Summary
Het huidige protocol beschrijft een microfluïdisch platform om de ontwikkeling van biofilms in quasi-2D poreuze media te bestuderen door microscopiebeeldvorming met hoge resolutie te combineren met gelijktijdige drukverschilmetingen. Het platform kwantificeert de invloed van poriegrootte en vloeistofstroomsnelheden in poreuze media op bioclogging.
Abstract
Bacteriële biofilms worden aangetroffen in verschillende milieu- en industriële poreuze media, waaronder bodems en filtratiemembranen. Biofilms groeien onder bepaalde stromingsomstandigheden en kunnen de poriën verstoppen, waardoor de lokale vloeistofstroom wordt omgeleid. Het vermogen van biofilms om poriën te verstoppen, de zogenaamde bioclogging, kan een enorm effect hebben op de lokale permeabiliteit van het poreuze medium, waardoor een drukopbouw in het systeem ontstaat en de massastroom erdoorheen wordt beïnvloed. Om de wisselwerking tussen biofilmgroei en vloeistofstroom onder verschillende fysieke omstandigheden (bijvoorbeeld bij verschillende stroomsnelheden en poriegroottes) te begrijpen, wordt in deze studie een microfluïdisch platform ontwikkeld om de ontwikkeling van biofilms te visualiseren met behulp van een microscoop onder extern opgelegde, gecontroleerde fysieke omstandigheden. De door de biofilm geïnduceerde drukopbouw in het poreuze medium kan gelijktijdig worden gemeten met behulp van druksensoren en later worden gecorreleerd met de oppervlaktedekking van de biofilm. Het gepresenteerde platform biedt een basis voor een systematische aanpak om bioclogging veroorzaakt door biofilms in poreuze media onder stromingsomstandigheden te onderzoeken en kan worden aangepast aan het bestuderen van omgevingsisolaten of biofilms met meerdere soorten.
Introduction
Biofilms - bacteriekolonies ingebed in een zelfuitgescheiden matrix van extrapolymere stoffen (EPS) - zijn alomtegenwoordig in natuurlijke poreuze media, zoals bodems en watervoerende lagen1, en technische en medische toepassingen, zoals bioremediatie2, waterfiltratie3 en medische hulpmiddelen4. De biofilmmatrix bestaat uit polysacchariden, eiwitvezels en extracellulair DNA5,6 en is sterk afhankelijk van de micro-organismen, de beschikbaarheid van voedingsstoffen en de omgevingscondities7. Toch zijn de functies van de matrix universeel; Het vormt de steiger van de biofilmstructuur, beschermt de microbiële gemeenschap tegen mechanische en chemische spanningen en is grotendeels verantwoordelijk voor de reologische eigenschappen van de biofilms5.
In poreuze media kan de groei van biofilms de poriën verstoppen, waardoor de zogenaamde bioclogging ontstaat. De ontwikkeling van biofilms wordt geregeld door de vloeistofstroom en poriegrootte, gedefinieerd als de afstand tussen twee pilaren, van het poreuze medium 8,9,10. Zowel de poriegrootte als de vloeistofstroom regelen het transport van voedingsstoffen en lokale schuifkrachten. Op zijn beurt verstopt de groeiende biofilm de poriën, wat de snelheidsverdeling van de vloeistof 11,12,13, het massatransport en de hydraulische geleidbaarheid van het poreuze medium beïnvloedt 14,15. De veranderingen in hydraulische geleidbaarheid worden weerspiegeld door verhoogde druk in gesloten systemen16,17,18,19. Huidige microfluïdische studies in biofilmontwikkeling en bioclogging richten zich op het bestuderen van de impact van stroomsnelheden in homogene geometrieën16,20 (d.w.z. met een enkelvoudige poriegrootte) of heterogene poreuze media12,21,22. Om echter de effecten van stroomsnelheden en poriegrootte op de ontwikkeling van biofilms en de daaruit voortvloeiende drukveranderingen in het bioclogeerde poreuze medium te ontwarren, is een zeer controleerbaar en veelzijdig experimenteel platform nodig dat de studie van verschillende poreuze mediageometrieën en omgevingscondities parallel mogelijk maakt.
