Summary
Publiserte data vedrørende kalsitoningenrelaterte peptidkonsentrasjoner (CGRP) i humant plasma er inkonsistente. Disse inkonsekvensene kan skyldes mangelen på en standardisert, validert metodikk for å kvantifisere dette nevropeptidet. Her beskriver vi en validert ELISA-protokoll (enzyme-linked immunosorbent assay) for å rense og kvantifisere CGRP i humant plasma.
Abstract
Kalsitonin-genrelatert peptid (CGRP) er et vasoaktivt nevropeptid som spiller en antatt rolle i patofysiologien ved migrene og kan være en kandidat for biomarkørstatus. CGRP frigjøres fra nevronfibre ved aktivering og induserer steril nevrogen inflammasjon og arteriell vasodilatasjon i vaskulaturen som mottar trigeminal efferent innervering. Tilstedeværelsen av CGRP i perifer vaskulatur har ansporet undersøkelser for å oppdage og kvantifisere dette nevropeptidet i humant plasma ved bruk av proteomiske analyser, slik som enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Halveringstiden på 6,9 minutter og variasjonen i tekniske detaljer i analyseprotokoller, som ofte ikke er fullstendig beskrevet, har imidlertid gitt inkonsistente CGRP ELISA-data i litteraturen. Her presenteres en modifisert ELISA-protokoll for rensing og kvantifisering av CGRP i humant plasma. De prosessuelle trinnene involverer prøveinnsamling og preparering, ekstraksjon ved bruk av en polar sorbent som et middel til rensing, ytterligere trinn for å blokkere ikke-spesifikk binding og kvantifisering via ELISA. Videre har protokollen blitt validert med pigg og gjenvinning og linearitet av fortynningseksperimenter. Denne validerte protokollen kan teoretisk brukes til å kvantifisere CGRP-konsentrasjoner i plasma hos individer, ikke bare med migrene, men også med andre sykdommer der CGRP kan spille en rolle.
Introduction
Kalsitonin-genrelatert peptid (CGRP) er et 37-aminosyre nevropeptid som er tilstede i nevronfibre med perivaskulær lokalisering samt ikke-nevronvev. De to formene for CGRP, α- og β-CGRP, deler mer enn 90 % homologi og deler fysiologiske funksjoner; αCGRP finnes imidlertid i det sentrale og perifere nervesystemet, mens βCGRP finnes i det enteriske nervesystemet 1,2. Ved nociceptoraktivering og kalsiumavhengig eksocytose frigjøres CGRP fra nevroner, og induserer steril nevrogen inflammasjon som involverer arteriell vasodilatasjon og ekstravasasjonav plasmaprotein 3,4,5,6,7. Herfra opptrer CGRP i postkapillærkarene og kan være en biomarkør for sykdommer som gir afferente nociseptiv aktivering, som migrene 8,9,10,11. Det er verdt å merke seg at CGRP også har vært involvert i COVID-19 gjennom sin rolle i angiogenese og immunmodulering, og kan forutsi ugunstig sykdomsutvikling12,13. Dermed kan en protokoll for nøyaktig kvantifisering av CGRP i humant plasma ha en bred verdi.
Mest oppmerksomhet har man kanskje fått om CGRPs rolle ved migrene. Basert på prekliniske og kliniske studier har CGRP blitt presentert som en mulig biomarkør for migrene og som et mål for behandling 3,4,5,6,7,8,9,10. Noen studier har funnet en økning av CGRP i kohorter med episodisk migrene i forhold til kontrolldeltakere10,14,15. Suksessen til CGRP-hemmere i kliniske studier for migrenehodepinebehandling ser ut til å implisere forhøyet CGRP som årsaksfaktor for migrenehodepine. Imidlertid har ikke alle etterforskere bekreftet disse resultatene16,17,18,19. Videre er CGRPs rolle ved ikke-hodepinesymptomer ved migrene ennå ikke klarlagt; det nåværende arbeidet var motivert av et ønske om å forstå CGRPs rolle i vestibulære symptomer på migrene.
