Summary
मानव प्लाज्मा में कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) सांद्रता से संबंधित प्रकाशित डेटा असंगत हैं। ये विसंगतियां इस न्यूरोपैप्टाइड को निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत, मान्य पद्धति की कमी के कारण हो सकती हैं। यहां, हम मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी को शुद्ध करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मान्य एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) एक वासोएक्टिव न्यूरोपैप्टाइड है जो माइग्रेन सिरदर्द के पैथोफिज़ियोलॉजी में एक कथित भूमिका निभाता है और बायोमार्कर स्थिति के लिए एक उम्मीदवार हो सकता है। सीजीआरपी सक्रियण पर न्यूरोनल फाइबर से जारी किया जाता है और वाहिका में बाँझ न्यूरोजेनिक सूजन और धमनी वासोडिलेशन को प्रेरित करता है जो ट्राइजेमिनल अपवाही संक्रमण प्राप्त करता है। परिधीय वाहिका में सीजीआरपी की उपस्थिति ने प्रोटिओमिक परख का उपयोग करके मानव प्लाज्मा में इस न्यूरोपैप्टाइड का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए जांच को प्रेरित किया है, जैसे कि एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा)। हालांकि, 6.9 मिनट के इसके आधे जीवन और परख प्रोटोकॉल के तकनीकी विवरणों में परिवर्तनशीलता, जो अक्सर पूरी तरह से वर्णित नहीं होती है, ने साहित्य में असंगत सीजीआरपी एलिसा डेटा प्राप्त किया है। यहां, मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी के शुद्धिकरण और परिमाणीकरण के लिए एक संशोधित एलिसा प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रक्रियात्मक चरणों में नमूना संग्रह और तैयारी, शुद्धिकरण के साधन के रूप में ध्रुवीय शर्बत का उपयोग करके निष्कर्षण, गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध करने के लिए अतिरिक्त कदम और एलिसा के माध्यम से मात्रा का ठहराव शामिल है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को स्पाइक और रिकवरी और कमजोर पड़ने वाले प्रयोगों की रैखिकता के साथ मान्य किया गया है। इस मान्य प्रोटोकॉल का उपयोग सैद्धांतिक रूप से न केवल माइग्रेन वाले व्यक्तियों के प्लाज्मा में सीजीआरपी सांद्रता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि अन्य बीमारियों के साथ भी किया जा सकता है जिसमें सीजीआरपी एक भूमिका निभा सकता है।
Introduction
कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) एक 37-एमिनो एसिड न्यूरोपेप्टाइड है जो पेरिवास्कुलर स्थानीयकरण के साथ-साथ गैर-न्यूरोनल ऊतकों के साथ न्यूरोनल फाइबर में मौजूद है। सीजीआरपी के दो रूप, α- और β-सीजीआरपी, 90% से अधिक होमोलॉजी साझा करते हैं और शारीरिक कार्यों को साझा करते हैं; हालांकि, केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र में एसीजीआरपी पाया जाता है, जबकि आंत्र तंत्रिका तंत्र 1,2 में पाया जाता है। नोसिसेप्टर सक्रियण और कैल्शियम-निर्भर एक्सोसाइटोसिस पर, सीजीआरपी न्यूरॉन्स से जारी किया जाता है, जो धमनी वाहिकाफैलाव और प्लाज्मा प्रोटीन एक्स्ट्रावेसन 3,4,5,6,7 से जुड़े बाँझ न्यूरोजेनिक सूजन को प्रेरित करता है। यहां से, सीजीआरपी पोस्टकेशिका वाहिकाओं में दिखाई देता है और उन बीमारियों के लिए बायोमार्कर हो सकता है जो अभिवाही नोसिसेप्टिव सक्रियण का कारण बनते हैं, जैसे माइग्रेन 8,9,10,11। ध्यान दें, सीजीआरपी को एंजियोजेनेसिस और प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन में अपनी भूमिका के माध्यम से सीओवीआईडी -19 में भी फंसाया गया है, और प्रतिकूल रोग विकास की भविष्यवाणी कर सकता है12,13. इस प्रकार, मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी की सटीक मात्रा के लिए एक प्रोटोकॉल का व्यापक मूल्य हो सकता है।
माइग्रेन में सीजीआरपी की भूमिका पर शायद सबसे अधिक ध्यान दिया गया है। प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययनों के आधार पर, सीजीआरपी को माइग्रेन के लिए एक संभावित बायोमार्कर के रूप में और उपचार 3,4,5,6,7,8,9,10 के लिए एक लक्ष्य के रूप में सामने रखा गया है। कुछ अध्ययनों में10,14,15 को नियंत्रित करने के सापेक्ष एपिसोडिक माइग्रेन वाले समूहों में सीजीआरपी की वृद्धि पाई गई है। माइग्रेन सिरदर्द उपचार के लिए नैदानिक परीक्षणों में सीजीआरपी अवरोधकों की सफलता माइग्रेन सिरदर्द के लिए एक कारण कारक के रूप में ऊंचा सीजीआरपी को फंसाती है। हालांकि, सभी जांचकर्ताओं ने इन परिणामों की पुष्टि नहीं कीहै 16,17,18,19। इसके अलावा, माइग्रेन के गैर-सिरदर्द लक्षणों में सीजीआरपी की भूमिका अभी तक स्पष्ट नहीं हुई है; वर्तमान काम माइग्रेन के वेस्टिबुलर लक्षणों में सीजीआरपी की भूमिका को समझने की इच्छा से प्रेरित था।
