Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

منصة الموائع الدقيقة لدراسة الانسداد الحيوي في الوسائط المسامية

Published: October 13, 2022 doi: 10.3791/64689
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, 2Department Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology

Summary

يصف هذا البروتوكول منصة الموائع الدقيقة لدراسة تطور الأغشية الحيوية في الوسائط المسامية شبه 2D من خلال الجمع بين التصوير المجهري عالي الدقة وقياسات فرق الضغط المتزامنة. تحدد المنصة تأثير حجم المسام ومعدلات تدفق السوائل في الوسائط المسامية على الانسداد الحيوي.

Abstract

توجد الأغشية الحيوية البكتيرية في العديد من الوسائط المسامية البيئية والصناعية ، بما في ذلك التربة وأغشية الترشيح. تنمو الأغشية الحيوية في ظل ظروف تدفق معينة ويمكن أن تسد المسام ، وبالتالي تعيد توجيه تدفق السوائل المحلي. يمكن أن يكون لقدرة الأغشية الحيوية على سد المسام ، ما يسمى بالانسداد الحيوي ، تأثير هائل على النفاذية المحلية للوسط المسامي ، مما يؤدي إلى تراكم الضغط في النظام ، والتأثير على تدفق الكتلة من خلاله. لفهم التفاعل بين نمو الأغشية الحيوية وتدفق السوائل في ظل ظروف فيزيائية مختلفة (على سبيل المثال ، بسرعات تدفق وأحجام مسامية مختلفة) ، في هذه الدراسة ، تم تطوير منصة الموائع الدقيقة لتصور تطور الأغشية الحيوية باستخدام مجهر في ظل ظروف فيزيائية محكومة من الخارج. يمكن قياس تراكم الضغط الناجم عن الأغشية الحيوية في الوسط المسامي في وقت واحد باستخدام أجهزة استشعار الضغط ، وفي وقت لاحق ، يرتبط بالتغطية السطحية للغشاء الحيوي. توفر المنصة المقدمة خط أساس لنهج منهجي للتحقيق في الانسداد البيولوجي الناجم عن الأغشية الحيوية في الوسائط المسامية في ظل ظروف التدفق ويمكن تكييفها لدراسة العزلات البيئية أو الأغشية الحيوية متعددة الأنواع.

Introduction

الأغشية الحيوية - المستعمرات البكتيرية المضمنة في مصفوفة ذاتية الإفراز من المواد خارج البوليمر (EPS) - موجودة في كل مكان في الوسائط المسامية الطبيعية ، مثل التربة وطبقات المياه الجوفية1 ، والتطبيقات التقنية والطبية ، مثل المعالجة البيولوجية2 ، وترشيح المياه3 والأجهزة الطبية4. تتكون مصفوفة الأغشية الحيوية من السكريات والألياف البروتينية والحمض النووي خارج الخلية 5,6 ، وتعتمد بشدة على الكائنات الحية الدقيقة ، وتوافر العناصر الغذائية ، وكذلك الظروف البيئية7. ومع ذلك ، فإن وظائف المصفوفة عالمية. إنه يشكل سقالة هيكل الأغشية الحيوية ، ويحمي المجتمع الميكروبي من الضغوط الميكانيكية والكيميائية ، وهو مسؤول إلى حد كبير عن الخصائص الريولوجية للأغشية الحيوية5.

في الوسائط المسامية ، يمكن أن يؤدي نمو الأغشية الحيوية إلى انسداد المسام ، مما يتسبب في ما يسمى بالانسداد الحيوي. يتم التحكم في تطوير الأغشية الحيوية من خلال تدفق السوائل وحجم المسام ، والذي يعرف بأنه المسافة التي تفصل بين عمودين ، للوسط المسامي8،9،10. يتحكم كل من حجم المسام وتدفق السوائل في نقل المغذيات وقوى القص المحلية. في المقابل ، يسد الغشاء الحيوي المتنامي المسام ، مما يؤثر على توزيع سرعة السائل 11،12،13 ، والنقل الجماعي ، والتوصيل الهيدروليكي للوسط المسامي14,15. تنعكس التغيرات في الموصلية الهيدروليكية من خلال زيادة الضغط في الأنظمة المحصورة16،17،18،19. تركز دراسات الموائع الدقيقة الحالية في تطوير الأغشية الحيوية والانسداد الحيوي على دراسة تأثير سرعات التدفق في الأشكال الهندسية المتجانسة16،20 (أي بحجم مسام مفرد) أو الوسائط المسامية غير المتجانسة12،21،22. ومع ذلك ، لفصل آثار معدلات التدفق وحجم المسام على تطور الأغشية الحيوية وتغيرات الضغط الناتجة في الوسط المسامي المسدود بيولوجيا ، يلزم وجود منصة تجريبية متعددة الاستخدامات يمكن التحكم فيها بدرجة عالية تسمح بدراسة مختلف أشكال هندسة الوسائط المسامية والظروف البيئية بالتوازي.