Inkonsistente CGRP-immunoassay-data i litteraturen kan skyldes flere årsaker. For det første er halveringstiden for CGRP i perifer vaskulatur 6,9 min 20, på grunn av aktiviteten til serinproteaser 21, insulinnedbrytende enzymer og andre metalloproteaser 22, nøytrale endopeptidaser 23 og endotelinkonverterende enzym-1 24. For det andre er de variable tekniske detaljene for immunoassays som brukes til å kvantifisere CGRP ikke fullstendig beskrevet i slike studier. Endelig kompliserer mangelen på standardisering av immunoassay-metoden bildet enda mer.
Denne artikkelen beskriver en modifisert enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA)-protokoll som muliggjør rensing og nøyaktig kvantifisering av α- og βCGRP i humant plasma. Settets antistoffer er ikke kryssreaktive med amylin, kalsitonin eller substans P. Denne protokollen har gjennomgått de nødvendige valideringseksperimentene, for eksempel spike og utvinning og linearitet av fortynning, dataene som presenteres her. En slik CGRP ELISA-protokoll som har gjennomgått validering er ikke tidligere fullstendig beskrevet i litteraturen. Denne protokollen kan brukes til å kvantifisere CGRP i humant plasma i sammenheng med migrene samt kardiologiske2,25, dermatologiske 26, obstetriske 27, revmatologiske28,29, muskel- og skjelettlidelser 30,31, endokrine 32,33 og virussykdommer 12,13 der CGRP har vært involvert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av humane plasmaprøver fra samtykkede personer med godkjenning fra Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).
1. Prøveinnsamling og forberedelse
- Samle 5 ml fullblod fra den antecubitale venen via standard venepunksjonsmetoder34 i et 6 ml vacutainer etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) oppsamlingsrør.
- Tilsett 0,5 ml aprotinin (10 000 KIU / ml) kompetitiv serinproteasehemmer til røret etter oppsamling for å blokkere lysen av målpeptidet. Snu røret 10 ganger for å la aprotinin blandes tilstrekkelig med blodet. Etterpå lagrer du rørene på is til neste trinn.
- Sentrifuger røret ved 604 x g i 4 minutter ved 4 °C innen 60 minutter etter blodoppsamling.
- Ta av plasmafraksjonen med en pipette og overfør til 2 ml sterile kryovialer med rundbunn.
- Oppbevar umiddelbart kryovialene ved -80 °C i opptil 2 uker.
2. Ekstraksjon av plasmaprøvene
- Plasser en ekstraksjonspatron inne i et 15 ml konisk sentrifugerør med de ytre kantene av patronen støttet av de ytre ryggene på røret.
- Aktiver sylinderampullen ved først å føre 5 ml 100 % metanol og deretter 10 ml ultrarent vann gjennom sylinderampullen.
- Når væske føres gjennom patronen via tyngdekraftsdrevet strømning, vil den samle seg i røret.
- Kast ut overflødig væske når det akkumuleres for å sikre at væsken ikke sluker patronen.
- Forsikre deg om at sylinderampullen ikke tørker i løpet av eksperimentet.
- Fortynn 250 μL plasma med 750 μL 4% eddiksyre.
- Før 1 ml plasma- og eddiksyreoppløsning langsomt gjennom sylinderampullen.
MERK: Dette trinnet skal ta omtrent 30 s via tyngdekraftdrevet strømning for hver milliliter som passeres. - Vask sylinderampullen med 10 ml 4% eddiksyre. Som gjort tidligere, kast ut overflødig væske når det akkumuleres for å sikre at væsken ikke sluker patronen.
- Etter at den siste dråpen eddiksyre er frigjort fra sylinderampullen, fjern sylinderampullen fra røret og legg den i et nytt 15 ml konisk sentrifugerør.