साहित्य में असंगत सीजीआरपी इम्यूनोसे डेटा कई कारणों से हो सकता है। सबसे पहले, परिधीय वाहिका में सीजीआरपी का आधा जीवन 6.9 मिनट 20 है, जो सेरीन प्रोटीज 21, इंसुलिन-डिग्रेडिंग एंजाइम और अन्य मेटालोप्रोटीज 22, तटस्थ एंडोपेप्टिडेस 23, और एंडोथेलिन-परिवर्तित एंजाइम -1 24 की गतिविधि के कारण है। दूसरे, सीजीआरपी को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोएसे के चर तकनीकी विवरण ऐसे अध्ययनों में पूरी तरह से वर्णित नहीं हैं। अंत में, इम्यूनोएसे पद्धति के मानकीकरण की कमी तस्वीर को और भी जटिल बनाती है।
यह लेख एक संशोधित एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो मानव प्लाज्मा में α- और 3सीजीआरपी के शुद्धिकरण और सटीक परिमाणीकरण की अनुमति देता है। किट के एंटीबॉडी एमीलिन, कैल्सीटोनिन या पदार्थ पी के साथ क्रॉस-रिएक्टिव नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल ने आवश्यक सत्यापन प्रयोगों से गुजरना पड़ा है, जैसे स्पाइक और रिकवरी और कमजोर पड़ने की रैखिकता, जिसके लिए डेटा यहां प्रस्तुत किया गया है। इस तरह के सीजीआरपी एलिसा प्रोटोकॉल जो सत्यापन से गुजरा है, पहले साहित्य में पूरी तरह से वर्णित नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग माइग्रेन के साथ-साथ कार्डियोलॉजिक2,25, त्वचाविज्ञान 26, प्रसूति27, रुमेटोलॉजी28,29, मस्कुलोस्केलेटल30,31, अंतःस्रावी 32,33, और वायरल रोगों 12,13 के संदर्भ में मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी को मापने के लिए किया जा सकता है, जिसमें सीजीआरपी को फंसाया गया है।
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Protocol
यह प्रोटोकॉल जॉन्स हॉपकिंस इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (NA_00092491) से अनुमोदन के साथ सहमति वाले व्यक्तियों से मानव प्लाज्मा नमूनों का उपयोग करके विकसित किया गया था।
1. नमूना संग्रह और तैयारी
- मानक वेनिपंक्चर विधियों34 के माध्यम से एंटीक्यूबिटल नस से 5 मिलीलीटर पूरे रक्त को 6 एमएल वैक्यूटेनर एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) संग्रह ट्यूब में एकत्र करें।
- लक्ष्य पेप्टाइड के लाइसिस को अवरुद्ध करने के लिए संग्रह के बाद ट्यूब में 0.5 एमएल एप्रोटिनिन (10,000 केआईयू / एमएल) प्रतिस्पर्धी सेरीन प्रोटीज अवरोधक जोड़ें। एप्रोटिनिन को रक्त के साथ पर्याप्त रूप से मिश्रण करने की अनुमति देने के लिए ट्यूब को 10 बार घुमाएं। बाद में, ट्यूबों को अगले चरण तक बर्फ पर स्टोर करें।
- रक्त संग्रह के 60 मिनट के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 604 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
- एक पिपेट के साथ प्लाज्मा अंश को उतारें और 2 एमएल राउंड-बॉटम बाँझ क्रायोवियल में स्थानांतरित करें।
- क्रायोवियल को तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक स्टोर करें।
2. प्लाज्मा नमूनों का निष्कर्षण
- ट्यूब की बाहरी लकीरों द्वारा समर्थित कारतूस की बाहरी लकीरों के साथ 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के अंदर एक निष्कर्षण कारतूस रखें।
- कारतूस के माध्यम से पहले 100% मेथनॉल के 5 एमएल और फिर 10 एमएल अल्ट्राप्योर पानी पास करके कारतूस को सक्रिय करें।
- चूंकि द्रव को गुरुत्वाकर्षण-संचालित प्रवाह के माध्यम से कारतूस के माध्यम से पारित किया जाता है, यह ट्यूब में इकट्ठा होगा।
- अतिरिक्त तरल पदार्थ को बाहर फेंक दें क्योंकि यह यह सुनिश्चित करने के लिए जमा होता है कि तरल पदार्थ कारतूस को घेर नहीं पाता है।
- सुनिश्चित करें कि प्रयोग के दौरान कारतूस सूख न जाए।
- 4% एसिटिक एसिड के 750 μL के साथ प्लाज्मा के 250 μL को पतला करें।
- कारतूस के माध्यम से धीरे-धीरे प्लाज्मा और एसिटिक एसिड समाधान के 1 मिलीलीटर को पारित करें।
