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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64834
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Center for Molecular Immunology and Infectious Disease and Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Penn State Cancer Institute, The Pennsylvania State University

Summary

Aqui, a injeção intraperitoneal de células leucêmicas é utilizada para estabelecer e propagar a leucemia mieloide aguda (LMA) em camundongos. Este novo método é eficaz no transplante seriado de células da LMA e pode servir como uma alternativa para aqueles que podem experimentar dificuldades e inconsistências com a injeção intravenosa em camundongos.

Abstract

Há uma necessidade não atendida de novas terapias para tratar a leucemia mieloide aguda (LMA) e a recaída associada que envolve células-tronco de leucemia persistente (LSCs). Um modelo experimental de roedores com LMA para testar terapias baseadas no transplante bem-sucedido dessas células via injeções retroorbitais em camundongos receptores é repleto de desafios. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método fácil, confiável e consistente para gerar um modelo murino robusto de LMA usando uma via intraperitoneal. No presente protocolo, células da medula óssea foram transduzidas com um retrovírus expressando oncoproteína de fusão MLL-AF9 humana. A eficiência de populações de linhagem negativa (Lin-) e Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como LSCs doadoras no desenvolvimento de LMA primária foi testada, e a injeção intraperitoneal foi adotada como um novo método para gerar LMA. A comparação entre as injeções intraperitoneais e retro-orbitárias foi feita em transplantes seriados para comparar e contrastar os dois métodos. As células de Lin e LSK transduzidas com o vírus MLL-AF9 humano enxertado bem na medula óssea e no baço dos receptores, levando a uma LMA completa. A injeção intraperitoneal de células doadoras estabeleceu LMA em receptores após transplante seriado, e a infiltração de células de LMA foi detectada no sangue, medula óssea, baço e fígado dos receptores por citometria de fluxo, qPCR e análises histológicas. Assim, a injeção intraperitoneal é um método eficiente de indução de LMA utilizando transplante seriado de células leucêmicas de doadores.

Introduction

A leucemia mieloide aguda (LMA) é um tipo de neoplasia hematológica de etiologia diversa e de mau prognóstico1. A geração de modelos animais de LMA estabelece as bases para a compreensão de suas complexas variações e patobiologia em um esforço para descobrir novas terapias2. A leucemogênese em camundongos envolve o transplante de células doadoras expressando oncoproteínas de fusão, incluindo fusões envolvendo o gene da leucemia de linhagem mista (MLL) para induzir potentemente a LMA, para mimetizar a doença em humanos3. Várias origens celulares de células de doadores têm sido relatadas no transplante de LMA4 associada ao gene MLL, sendo pouco conhecido sobre as células responsáveis pela origem da doença.

Múltiplas vias têm sido desenvolvidas para transplante em camundongos; em vez de uma injeção intrafemoral, que introduz diretamente células doadoras mutantes na medulaóssea5, uma injeção intravenosa que utiliza o plexo sinusal venoso, a veia caudal e a veia jugular tem sido amplamente utilizada para gerar modelos murinos de LMA 6,7,8,9. No caso da injeção retro-orbitária (r.o.), várias desvantagens inerentes, como limitação de volume, alta demanda técnica, poucas chances de tentativas repetidas ou erro e possíveis lesões oculares, têm sido grandes obstáculos com alternativas limitadas ou inviáveis7. A injeção da veia caudal pode ter problemas semelhantes, além de lesões locais; Para facilitar o procedimento, os camundongos muitas vezes precisam ser aquecidos para dilatar as veias da cauda10. Também é difícil localizar a veia da cauda sem uma fonte de luz adicional, particularmente na linhagem C57BL/6 de camundongos. Para a injeção da veia jugular, o pessoal da pesquisa requer treinamento suficiente para localizar a veia e limitar possíveis complicações. Além disso, tanto as injeções do seio venoso quanto da veia jugular precisam ser realizadas sob anestesia, o que acrescenta outro nível de complexidade. Assim, é tentador explorar novas rotas de transplante para facilitar o estabelecimento de modelos murinos de LMA.

A injeção intraperitoneal (i.p.) é comumente utilizada para administração de fármacos, corantes e anestésicos 11,12,13,14,15; Também tem sido utilizada na introdução de células hematopoéticas para hematopoese ectópica16 e no transplante de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea em vários modelos murinos 17,18,19,20,21. No entanto, tem sido pouco utilizada para estabelecer neoplasias hematopoéticas em camundongos, particularmente para estudar a progressão da doença da LMA.

O presente estudo descreve a viabilidade da injeção i.p. na geração de modelos de LMA em camundongos, além de comparar a eficiência do transplante de populações de linhagem negativa (Lin-) e Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como células doadoras. Esses achados fornecem uma maneira simples e eficiente de gerar modelos experimentais de LMA e leucemias mieloides relacionadas. Tal método tem o potencial de aprofundar nossa compreensão dos mecanismos da doença, bem como fornecer um modelo relativamente fácil para testar terapias experimentais.

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Protocol

Todos os experimentos foram pré-aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual da Pensilvânia.

