Summary
現在のプロトコルはVeroのアフリカの緑の猿の腎臓の細胞のジカウイルス(ZIKV)の伝播および24-wellおよび96-well(ハイスループット)フォーマットのセルベースの比色immunodetection方法を使用してZIKVの量化を記述する。
Abstract
ジカウイルス(ZIKV)は、 フラビウイルス属に属する蚊媒介ウイルスです。ZIKV感染は、成人の先天性脳異常およびギラン・バレー症候群の可能性と関連している。病気のメカニズムを理解するためのZIKVの研究は、ワクチンや治療法の開発を促進するために重要です。ウイルスを定量する方法は、ウイルス学の分野で重要かつ基本的です。焦点形成アッセイ(FFA)は、ペルオキシダーゼ免疫染色法を用いてウイルス抗原を抗体で検出し、細胞の感染病巣を同定するウイルス定量アッセイです。今回の研究では、24ウェルと96ウェル(ハイスループット)の両方のフォーマットを用いたウイルスの増殖および定量プロトコルについて説明しています。他の同様の研究と比較して、このプロトコルは、他のウイルスに対するこのアッセイの使用を拡大するためのガイドとして役立つ可能性のある焦点サイズの最適化をさらに説明しています。まず、ZIKVの増殖をVero細胞で3日間行います。ZIKVを含む培養上清を回収し、FFAを用いて定量します。簡単に説明すると、ウイルス培養物をVero細胞に接種し、2〜3日間インキュベートします。その後、細胞固定、透過処理、ブロッキング、抗体結合、ペルオキシダーゼ基質とのインキュベーションなど、最適化された染色プロセスを経て、病巣形成が決定されます。染色されたウイルス病巣は、実体顕微鏡(24ウェルフォーマットでの手動カウント)またはソフトウェアアナライザー(96ウェルフォーマットでの自動カウント)を使用して視覚化されます。FFAは、再現性のある比較的速い結果(3〜4日)を提供し、プラークを形成しないウイルスを含むさまざまなウイルスに使用するのに適しています。その後、このプロトコルはZIKV感染の研究に有用であり、他の臨床的に重要なウイルスの検出に使用できます。
Introduction
ジカウイルス(ZIKV)感染症は、蚊が媒介する新しいウイルス性疾患です。ZIKVの最初の孤立は1947年にウガンダで行われた1,2;1947年から2007年までは、臨床症状は無症候性であり、自己制限的な熱性疾患を特徴とするため、無視されたままでした。2007年、ジカ熱の流行はヤップ諸島で始まり3,4、続いて2013年から2014年にかけて太平洋地域(フランス領ポリネシア、イースター島、クック諸島、ニューカレドニア)でより大きな流行が続き5,6,7,8、重度の神経学的合併症であるギランバレー症候群(GBS)が初めて成人で報告されました9.2015年から2016年にかけて、早くも2013年にブラジルでZIKVのアジア遺伝子型が出現した後、最初の広範囲にわたるZIKVの流行が南北アメリカ大陸を席巻しました10。このアウトブレイクでは、新生児で44万〜130万件の小頭症やその他の神経障害が報告されました11。現在、ZIKV感染症の特定の治療法はありません。したがって、特に妊娠中の感染を予防できるZIKVワクチンの緊急の医学的必要性があります。
ウイルス定量は、サンプル中に存在するウイルスの数を決定するプロセスです。研究において重要な役割を担っており、学術研究所には医学や生命科学など多くの分野が関わっています。このプロセスは、ウイルスワクチン、組換えタンパク質、ウイルス抗原、抗ウイルス剤の製造などの商業分野でも重要です。ウイルスの定量には、多くの方法やアッセイを用いることができる12。方法やアッセイの選択は、通常、ウイルスの特性、望ましい精度のレベル、および実験や研究の性質によって異なります。一般に、ウイルスを定量する方法は、ウイルス核酸(DNAまたはRNA)の存在を検出する分子アッセイと、in vitroでウイルス感染性を測定するアッセイの2つのカテゴリーに分けることができます12。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR、DNA用)または定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR、RNA用)13およびデジタルドロップレットPCR14は、所与のサンプル中のウイルス核酸を定量するために使用される一般的な分子技術の例です15。しかし、これらの高感度の分子技術では、生存可能なウイルスと非生存可能なウイルスを区別することはできません15。そのため、細胞に対するウイルス感染力などの生物学的特徴に関する情報を必要とする研究は、上記の分子技術では完結できません。生存可能なウイルスの存在を測定および決定できるアッセイが必要です。ウイルスの感染性を測定するアッセイには、プラーク形成アッセイ(PFA)、50%組織培養感染線量(TCID50)、蛍光フォーカスアッセイ、透過型電子顕微鏡(TEM)などがあります12。