تقدم الدراسة الحالية منصة الموائع الدقيقة التي تجمع بين قياسات الضغط والتصوير المتزامن للغشاء الحيوي المتطور داخل الوسط المسامي. نظرا لنفاذية الغاز والتوافق الحيوي والمرونة في تصميم هندسة القناة ، فإن جهاز الموائع الدقيقة المصنوع من polydimethylsiloxane (PDMS) هو أداة مناسبة لدراسة تطور الأغشية الحيوية في الوسائط المسامية. تسمح الموائع الدقيقة بالتحكم في الظروف الفيزيائية والكيميائية (على سبيل المثال ، تدفق السوائل وتركيز المغذيات) بدقة عالية لمحاكاة بيئة الموائل الميكروبية23. علاوة على ذلك ، يمكن بسهولة تصوير أجهزة الموائع الدقيقة بدقة ميكرومترية باستخدام مجهر ضوئي وإلى جانب القياسات عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، الضغط المحلي).

في هذا العمل ، تركز التجارب على دراسة تأثير حجم المسام في نظير وسط مسامي متجانس في ظل ظروف التدفق المفروضة الخاضعة للرقابة. يتم فرض تدفق وسط الاستزراع باستخدام مضخة حقنة ، ويتم قياس فرق الضغط عبر قناة الموائع الدقيقة في وقت واحد مع أجهزة استشعار الضغط. يبدأ تطوير الأغشية الحيوية عن طريق زرع مستنبتة العوالق من العصوية الرقيقة في قناة الموائع الدقيقة. يسمح التصوير المنتظم للأغشية الحيوية المتطورة وتحليل الصور للمرء بالحصول على معلومات عن مقياس المسام حول تغطية السطح في ظل ظروف تجريبية مختلفة. توفر المعلومات المرتبطة بتغير الضغط ومدى الانسداد البيولوجي مدخلات حاسمة لتقديرات نفاذية الوسائط المسامية المسدودة بيولوجيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد رقاقة السيليكون

  1. صمم الأشكال الهندسية لقناة الموائع الدقيقة في برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD ؛ انظر جدول المواد) وطباعته على فيلم شفاف لإنشاء القناع الضوئي (الشكل 1 أ).
  2. قم بتصنيع القالب الرئيسي بواسطة الطباعة الحجرية الناعمة (في ظل ظروف الغرفة النظيفة) باتباع الخطوات أدناه.
    1. تخبز رقاقة السيليكون على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    2. ضع الرقاقة في وسط طبقة دوارة واسكب SU8 3050 مقاوم للضوء (انظر جدول المواد) على الرقاقة. قم بتدوير المعطف عند 1700 دورة في الدقيقة لمدة 40 ثانية مع وقت منحدر 10 ثوان / 100 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: تم ضبط معلمات الطلاء الدوراني للحصول على سمك مستهدف يبلغ 100 ميكرومتر ل SU8 3050.
    3. بعد عملية الطلاء المغزلي ، اخبز رقاقة السيليكون على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 600 ثانية و 95 درجة مئوية لمدة 2700 ثانية. دع الرقاقة تبرد في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
      ملاحظة: يعزز التبريد الليلي التصاق SU8 بالرقاقة.
    4. ضع القناع الضوئي (الخطوة 1.1) على الرقاقة وعرضه للأشعة فوق البنفسجية ، مع طاقة تعرض تبلغ 250 مللي جول / سم2 وبطول موجي 350 نانومتر.
    5. بعد التعرض ، اخبز الركيزة المكشوفة عند 65 درجة مئوية لمدة 60 ثانية و 95 درجة مئوية لمدة 300 ثانية.
    6. قم بتطوير رقاقة السيليكون للحصول على القالب الرئيسي عن طريق غمرها في دورق مملوء بمطور mrDev600 (انظر جدول المواد). رج الدورق برفق لمدة 1800 ثانية لغسل المقاومة غير المبلمرة. ثم ، يغسل عن طريق رش الأيزوبروبانول على رقاقة السيليكون ويجفف في الهواء.
    7. اخبز رقاقة السيليكون بقوة على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 1800 ثانية.
  3. قم بتقطيع القالب الرئيسي من خلال ترسيب بخار 20 ميكرولتر من سيلان ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) (انظر جدول المواد) يوضع على شريحة زجاجية بجوار القالب لمدة 40 دقيقة في مجفف فراغ ، مما يخلق ضغط قياس يبلغ 100 ملي بار.