1. Preparação de tampões e reagentes

  1. Preparar placas de ágar LB suplementadas com ampicilina (AP) (placas estéreis de 10 cm). Para isso, dissolva 10 g de caldo LB com ágar em 400 mL de água destilada, mexa e leve o volume até 500 mL. Esterilizar a solução por autoclavagem, em seguida, deixar a solução arrefecer, adicionar 0,5 ml de ampicilina (stock: 150 mg/ml) em solução e agitá-la para misturar. Adicionar imediatamente 18 ml de solução a uma placa estéril de 10 cm perto de uma lâmpada de álcool, deixar solidificar à temperatura ambiente e conservar as placas de cabeça para baixo a 4 °C até nova utilização.
  2. Preparar o meio LB dissolvendo 10 g de LB sem ágar em 500 mL de água destilada. Esterilizar a solução por autoclavagem, deixar a solução arrefecer, adicionar 0,5 ml de ampicilina (stock: 150 mg/ml) em solução e agitá-la para misturar.
  3. Preparar tampão de fluxo adicionando 5 mL de penicilina/estreptomicina e 10 mL de soro fetal bovino inativado pelo calor (hiFBS) em 485 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco.
    NOTA: Para inativar o FBS por aquecimento, coloque garrafas FBS descongeladas em banho-maria a 56 °C. Certifique-se de que as garrafas não tombem ou fiquem submersas no banho-maria. A temperatura é crítica para a degradação completa; para garantir isso, aguarde até que a temperatura se estabilize em 56 °C depois de colocar as garrafas no banho-maria. Gire suavemente as garrafas a cada 10 min três vezes. Não deixe o soro incubar por mais de 30 min.
  4. Preparar o meio de manutenção adicionando 50 mL de hiFBS, 5 mL de L-glutamina e 5 mL de penicilina/estreptomicina em 440 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM). Preparar o meio de transfecção adicionando 50 mL de hiFBS e 5 mL de L-glutamina em 445 mL de meio DMEM.
  5. Preparar tampão de lise de hemácias (RBC) adicionando 4,145 g de NH4Cl, 0,504 g de NaHCO3 e 16,81 mg de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em 500 mL de água destilada. Preparar meio de Dulbecco modificado (IMDM) de Iscove incompleto adicionando 75 mL de hiFBS, 5 g de albumina de soro bovino (BSA), 0,5 mL de 10 mg/mL de insulina, 2,5 mL de holo-transferrina 4 mg/mL, 3,5 μL de β-mercaptoetanol, 5 mL de L-glutamina e 0,5 mL de ciprofloxacina em 416,5 mL de meio IMDM.
  6. Preparar 10 mL de meio IMDM 2x, no qual a concentração de citocinas é o dobro da quantidade em meio IMDM 1x, adicionando 10 μL de 50 ng/μL mr-SCF, 20 μL de 25 ng/μL mr-Flt3L, 20 μL de 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL de 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μL de 10 mg/mL de insulina, e 50 μL de holo-transferrina 4 mg/mL em 9,87 mL de meio IMDM incompleto.
    NOTA: Certifique-se de que o buffer de fluxo, o buffer de lise RBC, o meio de manutenção, o meio de transfecção e o meio IMDM incompleto sejam esterilizados por filtro antes do uso.

2. Transformação plasmidial

  1. Descongelar 20 μL de células competentes α-Select no gelo. Adicione 1 μL (~2 ng) do plasmídeo MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC322 às células competentes descongeladas e misture suavemente batendo no tubo. Incubar a reação no gelo por 30 min.
  2. Choque térmico da mistura por incubação durante 40 s num bloco de aquecimento a 42 °C. Transfira imediatamente o tubo no gelo por 2 min.
  3. Adicionar 1 ml de LB (sem ampicilina) ao tubo e agitar a 37 °C e 200 rpm durante 1 h.
  4. Centrifugar o tubo à temperatura ambiente a 500 x g por 4 min e descartar 0,9 mL de sobrenadante. Ressuspender o precipitado nos 0,1 mL restantes de LB.
  5. Espalhe as células competentes transformadas em placas de ágar AP LB pré-aquecidas (37 °C). Incubar a placa de cabeça para baixo a 37 °C durante 12-16 horas.
  6. Escolha uma única colônia e gaste as células transformadas em 10 mL de meio AP LB durante a noite a 37 °C e 200 rpm.
  7. Adicionar 5 ml de células competentes transformadas gastas a 500 ml de meio AP LB num balão e incubar o balão durante a noite a 37 °C e 200 rpm.
  8. Extrair o plasmídeo usando um kit de extração de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante e ressuspender em 0,5 mL de água ultrapura autoclavada. Quantificar o plasmídeo usando um espectrofotômetro.

3. Transfecção de células Phoenix Ecotropic (pECO)

  1. Cultura 2 x 106 pECO células/placa em meio de manutenção em placas de 10 cm em estufa umidificada a 5% CO2 a 37 °C. Certifique-se de que as células pECO sejam mantidas na fase de crescimento exponencial e se dividam ativamente antes da passagem.
  2. Quando as células se tornarem 80% confluentes, lavar as placas com 5 mL de DPBS duas vezes, adicionar 1 mL de tripsina à placa e incubar em estufa umidificada de 5% CO 2 a 37 °C por2 min. Colher as células com 5 mL de meio de manutenção em tubo estéril de 15 mL e centrifugar a 4 °C e 400 x g por 3 min. Ressuspender o pellet celular em 5 mL de meio de manutenção.
  3. Misturar 10 μL de suspensão celular e 10 μL de azul de tripano e carregar 10 μL em um hemocitômetro para contar as células.
    Total de células/mL = (Total de células contadas x Fator de diluição x 104 células/mL)/ Número de quadrados contados)
    Semear 2 x 10 6 células/prato em placas de6 cm utilizando 5 mL de meio de manutenção para transfecção e cultura das células em estufa umidificada a 5% de CO2 a 37 °C.
  4. Substitua o meio de manutenção por 5 mL de meio de transfecção quando as células se tornarem 50%-60% confluentes após 18 h de cultura.
  5. Manter o reagente de transfecção à temperatura ambiente por pelo menos 30 min antes da transfecção.
  6. Adicionar 5,5 μg de plasmídeo MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC322 a 0,5 mL de meio DMEM simples em um tubo estéril de 1,5 mL. Misture suavemente batendo no tubo e deixe descansar por 10 min.
  7. Adicione 14,6 μL (3x a quantidade de plasmídeo; v/w) de reagente de transfecção ao tubo e bata suavemente o tubo a cada 10 min três vezes.
  8. Adicione uniformemente a mistura gota a gota em todas as áreas dos pratos com as células pECO em meios de transfecção. Mova suavemente os pratos para frente e para trás 10 vezes e para os lados 10 vezes. Incubar as placas em estufa umidificada com 5% de CO2 a 37 °C durante 48 horas.
  9. Medir a eficiência da transfecção por microscopia de florescência e citometria de fluxo para proteína fluorescente verde (GFP) como descrito em22. As células são primeiramente acopladas em FSC-A/FSC-H e FSC-A e SSC-A para adquirir singletes. A população GFP+ é limitada no gráfico FL1 comparando-a com células não transfectadas.
  10. Recolher e filtrar os sobrenadantes através de um filtro de seringa de 0,45 μm para um tubo estéril de 50 ml. Utilizar imediatamente os sobrenadantes para transdução ou congelá-los rapidamente em azoto líquido e armazená-los a -80 °C até nova utilização.
    NOTA: As células pECO devem ser devidamente misturadas e semeadas em pratos uniformemente. Permita que as células se espalhem movendo os pratos para frente e para trás 10 vezes e para os lados 10 vezes durante a semeadura. O número de células a serem semeadas pode variar dependendo das variações na contagem. Para encontrar o número ideal de células de semeadura que pode atingir 50%-60% de confluência após 18 h de cultura, a semeadura de células com diluições seriadas é útil.