De huidige studie introduceert een microfluïdisch platform dat drukmetingen combineert met gelijktijdige beeldvorming van de evoluerende biofilm in het poreuze medium. Vanwege de gasdoorlaatbaarheid, biocompatibiliteit en flexibiliteit in het kanaalgeometrieontwerp, is een microfluïdisch apparaat gemaakt van polydimethylsiloxaan (PDMS) een geschikt hulpmiddel voor het bestuderen van biofilmontwikkeling in poreuze media. Microfluïdica maken het mogelijk om de fysische en chemische omstandigheden (bijv. vloeistofstroom en nutriëntenconcentratie) met hoge precisie te beheersen om de omgeving van microbiële habitats na te bootsen23. Verder kunnen microfluïdische apparaten eenvoudig worden afgebeeld met micrometrische resolutie met behulp van een optische microscoop en gekoppeld aan online metingen (bijvoorbeeld de lokale druk).
In dit werk richten de experimenten zich op het bestuderen van de impact van poriegrootte in een homogeen poreus medium analoog onder gecontroleerde opgelegde stromingsomstandigheden. De stroom van een kweekmedium wordt opgelegd met behulp van een spuitpomp en het drukverschil door het microfluïdische kanaal wordt gelijktijdig gemeten met druksensoren. Biofilmontwikkeling wordt geïnitieerd door het zaaien van een planktoncultuur van Bacillus subtilis in het microfluïdische kanaal. Regelmatige beeldvorming van de evoluerende biofilm en beeldanalyse maakt het mogelijk om porieschaal opgeloste informatie over de oppervlaktedekking onder verschillende experimentele omstandigheden te verkrijgen. De gecorreleerde informatie over drukverandering en de mate van bioclogging levert cruciale input voor permeabiliteitsschattingen van bioclogged poreuze media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silicium wafer voorbereiding
- Ontwerp de geometrieën van het microfluïdische kanaal in computer-aided design (CAD; zie Materiaaltabel) software en print het op een transparante film om het fotomasker te maken (figuur 1A).
- Fabriceer de mastermal door zachte lithografie (onder cleanroomomstandigheden) volgens de onderstaande stappen.
- Bak de siliconen wafer 2 uur op 200 °C.
- Plaats de wafer in het midden van een spin-coater en giet SU8 3050 fotoresist (zie Materiaaltabel) op de wafer. Spin coat bij 1.700 rpm gedurende 40 s met een 10 s/100 rpm ramp time.
OPMERKING: De spin-coatingparameters zijn ingesteld om een doeldikte van 100 μm te verkrijgen voor de SU8 3050. - Na het spin-coatingproces bakt u de siliciumwafer zachtjes op 65 °C gedurende 600 s en 95 °C gedurende 2.700 s. Laat de wafel een nacht afkoelen bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De nachtelijke koeling verbetert de hechting van de SU8 aan de wafer. - Plaats het fotomasker (stap 1.1) op de wafer en stel het bloot aan UV-licht, met een belichtingsenergie van 250 mJ/cm2 en bij een golflengte van 350 nm.
- Bak het blootgestelde substraat na blootstelling bij 65 °C gedurende 60 s en 95 °C gedurende 300 s.
- Ontwikkel de siliciumwafer om de mastermal te verkrijgen door deze onder te dompelen in een bekerglas gevuld met mrDev600 developer (zie Materiaaltabel). Schud het bekerglas voorzichtig gedurende 1.800 s om de ongepolymeriseerde weerstand uit te spoelen. Spat vervolgens af door isopropanol op de siliciumwafer te spuiten en aan de lucht te drogen.
- Bak de siliconen wafer hard op 200 °C gedurende 1.800 s.
- Silaniseer de mastermal door dampafzetting van 20 μL Trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan (zie materiaaltabel) geplaatst op een glazen schuif naast de mal gedurende 40 minuten in een vacuüm exsiccator, waardoor een manometerdruk van 100 mbar ontstaat.
