72 h), Tag 3,5 (84 h) und Tag 4 (96 h) nach der Infektion zusammengeführt. (F) Negativkontrolle der Platte. Maßstab: 1.000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Foci-bildender Assay für ZIKV P6-740 in 96-Well-Platten zu verschiedenen Zeitpunkten. (A) Die Herde sind am Tag 1 (24 Stunden) nach der Infektion auf dem kommerziellen Software-Analysator weniger ausgeprägt. (B) Die Herde sind am Tag 1,5 (36 h) nach der Infektion auf dem kommerziellen Software-Analysator weniger ausgeprägt. (C) Die optimale Herdgröße ist am Tag 2 (48 h) nach der Infektion zu sehen. (D,E) Die Herde sind an Tag 2,5 (60 h) und Tag 3 (72 h) nach der Infektion verschmolzen. (F) Negativkontrolle der Platte. Maßstab: 1.000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Screenshots der Startseite des kommerziellen Software-Analyzers. (A) Wechseln Sie die Suite zu einer beliebigen Suite auf dem kommerziellen Software-Analysator. Klicken Sie anschließend auf "OK". (B) Um mit dem Scannen auf dem kommerziellen Software-Analysator zu beginnen, klicken Sie auf "Scannen" und dann auf "Vollständiger Plattenscan". Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Screenshots zur Anzeige des "Aufnahmeformats" und des ausgewählten Zentrierungsmodus als "Auto Prealignment User Verified" auf dem kommerziellen Software-Analysator. (A) Um das Aufnahmeformat anzuzeigen, klicken Sie auf "Dashboard" und wählen Sie das 96-Well-Format als Aufnahmeformat aus. (B) Wählen Sie für den Zentriermodus "Automatische Vorausrichtung, vom Benutzer verifiziert". Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Platzierung der 96-Well-Platte auf dem Plattenleser-Tray des kommerziellen Software-Analysators und ein Screenshot zur Kalibrierung der Positionen für die Wells A1, A12 und H1. (A) Legen Sie die Platte mit Reihe A nach oben. (B) Um die Positionen für die Wells A1, A12 und H1 zu kalibrieren, verwenden Sie die Tasten "Up, Down, Left, Right". Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf "Bestätigen". Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Screenshots zur Auswahl von Ordnern mit gescannten Platten für die Zählung mit dem kommerziellen Software-Analysator und "Schritt 2 von 5: Zählparameter definieren". (A) Um die gescannten Platten zu zählen, klicken Sie auf "Platte(n) laden". Markieren Sie den gesamten Ordner und klicken Sie auf "Auswählen", um die gescannten Platten zu importieren. (B) Passen Sie die Zählparameter an. Klicken Sie auf "Weiter", sobald die Parameter eingestellt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Screenshots des kommerziellen Software-Analysators "Schritt 3 von 5: Wells auswählen/abwählen" und "Schritt 4 von 5: Ausgabeeinstellungen". (A) Wählen Sie die zu zählenden Vertiefungen aus und heben Sie die Auswahl auf und klicken Sie anschließend auf "Weiter". (B) Klicken Sie für die Ausgabeeinstellungen auf "Ausgabeeinstellungen anzeigen/ändern", um zu überprüfen, ob die Einstellungen geeignet sind (z. B. Bildformat). Klicken Sie auf "Speichern und Beenden", wenn Sie fertig sind, und klicken Sie dann auf "Weiter". Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Screenshots des kommerziellen Software-Analysators "Schritt 5 von 5: AutoCount starten" und der Qualitätskontrollseite. (A) Wenn Sie für die Plattenzählung bereit sind, klicken Sie auf "AutoCount starten". (B) Markieren Sie auf der Qualitätskontrollseite den gesamten Ordner, um die gezählte Platte zu importieren, klicken Sie auf "Auswählen" und dann auf "QC starten". Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Screenshots der Qualitätskontrollseite für den kommerziellen Software-Analysator. (A) Doppelklicken Sie auf jedes Well, um Spots zu prüfen. Klicken Sie auf "Zählen", um einen beliebigen Fleck zu entfernen. Setzen Sie ein Häkchen bei "Flecken: Entfernen". (B) Dreifacher Linksklick, um Flecken zu entfernen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um den Vorgang abzuschließen, und klicken Sie dann auf "Ja". Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Foci-bildender Assay für ZIKV P6-740 in 24-Well-Platten zu verschiedenen Zeitpunkten. Eine zehnfache serielle Verdünnung (10-1 bis 10-5) wurde am ZIKV P6-740 durchgeführt und die Infektion wurde an Vero-Zellen in zweifacher Ausführung, einschließlich einer Negativkontrolle, durchgeführt. Ein Rohdatenbild wurde mit einem Stereomikroskop aufgenommen, wobei der Maßstabsbalken 1.000 μm anzeigte. (A) Tag 2 (48 h) nach der Infektion. (B) Tag 2,5 (60 h) nach der Infektion. (C) Tag 3 (72 Stunden) nach der Infektion. (D) Tag 3,5 (84 Stunden) nach der Infektion. (E) Tag 4 (96 Stunden) nach der Infektion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 9: Foci-bildender Assay für ZIKV P6-740 in 96-Well-Platten zu verschiedenen Zeitpunkten. Eine zehnfache serielle Verdünnung (10-1 bis 10-5) wurde am ZIKV P6-740 durchgeführt und die Infektion wurde an Vero-Zellen in zweifacher Ausführung, einschließlich einer Negativkontrolle, durchgeführt. Ein Rohdatenbild wurde mit einem Stereomikroskop aufgenommen, wobei der Maßstabsbalken 1.000 μm anzeigte. (A) Tag 1 (24 Stunden) nach der Infektion. (B) Tag 1,5 (36 Stunden) nach der Infektion. (C) Tag 2 (48 Stunden) nach der Infektion. (D) Tag 2,5 (60 Stunden) nach der Infektion. (E) Tag 3 (72 Stunden) nach der Infektion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Es gibt mehrere Assays, um den Virustiter zu bestimmen. Die PFA hat ein ähnliches Protokoll zur Virusquantifizierung wie die FFA, bei der das Virusinokulum verdünnt wird, um die Unterscheidung einzelner Plaques oder Herde zu ermöglichen. Nach der Färbung weist jede Plaque oder jeder Herd auf ein einzelnes infektiöses Partikel im Inokulum19 hin. Das PFA wird mit Kristallviolett gefärbt, um die Plaquebildung durch Zelllyse oder Zelltod sichtbar zu machen. Daher ist die PFA zeitaufwändiger, da sie länger dauert, bis das Virus CPEs verursacht, und sie ist nur auf die Viren beschränkt, die die Zelllyse oder den Zelltod induzieren. Viele Laboratorien haben FFAs erfolgreich eingesetzt, um infektiöse Virustiter für Flaviviren zu bestimmen, darunter ZIKV 19,20,21,22,23,24,25. Die FFA ist eine zellbasierte kolorimetrische Immunnachweismethode, die das virale Antigen mit Antikörpern nachweist und daher die Herde infizierter Zellen mit der Immunfärbetechnik identifiziert, nicht aber Plaques 12,26. Die FFA bietet dem ZIKV einige Vorteile gegenüber der PFA. Ein klarer Vorteil ist, dass es auf der Antikörpererkennung von Viruskomponenten ohne erkennbare CPEs basiert. Darüber hinaus ist die Verwendung virusspezifischer Antikörper auch nützlich, um verschiedene Viren oder virale Serotypen in gemischten Populationen zu identifizieren27. Daher ist die FFA spezifischer als die PFA, da sie alle Virusinfektionen misst und nicht von den Viren abhängig ist, die genügend Zelltod verursachen, um eine sichtbare Plaque zu bilden28. Die FFA hat auch eine kürzere Inkubationszeit als die PFA, was eine offensichtliche CPE erfordert, die Zelllyse und -tod bedeutet. Schließlich bietet die FFA-Methode unter Verwendung einer 96-Well-Platte den Vorteil, dass mehr Replikate und größere Verdünnungen verwendet werden, um das Virus nachzuweisen und zu titrieren27,29. Darüber hinaus kann der berichtete FFA-Assay leicht für Virusneutralisationstests und Methoden zum Screening auf antivirale Verbindungen angepasst werden. Durch die Integration kommerzieller oder kostenloser automatisierter Zellzählinstrumente oder -software kann die Benutzerfreundlichkeit (Konsistenz, Genauigkeit, Durchsatz) der FFA und der damit verbundenen Methoden weiter verbessert werden.