- Forbered en 10: 1-løsning av 100% metanol og 4% eddiksyre ved å blande 2,7 ml 4% eddiksyre og 0,3 ml 100% metanol. Bruk denne til å eluere CGRP ved å føre denne oppløsningen gjennom sylinderampullen 1 ml om gangen. Pause i 25 min mellom hver milliliter oppløsning passert. IKKE kast eluenten.
- Røret vil inneholde 3 ml av den eluerte væsken 25 minutter etter at den siste milliliter av metanol- og eddiksyreoppløsningen har passert. Plasser hver 1 ml av eluenten i et mikrosentrifugerør på 1,7 ml.
MERK: Dette skal gi tre mikrosentrifugerør fra hver patron. - Plasser hvert rør i en minisentrifuge i 1 s for å sikre at all eluenten er i bunnen av hvert rør.
- Tørk alle prøvene ved vakuumsentrifugering ved 4 °C (satt til konsentratorfunksjon, for vandige løsninger, ved 1,400 o / min; g-kraften varierer avhengig av rørets posisjon og varierer derfor fra 130-250 x g).
MERK: Tiden det tar for vakuumsentrifugen å tørke prøvene vil avhenge av hvilken type mikrosentrifugerør som brukes. - Umiddelbart før analyseprosedyren går videre (trinn 4.1), rekonstitueres den tidligere tørkede prøven med enzymimmunoassay (EIA)-buffer (se materialtabellen) tint til romtemperatur (RT) eller 20 °C.
MERK: Volumet av EIA-buffer som brukes til å rekonstituere den tørkede prøven, skal være lik det opprinnelige prøvevolumet, eller 250 μL.
3. Klargjøring av ELISA-platen - blokkering for å begrense ikke-spesifikk binding
- Tilsett 250 μL tris-bufret saltvann (TBS)/fiskegelatinblokkerende buffer til hver brønn på platen.
- Legg et deksel over platen og inkuber i 2 timer ved RT.
- Fjern dekselet og tøm platen ved inversjon eller aspirasjon ved hjelp av en flerkanalspipett. Deretter tørker du tallerkenen på et papirhåndkle for å kaste bort spor av væske.
- Tørk platen ved å la platen stå i en avtrekkshette med laminær luftstrøm i 10 minutter.
- Etter at tallerkenen er synlig tørr, legg den i en gripeforseglet foliepose med en pose med silikagel og oppbevar posen ved -20 °C i 24 timer.
MERK: Platene skal brukes innen 4 uker etter plateinkubasjon.
4. Før analyseprosedyren
- Forbered reagenser (EIA-buffer, CGRP-standard, CGRP-kvalitetskontroll, CGRP-sporer, vaskebuffer) i henhold til instruksjonene for settet. Forbered Ellmans reagens først etter at inkubasjonsperioden på 16-20 timer er avsluttet.
- Tine alle prøver og reagenser til RT før du utfører resten av protokollen.
5. Prosedyre for analyse
- Skyll hver brønn i den blokkerte platen fem ganger med en vaskebuffer fra settet (300 μL/brønn). For hver skylling, pause 30 s etter å ha plassert vaskebufferen i brønnene, kast deretter ut væsken eller aspiratet med en flerkanalspipett.
- Etter den siste skyllingen, fjern all buffer fra brønnene ved inversjon (invertering av platen for å utvise væsken i brønner) eller aspirasjon ved hjelp av en flerkanals pipette. Blett de siste dråpene på et papirhåndkle og bank på den omvendte platen til all væsken er synlig fjernet fra brønnene.
- Sett av minst to brønner uten reagenser eller buffer for å bli kjent som "Blank" brønner. Sett deretter av minst to andre brønner for ikke-spesifikk binding (NSB).
- Dispenser 100 μL EIA-buffer i hver NSB-brønn.