2. Fabricage van het microfluïdische apparaat
OPMERKING: De hier beschreven fabricageprocedure is voor een microfluïdisch apparaat met één microfluïdisch kanaal. Dezelfde methode kan echter worden toegepast om een microfluïdisch apparaat te fabriceren met meerdere microfluïdische kanalen parallel.
- Meng het elastomeer met zijn crosslinker in een verhouding van 10:1 (zie materiaaltabel) om een PDMS-mengsel te bereiden. Roer het mengsel totdat het gelijkmatig wordt gemengd en ondoorzichtig wordt door de ingesloten luchtbellen.
- Ontgast het mengsel in een vacuüm exsiccator, waardoor een manometerdruk van 100 mbar ontstaat totdat de ingesloten luchtbellen zijn verwijderd en het er transparant uitziet. De tijd die nodig is voor het ontgassen is meestal 30 minuten.
- Plaats de mastermal (stap 1) in een celkweekschaal (zie Materiaaltabel). Giet 20 g van het PDMS-mengsel op de hoofdmal om kanalen met een uiteindelijke dikte van 5 mm te produceren.
- Bak de mastervorm 2 uur op 70 °C.
- Snijd het uitgeharde PDMS rond het microfluïdische kanaal (op een afstand van ongeveer 3 mm) met behulp van een mes en pel vervolgens het PDMS-microfluïdische kanaal van de hoofdmal.
- Om de in- en uitlaat van de microfluïdische kanalen te creëren, ponst u gaten met een biopsiepons (diameter van 1,5 mm) aan de uiteinden (bovenkant van de driehoeken, zie figuur 1A). Pons een extra gat in het midden van de inlaatdriehoek om de druksensor later te installeren.
- Was een glasglaasje en het microfluïdische kanaal met een in de handel verkrijgbare 1% reinigingsmiddeloplossing (zie Materiaaltabel) gedurende 5 minuten en spoel ze vervolgens af met gedeïoniseerd water. Was daarna het PDMS-microfluïdische kanaal en de glasplaat met isopropanol. Spoel ze vervolgens opnieuw af met gedeïoniseerd water. Droog het PDMS microfluïdische kanaal en de glasplaat met perslucht op 1 bar gedurende 1 min.
OPMERKING: De poreuze structuur van het PDMS moet volledig droog zijn om de hechting effectief te laten zijn. - Plaats de glasplaat en het microfluïdische kanaal in een plasmareiniger (zie materiaaltabel) en zorg ervoor dat de te verlijmen oppervlakken naar boven zijn gericht. Zet de plasmareiniger aan en behandel het microfluïdische kanaal en de glasplaat met luchtplasma met een luchtstroom van 1 SL/h (standaard liter per uur) gedurende 1 min. Hecht het microfluïdische kanaal onmiddellijk na het verwijderen van de glasplaat aan de glasplaat door ze met elkaar in contact te brengen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de behandelde oppervlakken niet aanraakt, omdat dit de hechting kan beïnvloeden. Wanneer u een microfluïdisch apparaat met meerdere microfluïdische kanalen fabriceert, stelt u de microfluïdische kanalen tegelijkertijd bloot en bindt u ze in één stap. - Plaats het gebonden microfluïdische apparaat gedurende ten minste 15 minuten op een hete plaat van 80 °C.
- Bewaar het microfluïdische apparaat in een schone celkweekschaal totdat het experiment begint.
3. Bereiding van de bacteriële suspensie
- Kweek een populatie van Bacillus subtilis NCIB 3610 20 h voor het begin van het experiment door direct 3 ml voedingsbouillon nr. 3 kweekmedium (zie tabel met materialen) uit een bevroren glycerolvoorraad in een kweekbuis van 15 ml te enten. Incubeer in een schudincubator bij 30 °C en 200 tpm gedurende een nacht (gedurende 16 uur).