नोट: इस चरण को पारित प्रत्येक मिलीलीटर के लिए गुरुत्वाकर्षण-संचालित प्रवाह के माध्यम से लगभग 30 सेकंड लेना चाहिए। - कारतूस को 4% एसिटिक एसिड के 10 मिलीलीटर के साथ धोएं। जैसा कि पहले किया गया था, अतिरिक्त तरल पदार्थ को बाहर फेंक दें क्योंकि यह यह सुनिश्चित करने के लिए जमा होता है कि तरल पदार्थ कारतूस को घेर नहीं पाता है।
- कारतूस से एसिटिक एसिड की अंतिम बूंद निकलने के बाद, कारतूस को ट्यूब से हटा दें और इसे एक नए 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
- 4% एसिटिक एसिड के 2.7 एमएल और 100% मेथनॉल के 0.3 एमएल को मिलाकर 100% मेथनॉल और 4% एसिटिक एसिड का 10: 1 समाधान तैयार करें। एक बार में कारतूस 1 एमएल के माध्यम से इस समाधान को पारित करके सीजीआरपी को हटाने के लिए इसका उपयोग करें। प्रत्येक मिलीलीटर घोल के बीच 25 मिनट के लिए रुकें। एलुएंट को बाहर मत फेंको।
- मेथनॉल और एसिटिक एसिड समाधान के अंतिम मिलीलीटर गुजरने के 25 मिनट बाद ट्यूब में 3 मिलीलीटर तरल पदार्थ होगा। एलुएंट के प्रत्येक 1 एमएल को 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
नोट: यह प्रत्येक कारतूस से तीन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब उत्पन्न करना चाहिए। - प्रत्येक ट्यूब को 1 सेकंड के लिए एक मिनी सेंट्रीफ्यूज में रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी एलुएंट प्रत्येक ट्यूब के निचले भाग में हैं।
- वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सभी नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर सुखाएं (1,400 आरपीएम पर जलीय घोल के लिए कंसंट्रेटर फ़ंक्शन पर सेट; जी-बल ट्यूबों की स्थिति के आधार पर भिन्न होता है और इसलिए 130-250 x g तक होता है)।
नोट: वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज को नमूने सूखने में लगने वाला समय उपयोग किए गए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के प्रकार पर निर्भर करेगा। - परख प्रक्रिया (चरण 4.1) पर आगे बढ़ने से तुरंत पहले, पहले से सूखे नमूने को एंजाइम इम्यूनोएसे (ईआईए) बफर (सामग्री की तालिका देखें) के साथ कमरे के तापमान (आरटी) या 20 डिग्री सेल्सियस तक पिघलाकर पुनर्गठित करें।
नोट: सूखे नमूने को पुनर्गठित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ईआईए बफर की मात्रा मूल नमूना मात्रा, या 250 μL के बराबर होनी चाहिए।
3. एलिसा प्लेट की तैयारी - गैर-विशिष्ट बंधन को सीमित करने के लिए ब्लॉकिंग
- प्लेट पर प्रत्येक कुएं में ट्राइस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस)/फिश जिलेटिन ब्लॉकिंग बफर के 250 μL जोड़ें।
- प्लेट पर एक कवर शीट रखें और आरटी पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- कवर शीट को हटा दें और मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके उलटा या आकांक्षा द्वारा प्लेट को खाली करें। फिर, तरल के किसी भी निशान को छोड़ने के लिए प्लेट को पेपर टॉवल पर धब्बा दें।
- प्लेट को 10 मिनट के लिए एक लामिनर फ्लो हुड में छोड़कर सुखाएं।
- प्लेट के स्पष्ट रूप से सूखने के बाद, इसे सिलिका जेल डेसिकेंट सैशे के साथ एक ग्रिप-सील पन्नी थैली में रखें और थैली को 24 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: प्लेटों का उपयोग प्लेट इनक्यूबेशन के 4 सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए।
4. परख प्रक्रिया से पहले
- किट निर्देशों के अनुसार अभिकर्मक (ईआईए बफर, सीजीआरपी मानक, सीजीआरपी गुणवत्ता नियंत्रण, सीजीआरपी ट्रेसर, वॉश बफर) तैयार करें। 16-20 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि समाप्त होने के बाद ही एलमैन के अभिकर्मक को तैयार करें।
- बाकी प्रोटोकॉल करने से पहले सभी नमूनों और अभिकर्मकों को आरटी में पिघलाएं।
5. परख प्रक्रिया
- अवरुद्ध प्लेट में प्रत्येक को किट-प्रदान किए गए वॉश बफर (300 μL / well) के साथ पांच बार अच्छी तरह से धोएं। प्रत्येक कुल्ला के लिए, कुओं में वॉश बफर रखने के बाद 30 सेकंड रुकें, फिर मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके तरल या एस्पिरेट को बाहर फेंक दें।
- अंतिम कुल्ला करने के बाद, कुओं से सभी बफर को उलटा करके हटा दें (कुओं के भीतर तरल को बाहर निकालने के लिए प्लेट को रोकना) या मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके आकांक्षा। एक पेपर टॉवल पर आखिरी बूंदों को ब्लॉट करें और उल्टे प्लेट को तब तक टैप करें जब तक कि सभी तरल कुएं से स्पष्ट रूप से हटा न दिए जाएं।