4. Transdução lentiviral

  1. Eutanásia de camundongos CD45.1 fêmeas C57BL6/J de 8-10 semanas de idade (dois a três camundongos doadores por camundongo receptor) em uma câmara de CO2 .
  2. Esterilizar todo o corpo dos ratos com etanol 70%. Coloque os ratos em uma almofada cirúrgica estéril em uma placa de isopor e fixe as pernas através das almofadas da pata do rato.
  3. Corte a pele acima da cavidade abdominal na linha média e amplie o espaço subcutâneo em direção às patas traseiras com uma tesoura estéril afiada.
  4. Estenda a incisão da linha média abdominal até os tornozelos. Amplie o espaço subcutâneo abaixo das patas traseiras com as lâminas de tesoura estéril afiada.
  5. Corte o tendão de Aquiles com uma tesoura estéril afiada. Segure o tendão usando pinças com dentes e corte a outra extremidade presa ao fêmur para remover o músculo gastrocnêmio.
  6. Corte o tendão do quadríceps preso ao joelho com uma tesoura estéril afiada. Segure o tendão usando pinças com dentes e corte as cabeças musculares presas ao fêmur para remover o músculo gastrocnêmio.
  7. Corte os outros músculos ao redor do fêmur na extremidade presa à tíbia com uma tesoura estéril afiada.
  8. Corte o tornozelo com uma tesoura estéril afiada, garantindo que a tíbia permaneça intacta. Segure a extremidade distal do fêmur usando pinça com dentes e corte a articulação do quadril com tesoura estéril afiada, garantindo que a cabeça femoral permaneça intacta.
  9. Transfira as tíbias e fêmures para tampão de fluxo em tubo estéril de 15 mL.
  10. Separe a tíbia e o fêmur quebrando o joelho com a mão. Remova a patela, cartilagem e côndilos femorais para expor o platô tibial e o fêmur distal manualmente. Remova os músculos usando uma gaze estéril e, em seguida, mergulhe os ossos em tampão de fluxo.
  11. Cortar o colo femoral e lavar as células da medula óssea com tampão de fluxo de ambas as extremidades do fêmur usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 23 G.
  12. Cortar o maléolo tibial e lavar as células da medula óssea com tampão de fluxo de ambas as extremidades da tíbia usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 23 G.
  13. Dispersar as células pipetando para cima e para baixo usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 18 G. Centrifugar a suspensão de célula única a 4 °C e 400 x g durante 3 min.
  14. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de tampão de lise eritrocitária para lisar as hemácias por 3 min.
  15. Adicionar 5 ml de tampão de fluxo para parar a lise e centrifugar a suspensão celular a 4 °C e 400 x g durante 3 minutos.
  16. Coloque um filtro celular de 70 μm em um tubo estéril de 50 mL. Suspender o pellet com 5 mL de tampão de fluxo, misturar e passar pelo filtro de células para coletar as células.
  17. Ajustar a concentração celular com tampão de fluxo para 1 x 108/mL em tubos de polipropileno de fundo redondo.
  18. Selecione células Lin- usando um kit de isolamento de células hematopoiéticas de camundongo de acordo com as instruções do fabricante.
  19. Manter separados três tubos de 1 x 104 células em 100 μL de tampão para um controle não corado e dois controles corados com anticorpos únicos para APC-conjugado anti-camundongo CD117 (c-Kit) e PE-Cy7-conjugado anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1). Use 1 μL de anticorpo (a partir de 0,2 mg/mL de estoque) para cada um dos controles corados com anticorpos únicos.
  20. Manchar o restante das células em um tubo com ambos os anticorpos (4 μL de cada um dos estoques de 0,2 mg/mL) em 400 μL. Incubar os tubos no gelo no escuro por 0,5-1 h.
  21. Após a coloração, lavar as células adicionando 1 ml de tampão de fluxo e centrifugar a 4 °C e 400 x g durante 3 min.
  22. Ressuspender as células para o controle não corado e os controles corados com anticorpos únicos em 100 μL de tampão de fluxo. Ressuspender células coradas com anticorpos duplos em 1 mL de tampão de fluxo para triagem.
  23. Classificar células-tronco hematopoéticas (CTHs) como uma população de LSK usando um classificador de células, como descrito em23,24.
  24. Durante a coloração, cubra uma placa estéril de 6 cm com retronectina da seguinte forma: Prepare 100 μg/mL de estoque de retronectina em PBS e adicione 0,9 mL de PBS e 0,1 mL de retronectina a uma placa de 6 cm. Cubra o prato em um exaustor estéril à temperatura ambiente por 2 h. Em seguida, retirar a retronectina e bloquear a placa com 0,5 mL de BSA 2% filtrado (em PBS) por 30 min. Lave a placa com 5 mL de PBS duas vezes e a placa está pronta para transdução.
  25. Centrifugar as CTHs selecionadas ou células de Lin não separadas a 4 °C e 400 x g por 3 min e ressuspender em 3 mL de meio IMDM 2x (de citocinas) e 3 mL de sobrenadante viral (gerado a partir da etapa 3.10) em uma placa revestida com retronectina. Incubar o prato numa estufa humidificada a 5% CO2 a 37 °C durante 6 ou 24 horas.
    NOTA: No presente estudo, as células Lin- foram classificadas ou não, dependendo do desenho experimental.