- Maak 4 uur voor aanvang van het experiment een subcultuur van de nachtkweek door 3 μL van de nachtkweek toe te voegen in 3 ml vers kweekmedium (1:1.000 verdunning) in een kweekbuis van 15 ml. Incubeer de subcultuur in een schudincubator bij 30 °C bij 200 tpm gedurende 3,5-4 uur om een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,1 te verkrijgen.
4. Biofilm groei-experiment
- Zet de boxincubator van de microscoop 3 uur voor het experiment aan om een stabiele temperatuur van 25 °C te garanderen. Monteer de spuitpomp en de druksensoren (zie materiaaltabel).
- Sluit de inlaat- en uitlaatslang aan op het microfluïdische apparaat. Steek direct een naald (met een buitendiameter van 0,6 mm) in de inlaatslang om de verbinding tussen de slang en de spuit vast te zetten.
- Plaats het microfluïdische apparaat, 30 ml gedeïoniseerd water en 30 ml kweekmedium in een vacuümexsiccator en ontgast ze gedurende ten minste 1 uur. Trek vervolgens langzaam het kweekmedium en het gedeïoniseerde water in twee afzonderlijke spuiten van 30 ml.
OPMERKING: Deze stap is cruciaal om bubbelvorming in het kanaal te voorkomen tijdens het spoelen met het kweekmedium. - Monteer het microfluïdische apparaat op de microscoop en plaats de uitlaatslang in een afvalcontainer.
- Sluit de spuit gevuld met gedeïoniseerd water aan op het microfluïdische kanaal via de microfluïdische slang en injecteer het water langzaam totdat het uit de uitlaat van de druksensor komt. Vul de druksensor met water en spoel alle bellen uit de slang die het microfluïdische kanaal en de druksensor verbindt. Sluit de uitlaat van de druksensor met de schroeven die aan de druksensor zijn gewijd.
OPMERKING: De beschreven vulprocedure zorgt ervoor dat de drukveranderingen bij de inlaat van de microfluïdische kanalen nauwkeurig worden geregistreerd. Wanneer u een experiment uitvoert met meerdere microfluïdische kanalen, sluit u elk kanaal aan op een afzonderlijke spuit om gelijke stroomomstandigheden in alle kanalen te garanderen.
- Sluit de spuit gevuld met gedeïoniseerd water aan op het microfluïdische kanaal via de microfluïdische slang en injecteer het water langzaam totdat het uit de uitlaat van de druksensor komt. Vul de druksensor met water en spoel alle bellen uit de slang die het microfluïdische kanaal en de druksensor verbindt. Sluit de uitlaat van de druksensor met de schroeven die aan de druksensor zijn gewijd.
- Vul de rest van het microfluïdische kanaal met het gedeïoniseerde water.
- Plaats een filter van 1,2 μm (zie materiaaltabel) op de kweekmediaspuit. Verwijder vervolgens de waterspuit en sluit de kweekmediaspuit voorzichtig aan op de microfluïdische slang van de inlaat. Monteer de spuit op de spuitpomp en spoel het kanaal met het kweekmedium met een debiet van 2 ml/h gedurende 1 uur.
OPMERKING: Het filter voorkomt dat bacteriële cellen tijdens het laden in de spuit terechtkomen. Het spoelen van het microfluïdische kanaal met de kweekmedia zal de resterende bellen in de poreuze structuur verwijderen. - Stel de spuitpomp tijdens het experiment in op het gewenste debiet (hier 1 ml/h) en stel de drukmeting van de druksensoren in op nul.
OPMERKING: Door de initiële drukmeting op nul in te stellen, wordt alleen het drukverschil gemeten dat wordt veroorzaakt door de ontwikkeling van biofilm tijdens het experiment. - Pipetteer 1 ml van de bacteriecultuur bij een OD600 van 0,1 in een injectieflacon met centrifuge van 1,5 ml. Laad de bacteriecultuur in het microfluïdische kanaal door de uitlaatbuis in de injectieflacon met centrifuges te plaatsen. Na 5 minuten te hebben gewacht om eventuele luchtbellen uit de uitlaat van de buizen te verwijderen, trekt u 150 μL bacteriële oplossing op met een stroomsnelheid van 1 ml / uur, totdat het microfluïdische kanaal is gevuld met de bacteriecultuur.