- कम से कम दो कुओं को अलग रखें जिनमें कोई अभिकर्मक या बफर नहीं है जिसे "ब्लैंक" कुओं के रूप में जाना जाता है। फिर, गैर-विशिष्ट बाइंडिंग (एनएसबी) के लिए कम से कम दो अन्य कुओं को अलग रखें।
- प्रत्येक एनएसबी कुएं में ईआईए बफर के 100 μL वितरित करें।
- सीजीआरपी मानकों के 100 μL को डुप्लिकेट में उपयुक्त कुओं में वितरित करें।
- 100 μL नमूने (ईआईए बफर में पुनर्गठित) और उचित कुओं में डुप्लिकेट में गुणवत्ता नियंत्रण वितरित करें।
- एनएसबी, सीजीआरपी मानकों, नमूनों और गुणवत्ता नियंत्रण वाले प्रत्येक कुएं में सीजीआरपी ट्रेसर (एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ से जुड़े एंटी-सीजीआरपी एंटीबॉडी) के 100 μL वितरित करें। "रिक्त" कुओं में ट्रेसर न डालें।
- प्लेट को एक स्पष्ट कवर शीट का उपयोग करके कवर करें, प्रत्येक कुएं को सील करें ताकि प्रत्येक कुएं में नमूने और अभिकर्मक महत्वपूर्ण रूप से वाष्पित न हों। 4 डिग्री सेल्सियस पर 16-20 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद, किट निर्देशों के अनुसार एलमैन के अभिकर्मक का पुनर्गठन करें।
- सभी तरल को हटाने के लिए प्लेट को उल्टा करें। प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला करें (जैसा कि ऊपर वर्णित है) 300 μL वॉश बफर के साथ तीन बार।
- तीसरे कुल्ला के बाद, प्लेटों से तरल निकालें, प्लेट को शेकर प्लेट पर रखें, और 2 मिनट के लिए 120 आरपीएम पर हिलाएं।
- प्लेट को अतिरिक्त तीन बार धोएं। अंतिम कुल्ला करने के बाद, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके उलटा या आकांक्षा द्वारा कुओं से सभी बफर हटा दें। एक पेपर टॉवल पर तरल की आखिरी बूंदों को ब्लॉट करें और उल्टे प्लेट को तब तक टैप करें जब तक कि सभी तरल कुएं से स्पष्ट रूप से हटा न दिए जाएं।
नोट: एलिसा माइक्रोप्लेट वॉशर का उपयोग करते समय इस चरण में वर्णित अतिरिक्त तीन वॉश आवश्यक नहीं हो सकते हैं। - प्रत्येक कुएं में एलमैन के अभिकर्मक के 200 μL वितरित करें ("रिक्त" कुओं सहित नहीं)।
- प्लेट को एक नई कवर शीट के साथ कवर करें और किसी भी प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए इसे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। 1 घंटे के लिए आरटी पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
- सुनिश्चित करें कि प्लेट के पीछे की तरफ कोई तरल नहीं है जो सूखे पेपर तौलिया के साथ बैकसाइड को पोंछकर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर रीडिंग को भ्रमित कर सकता है।
- 405 एनएम (पीले रंग) पर अवशोषण के लिए प्लेट पढ़ें।
6. डेटा विश्लेषण
- प्रत्येक "रिक्त", एनएसबी, मानक, गुणवत्ता नियंत्रण और नमूने के लिए औसत अवशोषण की गणना करें।
- मानक, गुणवत्ता नियंत्रण और नमूना अवशोषण मूल्यों से एनएसबी औसत अवशोषण मूल्यों को घटाएं।
- वाई-अक्ष पर अवशोषण और एक्स-अक्ष पर एकाग्रता को प्लॉट करें। चार-पैरामीटर लॉजिस्टिक रिग्रेशन मॉडल का उपयोग करके एक मानक वक्र का निर्माण करें।
- एक बार वक्र का निर्माण हो जाने के बाद, गुणवत्ता नियंत्रण और नमूनों के लिए इंटरपोलेटेड सांद्रता निर्धारित करने के लिए वक्र के समीकरण का उपयोग करें, जिसे एक्स-अक्ष पर पढ़ा जा सकता है।
नोट: मानक वक्र केवल तभी मान्य होता है जब गुणवत्ता नियंत्रण के लिए गणना की गई इंटरपोलेटेड एकाग्रता अपेक्षित एकाग्रता के 25% के भीतर होती है (आमतौर पर 125 पीजी / एमएल, लेकिन गुणवत्ता नियंत्रण शीशी का लेबल देखें)।
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Representative Results
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें हाइलाइट किया जाना चाहिए। सबसे पहले, एप्रोटिनिन, एक सेरीन प्रोटीज अवरोधक, सीजीआरपी के आगे एंजाइमेटिक गिरावट को रोकने के लिए संग्रह पर तुरंत पूरे रक्त के नमूनों में जोड़ा जाना चाहिए। सेरीन प्रोटीज को सीजीआरपी चयापचय में भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, और पिछले अध्ययन ने मनुष्यों में सीजीआरपीको निर्धारित करने में एप्रोटिनिन का भी उपयोग किया है। यदि प्रोटीज इनहिबिटर का उपयोग नहीं किया जाता है, और नमूना तैयार करने में 60 मिनट से अधिक समय लगता है, तो एलिसा करने पर सीजीआरपी के स्तर में कमी की उम्मीद की जा सकती है। दूसरे, एलिसा से पहले ठोस चरण निष्कर्षण सीजीआरपी को एलुएंट में केंद्रित करता है और प्लाज्मा मैट्रिक्स से