1952年にレナート・ダルベッコによって開発されたPFAは、ZIKV16を含むウイルス滴定に最も一般的に使用される方法の1つです。感染性溶解性ビリオンのウイルス濃度を直接測定するために使用されます。この方法は、溶解性ウイルスがウイルス感染後に接種された細胞単層に細胞変性効果(CPE、細胞死またはプラーク、感染していない細胞に囲まれた感染領域)を産生する能力に基づいています。しかし、このアッセイには、その有用性に影響を与えるいくつかの欠点があります。アッセイは時間がかかり(ウイルスにもよりますが、約7〜10日かかります)、CPEに依存し、エラーが発生しやすいです。本研究では、24ウェルプレートおよび96ウェルプレートフォーマットでZIKVを検出および定量するための免疫比色技術である焦点形成アッセイ(FFA)を報告します。
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Protocol
1. ウイルスの伝播
- 細胞調製
- 10%ウシ胎児血清(FBS)と2 mM L-グルタミンを添加した12 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む75 cm2 細胞培養フラスコでVero細胞を増殖させます( 材料表を参照)。細胞培養インキュベーターで37°C、5%CO2で細胞をインキュベートします。
- 顕微鏡で細胞を監視します。細胞のコンフルエント度が70%〜90%に達すると、使用準備が整います(図1A)。
注:Veroセルは、約24時間17ごとに2倍になります。1:10の希釈は、75 cm2 フラスコで3%〜90%の濃度に達するのに90〜2日かかります。セルを毎日または一日おきに監視します。
- 細胞単層の感染
- 10 mLの血清ピペットを使用して、細胞培養フラスコから増殖培地を取り出します。5 mLの血清ピペットを使用して、3 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)でフラスコを2回すすぎます。
注意: フラスコ/プレートから廃棄された感染性液体廃棄物を消毒するために、10%次亜塩素酸ナトリウムを含むビーカーを準備する必要があります。 - 2 mLの無血清DMEM(FBSを含まない2 mM L-グルタミンを添加したDMEM)と20 μLのZIKV接種体を細胞培養フラスコに加えます。フラスコを室温で1時間穏やかに揺らしながらインキュベートし、ウイルスを吸着させます。
注:最初のZIKVストックの滴定は、ZIKV接種物添加量を決定するのに役立ちます(ステップ2)。
注意:ZIKVはバイオセーフティレベル2(BSL-2)の病原体に分類されています。ZIKVを含む材料を使用するすべての手順は、認定されたバイオセーフティキャビネットで実施し、適切な個人用保護具を使用してすべての実験室標準操作手順(SOP)に従う必要があります。
- 10 mLの血清ピペットを使用して、細胞培養フラスコから増殖培地を取り出します。5 mLの血清ピペットを使用して、3 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(dPBS)でフラスコを2回すすぎます。
- オーバーレイメディアの追加
- 1時間のインキュベーション後、5 mLの血清ピペットを使用して希釈したウイルス接種物を取り出し、廃棄します。細胞培養フラスコを3 mLのdPBS 2xですすぎます。
- 12 mLの維持培地(2% FBS、2 mM L-グルタミン、および100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM)を細胞培養フラスコに添加し、感染細胞を維持します。
- 感染したVero細胞を37°Cの細胞培養インキュベーターで5%CO2で3日間インキュベートします。
注:顕微鏡下で感染したVero細胞のCPEを毎日監視します。
- ZIKVを含む細胞培養上清の回収
- 感染後3日目には、細胞の丸めと剥離(CPE)が観察されます(図1B-D)。10 mLの血清ピペットを使用して、ZIKVを含む細胞培養上清を50 mLの遠心チューブに回収します。
- 0.22 μmのポリエーテルスルホンシリンジフィルター( 材料表参照)を使用して、細胞培養上清をろ過します。ろ過した細胞培養上清500 μLを2.0 mLスクリューキャップチューブに分注し、さらに使用するまで-80°Cで保存します。
注:収穫されたZIKVは、長期保存のために-80°Cで保存できます。
注意: 注射針を使用する場合は、針が皮膚に穴を開ける可能性があるため、特別な注意を払う必要があります。実験室のSOPを確立する必要があります。
2. ウイルスの定量化
- 細胞調製
- 指定されたプレート(24ウェルプレート:0.5 mL/ウェル、7.5 x 104 細胞/ウェル、96ウェルプレート:0.1 mL/ウェル、1.5 x 104 細胞/ウェル)にVero細胞を播種し、プレートを37°Cの細胞培養インキュベーターで5%CO2で一晩インキュベートします。