- Verwijder voorzichtig het filter van de kweekmediaspuit en plaats de uitlaat in de afvalcontainer. Laat de bacteriële cellen gedurende 3 uur op nulstroomcondities in het microfluïdische kanaal om hun oppervlakteaanhechting in het poreuze medium mogelijk te maken.
OPMERKING: Het verlaten van de bacteriële cellen op nul-flow omstandigheden gedurende 3 uur was geoptimaliseerd voor de aanhechting van de gebruikte bacteriestam terwijl een goed zuurstofrijke bacteriecultuur werd verzekerd. Andere bacteriestammen kunnen meer of minder tijd nodig hebben. - Om het experiment te starten, start u de stroom door de spuitpomp in te stellen op het gewenste debiet (hier 1 ml / h) en start u de drukmeting op 1 Hz.
- Verkrijg beelden van de groeiende biofilm met het gewenste tijdsinterval, optische configuratie en vergroting.
OPMERKING: In deze studie werden beelden met een vergroting van 4x in de helderveldmodus in 18 posities die het hele domein van het poreuze medium beslaan, elke 6 minuten gedurende 24 uur verkregen.
5. Beeldanalyse
- Reconstrueer het volledige poreuze medium uit de opgenomen beeldsequenties door de beelden van de 18 posities te naaien met behulp van beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel) en een stikalgoritme24.
- Sla de gestikte afbeeldingsreeksen op als een reeks enkelvoudige afbeeldingen.
OPMERKING: Als de bestanden te groot zijn, kunnen de afbeeldingen op dit moment opnieuw worden geschaald en in de prullenbak worden gegooid tot een redelijke grootte voor verdere verwerking. - Maak een masker van de pilaren van het poreuze medium om ze uit de analyse te verwijderen.
- Verwijder de achtergrond van de afbeeldingen door ze te delen door hun achtergrond met de afbeelding genomen op t = 0 h (figuur 2A) en binariseer de afbeeldingen op een drempel die geschikt is om de biofilm te segmenteren (figuur 2B).
- Bereken de verzadiging van de biofilm door het gebied te berekenen dat door de biofilm wordt bedekt (aantal pixels dat aan de biofilm wordt toegeschreven) in vergelijking met het lege gebied van het poreuze domein (figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor deze studie werd een microfluïdisch apparaat met drie parallelle microfluïdische kanalen met verschillende poriegroottes gebruikt (figuur 1) om biofilmvorming in poreuze media systematisch te bestuderen. Het biofilmvormingsproces werd gevisualiseerd met behulp van helderveldmicroscopie. De bacteriële cellen en de biofilm verschenen in de afbeeldingen als donkere pixels (figuur 2). Daarnaast werd een geleidelijk verstoppingsproces waargenomen; Tijdens een 24-uurs experiment koloniseerde de aanvankelijk willekeurig groeiende biofilm bijna het hele poreuze medium.
De oppervlaktedekking van de biofilm in de tijd gegroeid met een stroomsnelheid van Q = 1 ml / h, wat overeenkomt met een gemiddelde initiële vloeistofstroomsnelheid van 0,96 mm / s, werd gekwantificeerd voor drie verschillende poriegroottes (75 μm, 150 μm en 300 μm) (figuur 3, zwarte lijnen). Het bleek dat de oppervlaktedekking, die werd gebruikt als een proxy voor de bioverstoppingsgraad, 10% sneller optrad bij de kleinste poriegrootte van 75 μm dan bij de grootste poriegrootte (300 μm) bij vergelijking van de oppervlaktedekking bij t = 20 h. Vervolgens werd de oppervlaktebedekking gecorreleerd aan de drukopbouw veroorzaakt door de biofilm (figuur 3, blauwe lijnen). De verstopping in het microfluïdische kanaal met kleinere poriegrootte leidde tot een hoger drukverschil tussen de inlaat en de uitlaat dan in de microfluïdische kanalen met een grotere poriegrootte, wat aangeeft dat kleinere poreuze media een hogere drukopbouw zullen ontwikkelen wanneer ze worden blootgesteld aan bioclogging.