- Dispenser 100 μL av CGRP-standardene i duplikater til egnede brønner.
- Dispenser 100 mikrol prøver (rekonstituert i EIA-buffer) og kvalitetskontroll i duplikater til egnede brønner.
- Utlevering av 100 mikrol CGRP-tracer (anti-CGRP antistoff festet til acetylkolinesterase) til hver brønn som inneholder NSB, CGRP-standarder, prøver og kvalitetskontroll. Ikke dispenser tracer til "Blank" brønner.
- Dekk platen med et klart dekselark, forsegle hver brønn slik at prøvene og reagensene i hver brønn ikke fordampes betydelig. Inkuber platen i 16-20 timer ved 4 °C.
- Etter at inkubasjonen er fullført, rekonstitueres Ellmans reagens i henhold til instruksjonene i settet.
- Snu platen for å fjerne all væske. Skyll hver brønn (som beskrevet ovenfor) tre ganger med 300 μL vaskebuffer.
- Etter den tredje skyllingen, fjern væsken fra platene, legg platen på en risteplate og rist ved 120 o / min i 2 minutter.
- Vask tallerkenen ytterligere tre ganger. Etter den endelige skyllingen, fjern all buffer fra brønnene ved inversjon eller aspirasjon ved hjelp av en flerkanalspipette. Tørk de siste dråpene væske på et papirhåndkle og bank på den omvendte platen til all væsken er synlig fjernet fra brønnene.
MERK: De ytterligere tre vaskene som er beskrevet i dette trinnet, er kanskje ikke nødvendige hvis du bruker en ELISA mikroplatevaskemaskin. - Dispenser 200 μL av Ellmans reagens i hver brønn (ikke inkludert "Blank" brønner).
- Dekk platen med et nytt deksel og pakk det inn i aluminiumsfolie for å forhindre lyseksponering. Inkuber i mørket ved RT i 1 time.
- Forsikre deg om at det ikke er væske på baksiden av platen som kan forvirre spektrofotometeravlesningen ved å tørke baksiden med et tørt papirhåndkle.
- Les av platen for absorbans ved 405 nm (gul farge).
6. Dataanalyse
- Beregn gjennomsnittlig absorbans for hver "Blank", NSB, standard, kvalitetskontroll, og prøvene.
- Trekk NSBs gjennomsnittlige absorbansverdier fra standard-, kvalitetskontroll- og prøveabsorbansverdier.
- Plot absorbans på y-aksen og konsentrasjon på x-aksen. Konstruer en standardkurve ved hjelp av en logistisk regresjonsmodell med fire parametere.
- Når kurven er konstruert, bruk kurvens ligning for å bestemme de interpolerte konsentrasjonene for kvalitetskontroll og prøver, som kan leses på x-aksen.
MERK: Standardkurven valideres bare hvis den beregnede interpolerte konsentrasjonen for kvalitetskontrollen er innenfor 25 % av forventet konsentrasjon (vanligvis 125 pg/ml, men se etiketten på hetteglasset med kvalitetskontroll).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er flere viktige trinn i protokollen som bør fremheves. For det første må aprotinin, en serinproteasehemmer, tilsettes i fullblodprøver umiddelbart etter innsamling for å forhindre ytterligere enzymatisk nedbrytning av CGRP. Serinproteaser har vist seg å spille en rolle i CGRP-metabolismen, og en tidligere studie har også brukt aprotinin i kvantifisering av CGRP hos mennesker21,35. Hvis proteasehemmere ikke brukes, og prøvepreparering tar lengre tid enn 60 min, kan man forvente reduserte nivåer av CGRP ved utførelse av ELISA. For det andre konsentrerer fastfaseekstraksjon før ELISA CGRP i eluenten og eliminerer potensielt forstyrrende molekyler fra plasmamatrisen. Dette ekstraksjonstrinnet øker utbyttet av CGRP i pigg- og restitusjonseksperimenter (nærmere omtalt i neste avsnitt). Vakuumsentrifugering i kjølerom etter ekstraksjon begrenser tapet av CGRP ytterligere. For det tredje, før ELISA, må mikrotiterplatene blokkeres ved hjelp av en blokkeringsbuffer. Dette muliggjør passiv adsorpsjon av ikke-spesifikke proteiner i bufferen til de gjenværende bindingsstedene i platene, og reduserer dermed bakgrunnssignalet. Blokkering bidrar til å redusere urealistisk høye avlinger av CGRP.