2. تصنيع جهاز الموائع الدقيقة

ملاحظة: إجراء التصنيع الموصوف هنا هو لجهاز الموائع الدقيقة مع قناة الموائع الدقيقة واحدة. ومع ذلك ، يمكن تطبيق نفس الطريقة لتصنيع جهاز الموائع الدقيقة مع قنوات الموائع الدقيقة المتعددة بالتوازي.

  1. امزج المطاط الصناعي مع رابطه المتشابك بنسبة 10: 1 (انظر جدول المواد) لتحضير خليط PDMS. حرك الخليط حتى يمتزج بشكل موحد ويصبح معتما بسبب فقاعات الهواء المغلقة.
  2. قم بإزالة الغازات من الخليط في مجفف مفرغ من الهواء ، مما يخلق ضغط قياس يبلغ 100 ملي بار حتى تتم إزالة فقاعات الهواء المحاصرة وتبدو شفافة. الوقت اللازم للتفريغ هو عادة 30 دقيقة.
  3. ضع القالب الرئيسي (الخطوة 1) في طبق زراعة الخلايا (انظر جدول المواد). صب 20 جم من خليط PDMS على القالب الرئيسي لإنتاج قنوات بسمك نهائي 5 مم.
  4. اخبز القالب الرئيسي على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  5. قم بقطع PDMS المعالج حول قناة الموائع الدقيقة (على مسافة حوالي 3 مم) باستخدام شفرة ، ثم انزع قناة الموائع الدقيقة PDMS من القالب الرئيسي.
  6. لإنشاء مدخل ومخرج قنوات الموائع الدقيقة ، قم بعمل ثقوب باستخدام خزعة (قطرها 1.5 مم) في أطرافها (أعلى المثلثات ، انظر الشكل 1 أ). قم بعمل ثقب إضافي في وسط مثلث المدخل لتثبيت مستشعر الضغط لاحقا.
  7. اغسل شريحة زجاجية وقناة الموائع الدقيقة بمحلول منظف 1٪ متاح تجاريا (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، اغسل قناة الموائع الدقيقة PDMS والشريحة الزجاجية باستخدام الأيزوبروبانول. ثم اشطفها مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات. جفف قناة الموائع الدقيقة PDMS والشريحة الزجاجية بالهواء المضغوط عند 1 بار لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن يكون الهيكل المسامي لنظام PDMS جافا تماما حتى يكون الترابط فعالا.
  8. ضع الشريحة الزجاجية وقناة الموائع الدقيقة في منظف البلازما (انظر جدول المواد) وتأكد من أن الأسطح المراد ربطها متجهة لأعلى. قم بتشغيل منظف البلازما وعالج قناة الموائع الدقيقة والشريحة الزجاجية ببلازما الهواء عند تدفق هواء يبلغ 1 SL / h (لتر قياسي في الساعة) لمدة دقيقة واحدة. اربط قناة الموائع الدقيقة بالشريحة الزجاجية فور إخراجها من المنظف عن طريق ملامستها لبعضها البعض.
    ملاحظة: تأكد من عدم لمس الأسطح المعالجة ، فقد يؤثر ذلك على الترابط. عند تصنيع جهاز الموائع الدقيقة بقنوات الموائع الدقيقة المتعددة ، قم بفضح قنوات الموائع الدقيقة في وقت واحد وربطها في خطوة واحدة.
  9. ضع جهاز الموائع الدقيقة المستعبدين على طبق تسخين 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  10. قم بتخزين جهاز الموائع الدقيقة في طبق زراعة الخلايا النظيفة حتى تبدأ التجربة.

3. إعداد التعليق البكتيري

  1. قم بتنمية مجموعة من Bacillus subtilis NCIB 3610 قبل 20 ساعة من بدء التجربة عن طريق التلقيح المباشر ل 3 مل من وسط زراعة مرق المغذيات رقم 3 (انظر جدول المواد) من مخزون الجلسرين المجمد في أنبوب استزراع سعة 15 مل. احتضان في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها (لمدة 16 ساعة).
  2. اصنع مزرعة فرعية من الثقافة الليلية قبل 4 ساعات من بدء التجربة بإضافة 3 ميكرولتر من الثقافة الليلية في 3 مل من وسط الاستزراع الطازج (1: 1000 تخفيف) في أنبوب استزراع 15 مل. احتضان الاستزراع الفرعي في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 3.5-4 ساعات للحصول على كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD600) من 0.1.