संभावित हस्तक्षेप करने वाले अणुओं को समाप्त करता है। यह निष्कर्षण कदम स्पाइक और रिकवरी प्रयोगों में सीजीआरपी की उपज को बढ़ाता है (अगले खंड में आगे चर्चा की गई है)। निष्कर्षण के बाद ठंडे कमरे में वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन सीजीआरपी के नुकसान को और सीमित करता है। तीसरा, एलिसा से पहले, माइक्रोटिटर प्लेटों को ब्लॉकिंग बफर का उपयोग करके अवरुद्ध किया जाना चाहिए। यह बफर में गैर-विशिष्ट प्रोटीन के निष्क्रिय अधिशोषण को प्लेटों में शेष बाध्यकारी साइटों तक पहुंचाने की अनुमति देता है, इस प्रकार पृष्ठभूमि संकेत को कम करता है। ब्लॉकिंग सीजीआरपी की अवास्तविक उच्च पैदावार को कम करने में मदद करती है।
स्पाइक और रिकवरी प्रयोग यह निर्धारित करते हैं कि क्या सीजीआरपी का पता लगाना मानक वक्र डिल्यूएंट (यहां, ईआईए बफर) और प्रयोगात्मक नमूना मैट्रिक्स (यहां, प्लाज्मा) के बीच अंतर से प्रभावित होता है। प्लाज्मा और / या सीरम में अणु हो सकते हैं जो सीजीआरपी के एंटीबॉडी बंधन को अवरुद्ध करते हैं या पेप्टाइड को नीचा दिखाते हैं, इस प्रकार सीजीआरपी की शुरुआती एकाग्रता का सटीक पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने की परख की क्षमता में हस्तक्षेप करते हैं। इसके लिए, हमने प्लाज्मा नमूनों में सीजीआरपी की ज्ञात मात्रा को जोड़ा - "स्पाइकिंग" चरण - और गणना की कि निष्कर्षण और एलिसा के बाद कितना सीजीआरपी "पुनर्प्राप्त" किया गया था। सीजीआरपी स्टॉक निर्माता से प्राप्त किया गया था और उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया गया था।
कमजोर पड़ने के परीक्षण की रैखिकता में, एक नमूना क्रमिक रूप से पतला होता है, और प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए सीजीआरपी की सांद्रता की गणना की जाती है। यदि पतला नमूने सीजीआरपी एकाग्रता में उचित रैखिक कमी प्रदर्शित नहीं करते हैं, तो यह इंगित करेगा कि ईआईए बफर या प्लाज्मा कुछ सांद्रता पर सीजीआरपी का पता लगाने में हस्तक्षेप करता है या मानक वक्र प्रभावित सीमा में सटीक नहीं है। उपरोक्त वर्णित स्पाइक और रिकवरी प्रयोग करने में, हमने "स्पाइक्ड" नमूनों को क्रमिक रूप से पतला किया; हमने 200 pg/mL की CGRP की सांद्रता देने के लिए एक प्लाज्मा नमूने को स्पाइक किया और बाद में नमूने को 100 pg/mL और फिर 50 pg/mL तक पतला कर दिया।
तीन प्रतिभागियों के प्लाज्मा के नमूने जिनमें कार्डियोवैस्कुलर, श्वसन, या हाल ही में सिरदर्द या न्यूरोलॉजिकल लक्षणों का कोई इतिहास नहीं था, सीजीआरपी की विभिन्न सांद्रता के साथ स्पाइक किए गए थे। गैर-स्पाइक्ड नियंत्रण नमूनों के अलावा, इन नमूनों के लिए प्रोटोकॉल चलाया गया था। चित्र 1 स्पाइक और रिकवरी और कमजोर पड़ने के प्रयोगों की रैखिकता के लिए एक प्लेट मानचित्र का एक उदाहरण दिखाता है। एक मानक वक्र बनाने के लिए एक चार-पैरामीटर लॉजिस्टिक फिट का प्रदर्शन किया गया था जो रैखिक सीमा (तालिका 1 और चित्रा 2) से परे फिटिंग की अनुमति देता था। प्रत्येक स्पाइक किए गए नमूने के लिए वसूली दर की गणना की गई थी और स्वीकार्य सीमा के भीतर थी (तालिका 2)। स्पाइक किए गए नमूनों में कमजोर पड़ने की रैखिकता प्रदर्शित की गई थी (चित्रा 3)। तालिका 3 निर्माता के निर्देशों के बाद और गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को अवरुद्ध करने के लिए जोड़े गए चरणों को शामिल करने से पहले किए गए असफल स्पाइक और रिकवरी प्रयोग से प्राप्त परिणामों को दर्शाती है। ये आंकड़े 125% की ऊपरी सीमा से अधिक वसूली दर दिखाते हैं, जो गैर-विशिष्ट बाध्यकारी की उपस्थिति को दर्शाता है। ब्लॉकिंग बफर (चरण 3.1-3.5) का उपयोग करके प्लेट को ब्लॉक करने के लिए प्रोटोकॉल में चरणों को जोड़ने के बाद, हम इस प्रभाव को कम करने और स्वीकार्य पुनर्प्राप्ति मूल्यों को प्राप्त करने में सक्षम थे (तालिका 2)। माइग्रेन या वेस्टिबुलर लक्षणों के बिना तीन रोगियों में, हमने पाया कि प्लाज्मा में सीजीआरपी की औसत एकाग्रता 1.68 ± 0.13 पीजी / एमएल थी। भविष्य के प्रयोगों का उद्देश्य नियंत्रण रोगियों के बड़े पैमाने पर वर्तमान पद्धति का उपयोग करना होना चाहिए।