5. Transplante seriado (Figura 1)

NOTA: Os camundongos receptores primários foram camundongos C57BL6/J machos de 8-10 semanas de idade (CD45.2). Eles receberam água ad libitum contendo antibióticos para prevenir infecções digestivas oportunistas, de 3 dias antes do transplante a 7 dias após o transplante. Camundongos receptores primários foram irradiados subletalmente (4,75 Gy) 3 h antes do transplante25. O isoflurano não foi aplicado em camundongos com injeção intraperitoneal.

  1. Após transdução por 6 ou 24 h, colher as células por centrifugação à temperatura ambiente e 400 x g por 3 min. Use tripsina para coletar as células anexadas ao fundo do prato, se necessário. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em PBS pré-aquecido. Determine o volume de PBS dependendo do número de receptores (ou seja, 0,1 mL/camundongo e 0,5 mL/camundongo para receptores com injeções retroorbitais e intraperitoneais, respectivamente).
  2. Colocar os camundongos receptores irradiados subletalmente em uma câmara de isoflurano (a taxa de fluxo de oxigênio é definida como 1,0 L/min e o vaporizador de isoflurano é definido como 5%). Aplique pomada úmida nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Os ratos estão prontos para novos procedimentos quando os batimentos cardíacos caem para 60 batimentos por minuto.
  3. Injetar células em camundongos receptores primários retro-orbitalmente (0,1 mL/camundongo)7 ou intraperitonealmente (0,5 mL/camundongo)26 com uma agulha 27 G1/2. Observe os camundongos continuamente até que eles ganhem consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Monitore os camundongos diariamente para seu bem-estar pós-transplante.
  4. Após 1 mês, coletar sangue semanalmente por sangramento retro-orbital para monitorar a leucocitose avaliando o hemograma completo (hemograma) em um hemavet conforme descrito abaixo.
    1. Coloque o camundongo lateralmente após a anestesia com isoflurano (a taxa de fluxo de oxigênio é definida como 1,0 L/min e o vaporizador de isoflurância é definido como 5%). Os ratos estão prontos para novos procedimentos quando os batimentos cardíacos caem para 60 batimentos por minuto.
    2. Proponha o olho com o polegar e o indicador. Penetrar o plexo do seio venoso com tubo capilar hemacrit asteril através do canto interno.
    3. Colete 20-25 μL de sangue em um tubo de coleta de sangue EDTA e feche as pálpebras para parar o sangramento. Aplique uma gota de solução oftálmica de sulfato de gentamicina no olho.
  5. Ao final, quando os leucócitos atingirem 4 x 10 4 células/μL, eutanasiar o camundongo em uma câmara de CO2 e isolar as células da medula óssea lavando os fêmures e tíbias com tampão de fluxo, seguido de lise eritrocitária, conforme mencionado na etapa4.
  6. No ponto final, colher os esplenócitos conforme mencionado abaixo.
    1. Eutanasiar o rato numa câmara de CO2 . Coloque os ratos em uma almofada cirúrgica estéril em uma placa de isopor e fixe as pernas através das almofadas da pata do rato. Esterilizar todo o corpo dos ratos com etanol 70%.
    2. Corte a pele e o músculo na linha média para expor a cavidade abdominal com uma tesoura estéril afiada. Isole o baço com uma tesoura estéril afiada e coloque-o em tampão de fluxo em um tubo estéril de 15 mL.
    3. Endireitar o baço através de um filtro estéril de 70 μm em uma placa de 6 cm com 3 mL de tampão de fluxo. Transferir as células da placa para um tubo estéril de 15 mL e centrifugar a suspensão de célula única a 4 °C e 400 x g por 3 min.
    4. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de tampão de lise eritrocitária para lisar as hemácias por 3 min. Adicionar 5 ml de tampão de fluxo para parar a lise e centrifugar a suspensão celular a 4 °C e 400 x g durante 3 minutos.
    5. Coloque um filtro celular de 70 μm em um tubo estéril de 50 mL. Suspender o pellet com 5 mL de tampão de fluxo, misturar e passar pelo filtro de células para coletar células.
  7. Identificar células primárias (1°) de LMA corando os esplenócitos e as células da medula óssea com o anticorpo CD45.1 de camundongo conjugado com FITC e detectando em um citômetro de fluxo. As células são primeiramente acopladas em FSC-A/FSC-H e FSC-A e SSC-A para adquirir singletes. A população CD45.1+ é limitada na parcela FL1 comparando-a com células não coradas.
  8. Para o transplante secundário (2°), ressuspenda as células esplênicas CD45.1 da LMA de receptores de 1° r.o. em PBS (0,1 mL/camundongo) e injete-as retroorbitalmente em camundongos C57BL6/J machos CD45.2. Paralelamente, ressuspenda as células esplênicas da LMA de receptores de 1° i.p. em PBS (0,5 mL/camundongo) e injete-as intraperitonealmente em camundongos machos Ai14TdTomato com 8-12 semanas de idade expressando proteína de fluorescência vermelha (RFP)27.
  9. Para o transplante terciário (3°), ressuspender as células da LMA isoladas da medula óssea ou da cavidade peritoneal dos receptores de 2° i.p. e injetá-las intraperitonealmente em camundongos Ai14TdTomato (RFP+) ou CD45.2, respectivamente. Ressuspender células de LMA isoladas da cavidade peritoneal de receptores de 2° r.o. e transplantá-las por injeção de r.o. em camundongos Ai14TdTomato (RFP+).
    OBS: Para o 2° transplante, identificamos a progressão da doença nos receptores de 2° através da monitorização do hemograma completo no sangue periférico. Para confirmar ainda mais o estabelecimento da LMA, coletamos sangue periférico total por punção cardíaca, medula óssea, baço e fígado. Além disso, realizamos lavagem i.p. para coletar células i.p. As suspensões unicelulares foram adquiridas da medula óssea, baço e lavagem i.p., conforme descrito acima. As células desses sítios foram analisadas em citômetro de fluxo após lise de hemácias. As células AML foram reconhecidas como RFP negativo (RFP-). Para o 3° transplante, foram coletadas amostras de sangue, medula óssea, baço, fígado e células i.p. no desfecho; Células RFP- ou CD45.1+ foram identificadas como células AML e examinadas por citometria de fluxo. Nenhuma irradiação ou água antibiótica foi administrada aos camundongos receptores de 2° e 3°.