Figuur 1: Microfluïdisch kanaalontwerp en experimentele opstelling. (A) Fotomasker van de microfluïdische kanalen met verschillende poriegroottes (75 μm, 150 μm en 300 μm) gebruikt als poreuze media-analogen en een ingezoomd zicht op de opstelling van de pilaren (onderste rij). De cirkels tonen de locatie van de pilaren (ondoordringbare obstakels), die de vaste fase van het poreuze medium vertegenwoordigen. (B) Schema van de experimentele opstelling met de spuit, de druksensor, het microfluïdische apparaat (met een enkel microfluïdisch kanaal) en de opstelling van de digitale camera met het doel (d.w.z. de microscoop). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Visualisatie en kwantificering van biofilmontwikkeling in het poreuze medium. (A) Representatieve beeldsequentie van de biofilmontwikkeling bij de opgelegde stroomsnelheid van Q = 1 ml/h (komt overeen met een gemiddelde initiële vloeistofstroomsnelheid van 0,96 mm/s) en een poriegrootte van d = 300 μm weergegeven voor de experimentele tijdstippen t = 5 h; t = 10 uur, t = 15 uur en t = 20 uur . De bright-field beelden werden gestikt en de achtergrond werd verwijderd. (B) De binarisatie van deze beelden en de kwantificering van het door biofilm ingenomen gebied (donkere pixels) leidden tot de kwantificering van de oppervlaktebedekking in figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Temporele evolutie van biofilmdekking en impact op druk. Biofilmdekking met gelijktijdige drukmeting voor de drie poriegroottes (300 μm, 150 μm en 75 μm) in dezelfde experimentele omstandigheden als figuur 2. Het drukverschil veroorzaakt door de biofilm in het poreuze medium microfluïdische kanaal, Δp, (blauwe lijnen) weergegeven op de rechter y-as, neemt toe met een verhoogde oppervlaktedekking van de biofilm (zwarte lijnen). De groene markeringen komen overeen met de gegevenspunten van de afbeeldingen in figuur 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microfluïdische poreuze media-analogen in combinatie met druksensoren bieden een geschikt hulpmiddel om de ontwikkeling van biofilms in poreuze media te bestuderen. De veelzijdigheid in het ontwerp van het microfluïdische poreuze medium, met name de opstelling van de pilaren, inclusief diameter, onregelmatige vormen en poriegrootte, maakt het mogelijk om vele geometrieën te onderzoeken. Deze geometrieën variëren van enkele poriën tot zeer complexe, onregelmatig gerangschikte obstakels die verschillende natuurlijke (bijv. Bodems) en industriële (bijv. membranen en filters) poreuze media nabootsen. In het huidige microfluïdische platform werden drie poreuze mediageometrieën gecreëerd met regelmatig gerangschikte cilindrische pilaren (poriegroottes: 75 μm, 150 μm en 300 μm), waar de vloeistofstroomsnelheid per experiment kon worden gekozen. Het gepresenteerde platform kan eenvoudig worden aangepast om bioclogging te bestuderen met een vaste drukkop in plaats van een opgelegd vloeistofdebiet. In dit geval moet het debietregelapparaat een drukregelaar zijn met een kweekmediumreservoir in plaats van een spuitpomp. De resulterende veranderingen in het debiet als gevolg van bioclogging kunnen worden gevolgd door de uitstroom in de loop van de tijd te meten met behulp van een stroomsnelheidssensor.