चित्र 1: उदाहरण प्लेट मानचित्र। प्रत्येक प्लेट में मानक, नमूने, रिक्त स्थान और एनएसबी कुएं होने चाहिए, सभी डुप्लिकेट या तीन प्रतियों में। रिक्त कुओं में कोई तरल नहीं होना चाहिए, और एनएसबी कुओं में मालिकाना एंजाइम इम्यूनोसे बफर, एंजाइम-लिंक्ड माध्यमिक एंटीबॉडी और एलमैन के अभिकर्मक होना चाहिए। मानक वक्र बनाने से पहले एनएसबी कुओं के लिए औसत अवशोषण मूल्यों को मानक के अवशोषण मूल्यों से घटाया जाना चाहिए। वसूली के प्रतिशत की गणना करने से पहले, एनएसबी कुओं के लिए औसत अवशोषण मूल्यों को भी नमूने के अवशोषण मूल्यों से घटाया जाना चाहिए। प्लेट की स्थिति का कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: चार-पैरामीटर लॉजिस्टिक (4पीएल) प्रतिगमन मानक वक्र का उदाहरण। इस मानक वक्र को गणितीय रूप से एक समीकरण द्वारा उसी रूप में वर्णित किया गया है जैसा कि तालिका 1 में देखा गया है। एक 4पीएल प्रतिगमन वक्र रैखिक वक्रों की तुलना में जैविक प्रणालियों के लिए अधिक फिट है। इस वक्र और समीकरण का उपयोग उसी प्लेट पर गुणवत्ता नियंत्रण और नमूने को इंटरपोल करने के लिए किया जाता है जिस पर मानक बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: तनुकरण रेखा चार्ट की रैखिकता जिसमें नमूने 200 pg/mL पर बढ़े हुए हैं, फिर क्रमिक रूप से 1:2 और 1:4 को पतला किया गया है। यह डेटा कमजोर पड़ने की एक विस्तृत श्रृंखला पर रैखिकता प्रदर्शित करता है, यह दर्शाता है कि परख विधि सीजीआरपी सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में सटीक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| प्राचल | मूल्य |
| X50 | 294.75 |
| समीकरण |  |
| समीकरण प्रपत्र |  |
तालिका 1: टिटर्स एक्स50 के साथ चार-पैरामीटर लॉजिस्टिक (4पीएल) प्रतिगमन मानक वक्र समीकरण का उदाहरण। एक 4पीएल प्रतिगमन वक्र जैविक प्रणालियों में देखी गई जटिलता के लिए समायोजित करता है। इस वक्र का उपयोग एलिसा के परिणामों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, क्योंकि यह रैखिक प्रतिगमन से अधिक उपयुक्त है।
| अवशोषण (ओडी) | इंटरपोलेटेड एकाग्रता (pg/mL) | प्रतिशत उपज | |
| अन-स्पाइक्ड नियंत्रण | -0.0434 | वक्र पर नहीं गिरता है (यानी, ~ 0)। | |
| 200 pg/mL पर बढ़ाया गया | 0.2712 | 214.7 ± 23.4 | 107.40% |
| 100 pg/mL पर बढ़ाया गया | 0.0966 | 102.7 ± 2.35 | 102.70% |
| 50 pg/mL पर बढ़ाया गया | 0.0205 | 55.1 ± 12.65 | 110.20% |
तालिका 2: ठोस चरण निष्कर्षण और प्लेट ब्लॉकिंग की कमी के कारण तीन नियंत्रण प्रतिभागियों के सफल स्पाइक और रिकवरी प्रयोग के परिणाम। स्पाइक किए गए नमूनों के लिए उपज का प्रतिशत सभी आदर्श 100% उपज के 20% के भीतर गिर गया, यह दर्शाता है कि सीजीआरपी का पता लगाना प्लाज्मा के प्रयोगात्मक नमूना मैट्रिक्स से प्रभावित नहीं है।
| अवशोषण (ओडी) | इंटरपोलेटेड एकाग्रता (pg/mL) | प्रतिशत उपज | |
| अन-स्पाइक्ड नियंत्रण | -0.2087 | वक्र पर नहीं गिरता है (यानी, ~ 0)। | |
| 200 pg/mL पर बढ़ाया गया | 2.371 | 264.2 ± 104 | 132.10% |
| 100 pg/mL पर बढ़ाया गया | 1.134 | 167.5 ± 31.2 | 167.50% |
| 50 pg/mL पर बढ़ाया गया | 0.3218 | 80.55 ± 4.54 | 161.10% |
तालिका 3: प्लेट ब्लॉकिंग की कमी के कारण तीन नियंत्रण प्रतिभागियों के असफल स्पाइक और रिकवरी प्रयोग के परिणाम। स्पाइक किए गए नमूनों के लिए उपज का प्रतिशत सभी 120% उपज की ऊपरी सीमा से ऊपर गिर गया, यह दर्शाता है कि परख एनएसबी द्वारा दूषित हो सकती है। इन परिणामों को प्राप्त करने के बाद, हमने परख से पहले प्लेट पर एनएसबी को ब्लॉक करने के लिए प्रोटोकॉल में चरण 3.1-3.5 जोड़ा।
| अवशोषण (ओडी) | इंटरपोलेटेड एकाग्रता (pg/mL) | प्रतिशत उपज | |
| अन-स्पाइक्ड नियंत्रण | 0.0401 | 12.93 | |
| 100 pg/mL पर बढ़ाया गया | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| 50 pg/mL पर बढ़ाया गया | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| 25 pg/mL पर बढ़ा | 0.0007 | 0.2177±6.43 | 0.87% |
तालिका 4: तीन नियंत्रण प्रतिभागियों के एक असफल स्पाइक और रिकवरी प्रयोग के परिणाम। स्पाइक किए गए नमूनों के लिए उपज का प्रतिशत सभी 80% उपज की निचली सीमा से नीचे गिर गया, यह दर्शाता है कि संभावित गिरावट और प्रतिस्पर्धी बाध्यकारी प्रक्रियाओं को संबोधित करने के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता थी। ये परिणाम एक अन्य निर्माता के प्रतिस्पर्धी एलिसा परख से हैं, जिसमें 2.23 pg / mL का पता लगाने की कम सीमा है, और इंट्रा-परख CV 10% < और अंतर-परख CV 12% < है।