注:検査する時点は5種類あります(24ウェルプレート:感染後48時間、60時間、72時間、84時間、96時間、96ウェルプレート:感染後24時間、36時間、48時間、60時間、72時間)。そのため、各時点につき1枚ずつプレートを用意します。 - 24時間のインキュベーション後、細胞が70%〜90%のコンフルエント度に達すると(図1E)、プレートは感染の準備が整います。希釈したウイルスストックの調製(ステップ2.2)は、細胞単層の感染前に行います。
- 指定されたプレート(24ウェルプレート:0.5 mL/ウェル、7.5 x 104 細胞/ウェル、96ウェルプレート:0.1 mL/ウェル、1.5 x 104 細胞/ウェル)にVero細胞を播種し、プレートを37°Cの細胞培養インキュベーターで5%CO2で一晩インキュベートします。
- ウイルス希釈
- 24ウェルプレートおよび96ウェルプレートの場合、各プレートに6本の滅菌済み1.5 mL微量遠心チューブを調製し、ネガティブコントロールを含む10倍希釈(10-1 から10-5まで)を実施します。24ウェルプレートの実験セットアップでは、6本の微量遠心チューブすべてに450 μLの無血清DMEMを添加します。96ウェルプレートの実験セットアップでは、135 μLの無血清DMEMを6本のチューブに添加します。
注意: 10倍の段階希釈を行う前に、内容物の希釈を示すために、各チューブに明確にラベルを付けてください。 - 段階希釈を行うには、24 ウェルプレート実験セットアップで、ステップ 1 で回収した ZIKV ストック 50 μL を、450 μL の無血清 DMEM が入った 10-1 チューブに加えます。96ウェルプレート実験のセットアップでは、135 μLの無血清DMEMを含む10-1 チューブに15 μLのZIKVストックを加えます。
- 各チューブをボルテックスして、ウイルスと培地を混合します。これが最初の10倍希釈です。
注:正確な段階希釈を確実に行うには、各希釈チューブ内でウイルスと培地を適切に混合する必要があります。 - 24ウェルプレート実験のセットアップでは、新しいピペットチップを使用して10-1 チューブを再懸濁し、希釈したZIKV50 μLを2回目の10倍希釈液として10-2 チューブに移します。96ウェルプレート実験のセットアップでは、新しいピペットチップを使用して10-1 チューブを再懸濁し、希釈したZIKV15 μLを2回目の10倍希釈液として10-2 チューブに移します。
- 手順2.2.4を5本目のチューブまで4回繰り返します(ネガティブコントロールを除く)。
注:クロスコンタミネーションを避けるために、各ピペッティングステップの後に新しいピペットチップを使用してください。
- 24ウェルプレートおよび96ウェルプレートの場合、各プレートに6本の滅菌済み1.5 mL微量遠心チューブを調製し、ネガティブコントロールを含む10倍希釈(10-1 から10-5まで)を実施します。24ウェルプレートの実験セットアップでは、6本の微量遠心チューブすべてに450 μLの無血清DMEMを添加します。96ウェルプレートの実験セットアップでは、135 μLの無血清DMEMを6本のチューブに添加します。
- 細胞単層の感染
- 各ウェル(24ウェルプレート:0.5 mL/ウェル、96ウェルプレート:0.1 mL/ウェル)から馴化培地を取り出し、廃棄します。
- 各ウェルをdPBS 2x(24ウェルプレート:300 μL/ウェル、96ウェルプレート:60 μL/ウェル)で洗浄します。
- 希釈率が最も高いものから低いものへと、段階希釈した各ウイルス接種物をウェルに加えます(24ウェルプレート:200 μL/ウェル、96ウェルプレート:40 μL/ウェル)。
注:各希釈液の感染は、重複したウェルで行われます。ネガティブコントロールとして2つの未感染ウェルを維持します。混乱を避けるために、プレートとウェルに明確にラベルを付けます。クロスコンタミネーションを防ぐために、各ピペッティングステップの後にピペットチップを交換してください。 - プレートを室温で1時間穏やかに揺らしながらインキュベートし、ウイルスの吸着を促します。
- オーバーレイ細胞培養培地の添加
- 1時間のインキュベーション後、ウイルス懸濁液を最低濃度から最高濃度まで除去して廃棄します。
- 感染した細胞をdPBS 2x(24ウェルプレート:300 μL/ウェル、96ウェルプレート:60 μL/ウェル)で洗浄します。
- DMEM(2% FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシンを添加)と 1.5% 低粘度カルボキシメチルセルロース(CMC、 材料表を参照)(24 ウェルプレート:1 mL/ウェル、96 ウェルプレート:0.2 mL/ウェル)をウェルに重ね合わせます。
- プレートを細胞培養インキュベーターで37°C、5%CO2でインキュベートします。
注意: このインキュベーション期間中は、プレートを乱さないでください。 - 細胞培養インキュベーターからプレートを取り出し、さまざまな時点で染色します(24ウェルプレート:感染後48時間、60時間、72時間、84時間、96時間、96ウェルプレート:感染後24時間、36時間、48時間、60時間、72時間)。
3. 染色
- 細胞固定
- 特定のインキュベーション時間(24ウェルプレート:感染後48時間、60時間、72時間、84時間、96時間、96ウェルプレート:感染後24時間、36時間、48時間、60時間、72時間)後、オーバーレイ培地を除去して廃棄し、細胞を1x PBSで3回洗浄します。96ウェルプレートの場合は、オーバーレイ培地を取り外して廃棄し、マルチチャンネルピペットで60 μL/ウェルの1x PBSで細胞を3回洗浄します。
- 4%パラホルムアルデヒドを添加して細胞を固定します(24ウェルプレート:300 μL/ウェル、96ウェルプレート:60 μL/ウェル)。プレートを室温で20分間インキュベートします。
注意:パラホルムアルデヒドは固体重合ホルムアルデヒドです。可燃性の固体白色結晶性粉末で、水と混合したり加熱したりするとホルムアルデヒドガスを放出します。パラホルムアルデヒドの使用を含むすべての手順は、ホルムアルデヒド含有化学物質に固有の実験室SOPに従って、認定された化学ヒュームフードまたは承認された排気されたエンクロージャーで実施する必要があります。 - 20分後、パラホルムアルデヒドを廃棄し、細胞を1x PBSで3回洗浄します。透過処理、ブロッキング、および抗体インキュベーションは、ステップ3.2-3.5に従って行います。
注意: 4%パラホルムアルデヒドを廃棄する場合は、大学または研究所の廃棄物処理手順に従ってください。
- 細胞透過処理
- 1%オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノール( 材料表を参照)を添加して細胞を透過処理します(24ウェルプレート:200 μL/ウェル、96ウェルプレート:40 μL/ウェル)。プレートを室温で15分間インキュベートします。
- 15分後、オクチルフェノキシポリ(エチレンオキシ)エタノールを廃棄し、細胞を1x PBSで3回洗浄します。
- ブロッキング
- 3%スキムミルクを添加して、サンプル中の非特異的結合を減らします(24ウェルプレート:500 μL/ウェル、96ウェルプレート:100 μL/ウェル)。プレートを室温で2時間インキュベートします。
- 2時間後、3%スキムミルクを捨て、1x PBSで細胞を3回洗浄します。
注: これは停止ポイントです。3%スキムミルクを添加した後、プレートは一次抗体挿入の2日前まで4°Cで保存できます。
- 一次抗体のインキュベーション
- 抗フラビウイルスモノクローナル抗体4G2(クローンD1-4G2-4-15;一次抗体、 材料表参照)を1%スキムミルク(1:1,000比)で希釈して添加します(24ウェルプレート:200 μL/ウェル、96ウェルプレート:40 μL/ウェル)。プレートを37°Cで1時間インキュベートします。
- 1時間後、モノクローナル抗体を含む溶液を除去し、細胞を1x PBSで3回洗浄します。
- 二次抗体インキュベーション
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合したヤギ抗マウスIgG二次抗体( 材料表を参照)を1%スキムミルク(1:1,000の比率)で希釈して添加します(24ウェルプレート:200 μL/ウェル、96ウェルプレート:40 μL/ウェル)。プレートを37°Cで1時間インキュベートします。
- 1時間後、二次抗体を含む溶液を除去し、細胞を1x PBSで3回洗浄します。
- 基質インキュベーション
- 3,3'ジアミノベンジジン(DAB)ペルオキシダーゼ基質( 材料表を参照)を添加し、プレートを暗所で30分間インキュベートします(24ウェルプレート:200 μL/ウェル、96ウェルプレート:40 μL/ウェル)。30分後、ウェルを水で洗浄して反応を停止します。
- プレートを一晩風乾し、プレートが完全に乾いたら病巣計数に進みます。
4. ウイルス力価の決定
- 手動焦点計数プロセス(24ウェルフォーマット)
- 病巣は実体顕微鏡で可視化できます。50〜200焦点を生成する希釈液を選択します。
- 選択した希釈液の繰り返しごとに焦点をカウントします。選択した希釈液ごとに平均焦点数を計算します。
- 以下の式を使用して、各サンプルの mL あたりの病巣形成単位 (FFU/mL) を計算します: FFU/mL = 平均病巣数/(希釈 x 添加した希釈ウイルスの量)。
- 自動焦点計数プロセス(96ウェルフォーマット)
- 市販のソフトウェア分析装置で96ウェルプレートをスキャンします。
- ソフトウェア( 材料表を参照)をダブルクリックして開きます。
- [ Switch Suites ] をクリックし、スイートが該当するスイートに切り替わっていることを確認します(補足図 1A)。[ OK] をクリックします。
- [ スキャン]>[フルプレートスキャン ]をクリックしてスキャンを開始します(補足図1B)。
- [Dashboard]をクリックして、キャプチャーフォーマットが96ウェルフォーマットであることを確認します(補足図2A)。
- センタリングモードを「自動プリアライメントユーザー検証済み」として選択します(補足図2B)。