Beim Vergleich der 24-Well-Platte mit der 96-Well-Platte ist es wichtig zu beachten, dass das 24-Well-Format eine größere Anzahl von Zellen erfordert, die in Monolayer-Kulturen gezüchtet werden müssen, sowie größere Mengen an Medien und Virusbeständen. Daher ist das 24-Well-Plattenformat möglicherweise nicht für die Verwendung mit Proben mit begrenztem Volumen geeignet. Diese Einschränkung kann durch die Verwendung des 96-Well-Formats, wie in diesem Dokument beschrieben, überwunden werden. Erstens benötigt das 96-Well-Format weniger Material, was es zu einer kostengünstigeren Option macht. Darüber hinaus ermöglicht die automatisierte Zählung der gefärbten Virusherde im 96-Well-Format einen hohen Durchsatz und eine schnelle Analyse, was im 24-Well-Format, das eine manuelle Zählung erfordert, nicht möglich ist. Dieser automatisierte Zählprozess erhöht auch die Reproduzierbarkeit und reduziert die Subjektivität im Vergleich zur manuellen Zählung, was zu genaueren und zuverlässigeren Ergebnissen der FFA führt. Daher ist das 96-Well-Format mit automatisierten Bildgebungssystemen sehr empfehlenswert für Labore, die einen hohen Durchsatz und eine zuverlässige Virusquantifizierung benötigen.

Auf der anderen Seite verwenden einige Menschen den Immunfluoreszenz-Fokus-Assay, um ZIKV 25,27,28,30,31 nachzuweisen. Der Immunfluoreszenz-Fokus-Assay ähnelt dem FFA, mit der Ausnahme, dass er durch Immunfärbung der Antigene mit Fluorochrom-konjugierten spezifischen Antikörpern durchgeführt wird, gefolgt von der Zählung der Infektionsherde unter einem Fluoreszenzmikroskop25. Dieser Assay verwendet teurere Reagenzien und benötigt Fluoreszenzmikroskopie, um den Assay zu vervollständigen. Daher ist der Immunfluoreszenz-Fokus-Assay auf besser ausgestattete Labore, wie z. B. Referenzlabore, beschränkt. Es ist nicht einfach, diesen Assay in einem ressourcenintensiven Umfeld zu verwenden.

Obwohl die FFA viele Vorteile hat, hat sie auch einige Einschränkungen. Im Vergleich zu anderen Assays, wie z. B. dem PFA, umfasst der FFA mehr Schritte während des Färbeprozesses. Während die Schritte nach der Fixierung flexibel sind und Übernachtungs- oder längere Pausen zulassen, dauert die Färbung der Herde immer noch länger. Darüber hinaus verlangt die FFA spezifische oder kreuzreagierende Antikörper im Färbeprozess, was ihre Anwendbarkeit für die Identifizierung und Quantifizierung neuer oder neuartiger Viren einschränkt. Darüber hinaus sind die Kosten für die FFA höher als für die PFA, die nur Kristallviolett für die Färbung benötigt. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass der automatisierte Zählprozess (96-Well-Format) nur in einem Labor mit der entsprechenden Ausrüstung durchgeführt werden kann. Daher ist es nicht für Labore ohne die erforderliche Ausrüstung geeignet.

Abschließend berichten wir über detaillierte Protokolle für die Vermehrung und Quantifizierung von ZIKV unter Verwendung des zellbasierten kolorimetrischen Immundetektionsassays oder der FFA in 24-Well-Platten- und 96-Well-Plattenformaten. Die Methode bietet eine Reihe praktischer Vorteile gegenüber der klassischen PFA. Es ist schneller und eignet sich für Anwendungen mit hohem Durchsatz, wenn es mit einem automatisierten Bildgebungssystem für die Foci-Zählung angewendet wird. Die Standardisierung zuverlässiger Protokolle für diese Studie wird einen großen Beitrag zur Zika-Forschung leisten und kann auch auf breiter Basis angepasst werden, um andere klinisch wichtige Viren zu quantifizieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde vom malaysischen Ministerium für Hochschulbildung im Rahmen des Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) und der Finanzierung des Higher Institution Centre of Excellence (HICoE)-Programms (MO002-2019) unterstützt. Abbildung 3 in dieser Studie, die zeigt, dass der Ablauf der Färbung für den focibildenden Assay aus "DAB Immunohistochemistry" von BioRender.com (2022) übernommen wurde. Abgerufen von https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 194 Zika-Virus (ZIKV) Flavivirus Angeborene Hirnanomalien Guillain-Barr-Syndrom© Virologie Fokusbildender Assay (FFA) Virales Antigen Peroxidase-Immunfärbetechnik 24-Well-Format 96-Well-Format Foci-Größenoptimierung Vero-Zellen Inkubation Färbeprozesse Zellfixierung Permeabilisierung Blockierung Antikörperbindung Peroxidase-Substrat
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