Pigg- og restitusjonseksperimenter avgjør om CGRP-deteksjon påvirkes av forskjellene mellom standardkurvefortynningsmiddelet (her EIA-bufferen) og den eksperimentelle prøvematrisen (her plasma). Plasma og/eller serum kan inneholde molekyler som blokkerer antistoffbinding til CGRP eller nedbryter peptidet, og dermed forstyrrer analysens evne til å oppdage og kvantifisere startkonsentrasjonen av CGRP nøyaktig. For dette formålet la vi til kjente mengder CGRP i plasmaprøver - "spiking"-trinnet - og beregnet hvor mye CGRP som ble "gjenvunnet" etter ekstraksjon og ELISA. CGRP-lageret ble hentet fra produsenten og lagret i en -20 °C fryser inntil bruk.
Ved linearitet av fortynningstesting fortynnes en prøve serielt, og konsentrasjoner av CGRP beregnes for hver fortynning. Dersom de fortynnede prøvene ikke viser passende lineære reduksjoner i CGRP-konsentrasjonen, vil dette indikere at EIA-bufferen eller plasmaet interfererer med deteksjonen av CGRP ved noen konsentrasjoner eller at standardkurven ikke er nøyaktig i det påvirkede området. Ved å utføre det ovenfor beskrevne pigg- og gjenopprettingseksperimentet, fortynnet vi serielt de "piggete" prøvene; Vi pigget en plasmaprøve for å gi en konsentrasjon av CGRP på 200 pg/ml og fortynnet deretter prøven til 100 pg/ml og deretter 50 pg/ml.
Plasmaprøver fra tre deltakere uten kardiovaskulær, respiratorisk eller nylig hodepine eller nevrologiske symptomer ble tilsatt forskjellige konsentrasjoner av CGRP. Protokollen ble kjørt for disse prøvene, i tillegg til ikke-piggete kontrollprøver. Figur 1 viser et eksempel på et platekart for pigg og gjenvinning og linearitet av fortynningsforsøk. En fire-parameter logistisk tilpasning ble utført for å lage en standardkurve som tillot tilpasning utover det lineære området (tabell 1 og figur 2). Gjenvinningsgraden ble beregnet for hver piggprøve og var innenfor akseptabelt område (tabell 2). Fortynningens linearitet ble påvist i piggeprøvene (figur 3). Tabell 3 viser resultater oppnådd fra et mislykket pigg- og gjenopprettingseksperiment utført i henhold til produsentens instruksjoner og før inkluderingen av de tilføyde trinnene for å blokkere ikke-spesifikk binding. Disse dataene viser utvinningsgrader som overskrider den øvre grensen på 125%, noe som indikerer tilstedeværelse av ikke-spesifikk binding. Etter å ha lagt til trinnene i protokollen for å blokkere platen ved hjelp av en blokkeringsbuffer (trinn 3.1-3.5), kunne vi redusere denne effekten og oppnå akseptable gjenopprettingsverdier (tabell 2). Hos tre pasienter uten migrene eller vestibulære symptomer fant vi at gjennomsnittlig konsentrasjon av CGRP i plasma var 1,68 ± 0,13 pg/ml. Fremtidige eksperimenter bør ta sikte på å utnytte dagens metodikk i større skala av kontrollpasienter.