Figure 1
Figura 1: Esquema da transdução viral MLL-AF9 em CTHs de medula óssea e transplante seriado (1°, 2° e 3°). A classificação da população dupla positiva de Sca-1 e c-Kit usando um classificador de células mostrado na caixa de sombra pontilhada é considerada opcional, se os recursos permitirem. A figura foi criada usando BioRender (https://biorender.com/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Lavagem intraperitoneal

  1. Injetar 5 mL de IMDM incompleto na cavidade peritoneal duas vezes para coletar as células em um tubo estéril de 15 mL. Centrifugar a suspensão celular à temperatura ambiente e 400 x g por 3 min. Transplantar células de LMA (4 x 105 células/camundongo) da cavidade peritoneal de receptores de 2° via injeção i.p. em camundongos receptores CD45.2 de 3° (n = 3).

7. Análise histológica 28

  1. Isole os baços, fígados e fêmures de camundongos após a eutanásia. Fixá-los em 5 mL de formalina tamponada a 10% (v/v). Amostra de baços e fígados de contrapartes saudáveis para comparações.
  2. Embutir tecidos fixos em parafina e cortá-los em cortes. Corar os cortes com hematoxilina e eosina (H&E).
  3. Obter as imagens ao microscópio em aumento de 20x instalado com software compatível para análise histológica.

8. Realização de PCR semiquantitativo (qPCR)

  1. Preparar RNAs em reagente de RNA de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Use 0,5-1,0 μg de RNAs para sintetizar cDNA usando um kit de transcrição reversa de cDNA de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Use cDNA para realizar qPCR usando um kit qPCR e execute as amostras em um sistema qPCR. Use as seguintes sondas TaqMan pré-validadas: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 e RNA ribossomal 18S (Hs99999901_s1).
  4. Coloque os amplicons KMT2A e 18S em um gel de agarose a 2% para visualizar a expressão. Adquira imagens em um imageador instalado com o programa de software compatível.

9. Processamento de dados

  1. Analisar os resultados utilizando software de análise estatística e apresentar os resultados como a média ± MEV.

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Representative Results

Comparação da eficiência do transplante de células murinas de LMA utilizando as vias de transplante r.o. e i.p.
Previamente, o estabelecimento de 1° AML foi relatado em camundongos receptores transplantados retroorbitalmente com células LSK transduzidas por MLL-AF9, e a transplantabilidade de 1° de células AML foi demonstrada por transplante seriado30. O presente estudo é o primeiro a avaliar a possibilidade de utilização de células de Lin- da medula óssea para a realização do transplante. A presença de leucocitose aberrante (Figura 2A) e o aumento da infiltração de células leucêmicas (CD45.1+) na medula óssea e no baço (Figura 2B) reforçam a viabilidade do uso de células Lin- da medula óssea para gerar 1° LMA. Para comparar o período de indução da doença, dois camundongos doadores por receptor foram eutanasiados para isolar células LSK ou Lin- . A partir dos resultados, não foram observadas diferenças significativas nos receptores de 1° transplantados com LSK ou células de Lin- (Figura 2C).

Durante o exame de metástase de 1° LMA, descobriu-se que as células de LMA se espalhavam na cavidade abdominal de receptores de 1° por células Lin- transduzidas por MLL-AF9 (Figura 1 suplementar). Esse achado inspirou a exploração para testar se a injeção i.p. poderia ser adotada na geração de LMA murina, o que poderia servir como uma nova e mais fácil via de transplante. Devido ao sucesso do uso da população Lin- da medula óssea como células doadoras de LMA, os dados atuais confirmaram o estabelecimento de 1° de LMA via injeção i.p. de células Lin- da medula óssea transduzidas por MLL-AF9, como visto na forma de leucocitose (Figura 2D) e a presença de células de LMA (CD45.1+) na medula óssea e no baço de camundongos receptores (Figura 2E). No entanto, o transplante por injeção i.p. levou mais tempo para desenvolver LMA do que por injeção r.o., apesar de os receptores receberem um número igual de células de doadores (Figura 2F). Além disso, camundongos transplantados retroorbitalmente com mais células Lin- (5,125 x 10 6 células/camundongo) na Figura 2F pareceram desenvolver LMA mais rapidamente do que aqueles transplantados com menos células Lin- (3,69 x 10 6 células/camundongo) na Figura 2C.

Devido à inerente inconsistência do tempo de incubação em receptores de 1° LMA (Figura 2F), procurou-se testar o transplante i.p. em receptores de 2°. Para o 2° transplante, a injeção i.p. foi realizada com 8 x 105 células de LMA isoladas de receptores de 1° transplantados intraperitonealmente. Os receptores do 2° apresentaram leucocitose (Figura 2G) e hepatoesplenomegalia significativa (Figura 2H) em menos de 1 mês pós-transplante, um claro avanço em relação ao 1° transplante. Consistente com essa observação, células da LMA (RFP-) também foram detectadas no sangue periférico, medula óssea e baço (Figura 2I), bem como na cavidade peritoneal (Figura 1 suplementar). Além disso, a expressão do oncogene KMT2A no sangue, baço e fígado de receptores de 2° também confirmou o sucesso na geração de LMA (Figura 2J). Além disso, a análise histológica demonstrou ainda a infiltração de células leucêmicas no baço e fígado de camundongos transplantados intraperitonealmente (Figura 2K). Esses dados confirmam que as células de 1° AML geradas por injeção i.p. são transplantáveis em receptores de 2°. Além disso, a injeção i.p. de 8 x 10 5 células AML por camundongo em receptores obteve enxerto comparável à injeção r.o. de 8 x 105 células AML por camundongo em receptores (Figura 2L).