4. تجربة نمو الأغشية الحيوية

  1. قم بتشغيل حاضنة صندوق المجهر قبل 3 ساعات من التجربة لضمان درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 درجة مئوية. قم بتركيب مضخة المحقنة وأجهزة استشعار الضغط (انظر جدول المواد).
  2. قم بتوصيل أنبوب المدخل والمخرج بجهاز الموائع الدقيقة. أدخل إبرة مباشرة (بقطر خارجي 0.6 مم) في أنبوب المدخل لتأمين الاتصال بين الأنبوب والمحقنة.
  3. ضع جهاز الموائع الدقيقة ، و 30 مل من الماء منزوع الأيونات ، و 30 مل من وسط الاستزراع في مجفف فراغ وقم بتفريغها لمدة 1 ساعة على الأقل. بعد ذلك ، اسحب ببطء وسط الاستزراع والماء منزوع الأيونات إلى حقنتين منفصلتين سعة 30 مل.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لمنع تكوين الفقاعات في القناة أثناء التنظيف باستخدام وسط الاستزراع.
  4. قم بتركيب جهاز الموائع الدقيقة على المجهر وضع أنبوب المخرج في حاوية نفايات.
    1. قم بتوصيل المحقنة المملوءة بالماء منزوع الأيونات بقناة الموائع الدقيقة من خلال أنبوب الموائع الدقيقة وقم بحقن الماء ببطء حتى يخرج من مخرج مستشعر الضغط. املأ مستشعر الضغط بالماء واغسل جميع الفقاعات من الأنبوب الذي يربط قناة الموائع الدقيقة ومستشعر الضغط. أغلق مخرج مستشعر الضغط بالبراغي المخصصة لمستشعر الضغط.
      ملاحظة: يضمن إجراء التعبئة الموصوف تسجيل تغيرات الضغط عند مدخل قنوات الموائع الدقيقة بدقة. عند إجراء تجربة مع قنوات الموائع الدقيقة المتعددة ، قم بتوصيل كل قناة بحقنة منفصلة لضمان ظروف تدفق متساوية في جميع القنوات.
  5. املأ بقية قناة الموائع الدقيقة بالماء منزوع الأيونات.
  6. ضع مرشح 1.2 ميكرومتر (انظر جدول المواد) على حقنة وسائط الاستزراع. بعد ذلك ، قم بإزالة حقنة الماء وقم بتوصيل حقنة وسائط الثقافة بعناية بأنبوب الموائع الدقيقة المدخل. قم بتركيب المحقنة على مضخة المحقنة واغسل القناة بوسط الاستزراع بمعدل تدفق 2 مل / ساعة لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: يمنع المرشح الخلايا البكتيرية من دخول المحقنة أثناء التحميل. سيؤدي تنظيف قناة الموائع الدقيقة بوسائط الاستزراع إلى إزالة الفقاعات المتبقية في البنية المسامية.
  7. اضبط مضخة المحقنة على معدل التدفق المطلوب (هنا 1 مل / ساعة) أثناء التجربة واضبط قراءة ضغط مستشعرات الضغط على الصفر.
    ملاحظة: من خلال ضبط قراءة الضغط الأولية على الصفر ، سيتم قياس فرق الضغط الناجم عن تطور الأغشية الحيوية أثناء التجربة فقط.
  8. ماصة 1 مل من الثقافة البكتيرية عند OD600 من 0.1 في قارورة طرد مركزي 1.5 مل. قم بتحميل الثقافة البكتيرية في قناة الموائع الدقيقة عن طريق وضع أنبوب المخرج في قارورة الطرد المركزي. بعد الانتظار لمدة 5 دقائق لإزالة أي فقاعات هواء محتملة من مخرج الأنابيب ، اسحب 150 ميكرولتر من المحلول البكتيري بمعدل تدفق 1 مل / ساعة ، حتى تمتلئ قناة الموائع الدقيقة بالمزرعة البكتيرية.
  9. قم بإزالة مرشح حقنة وسائط الثقافة بعناية وضع المخرج في حاوية النفايات. اترك الخلايا البكتيرية في ظروف التدفق الصفري في قناة الموائع الدقيقة لمدة 3 ساعات للسماح لسطحها بالتعلق في الوسط المسامي.
    ملاحظة: تم تحسين ترك الخلايا البكتيرية في ظروف التدفق الصفري لمدة 3 ساعات لربط السلالة البكتيرية المستخدمة مع ضمان وجود ثقافة بكتيرية مؤكسجة جيدا. قد تتطلب السلالات البكتيرية الأخرى وقتا أطول أو أقل.
  10. لبدء التجربة ، ابدأ التدفق عن طريق ضبط مضخة المحقنة على معدل التدفق المطلوب (هنا 1 مل / ساعة) وابدأ قراءة الضغط عند 1 هرتز.
  11. الحصول على صور للغشاء الحيوي المتنامي في الفترة الزمنية المطلوبة ، والتكوين البصري ، والتكبير.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم الحصول على صور بتكبير 4x في وضع المجال الساطع في 18 موقعا تغطي كامل مجال الوسط المسامي كل 6 دقائق لمدة 24 ساعة.