Figur 1: Eksempel på platekart. Hver plate skal inneholde standarder, prøver, emner og NSB-brønner, alt i dupliserte eller triplikate. Blanke brønner skal ikke inneholde væske, og NSB-brønner skal inneholde proprietær enzymimmunoassaybuffer, enzymbundet sekundært antistoff og Ellmans reagens. Gjennomsnittlige absorbansverdier for NSB-brønnene bør trekkes fra absorbansverdiene i standarden før standardkurven opprettes. Gjennomsnittlige absorbansverdier for NSB-brønnene bør også trekkes fra absorbansverdiene i prøvene før prosentandel av utvinning beregnes. Det er ingen effekt av plateposisjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på en fireparameters logistisk (4PL) regresjonsstandardkurve. Denne standardkurven er matematisk beskrevet ved en ligning i en lignende form som vist i tabell 1. En 4PL regresjonskurve er bedre tilpasset biologiske systemer sammenlignet med lineære kurver. Denne kurven og ligningen brukes til å interpolere kvalitetskontroller og prøver på samme plate som standarden ble opprettet på. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Linearitet av fortynningslinjediagram som viser prøver pigget ved 200 pg / ml, deretter serielt fortynnet 1: 2 og 1: 4. Disse dataene viser linearitet over et bredt spekter av fortynninger, noe som indikerer at analysemetoden er nøyaktig over et bredt spekter av CGRP-konsentrasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Parameter | Verdi |
| X50 | 294.75 |
| Ligning |  |
| Ligningsskjema |  |
Tabell 1: Eksempel på afour-parameter logistic (4PL) regresjon standard kurveligning med titere X50. En 4PL regresjonskurve tar høyde for kompleksiteten sett i biologiske systemer. Denne kurven ble brukt til å analysere resultatene av ELISA, da den er mer egnet enn lineær regresjon.
| Absorbans (OD) | Interpolert konsentrasjon (pg/ml) | Prosent utbytte | |
| Kontroll uten pigg | -0.0434 | Faller ikke på kurve (dvs. ~0) | |
| Spiked på 200 pg / ml | 0.2712 | 214,7 ± 23,4 | 107.40% |
| Spiked på 100 pg / ml | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| Spiked på 50 pg / ml | 0.0205 | 55,1 ± 12,65 | 110.20% |
Tabell 2: Resultater av et vellykket spike- og utvinningseksperiment av tre kontrolldeltakere på grunn av mangel på fastfaseekstraksjon og plateblokkering. Prosentandelen av utbyttet for piggprøver falt alle innenfor 20 % av det ideelle utbyttet på 100 %, noe som indikerer at CGRP-deteksjon ikke påvirkes av den eksperimentelle prøvematrisen av plasma.
| Absorbans (OD) | Interpolert konsentrasjon (pg/ml) | Prosent utbytte | |
| Kontroll uten pigg | -0.2087 | Faller ikke på kurve (dvs. ~0) | |
| Spiked på 200 pg / ml | 2.371 | 264,2 ± 104 | 132.10% |
| Spiked på 100 pg / ml | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| Spiked på 50 pg / ml | 0.3218 | 80,55 ± 4,54 | 161.10% |
Tabell 3: Resultater av et mislykket pigg- og gjenopprettingseksperiment av tre kontrolldeltakere på grunn av mangel på plateblokkering. Prosentandelen av utbyttet for piggeprøver falt alle godt over den øvre grensen på 120% utbytte, noe som indikerer at analysen kan være ødelagt av NSB. Etter å ha oppnådd disse resultatene, la vi til trinn 3.1-3.5 i protokollen for å blokkere NSB på platen før analysen.
| Absorbans (OD) | Interpolert konsentrasjon (pg/ml) | Prosent utbytte | |
| Kontroll uten pigg | 0.0401 | 12.93 | |
| Spiked på 100 pg / ml | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| Spiked på 50 pg / ml | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| Spiked på 25 pg / ml | 0.0007 | 0,2177±6,43 | 0.87% |
Tabell 4: Resultater av et mislykket pigg- og restitusjonseksperiment av tre kontrolldeltakere. Prosentandelen av utbyttet for piggeprøver falt alle godt under den nedre grensen på 80 % utbytte, noe som indikerer at ytterligere optimalisering var nødvendig for å håndtere mulige nedbrytnings- og konkurransebindingsprosesser. Disse resultatene er fra en annen produsents konkurransedyktige ELISA-analyse, med en nedre deteksjonsgrense på 2,23 pg / ml, og CV < 10% og CV mellom analyser < 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en validert protokoll som muliggjør påvisning og kvantifisering av CGRP i humant plasma. Denne protokollen ble syntetisert etter at kommersielle CGRP ELISA-sett ble funnet å ikke kvantifisere dette molekylet nøyaktig. Etter å ha etablert en prøveprepareringsprotokoll og en gyldig standardkurve, viste pigg, gjenvinning og linearitet av fortynningseksperimenter at prosentandelen av utvinninger var mye lavere enn forventet. Lignende resultater ble funnet ved bruk av et annet kommersielt CGRP ELISA-sett (tabell 4). Til referanse er den allment aksepterte standardgjenopprettingen 80-120%36. Disse resultatene kan tyde på tilstedeværelse av proteaseaktivitet som nedbryter CGRP21,22,23,24, andre molekyler som binder seg til CGRP, og dermed begrenser tilgjengeligheten for binding til platens antistoffer, eller konkurransedyktig binding av ikke-målproteiner til platens antistoffer.
For å kontrollere for disse mulige forstyrrelsene ble en ekstraksjonsprotokoll optimalisert for å rense plasma gjennom ekstraksjon med en proprietær sorbent før ELISA. Denne sorbenten isolerer tilsynelatende polare molekyler som CGRP. For å bestemme effekten av ekstraksjon før ELISA, økte humane plasmaprøver med kjente konsentrasjoner av CGRP da positive kontroller ble ekstraksjonert og deretter ELISA. Disse piggete prøvene ga bare ~ 50% -60% utvinning. Disse resultatene indikerte at eksogent tilsatt CGRP ikke er detektert i plasma, slik man kunne forvente.
Ulike andre trinn i protokollen ble optimalisert: tilsetning av serinproteasehemmer til fullblodprøver før sentrifugering for å hemme nedbrytning21, senking av temperaturen for vakuumsentrifugering etter ekstraksjon og justering av resuspensjonsmetoder etter sentrifugering. Et pigg- og restitusjonseksperiment etter disse endringene viste urealistisk høye CGRP-konsentrasjoner, en større enn 120 % utvinning (tabell 3). Betryggende nok ble det også nylig rapportert høyere enn forventede verdier etter ekstraksjon ved hjelp av en lignende analyse av Messlinger et al.37, noe som indikerer at dette fortsatt er et problem. Messlinger og medarbeidere erkjenner at analysen etter plasmaekstraksjon ikke reproduserer realistiske CGRP-konsentrasjoner, uten å gi en begrunnelse for dette fenomenet37.
Vi antydet at gjenværende bindingskapasitet på ELISA-mikrotiterplatene som forårsaker ikke-spesifikk binding kan være ansvarlig for de høye utvinningsgradene. Før ELISA ble platen inkubert med en blokkeringsbuffer, TBS/fiskegelatinbuffer, for å redusere denne bindingskapasiteten. Dette ekstra trinnet resulterte i mer passende utvinningsgrad (tabell 2). Dermed forblir modifikasjonene og optimaliseringene diskutert ovenfor, inkludert bruk av blokkeringsbufferen, kritiske trinn i protokollen. Disse trinnene har tillatt en nedre deteksjonsgrense på 1,05 pg / ml, sammenlignet med den opprinnelige produsentens sett oppført som 2 pg / ml.