Uma das principais características dos LSCs é a transplantabilidade seriada; assim, para averiguar melhor o estabelecimento da LMA em receptores de 2°, este protocolo procurou verificar se as células de LMA do transplante de 2° i.p. permaneciam transplantáveis em série, bem como a viabilidade do transplante de células-tronco por injeção i.p. no 3° transplante. Células de LMA isoladas da medula óssea (8 x 10, 5 células leucêmicas/camundongo em 0,5 mL de PBS) ou lavagem i.p. (4 x 10, 5 células leucêmicas/camundongo em0,5 mL de PBS) de receptores de 2° foram injetadas em receptores de 3°. Apesar de terem sido transplantados com células de doadores geradas de diferentes fontes, camundongos receptores de 3° exibiram agudamente sinais de LMA (dentro de 3 e 4 semanas para células da medula óssea e células i.p., respectivamente), incluindo leucocitose (Figura 3A) e hepatoesplenomegalia (Figura 3B), presença de células leucêmicas no sangue, medula óssea e baço (Figura 3C) e expressão de KMT2A (Figura 3D ). A observação histológica do fêmur e baço demonstrou ainda infiltração de células leucêmicas (Figura 3E). Como comparação, a injeção r.o. de esplenócitos leucêmicos (4 x 105 células) de receptores de 2° também foi igualmente capaz de enxertar e desenvolver LMA em receptores de 3°, caracterizada por leucocitose (Figura 2A suplementar), hepatoesplenomegalia (Figura 2B suplementar) e infiltração de células de LMA no sangue, medula óssea e baço (Figura 2C suplementar).

O transplante intraperitoneal é efetivo mesmo para o transplante de 3° de células da LMA
Em comparação com os transplantes de 2° e 3°, pode-se facilmente concluir que o 3° transplante (Figura 3F) progrediu muito mais rápido do que o 2° transplante (Figura 2L) para ambas as injeções i.p. e r.o. Notadamente, a injeção i.p. de 4 x 105 células AML/camundongo desenvolveu LMA mais tarde do que a injeção r.o. do mesmo número de células AML por 6 dias (Figura 3F), possivelmente indicando o tempo gasto na migração da cavidade peritoneal para o nicho da medula óssea. Curiosamente, a alta frequência de células leucêmicas na cavidade peritoneal (Figura Suplementar S2) nos 3° transplantados sugeriu que a cavidade peritoneal também pode fornecer o nicho para a rápida expansão das células leucêmicas. Além disso, a presença de células leucêmicas na cavidade peritoneal de receptores de 1° e 3° transplantados retro-orbitalmente indicou a circulação mútua de células leucêmicas entre a cavidade peritoneal e o sistema sanguíneo, justificando o transplante i.p. Coletivamente, esses achados validam o uso da injeção i.p. no transplante seriado de LMA.