5. تحليل الصور

  1. أعد بناء الوسط المسامي بالكامل من تسلسلات الصور المسجلة عن طريق خياطة الصور من المواضع ال 18 باستخدام برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) وخوارزمية خياطة24.
  2. احفظ تسلسلات الصور المجمعة على هيئة تسلسل من الصور المفردة.
    ملاحظة: إذا كانت الملفات كبيرة جدا ، في هذه المرحلة ، يمكن إعادة تحجيم الصور وتثبيتها إلى حجم معقول لمزيد من المعالجة.
  3. قم بإنشاء قناع لأعمدة الوسط المسامي لإزالتها من التحليل.
  4. قم بإزالة خلفية الصور عن طريق تقسيمها على خلفيتها مع الصورة الملتقطة عند t = 0 h (الشكل 2A) وتقسيم الصور عند عتبة مناسبة لتقسيم الغشاء الحيوي (الشكل 2B).
  5. احسب تشبع الغشاء الحيوي عن طريق حساب المساحة التي يغطيها الغشاء الحيوي (عدد وحدات البكسل المنسوبة إلى الغشاء الحيوي) مقارنة بمساحة الفراغ في المجال المسامي (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام جهاز الموائع الدقيقة مع ثلاث قنوات موائع دقيقة متوازية بأحجام مسام مختلفة (الشكل 1) لدراسة تكوين الأغشية الحيوية في الوسائط المسامية بشكل منهجي. تم تصور عملية تكوين الأغشية الحيوية باستخدام المجهر في المجال الساطع. ظهرت الخلايا البكتيرية والأغشية الحيوية في الصور كوحدات بكسل أغمق (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت عملية انسداد تدريجية؛ خلال تجربة 24 ساعة ، استعمر الغشاء الحيوي الذي ينمو بشكل عشوائي في البداية الوسط المسامي بأكمله تقريبا.

تم تحديد التغطية السطحية للغشاء الحيوي الرقيق في الوقت الذي ينمو بمعدل تدفق Q = 1 مل / ساعة ، والذي يتوافق مع متوسط سرعة تدفق السائل الأولية البالغة 0.96 مم / ثانية ، لثلاثة أحجام مختلفة للمسام (75 ميكرومتر و 150 ميكرومتر و 300 ميكرومتر) (الشكل 3 ، الخطوط السوداء). وجد أن التغطية السطحية ، التي تم استخدامها كبديل لدرجة الانسداد الحيوي ، حدثت أسرع بنسبة 10٪ عند أصغر حجم مسام يبلغ 75 ميكرومتر مقارنة بأكبر حجم للمسام (300 ميكرومتر) عند مقارنة التغطية السطحية عند t = 20 h. بعد ذلك ، ارتبطت التغطية السطحية بتراكم الضغط الناجم عن الأغشية الحيوية (الشكل 3 ، الخطوط الزرقاء). أدى الانسداد في قناة الموائع الدقيقة ذات حجم المسام الأصغر إلى اختلاف ضغط أعلى بين المدخل والمخرج مقارنة بقنوات الموائع الدقيقة ذات حجم المسام الأكبر ، مما يشير إلى أن الوسائط المسامية الأصغر حجما ستطور تراكما أعلى للضغط عند تعرضها للانسداد الحيوي.