Når det gjelder feilsøking, krever trinn 2.10 vakuumsentrifugering for å tørke eluenten. Lengden på dette trinnet har blitt observert å variere avhengig av hvilken type mikrosentrifugerør prøvene er i. Ved bruk av mikrosentrifugerørene beskrevet i materialfortegnelsen, varer dette trinnet vanligvis 5 timer. Men når alternative mikrosentrifugerør med større volum brukes, kan dette trinnet vare opptil 11 timer. Et alternativ til vakuumsentrifugering kan være lyofilisering eller frysetørking av prøvene, noe som vil kreve at prøvene fryses etter ekstraksjon. Lyofilisering ble imidlertid ikke testet i konstruksjonen av denne protokollen. I tillegg, hvis man systematisk finner lavere enn forventede konsentrasjoner av CGRP, bør man sørge for at alle reagenser, spesielt antistoffene, tines til romtemperatur før bruk. Instabiliteten til reagenser, som antistoff- og tracerløsninger, kan bidra til systematiske feil i bindingen av CGRP. Dersom utbyttet fortsetter å være utilstrekkelig, kan antistoffbinding til CGRP påvirkes av den relative surhetsgraden til eluenten (metanol og eddiksyreoppløsning), til tross for rekonstituering med en buffer. I dette tilfellet vil et pH-korrigeringstrinn være et logisk tillegg etter rekonstituering med buffer.
Begrensninger i denne protokollen inkluderer begrensningene knyttet til enhver ELISA-metodikk, spesielt antistoffustabilitet38. Antistoffreagenser må tines til romtemperatur før bruk i analysen. Oppvarming i en lengre periode kan imidlertid forårsake denaturering og følgelig redusert effektivitet i bindingen av CGRP. I tillegg kan CGRP gjennomgå nedbrytning av en rekke ikke-serinproteaser, noe som fører til økte falske negative resultater. Selv om denne protokollen begrenser nedbrytningen ved å legge til en serinprotease og begrense prøvebehandlingstiden til mindre enn 60 minutter, kan nedbrytning fortsatt forekomme. En annen begrensning er mangelen på fryse-tine sykluser testet. Lee et al.39 viste at fryse-tine-sykluser kan øke eller redusere serum- og plasmaproteinmengder, avhengig av proteinets følsomhet. Følsomheten til CGRP for fryse-tine-sykluser er ikke fullstendig testet i litteraturen, selv om Messlinger et al. har bemerket at nivåene av CGRP reduseres ved en syklus med frysing og tining37. Videre kan denne protokollens utbytte dra nytte av bruk av protein LoBind-rør, designet med en hydrofil overflate, og dermed føre til forbedret proteinutvinning.
Vi bemerker at disse valideringseksperimentene ikke ser ut til å ha blitt utført av forfattere av nyere studier som kvantifiserer CGRP i humant plasma 16,18,35,40,41. En gjennomgang av ELISA-metodikken av Messlinger et al.37 understreker behovet for slike kontroller og stiller spørsmål ved studier som ikke har brukt dem. Vi tror at vårt arbeid med å validere og standardisere en protokoll vil gi fremtidig CGRP-forskning et bedre grunnlag. Implikasjonene av en slik protokoll spenner vidt, og kan teoretisk utvides til å undersøke biomarkørstatusen til CGRP i nevrologiske og ikke-nevrologiske sykdomsprosesser 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen ytterligere avsløringer å legge til.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Robert N. Cole, Lauren R. DeVine og Marcos Iglesias for deres nyttige diskusjoner angående denne protokollen. Dette ble støttet delvis av finansiering fra American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), American Hearing Research Foundation (90066548/90072266, JPC) og National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), en del av National Institutes of Health (NIH), og NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). Publikasjonens innhold er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis det offisielle synet til Johns Hopkins ICTR, NCATS eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H.
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