Figure 2
Figura 2: Geração do modelo murino de LMA no 1° e 2° transplante. (A) Hemograma completo; 1 x 10 3 células/μL de sangue), leucócitos, neutrófilos (NE), linfócitos (LY), monócitos (MO), eosinófilos (EO) e basófilos (BA) de camundongos receptores de 1° transplantados retroorbitalmente com células Lin- transduzidas de medula óssea MLL-AF9 (5,125 x 106 células/camundongo) por hemavet (n =3). (B) Análise por citometria de fluxo da frequência de células AML (CD45.1+) na medula óssea e baço de camundongos receptores de 1° CD45.2 transplantados retroorbitalmente com células Lin- (5,125 x 106 células/camundongo) transduzidas por MLL-AF9 (n = 3). (C) Duração de incubação do 1° LMA em receptores transplantados retro-orbitalmente com células LSK da medula óssea transduzidas por MLL-AF9 (3,16 x10 5 células/camundongo isoladas de dois doadores, n = 4) ou células Lin- (3,69 x 106 células/camundongo isoladas de dois doadores, n = 3). Cada receptor recebeu células isoladas de dois doadores. (D) Análise hemopulmonar de camundongos receptores de 1° transplantados intraperitonealmente com células Lin- da medula óssea transduzidas por MLL-AF9 (5,125 x 106 células/camundongo) por hemavet (n = 4). (E) Análise por citometria de fluxo da frequência de células AML (CD45.1+) na medula óssea e baço de camundongos receptores de 1° CD45.2 transplantados intraperitonealmente com células Lin- da medula óssea transduzidas por MLL-AF9 (5,125 x 106 células/camundongo, n = 3). (F) Duração de incubação do 1° LMA em receptores transplantados retro-orbitalmente (n = 3) ou intraperitonealmente (n = 3) com células Lin- transduzidas da medula óssea MLL-AF9. Cada receptor recebeu a mesma quantidade de células do doador (5,125 x 106 células/camundongo). (G) Análise hemoquímica de receptores de 2° transplantados intraperitonealmente com células de LMA (8 x 105 células/camundongo) isoladas do baço de receptores transplantados de 1° i.p. por hemavet (n = 3). (H) Pesos (mg) do baço e fígado de camundongos receptores de 2° transplantados intraperitonealmente com células de LMA (8 x 105 células/camundongo) isoladas do baço de receptores transplantados a 1° i.p. As áreas sombreadas representam as faixas de peso normal do baço e do fígado. Imagem representativa do baço e fígado de camundongos receptores de 2° e homólogos saudáveis. (I) Análise por citometria de fluxo da frequência de células AML (RFP-) no sangue, medula óssea e baço de camundongos receptores de 2° RFP+ transplantados intraperitonealmente com células AML (8 x 105 células/camundongo) isoladas do baço de receptores transplantados a 1° i.p. (n = 3). (J) Expressão gênica de KMT2A e 18S apresentados como uma banda de DNA. RNAs foram isolados do sangue, medula óssea, baço e fígado de camundongos receptores de 2° transplantados intraperitonealmente com células de LMA (8 x 105 células/camundongo) isoladas do baço de receptores transplantados a 1° i.p. (K) Imagens representativas de alterações histológicas no baço (painel esquerdo) e fígado (painel direito) de receptores de 2° transplantados intraperitonealmente com células de LMA (8 x 105 células/camundongo) isoladas do baço de receptores transplantados de 1° i.p. e contrapartes saudáveis. (L) Duração de incubação de 2° LMA em receptores transplantados retro-orbitalmente (4 x 10 5/camundongo, n = 9) ou intraperitonealmente (8 x 105/camundongo, n = 4) com células de LMA isoladas de receptores transplantados a 1° r.o. e i.p., respectivamente. Os resultados são médios ± MEV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: 3° transplante de células da LMA via transplante i.p. Camundongos receptores de (A-E) 3° RFP+ ou CD45.2. Esquerda: injeção i.p. de células AML (8 x 105 células/camundongo) da medula óssea de receptores de 2°. Direita: injeção i.p. de células AML (4 x 105 células/camundongo) da cavidade peritoneal (i.p.) de receptores de 2° (n = 3). (A) Análise hemograma completo de camundongos receptores de 3° por hemavet. (B) Pesos (mg) do baço e fígado de camundongos receptores do 3º. As áreas sombreadas representam as faixas de peso normal do baço e do fígado. (C) Análise por citometria de fluxo da frequência de células AML (esquerda: RFP-; direita: CD45.1+) no sangue, medula óssea e baço de camundongos receptores de 3°. (D) Expressão gênica de KMT2A e 18S apresentados como uma banda de DNA. RNAs foram isolados do sangue, medula óssea, baço e fígado de camundongos receptores do 3°. (E) Imagens representativas das alterações histológicas no baço (painel esquerdo) e fêmur (painel direito) de camundongos receptores de 3°. (F) Duração de incubação do 3° LMA em receptores transplantados retro-orbitalmente (4 x 10 5 células/camundongo, n = 3) ou intraperitonealmente (4 x 105 células/camundongo, n = 3) com células de LMA isoladas de receptores transplantados a 2° r.o. e i.p., respectivamente. Os resultados são médios ± MEV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Análise por citometria de fluxo da infiltração de células AML na cavidade peritoneal. Frequência de células de LMA no lavado peritoneal de receptores de 1° transplantados retro-orbitalmente (1° RO, n = 2), receptores de 2° transplantados intraperitonealmente (2° IP, n = 2) e receptores de 3° transplantados via injeção i.p. com células de LMA de medula óssea (3° BM-IP, n = 3) e células de LMA i.p. (3° IP-IP, n = 3), bem como receptores de 3° transplantados via injeção de esplenócitos de LMA (3° SP-RO, n = 3). Os resultados são médios ± SEM. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: 3° transplante de esplenócitos de LMA por injeção de r.o. (A) Análise hemotécnica de camundongos receptores de 3° transplantados retroorbitalmente com células AML (4 x 105 células/camundongo) do baço de camundongos receptores de 2°. (B) Pesos (mg) do baço e fígado de camundongos receptores transplantados retro-orbitalmente 3°. As áreas sombreadas representam as faixas de peso normal do baço e do fígado. (C) Frequência de células AML (RFP-) no sangue, medula óssea e baço de camundongos receptores transplantados retro-orbitalmente 3° (n = 3). Os resultados são médios ± MEV. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Esses estudos descritos acima fornecem evidências de suporte de que o transplante de células Lin- é comparável às células LSK na geração de 1° de LMA murina. Além disso, os dados atuais também mostram que a injeção i.p. é um método eficiente e conveniente para estabelecer LMA murina em comparação com a injeção intravenosa (ou r.o.).

Além das células LSK, outras populações, como o progenitor de granulócitos monócitos (GMP), o progenitor linfoide comum (CLP) e o progenitor mieloide comum (CMP), têm sido substituídos como células doadoras na geração de LMA induzida por 1° MLL-AF9 com várias durações de incubação31,32, embora a comparação quantitativa não sugira a escolha ideal. No presente estudo, Lin- e LSK isolados dos mesmos camundongos doadores não tiveram diferença aparente na geração de LMA induzida por 1° MLL-AF9, uma vez que células progenitoras mieloides transduzidas (Sca-1-) foram capazes de iniciar LMA33. Considerando o custo e o tempo necessários para a triagem baseada em citometria de fluxo da população LSK, esses estudos apoiam o uso da população Lin- como células doadoras para o 1° transplante. Assim, as etapas de 4.19 a 4.23 neste protocolo não são necessárias, mas opcionais, e não afetam o resultado final.

Em termos da quantidade de camundongos doadores no 1° transplante, um doador foi capaz de fornecer ~1,0 a 1,5 x 105 células LSK, e um receptor transplantado com essa quantidade de células LSK desenvolveu 1° AML em cerca de 4 meses. No entanto, aumentar o número de doadores para construir células LSK até ~3 x 105 células por receptor pode encurtar a duração da incubação para ~70 dias. Assim, dois doadores devem ser suficientes para gerar rapidamente 1° de LMA. Este princípio também se aplica às células Lin-, em que ~1,0 a 2,5 x10 6 células Lin- podem ser isoladas de cada camundongo doador. No entanto, quando a densidade de células doadoras foi aumentada, o tempo de resposta da leucemogênese foi consideravelmente menor. Esses dados devem ser levados em consideração ao decidir o número de camundongos doadores na etapa 4.1.

Em comparação com a injeção de r.o., a injeção i.p. levou cerca de ~20 dias a mais para desenvolver a LMA completa de 1°, no entanto, essa limitação foi superada aumentando as células doadoras para injeção i.p. Apesar dessa aparente diferença, ambos os métodos mostraram taxa de enxerto semelhante (>80%) na medula óssea e baço ao extremo, indicando a aplicabilidade geral da injeção i.p. no 1° transplante na LMA. O período de incubação relativamente longo para o 1° transplante, bem como sua imprevisível progressão da doença em termos de inconsistência de latência em camundongos receptores, é uma grande limitação para experimentos controlados, como intervenções farmacológicas e estudos mecanísticos. Assim, recomenda-se o uso de células leucêmicas de 1° para transplante em transplantes seriados subsequentes, tipicamente transplante de 2° (Figura 1). Uma vez que até 3 x 108 células leucêmicas no baço (e 6 x 107 células na medula óssea) podem ser geradas a partir de cada 1° receptor no desfecho, o que seria suficiente para realizar o 2° transplante em mais de 300 camundongos, sugere-se transplantar o maior número possível de células para menos receptores para encurtar a latência e aumentar a taxa de enxerto do 1° transplante, o que é importante para as etapas 4.1 e 5.2.

Dada a sua latência consistente e curta, o transplante de 2° pode ser utilizado em múltiplas aplicações, incluindo experimentos in vivo mencionados acima. Além disso, a injeção i.p. também facilita o procedimento para transplante abundante para técnicos inexperientes. Em comparação com a via de injeção r.o., que geralmente gera a LMA em 3 semanas, o método de injeção i.p. levou um pouco mais de tempo (~4 semanas) com o mesmo número de células doadoras para estabelecer uma LMA completa. Embora seja relativamente mais fácil e conveniente, aumentar o número de células transplantadas ou realizar o transplante terciário também pode acelerar a progressão da LMA por injeção intravenosa.

Em resumo, a principal limitação dessa técnica é o maior tempo de incubação do que a injeção intravenosa com a mesma quantidade de células doadoras nos transplantes de 1° e 2°. No entanto, pode ser facilmente superada aumentando o número de células a serem transplantadas. Além das vantagens óbvias, esta técnica também tem algumas outras aplicações. Por exemplo, a capacidade de usar métodos de transplante i.p. também pode servir para cultivar rotineiramente essas células sem a necessidade de meios de cultura in vitro caros. Para ampliar a aplicação dessa técnica em outras neoplasias hematológicas, como leucemia linfoide e leucemia mieloide crônica, e xenoenxertos derivados de pacientes, novos estudos precisam ser feitos no futuro.

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Disclosures

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Flow Cytometry Core Facility do Instituto Huck e ao Histopathology Core Facility do Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, por fornecer suporte técnico oportuno. Este trabalho foi apoiado por subsídios do American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, número de adesão 00000005 ao K.S.P. e R.F.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
a-Select competent cells  Bioline BIO-85027
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma Aldrich Cat# A-9434
Ampicillin Sigma Aldrich Cat# A0797
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade Gemini bio-products Cat# 700-102P
Ciprofloxacin HCl GoldBio.com Cat# C-861-100
DMEM, high glucose, no glutamine Gibco Cat# 11960-044
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning Cat# 21-031-CV
EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade Calbiochem Cat# 324503
Fetal Bovine Serum - Premium Select Atlanta Biologicals Cat# S11550
Holo-transferrin, bovine Sigma Aldrich Cat# T1283
Insulin solution human Sigma Cat# I-9278
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco Cat# 12440-053
L-glutamine 200 mM (100×) solution HyClone, Gelifesciences Cat# SH30034.01
LB broth, Lennox NEOGEN Cat #: 7290A
LB Broth with agar (Miller) Sigma Aldrich Cat# L-3147
Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) Miltenyi Biotec Cat# 130-124-211
Mouse Interleukin-3 (IL-3) Gemini bio-products Cat# 300-324P
Mouse Interleukin-6 (IL-6) Gemini bio-products Cat# 300-327P
Mouse Stem Cell Factor (SCF) Gemini bio-products Cat# 300-348P
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Corning Cat# 30-002-CI
Phenix-Eco (pECO) cells ATCC CRL-3214
Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular JT. Baker Cat# 2940-01
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) BioLegend  Cat # 105812
Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) BD Pharmingen Cat# 558162
Recombinant Murine Flt3-Ligand Pepro Tech, INC. Cat# 250-31L
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment TaKaRa Cat# T100A
TransIT-293 Reagent MirusBio Cat# MIR 2705
TRI Reagent Sigma Aldrich Cat# T9424
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco Cat # 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco Cat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME) Sigma Aldrich Cat# M3148
Commercial Assays 
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit  StemCell technologies Cat# 19856A
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher  Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMix Quanta Bio Cat# 95051-500
Plasmid Maxi Kit (25) Qiagen Cat#:12163
Animals
Ai14TdTomato mice Jackson Laboratory Strain # 007914
CD45.1 C57BL6/J mice  Jackson Laboratory Strain # 002014
CD45.2 C57BL6/J mice  Jackson Laboratory Strain # 000664
Instruments and Softwares
Adobe illustrator  Version 25.2.3
BD accuri C6 flow cytometer BD Biosciences
FlowJo 10.8.0 BD
GeneSys software program  Version 1.5.7.0
GraphPad Prism version 6  GraphPad
Hemavet 950FS  Drew Scientific
7300 Real time PCR system Applied Biosystems
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging G:Box Chemi

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Pesquisa sobre o Câncer Edição 191
Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos
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Qian, F., Arner, B. E., Nettleford,… More

Qian, F., Arner, B. E., Nettleford, S. K., Paulson, R. F., Prabhu, K. S. Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice. J. Vis. Exp. (191), e64834, doi:10.3791/64834 (2023).

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