Figure 1
الشكل 1: تصميم قناة الموائع الدقيقة والإعداد التجريبي. (أ) قناع ضوئي لقنوات الموائع الدقيقة ذات أحجام مسامية مختلفة (75 ميكرومتر و 150 ميكرومتر و 300 ميكرومتر) تستخدم كنظائر وسائط مسامية وعرض مكبر لترتيب الأعمدة (الصف السفلي). تظهر الدوائر موقع الأعمدة (العوائق غير المنفذة) ، والتي تمثل المرحلة الصلبة للوسائط المسامية. (ب) رسم تخطيطي للإعداد التجريبي يوضح المحقنة ، ومستشعر الضغط ، وجهاز الموائع الدقيقة (مع قناة ميكروفلويديك واحدة) ، وإعداد الكاميرا الرقمية مع الهدف (أي المجهر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصور وتقدير كمي لتطور الأغشية الحيوية في الوسط المسامي. (أ) تسلسل الصورة التمثيلية لتطور الأغشية الحيوية عند معدل التدفق المفروض Q = 1 mL/h (يتوافق مع متوسط سرعة تدفق مائع أولي قدره 0.96 مم/ث) وحجم مسام d = 300 ميكرومتر مبين للنقاط الزمنية التجريبية t = 5 h، ر = 10 ساعات ، ر = 15 ساعة ، و ر = 20 ساعة. تم خياطة صور المجال الساطع ، وتمت إزالة الخلفية. (ب) أدى تحديد هذه الصور والقياس الكمي للمساحة التي تشغلها الأغشية الحيوية (وحدات البكسل الداكنة) إلى تحديد كمية التغطية السطحية في الشكل 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التطور الزمني لتغطية الأغشية الحيوية وتأثيرها على الضغط. تغطية الأغشية الحيوية مع قراءة ضغط متزامنة لأحجام المسام الثلاثة (300 ميكرومتر و 150 ميكرومتر و 75 ميكرومتر) في نفس الظروف التجريبية مثل الشكل 2. يزداد فرق الضغط الناجم عن الأغشية الحيوية في قناة الموائع الدقيقة المتوسطة المسامية ، Δp ، (الخطوط الزرقاء) الموضحة على المحور y الأيمن ، مع زيادة التغطية السطحية للغشاء الحيوي (الخطوط السوداء). تتوافق العلامات الخضراء مع نقاط بيانات الصور الموضحة في الشكل 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توفر نظائر الوسائط المسامية Microfluidic إلى جانب أجهزة استشعار الضغط أداة مناسبة لدراسة تطور الأغشية الحيوية في الوسائط المسامية. يسمح التنوع في تصميم الوسط المسامي للسوائع الدقيقة ، وتحديدا ترتيب الأعمدة ، بما في ذلك القطر والأشكال غير المنتظمة وحجم المسام ، بالتحقيق في العديد من الأشكال الهندسية. تتراوح هذه الأشكال الهندسية من المسام المفردة إلى العوائق المعقدة للغاية وغير المنتظمة التي تحاكي الوسائط المسامية الطبيعية المختلفة (مثل التربة) والصناعية (مثل الأغشية والمرشحات). في منصة الموائع الدقيقة الحالية ، تم إنشاء ثلاث أشكال هندسية للوسائط المسامية بأعمدة أسطوانية مرتبة بانتظام (أحجام المسام: 75 ميكرومتر و 150 ميكرومتر و 300 ميكرومتر) ، حيث يمكن اختيار معدل تدفق السوائل لكل تجربة. يمكن تكييف المنصة المقدمة بسهولة لدراسة الانسداد الحيوي برأس ضغط ثابت بدلا من معدل تدفق السوائل المفروض. في هذه الحالة ، يجب أن يكون جهاز التحكم في التدفق عبارة عن جهاز تحكم في الضغط مع خزان متوسط للثقافة بدلا من مضخة حقنة. يمكن مراقبة التغيرات الناتجة في معدل التدفق بسبب الانسداد الحيوي عن طريق قياس التدفق الخارجي بمرور الوقت باستخدام مستشعر معدل التدفق.

يجب النظر في العديد من النقاط الحرجة لإجراء تجربة الموائع الدقيقة الناجحة مع نمو الأغشية الحيوية. لتجنب تكوين فقاعة الهواء في قناة الموائع الدقيقة أثناء التجربة ، تم تفريغ قناة الموائع الدقيقة ووسط الاستزراع (الخطوة 4.3). بعد ذلك ، يجب إجراء ملء قناة الموائع الدقيقة بوسط الاستزراع المنزوع بسرعة ولكن بعناية للحصول على قناة مشبعة بالكامل دون أي فقاعات هواء. في حالة احتجاز فقاعات الهواء في الوسط المسامي ، يمكن أن يؤدي تنظيف قناة الموائع الدقيقة بمعدل تدفق أعلى إلى إزالة الفقاعات بعد وقت قصير. الخطوة الثانية الحاسمة هي ضمان بيئة درجة حرارة ثابتة لإعادة إنتاج نمو الأغشية الحيوية باستمرار. يختلف نمو الكائنات الحية الدقيقة مع درجة الحرارة25 ، مما قد يؤدي إلى نتائج غير قابلة للتكرار عند عدم الحفاظ على استقرار درجة الحرارة أثناء التجربة (في هذه الحالة ، 24 ساعة). بالنسبة للمنصة الحالية ، تم استخدام حاضنة صندوقية حول المجهر ، على الرغم من أن غلافا أصغر مستقرا لدرجة الحرارة لجهاز الموائع الدقيقة من المحتمل أن يكون كافيا أيضا. أخيرا ، أثناء الحصول على الصورة ، يجب اختيار مواضع الصور الفردية بتداخل لا يقل عن 15٪ للحصول على تداخل كاف لخوارزمية الخياطة24.