- Eject(イジェクト)をクリックしてプレートをロードします。
注意: プレートの蓋を開け、列Aを上にして上に置きます(補足図3A)。 - プレート名を入力し、[ OK]をクリックします。 Load をクリックしてプレートをロードします。
- [ 開始 ]をクリックしてスキャンを開始します。その後、「上、下、左、右」ボタンを使用してA1、A12、およびH1の位置を調整し、[ 確認 ]をクリックします(補足図3B)。
注意: ソフトウェアは各ウェルのスキャンを開始します。 - スキャンが完了すると、概要画像がポップアップ表示されます。[ 閉じる]をクリックします。
- [ スイッチボードに戻る]をクリックしてスキャンを終了します。
- ソフトウェアを使用して 96 ウェルプレートをカウントします。
- 「 カウント」>「スマートカウント」をクリックします。
- ソフトウェアには、「ステップ1/5:カウントするプレートを選択」と表示されます。 Load plate(s)をクリックします。フォルダ全体にチェックマークを付け、[ 選択 ]をクリックしてスキャンしたプレートをインポートします(補足図4A)。
- ソフトウェアでは、「ステップ2/5:カウントパラメータの定義」と表示されます。 パラメータの調整をクリックすると、パラメータが表示されます(拡散プロセス、小/通常/大/最大/最大+1、スポット分離、カウント領域、バックグラウンドバランス、繊維除去、ゲーティング)。
注意: 1つのウェルから始めて、すべてのウェルに最適な設定を見つけるために何度もチェックしてください。 - 完了したら、[ 次へ ]をクリックします(補足図4B)。
- ソフトウェアには、「ステップ3/5:ウェルの選択/選択解除」と表示されます。カウントする井戸の選択が完了したら、[ 次へ ]をクリックして次に進みます。
注:カウント対象として選択されたウェルは、各ウェルの右上隅に「C」で表示されます(補足図5A)。 - ソフトウェアでは、「ステップ4/5:出力設定」と表示されます。[ 出力設定の表示/変更 ]をクリックして、設定(画像形式など)が適切かどうかを確認します。[ Save and Exit > Next ]をクリックします(補足図5B)。
- ソフトウェアでは、「ステップ5/5:自動カウントの開始」と表示されます。[ Start AutoCount ] をクリックします (補足図 6A)。
- 完了したら、[ オートカウントの終了]をクリックします。
- 市販のソフトウェア分析装置で96ウェルプレートをスキャンします。
- 商用ソフトウェアアナライザーで品質管理(QC)を実行します。
- 交換盤ページで、[品質管理]>[ プレートの追加]をクリックします。フォルダ全体にチェックマークを付けてカウントプレートをインポートし、選択をクリックして QCを開始> (補足図6B)。
- 各ウェルをダブルクリックして、スポットを監査します。[ カウント ]をクリックして、スポットを削除します。ソフトウェアがカウントを開始します。
注意: 「Spots: Remove(斑点:削除)」にチェックが入っていることを確認します。計数の完了は、例えば「30」という計数された病巣の数によって示すことができる(補足図7A)。 - カウントが終了したら(カウントされた病巣の数、たとえば「30」で示されます)、「はい」をクリックしてスポットを削除します(補足図7B)。削除する場所を左にトリプルクリックします。右クリックして終了し、[ はい]をクリックします。
- QCが完了したら、 Finish Plateをクリックし、Project Overviewに移動します 。
- ソフトウェアアナライザを使用してイメージングを実行します。
- スキャン、カウント、QCプレートの画像を確認します(図2)。
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Representative Results
ZIKVは、図3に概略図で示したように、FFAを使用して定量化できます。24ウェルプレートの場合、感染したVero細胞は、感染後48時間、60時間、72時間、84時間、および96時間で固定されました。その結果、感染後96時間(4日)後も細胞は無傷のままであった(細胞剥離は認められなかった)ことが示された(図4および補足図8A-E)。ウイルス病巣の出現は、感染後48時間(2日)に初めて観察されました(図4A-F)。しかし、病巣のサイズが小さすぎたため、病巣を正確に数えることが困難でした。最適な病巣サイズは、感染後60時間(2.5日)で達成されました(図4B)。後者の時点(感染後72時間、84時間、および96時間)では、病巣はより大きく、融合または重なり合う傾向がありました。融合または重なり合った焦点は、時間の経過とともに増加しました(図4C-E)。したがって、感染後60時間(2.5日)に形成された病巣を選択して、24ウェルプレートのZIKV力価を測定しました(図4B)。
96ウェルプレートの場合、感染したVero細胞は、感染後24時間、36時間、48時間、60時間、および72時間で固定されました。結果は、感染後72時間(3日)後も細胞が無傷のままであることを示しました(図5A-Fおよび補足図9A-E)。ウイルス病巣の出現は、感染後24時間(1日)に初めて観察されました(図5A)。しかし、感染後36時間(1.5日)までは病巣のサイズが小さすぎたため、病巣の数を正確に決定することは困難でした(図5A、B)。最適な病巣サイズは、感染後48時間(2日)で達成されました(図5C)。後者の時点(感染後60時間および72時間)では、重複または融合した病巣が観察され、重複した病巣の数は時間の経過とともに増加しました(図5D、E)。したがって、感染後48時間(2日)に形成された病巣を選択して、ZIKV分離株のウイルス力価を決定しました(図5C)。病巣形成は、代替として市販のソフトウェアアナライザーを使用して視覚化および列挙できます。
図1:Vero細胞の顕微鏡画像。 (A)40倍倍のVero細胞は、ウイルス増殖のために75cm2の細胞培養フラスコで70%〜90%のコンフルエントを示しました。(B)感染後1日目にZIKVに感染した後のVero細胞のCPE、100倍の倍率。(C)感染後2日目にZIKVに感染した後のVero細胞のCPE、100倍の倍率。(D)感染後3日目にZIKVに感染した後のVero細胞のCPE、100倍の倍率。(E)40倍倍のVero細胞は、ウイルス定量のために24時間インキュベーションした後、24ウェルプレートで70%〜90%のコンフルエント性を示しました。スケールバー:100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:市販のソフトウェア分析装置を使用してスキャン、カウント、および後品質管理プレートをスキャン、計数した96ウェルフォーマットの画像。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:病巣形成アッセイの染色のワークフロー。 細胞固定、透過処理、ブロッキング、抗体結合、ペルオキシダーゼ基質とのインキュベーションなどの染色プロセス。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:異なる時点での24ウェルプレートにおけるZIKV P6-740の病巣形成アッセイ。 (A)感染後2日目(48時間)には病巣はあまり明瞭ではありません。(B)最適な病巣サイズは、感染後2.5日目(60時間)に見られます。(C-E)病巣は、感染後3日目(72時間)、3.5日目(84時間)、および4日目(96時間)に融合しました。(F)プレートのネガティブコントロール。スケールバー:1,000 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:異なる時点での96ウェルプレートにおけるZIKV P6-740の焦点形成アッセイ。 (A)病巣は、感染後1日目(24時間)に市販のソフトウェアアナライザーでカウントされるほど明確ではありません。(B)病巣は、感染後1.5日目(36時間)に市販のソフトウェアアナライザーでカウントされるほど明確ではありません。(C)最適な病巣サイズは、感染後2日目(48時間)に見られます。(D、E)病巣は、感染後2.5日目(60時間)と3日目(72時間)に融合しました。(F)プレートのネガティブコントロール。スケールバー:1,000 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図1:商用ソフトウェアアナライザの起動ページのスクリーンショット。 (A) スイートを、商用ソフトウェアアナライザーで該当するものに切り替えます。完了したら「OK」をクリックします。(B)市販のソフトウェアアナライザーでスキャンを開始するには、「スキャン」をクリックし、「フルプレートスキャン」をクリックします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:市販のソフトウェアアナライザで「キャプチャ形式」と選択したセンタリングモードを「自動プリアライメントユーザー検証済み」として表示するためのスクリーンショット。 (A)キャプチャーフォーマットを表示するには、「ダッシュボード」をクリックし、キャプチャーフォーマットとして96ウェルフォーマットを選択します。(B)センタリングモードの場合は、「自動プリアライメントユーザー検証済み」を選択します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:市販のソフトウェア分析装置プレートリーダートレイ上の96ウェルプレートの配置と、ウェルA1、A12、H1の位置を校正するためのスクリーンショット。 (A)プレートを上向きに置き、列Aを上にします。(B)ウェルA1、A12、およびH1の位置を校正するには、「上、下、左、右」ボタンを使用します。完了したら、「確認」をクリックします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:市販のソフトウェアアナライザーで計数するためのスキャンプレートを含むフォルダーを選択するためのスクリーンショットと、「ステップ2/5:計数パラメータの定義」 。