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Discussion
यह आलेख मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए अनुमति देने वाले एक मान्य प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। वाणिज्यिक सीजीआरपी एलिसा किट को इस अणु को सटीक रूप से निर्धारित नहीं करने के बाद संश्लेषित किया गया था। एक नमूना तैयारी प्रोटोकॉल और एक वैध मानक वक्र स्थापित करने के बाद, स्पाइक और रिकवरी और कमजोर पड़ने वाले प्रयोगों की रैखिकता से पता चला कि रिकवरी का प्रतिशत अपेक्षा से बहुत कम था। इसी तरह के परिणाम एक अलग वाणिज्यिक सीजीआरपी एलिसा किट (तालिका 4) का उपयोग करके पाए गए थे। संदर्भ के लिए, व्यापक रूप से स्वीकृत मानक वसूली 80-120% 36 है। ये परिणाम सीजीआरपी21,22,23,24, सीजीआरपी से जुड़े अन्य अणुओं को कम करने वाली प्रोटीज गतिविधि की उपस्थिति का सुझाव दे सकते हैं, इस प्रकार प्लेट के एंटीबॉडी को बांधने के लिए इसकी उपलब्धता को सीमित कर सकते हैं, या प्लेट के एंटीबॉडी के लिए गैर-लक्ष्य प्रोटीन के प्रतिस्पर्धी बंधन को सीमित कर सकते हैं।
इन संभावित तत्वों को नियंत्रित करने के लिए, एलिसा से पहले एक मालिकाना सॉर्बेंट के साथ निष्कर्षण के माध्यम से प्लाज्मा को शुद्ध करने के लिए एक निष्कर्षण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। यह शर्बत स्पष्ट रूप से सीजीआरपी जैसे ध्रुवीय अणुओं को अलग करता है। एलिसा से पहले निष्कर्षण की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए, मानव प्लाज्मा के नमूनों को सीजीआरपी की ज्ञात सांद्रता के साथ स्पाइक किया गया क्योंकि सकारात्मक नियंत्रण निष्कर्षण और फिर एलिसा से गुजरना पड़ा। इन स्पाइक किए गए नमूनों ने केवल ~ 50% -60% वसूली की। इन परिणामों ने संकेत दिया कि बहिर्जात रूप से जोड़ा गया सीजीआरपी प्लाज्मा में नहीं पाया जाता है, जैसा कि कोई उम्मीद करेगा।
प्रोटोकॉल के विभिन्न अन्य चरणों को अनुकूलित किया गया था: क्षरण को रोकने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले पूरे रक्त के नमूनों में सेरीन प्रोटीज अवरोधक जोड़ना, निष्कर्षण के बाद वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन के तापमान को कम करना और पोस्ट-सेंट्रीफ्यूजेशन रीसस्पेंशन विधियों को समायोजित करना। इन परिवर्तनों के बाद एक स्पाइक और रिकवरी प्रयोग ने अवास्तविक रूप से उच्च सीजीआरपी सांद्रता का खुलासा किया, जो 120% से अधिक वसूली है (तालिका 3)। आश्वस्त रूप से, मेसलिंगर एट अल .37 द्वारा इसी तरह की परख का उपयोग करके निष्कर्षण के बाद हाल ही में अपेक्षित मूल्यों से अधिक की सूचना दी गई थी, यह दर्शाता है कि यह एक मुद्दा बना हुआ है। मेसलिंगर एट अल स्वीकार करते हैं कि प्लाज्मा निष्कर्षण के बाद परख यथार्थवादी सीजीआरपी सांद्रता को पुन: उत्पन्न नहीं करती है,इस घटना के लिए कोई कारण प्रदान किए बिना।
हमने अनुमान लगाया कि एलिसा माइक्रोटिटर प्लेटों पर अवशिष्ट बाध्यकारी क्षमता गैर-विशिष्ट बंधन पैदा करने के लिए उच्च वसूली दर के लिए जिम्मेदार हो सकती है। एलिसा से पहले, प्लेट को इस बाध्यकारी क्षमता को कम करने के लिए एक ब्लॉकिंग बफर, टीबीएस / मछली जिलेटिन बफर के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इस अतिरिक्त कदम के परिणामस्वरूप अधिक उपयुक्त वसूली दर (तालिका 2) हुई। इस प्रकार, ब्लॉकिंग बफर के उपयोग सहित ऊपर चर्चा किए गए संशोधन और अनुकूलन, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम बने हुए हैं। इन कदमों से 2 पीजी/एमएल के रूप में सूचीबद्ध मूल निर्माता किट की तुलना में 1.05 पीजी/एमएल की पहचान की कम सीमा की अनुमति दी गई है।
समस्या निवारण के संबंध में, चरण 2.10 एलुएंट को सुखाने के लिए वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन का आह्वान करता है। इस चरण की लंबाई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के प्रकार के आधार पर भिन्न देखी गई है। सामग्री की तालिका में वर्णित माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके, यह चरण आमतौर पर 5 घंटे तक रहता है। हालांकि, जब बड़ी मात्रा के वैकल्पिक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग किया जाता है, तो यह चरण 11 घंटे तक चल सकता है। वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन का एक विकल्प लियोफिलाइजेशन या नमूनों को फ्रीज-सुखाने हो सकता है, जिसके लिए निष्कर्षण के बाद नमूनों को फ्रीज करने की आवश्यकता होगी। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के निर्माण में लियोफिलाइजेशन का परीक्षण नहीं किया गया था। इसके अतिरिक्त, यदि सीजीआरपी की अपेक्षित सांद्रता से व्यवस्थित रूप से कम पाया जाता है, तो किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सभी अभिकर्मकों, विशेष रूप से एंटीबॉडी, उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर पिघल जाएं। अभिकर्मकों की अस्थिरता, जैसे एंटीबॉडी और ट्रेसर समाधान, सीजीआरपी को बांधने में व्यवस्थित त्रुटि में योगदान कर सकते हैं। यदि उपज अपर्याप्त बनी रहती है, तो सीजीआरपी के लिए एंटीबॉडी बाइंडिंग एक बफर के साथ पुनर्गठन के बावजूद एलुएंट (मेथनॉल और एसिटिक एसिड समाधान) की सापेक्ष अम्लता से प्रभावित हो सकती है। इस मामले में, बफर के साथ पुनर्गठन के बाद एक पीएच सुधार कदम एक तार्किक अतिरिक्त होगा।
इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में किसी भी एलिसा पद्धति से जुड़ी सीमाएं शामिल हैं, विशेष रूप से एंटीबॉडी अस्थिरता38। परख में उपयोग से पहले एंटीबॉडी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर पिघलाया जाना चाहिए; हालांकि, एक विस्तारित अवधि के लिए वार्मिंग विकृतीकरण का कारण बन सकती है और परिणामस्वरूप सीजीआरपी को बांधने में प्रभावशीलता कम हो सकती है। इसके अतिरिक्त, सीजीआरपी विभिन्न प्रकार के गैर-सेरीन प्रोटीज द्वारा गिरावट से गुजर सकता है, जिससे झूठे नकारात्मक परिणाम बढ़ सकते हैं। हालांकि यह प्रोटोकॉल एक सेरीन प्रोटीज जोड़कर और नमूना प्रसंस्करण समय को 60 मिनट से कम तक सीमित करके गिरावट को सीमित करता है, फिर भी गिरावट हो सकती है। एक और सीमा परीक्षण किए गए फ्रीज-पिघलाव चक्रों की कमी है। ली एट अल .39 ने प्रदर्शित किया कि फ्रीज-पिघलना चक्र प्रोटीन की संवेदनशीलता के आधार पर सीरम और प्लाज्मा प्रोटीन की मात्रा को बढ़ा या घटा सकता है। फ्रीज-पिघलाव चक्रों के लिए सीजीआरपी की संवेदनशीलता को साहित्य में पूरी तरह से परीक्षण नहीं किया गया है, हालांकि मेसलिंगर एट अल ने नोट किया है कि सीजीआरपी का स्तर ठंड और पिघलने के एक चक्र पर कम हो जाताहै। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल की उपज को प्रोटीन लोबिंद ट्यूबों के उपयोग से लाभ हो सकता है, जिसे हाइड्रोफिलिक सतह के साथ डिज़ाइन किया गया है, इस प्रकार प्रोटीन वसूली में सुधार हो सकता है।
हम ध्यान दें कि ये सत्यापन प्रयोग मानव प्लाज्मा 16,18,35,40,41 में सीजीआरपी की मात्रा निर्धारित करने वाले हालिया अध्ययनों के लेखकों द्वारा नहीं किए गए थे। मेसलिंगर एट अल.37 द्वारा एलिसा पद्धति की समीक्षा इस तरह के नियंत्रणों की आवश्यकता पर जोर देती है और उन अध्ययनों पर सवाल उठाती है जिन्होंने उनका उपयोग नहीं किया है। हमारा मानना है कि प्रोटोकॉल को मान्य और मानकीकृत करने में हमारा काम भविष्य के सीजीआरपी अनुसंधान को बेहतर स्तर पर रखेगा। इस तरह के प्रोटोकॉल के निहितार्थ व्यापक हैं, और सैद्धांतिक रूप से न्यूरोलॉजिकल और गैर-न्यूरोलॉजिकरोग प्रक्रियाओं 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33 में सीजीआरपी की बायोमार्कर स्थिति की जांच के लिए विस्तारित किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास जोड़ने के लिए कोई और खुलासा नहीं है।
Acknowledgments
हम इस प्रोटोकॉल के बारे में उनकी उपयोगी चर्चाओं के लिए रॉबर्ट एन कोल, लॉरेन आर डेविन और मार्कोस इग्लेसियस को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह अमेरिकन ओटोलॉजिकल सोसाइटी (फैलोशिप ग्रांट, पीएसके), अमेरिकन हियरिंग रिसर्च फाउंडेशन (90066548/90072266, जेपीसी), और नेशनल सेंटर फॉर एडवांसट्रांसलेशनल साइंसेज (एनसीएटीएस), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) के एक घटक और एनआईएच रोडमैप फॉर मेडिकल रिसर्च (यूएल 1 टीआर 003098, एनएसएफ) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित था। प्रकाशन की सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि जॉन्स हॉपकिंस आईसीटीआर, एनसीएटीएस या एनआईएच के आधिकारिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करें।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
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