تقتصر منصة الموائع الدقيقة الحالية على المراقبة ثنائية الأبعاد ، في حين أن تطبيقات الوسائط المسامية مثل التربة أو الأغشية لها بنية ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك ، فإن مزايا منصة الموائع الدقيقة شبه 2D مقارنة بمنصات الوسائط المسامية ثلاثية الأبعاد لدراسة الانسداد الحيوي هي الوصول البصري الكامل ودقة الوقت العالي ، حيث تقوم منصات 3D عادة بتصوير نقطة النهاية26,27. بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع أن تستمر عملية الانسداد الحيوي (أي التطور الزمني للتغطية السطحية) في أنظمة 3D 26,27 ، كما يحدث أيضا لتوزيع حجم الكتلة لمرحلة غير قابلة للامتزاج داخل الوسائط المسامية28 ، والتي تقدم نفس القياس في أنظمة2D و 3D.

تسمح هذه الطريقة بقياس استجابة الضغط لنمو الأغشية الحيوية في الأوساط المسامية أثناء دراسة تطورها المكاني والزماني بدقة زمنية ومكانية عالية وأحجام مسام مختلفة. وتعطي مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من هذه القياسات نظرة ثاقبة للعلاقة بين تطور الأغشية الحيوية على نطاق المسام واستجابات الضغط لنظام الوسط المسامي للغشاء الحيوي، ويمكن أن توفر معيارا للنمذجة العددية للأغشية الحيوية. وتتسم جهود النمذجة هذه بأهمية خاصة لتوسيع نطاق الظروف (مثل أحجام المسام، وسرعات التدفق، وخصائص الأغشية الحيوية الرقيقة للأنواع الأخرى أو الأغشية الحيوية متعددة الأنواع) التي تتجاوز القدرات التجريبية. هذا الأخير وثيق الصلة بفهم آليات الانسداد الحيوي بالقرب من الآبار ، وتطبيقات المعالجة الحيوية ، والتمعدن الحيوي29،30،31. وعموما، يمكن بسهولة تكييف هذه الطريقة لدراسة التمعدن الأحيائي أو تتبع التحول الأحيائي للملوثات بواسطة الأغشية الحيوية في الأوساط المسامية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يقر المؤلفون بالدعم المقدم من SNSF PRIMA Grant 179834 (إلى E.S.) ، والتمويل التقديري من ETH (إلى RS) ، ومنحة ETH Zurich Research Grant (إلى RS و JJM) ، والتمويل التقديري من Eawag (إلى JJM). يود المؤلفون أن يشكروا روبرتو بيولي على توضيح الإعداد التجريبي في الشكل 1B و Ela Burmeister على تحضير رقاقة السيليكون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane Pall Corporation PN4190 1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) BD 300912 used to fill the channel with deionised water
Box Incubator Life Imaging Services used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000 WPA biowave OD meter
Centrifuge vial Eppendorf 30120086 1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI GmbH syringe pump
CorelCAD CorelDRAW software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile) greiner bio-one Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line VWR Oven to cure the PDMS
Handy Migros Detergent solution
Hot plate with temperature control VRW to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ FIJI  Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) Eppendorf Incubator
Isopropanol (> 99.8%) Sigma Aldrich 67-63-0
Masterflex transfer tubing Masterflex HV-06419-05 0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm Corning 2947-75X50 Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar) Elveflow Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm Integra Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer Microresist
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments Microscope
Nutrient broth n°3 Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock B.Braun syringes of different volume
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1  used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science) Kimberly Clark KCP-7552 to dry the glass slide
Scale VWR-CH 611-2605 used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm) Silicon Materials Inc.  N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150 Sawatec
SU8 3050 Photoresist Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner SUSS MicroTec Group used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184 Dow Corning silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01 Technic Technic
Tissue culture dish 150 TPP 93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane Sigma Aldrich Sigma Aldrich used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M Veeco Profilometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 17 (4), 247-260 (2019).
  2. Cunningham, A. B., Sharp, R. R., Hiebert, R., James, G. Subsurface biofilm barriers for the containment and remediation of contaminated groundwater. Bioremediation Journal. 7 (3-4), 151-164 (2003).
  3. Pronk, W., et al. Gravity-driven membrane filtration for water and wastewater treatment: A review. Water Research. 149, 553-565 (2019).