(A)スキャンしたプレートを数えるには、「プレートをロードする」をクリックします。フォルダ全体にチェックマークを付け、「選択」をクリックしてスキャンしたプレートをインポートします。(B)カウントパラメータを調整します。パラメータを設定したら「次へ」をクリックします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:市販のソフトウェアアナライザ「ステップ3/5:ウェルの選択/選択解除」および「ステップ4/5:出力設定」のスクリーンショット。 (A)カウントするウェルを選択および選択解除し、完了したら「次へ」をクリックします。(B)出力設定については、「出力設定の表示/変更」をクリックして、設定が適切かどうか(画像形式など)を確認してください。完了したら「保存して終了」をクリックし、「次へ」をクリックします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:商用ソフトウェアアナライザーの「ステップ5/5:自動カウントの開始」と品質管理ページのスクリーンショット。 (A)プレートカウントの準備ができたら、「自動カウントの開始」をクリックします。(B)品質管理ページで、フォルダ全体にチェックマークを付けてカウントプレートをインポートし、[選択]をクリックしてから、[QCの開始]をクリックします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図7:商用ソフトウェアアナライザの品質管理ページのスクリーンショット。 (A)各ウェルをダブルクリックして、スポットを監査します。「カウント」をクリックして、スポットを削除します。「スポット:削除」にチェックを入れます。(B)左トリプルクリックで斑点を削除します。右クリックして終了し、「はい」をクリックします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図8:異なる時点での24ウェルプレートにおけるZIKV P6-740の焦点形成アッセイ。 10倍段階希釈(10-1 〜10-5)をZIKV P6-740で行い、ネガティブコントロールを含むVero細胞で感染を二重に行いました。生データ画像は実体顕微鏡で撮影し、スケールバーは1,000μmを示しました。 (A)感染後2日目(48時間)。(B)感染後2.5日目(60時間)。(C)感染後3日目(72時間)。(D)感染後3.5日目(84時間)。(E)感染後4日目(96時間)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図9:異なる時点での96ウェルプレートにおけるZIKV P6-740の焦点形成アッセイ。 10倍段階希釈(10-1 〜10-5)をZIKV P6-740で行い、ネガティブコントロールを含むVero細胞で感染を二重に行いました。生データ画像は実体顕微鏡で撮影し、スケールバーは1,000μmを示しました。 (A)感染後1日目(24時間)。(B)感染後1.5日目(36時間)。(C)感染後2日目(48時間)。(D)感染後2.5日目(60時間)。(E)感染後3日目(72時間)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ウイルス力価を決定するためのいくつかのアッセイがあります。PFAにはFFAと同様のウイルス定量プロトコルがあり、ウイルス接種物を希釈して個々のプラークまたは病巣を区別できるようにします。染色後、各プラークまたは病巣は、接種体19内の単一の感染性粒子を示す。PFAはクリスタルバイオレットで染色され、細胞溶解または細胞死によって引き起こされるプラーク形成を視覚化します。したがって、PFAは、ウイルスがCPEを引き起こすのに長い時間を必要とし、細胞溶解または死を誘発するウイルスのみに限定されるため、より時間がかかります。多くの研究室では、ZIKV 19,20,21,22,23,24,25などのフラビウイルスの感染性ウイルス力価を決定するためにFFAを使用することに成功しています。FFAは、ウイルス抗原を抗体で検出する細胞ベースの比色免疫検出法であり、したがって、免疫染色技術を使用して感染細胞の病巣領域を特定しますが、プラークは特定しません12,26。FFAは、PFAに比べてZIKVにいくつかの利点をもたらします。明らかな利点の1つは、CPEを認識せずにウイルス成分の抗体認識に基づいていることです。さらに、ウイルス特異的抗体の使用は、混合集団における異なるウイルスまたはウイルス血清型の同定にも有用である27。したがって、FFAは、すべてのウイルス感染を測定し、目に見えるプラークを形成するのに十分な細胞死を引き起こすウイルスに依存しないため、PFAよりも特異的です28。また、FFAはPFAよりも潜伏期間が短いため、細胞の溶解と死を意味する明らかなCPEが必要です。最後に、96ウェルプレートを使用するFFA法は、ウイルスの検出と滴定により多くの複製とより大きな希釈を使用するという利点を提供します27,29。さらに、報告されたFFAアッセイは、ウイルス中和試験や抗ウイルス化合物のスクリーニング方法に容易に適応できます。市販または無料の自動細胞計数装置またはソフトウェアを組み込むことで、FFAおよびそれに関連するメソッドの使いやすさ(一貫性、正確性、スループット)をさらに向上させることができます。
24ウェルプレートと96ウェルプレートを比較する場合、24ウェルフォーマットでは、単層培養で増殖させる細胞の数が多く、培地やウイルスストックの量も多く必要であることに注意することが重要です。そのため、24ウェルプレートフォーマットは、容量が限られているサンプルでの使用には適していない場合があります。この制限は、このホワイトペーパーで説明しているように、96ウェルフォーマットを使用することで克服できます。まず、96ウェルフォーマットは必要な材料が少なくて済むため、より費用対効果の高いオプションです。さらに、96ウェルフォーマットの染色ウイルス病巣の自動カウントにより、手動カウントが必要な24ウェルフォーマットでは不可能なハイスループットと迅速な分析が可能になります。また、この自動計数プロセスにより、手動計数と比較して再現性が向上し、主観性が低減されるため、FFAのより正確で信頼性の高い結果が得られます。そのため、自動イメージングシステムを備えた96ウェルフォーマットは、ハイスループットと信頼性の高いウイルス定量を必要とするラボに強く推奨されます。
一方、免疫蛍光フォーカスアッセイを使用してZIKV25、27、28、30、31を検出する人もいます。免疫蛍光フォーカスアッセイは、蛍光色素標識特異的抗体で抗原を免疫染色し、続いて蛍光顕微鏡25で感染病巣をカウントすることによって行われることを除いて、FFAと類似している。このアッセイは、より高価な試薬を使用し、アッセイを完了するために蛍光顕微鏡検査が必要です。したがって、免疫蛍光フォーカスアッセイは、紹介ラボなどの設備の整ったラボに限定されます。このアッセイをリソースが困難な環境で使用するのは簡単ではありません。
FFAには多くの利点がありますが、いくつかの制限もあります。PFAなどの他のアッセイと比較して、FFAは染色プロセス中により多くのステップを要します。固定後のステップは柔軟で、一晩またはより長い一時停止が可能ですが、病巣の染色は完了するまでにさらに時間がかかります。さらに、FFAは染色プロセスにおいて特異的抗体または交差反応抗体を必要とするため、新規または新規のウイルスの同定および定量への適用性が制限されます。さらに、FFAのコストは、染色にクリスタルバイオレットのみを必要とするPFAと比較して高くなります。それに加えて、自動計数プロセス(96ウェルフォーマット)は、適切な機器を備えた実験室でのみ実行できることは注目に値します。したがって、必要な機器のない研究室には適していません。
結論として、24ウェルプレートおよび96ウェルプレートフォーマットの細胞ベースの比色免疫検出アッセイまたはFFAを使用したZIKVの増殖および定量のための詳細なプロトコルを報告します。この方法には、従来のPFAに比べて多くの実用的な利点があります。これは、焦点カウント用の自動イメージングシステムと併用すると、より高速で高スループットのアプリケーションに適しています。この研究のための信頼できるプロトコルの標準化は、ジカ熱の研究に大きく貢献し、他の臨床的に重要なウイルスの定量化にも広く適応させることができます。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
本研究は、マレーシア高等教育省の長期研究助成制度(LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018)および高等教育機関センターオブエクセレンス(HICoE)プログラム(MO002-2019)の資金提供を受けました。本研究の図3は、BioRender.com(2022)の「DAB Immunohistochemistry」から引用した、病巣形成アッセイのための染色のワークフローを示しています。https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry から取得。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 - 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 - 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 - 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | - | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
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