Verschillende kritieke punten moeten worden overwogen om een succesvol microfluïdisch experiment met biofilmgroei uit te voeren. Om luchtbelvorming in het microfluïdische kanaal tijdens het experiment te voorkomen, werden het microfluïdische kanaal en het kweekmedium ontgast (stap 4.3). Vervolgens moet het vullen van het microfluïdische kanaal met het ontgaste kweekmedium snel maar zorgvuldig worden uitgevoerd om een volledig verzadigd kanaal zonder luchtbellen te verkrijgen. In het geval dat luchtbellen gevangen zitten in het poreuze medium, kan het spoelen van het microfluïdische kanaal met een hogere stroomsnelheid de bellen na korte tijd verwijderen. De tweede cruciale stap is het zorgen voor een omgeving met een constante temperatuur om de groei van de biofilm consistent te reproduceren. De groei van micro-organismen varieert met temperatuur 25, wat kan leiden tot niet-reproduceerbare resultaten wanneer de temperatuur tijdens het experiment niet stabiel wordt gehouden (in dit geval24 uur). Voor het huidige platform werd een boxincubator rond de microscoop gebruikt, hoewel een kleinere temperatuurstabiele behuizing voor het microfluïdische apparaat waarschijnlijk ook voldoende zou zijn. Ten slotte moeten tijdens de beeldacquisitie de posities van de afzonderlijke afbeeldingen worden gekozen met een overlap van ten minste 15% om voldoende overlap te verkrijgen voor het stikalgoritme24.
Het huidige microfluïdische platform is beperkt tot tweedimensionale observatie, terwijl poreuze mediatoepassingen zoals bodem of membranen een driedimensionale structuur hebben. Voordelen van het quasi-2D microfluïdische platform in vergelijking met 3D poreuze mediaplatforms om bioclogging te bestuderen zijn echter de volledige optische toegang en de hoge tijdsresolutie, aangezien 3D-platforms meestal endpoint imaginguitvoeren 26,27. Bovendien wordt verwacht dat het bioverstoppingsproces (d.w.z. de tijdsevolutie van oppervlaktebedekking) aanhoudt in 3D-systemen 26,27, zoals het ook voorkomt voor de clustergrootteverdeling van een onmengbare fase binnen poreuze media28, die dezelfde schaal vertoont in2D- en 3D-systemen.
Deze methode maakt het mogelijk om de drukrespons op biofilmgroei in poreuze media te meten en tegelijkertijd de spatio-temporele ontwikkeling te bestuderen bij hoge temporele en ruimtelijke resolutie en verschillende poriegroottes. De datasets verkregen uit dergelijke metingen geven inzicht in de correlatie van biofilmontwikkeling op porieschaal met drukresponsen van het biofilmporeuze mediumsysteem en kunnen een benchmark vormen voor de numerieke modellering van biofilms. Deze modelleringsinspanningen zijn vooral relevant voor het uitbreiden van het bereik van omstandigheden (bijv. Poriegroottes, stroomsnelheden en biofilmeigenschappen voor andere soorten of biofilms met meerdere soorten) die de experimentele capaciteiten overschrijden. Dit laatste is zeer relevant voor het begrijpen van de mechanismen van bioclogging in de buurt van putten, bioremediatietoepassingen en biomineralisatie 29,30,31. Over het algemeen kan deze methode gemakkelijk worden aangepast om biomineralisatie te bestuderen of de biotransformatie van verontreinigingen door biofilms in poreuze media te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de steun van SNSF PRIMA grant 179834 (aan E.S.), discretionaire financiering van ETH (aan R.S.), ETH Zurich Research Grant (aan R.S. en J.J.M.), en discretionaire financiering van Eawag (aan J.J.M.). De auteurs willen Roberto Pioli bedanken voor het illustreren van de experimentele opstelling in figuur 1B en Ela Burmeister voor het siliciumwaferpreparaat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
References
- Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 17 (4), 247-260 (2019).
- Cunningham, A. B., Sharp, R. R., Hiebert, R., James, G. Subsurface biofilm barriers for the containment and remediation of contaminated groundwater. Bioremediation Journal. 7 (3-4), 151-164 (2003).
- Pronk, W., et al. Gravity-driven membrane filtration for water and wastewater treatment: A review. Water Research. 149, 553-565 (2019).
- Caldara, M., Belgiovine, C., Secchi, E., Rusconi, R. Environmental, microbiological, and immunological features of bacterial biofilms associated with implanted medical devices. Clinical Microbiology and Infection. 35 (2), 00221 (2022).
- Flemming, H. C., Wingender, J.
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (4), 847-867 (2000).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. Journal of Applied Microbiology. 85 (1), 19-28 (1998).
- Thomen, P., et al. Bacterial biofilm under flow: First a physical struggle to stay, then a matter of breathing. PLoS ONE. 12 (4), 0175197 (2017).
- Horn, H., Reiff, H., Morgenroth, E. Simulation of growth and detachment in biofilm systems under defined hydrodynamic conditions. Biotechnology and Bioengineering. 81 (5), 607-617 (2003).
- Thullner, M., Mauclaire, L., Schroth, M. H., Kinzelbach, W., Zeyer, J. Interaction between water flow and spatial distribution of microbial growth in a two-dimensional flow field in saturated porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 58 (3-4), 169-189 (2002).
- Bottero, S., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29 (9), 1069-1086 (2013).
- Durham, W. M., Tranzer, O., Leombruni, A., Stocker, R. Division by fluid incision: Biofilm patch development in porous media. Physics of Fluids. 24 (9), 091107 (2012).
- Coyte, K. Z., Tabuteau, H., Gaffney, E. A., Foster, K. R., Durham, W. M. Microbial competition in porous environments can select against rapid biofilm growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (2), 161-170 (2017).
- Taylor, S. W., Jaffé, P. R. Biofilm growth and the related changes in the physical properties of a porous medium: 1. Experimental investigation. Water Resources Research. 26 (9), 2153-2159 (1990).
- Cunningham, A. B., Characklls, W. G., Abedeen, F., Crawford, D. Influence of biofilm accumulation on porous media hydrodynamics. Environmental Science and Technology. 25 (7), 1305-1311 (1991).
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: Biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (24), 5133-5137 (2012).
- Biswas, I., Sadrzadeh, M., Kumar, A. Impact of bacterial streamers on biofouling of microfluidic filtration systems. Biomicrofluidics. 12 (4), 044116 (2018).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Stewart, T. L., Scott Fogler, H. Pore-scale investigation of biomass plug development and propagation in porous media. Biotechnology and Bioengineering. 77 (5), 577-588 (2002).
- Hassanpourfard, M., Ghosh, R., Thundat, T., Kumar, A. Dynamics of bacterial streamers induced clogging in microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (21), 4091-4096 (2016).
- Aufrecht, J. A., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14 (6), 0218316 (2019).
- Karimifard, S., Li, X., Elowsky, C., Li, Y. Modeling the impact of evolving biofilms on flow in porous media inside a microfluidic channel. Water Research. 188, 116536 (2021).
- Yawata, Y., Nguyen, J., Stocker, R., Rusconi, R. Microfluidic studies of biofilm formation in dynamic environments. Journal of Bacteriology. 198 (19), 2589-2595 (2016).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Ratkowsky, D. A., Olley, J., McMeekin, T. A., Ball, A. Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures. Journal of Bacteriology. 149 (1), 1-5 (1982).
- Ostvar, S., et al. Investigating the influence of flow rate on biofilm growth in three dimensions using microimaging. Advances in Water Resources. 117, 1-13 (2018).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Iglauer, S., Favretto, S., Spinelli, G., Schena, G., Blunt, M. J. X-ray tomography measurements of power-law cluster size distributions for the nonwetting phase in sandstones. Physical Review E. 82 (5), 10-12 (2010).
- Wu, C., Chu, J., Wu, S., Cheng, L., van Paassen, L. A. Microbially induced calcite precipitation along a circular flow channel under a constant flow condition. Acta Geotechnica. 14 (3), 673-683 (2019).
- Nassar, M. K., et al. Large-scale experiments in microbially induced calcite precipitation (MICP): reactive transport model development and prediction. Water Resources Research. 54 (1), 480-500 (2018).
- Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Reviews in Environmental Science and Biotechnology. 21 (1), 27-52 (2022).