  4. Caldara, M., Belgiovine, C., Secchi, E., Rusconi, R. Environmental, microbiological, and immunological features of bacterial biofilms associated with implanted medical devices. Clinical Microbiology and Infection. 35 (2), 00221 (2022).
  5. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  6. Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (4), 847-867 (2000).
  7. Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. Journal of Applied Microbiology. 85 (1), 19-28 (1998).
  8. Thomen, P., et al. Bacterial biofilm under flow: First a physical struggle to stay, then a matter of breathing. PLoS ONE. 12 (4), 0175197 (2017).
  9. Horn, H., Reiff, H., Morgenroth, E. Simulation of growth and detachment in biofilm systems under defined hydrodynamic conditions. Biotechnology and Bioengineering. 81 (5), 607-617 (2003).
  10. Thullner, M., Mauclaire, L., Schroth, M. H., Kinzelbach, W., Zeyer, J. Interaction between water flow and spatial distribution of microbial growth in a two-dimensional flow field in saturated porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 58 (3-4), 169-189 (2002).
  11. Bottero, S., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29 (9), 1069-1086 (2013).
  12. Durham, W. M., Tranzer, O., Leombruni, A., Stocker, R. Division by fluid incision: Biofilm patch development in porous media. Physics of Fluids. 24 (9), 091107 (2012).
  13. Coyte, K. Z., Tabuteau, H., Gaffney, E. A., Foster, K. R., Durham, W. M. Microbial competition in porous environments can select against rapid biofilm growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (2), 161-170 (2017).
  14. Taylor, S. W., Jaffé, P. R. Biofilm growth and the related changes in the physical properties of a porous medium: 1. Experimental investigation. Water Resources Research. 26 (9), 2153-2159 (1990).
  15. Cunningham, A. B., Characklls, W. G., Abedeen, F., Crawford, D. Influence of biofilm accumulation on porous media hydrodynamics. Environmental Science and Technology. 25 (7), 1305-1311 (1991).
  16. Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: Biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (24), 5133-5137 (2012).
  17. Biswas, I., Sadrzadeh, M., Kumar, A. Impact of bacterial streamers on biofouling of microfluidic filtration systems. Biomicrofluidics. 12 (4), 044116 (2018).
  18. Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
  19. Stewart, T. L., Scott Fogler, H. Pore-scale investigation of biomass plug development and propagation in porous media. Biotechnology and Bioengineering. 77 (5), 577-588 (2002).
  20. Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
  21. Aufrecht, J. A., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14 (6), 0218316 (2019).
  22. Karimifard, S., Li, X., Elowsky, C., Li, Y. Modeling the impact of evolving biofilms on flow in porous media inside a microfluidic channel. Water Research. 188, 116536 (2021).
  23. Yawata, Y., Nguyen, J., Stocker, R., Rusconi, R. Microfluidic studies of biofilm formation in dynamic environments. Journal of Bacteriology. 198 (19), 2589-2595 (2016).
  24. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  25. Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., Ball, A. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology. 149 (1), 1-5 (1982).
  26. Ostvar, S., et al. Investigating the influence of flow rate on biofilm growth in three dimensions using microimaging. Advances in Water Resources. 117, 1-13 (2018).
  27. Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
  28. Iglauer, S., Favretto, S., Spinelli, G., Schena, G., Blunt, M. J. X-ray tomography measurements of power-law cluster size distributions for the nonwetting phase in sandstones. Physical Review E. 82 (5), 10-12 (2010).
  29. Wu, C., Chu, J., Wu, S., Cheng, L., van Paassen, L. A. Microbially induced calcite precipitation along a circular flow channel under a constant flow condition. Acta Geotechnica. 14 (3), 673-683 (2019).
  30. Nassar, M. K., et al. Large-scale experiments in microbially induced calcite precipitation (MICP): reactive transport model development and prediction. Water Resources Research. 54 (1), 480-500 (2018).
  31. Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 21 (1), 27-52 (2022).

Tags

التراجع، العدد 188،
منصة الموائع الدقيقة لدراسة الانسداد الحيوي في الوسائط المسامية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker,… More

Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. A Microfluidic Platform to Study Bioclogging in Porous Media. J. Vis. Exp. (188), e64689, doi:10.3791/64689 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter