Summary
Här används intraperitoneal injektion av leukemiceller för att etablera och sprida akut myeloisk leukemi (AML) hos möss. Denna nya metod är effektiv vid serietransplantation av AML-celler och kan fungera som ett alternativ för dem som kan uppleva svårigheter och inkonsekvenser med intravenös injektion hos möss.
Abstract
Det finns ett ouppfyllt behov av nya terapier för att behandla akut myeloisk leukemi (AML) och tillhörande återfall som involverar ihållande leukemistamceller (LSC). En experimentell AML-gnagarmodell för att testa terapier baserade på framgångsrik transplantation av dessa celler via retroorbitala injektioner i mottagarmöss är full av utmaningar. Syftet med denna studie var att utveckla en enkel, tillförlitlig och konsekvent metod för att generera en robust murin modell av AML med hjälp av en intraperitoneal väg. I det nuvarande protokollet transducerades benmärgsceller med ett retrovirus som uttrycker humant MLL-AF9-fusionsonkoprotein. Effektiviteten hos härstamningsnegativa (Lin-) och Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populationer som donator-LSC vid utvecklingen av primär AML testades och intraperitoneal injektion antogs som en ny metod för att generera AML. Jämförelse mellan intraperitoneala och retroorbitala injektioner gjordes i serietransplantationer för att jämföra och kontrastera de två metoderna. Både Lin- och LSK-celler transducerade med humant MLL-AF9-virus transplanterade väl i benmärgen och mjälten hos mottagare, vilket ledde till en fullblåst AML. Den intraperitoneala injektionen av donatorceller etablerade AML hos mottagare vid serietransplantation, och infiltration av AML-celler detekterades i blod, benmärg, mjälte och lever hos mottagare genom flödescytometri, qPCR och histologiska analyser. Således är intraperitoneal injektion en effektiv metod för AML-induktion med seriell transplantation av donatorleukemiska celler.
Introduction
Akut myeloisk leukemi (AML) är en typ av hematologisk malignitet av olika etiologi med dålig prognos1. Genereringen av AML-djurmodeller lägger grunden för förståelsen av dess komplexa variationer och patobiologi i ett försök att upptäcka nya terapier2. Leukemogenes hos möss involverar transplantation av donatorceller som uttrycker fusions-onkoproteiner, inklusive fusioner som involverar genen blandad härstamningsleukemi (MLL) för att kraftigt inducera AML, för att efterlikna sjukdomen hos människor3. Olika cellulära ursprung av donatorceller har rapporterats vid transplantation av MLL-genassocierad AML4, med mycket lite känt om cellerna som är ansvariga för sjukdomens ursprung.
Flera vägar har utvecklats för transplantation på möss; I stället för en intrafemoral injektion, som direkt introducerar mutanta donatorceller i benmärg5, har en intravenös injektion som använder venös sinusplexus, svansven och halsvenen använts i stor utsträckning för att generera murina AML-modeller 6,7,8,9. När det gäller retroorbital injektion (r.o.) har olika inneboende nackdelar, såsom volymbegränsning, hög teknisk efterfrågan, få chanser till upprepade försök eller fel och potentiella ögonskador, varit stora stötestenar med begränsade eller inga genomförbara alternativ7. Svansveninjektion kan ha liknande problem förutom lokala skador; För att underlätta proceduren måste möss ofta värmas upp för att utvidga svansvenerna10. Det är också svårt att lokalisera svansvenen utan en extra ljuskälla, särskilt i C57BL/6-stammen hos möss. För injektion av halsvenen kräver forskningspersonal tillräcklig utbildning för att lokalisera venen och begränsa eventuella komplikationer. Dessutom måste både venösa sinus- och halsveninjektioner utföras under anestesi, vilket ger en annan nivå av komplexitet. Därför är det frestande att utforska nya vägar för transplantation för att underlätta upprättandet av AML-murina modeller.
Intraperitoneal (i.p.) injektion används ofta för att administrera läkemedel, färgämnen och anestetika 11,12,13,14,15; Det har också använts för att introducera hematopoetiska celler för ektopisk hematopoes16 och för att transplantera benmärgshärledda mesenkymala stamceller i olika musmodeller 17,18,19,20,21. Det har dock sällan använts för att etablera hematopoetiska maligniteter hos möss, särskilt för att studera AML-sjukdomsprogression.
Den aktuella studien beskriver genomförbarheten av i.p. injektion i genereringen av AML-musmodeller, förutom att jämföra transplantationseffektiviteten hos härstamningsnegativa (Lin-) och Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) populationer som donatorceller. Dessa fynd ger ett enkelt och effektivt sätt att generera experimentella modeller av AML och relaterade myeloida leukemier. En sådan metod har potential att öka vår förståelse av sjukdomsmekanismerna samt ge en relativt enkel modell för att testa experimentella terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment godkändes i förväg av Institutional Animal Care and Use Committee vid Pennsylvania State University.
1. Beredning av buffertar och reagenser
- Förbered ampicillinkompletterade (AP) LB-agarplattor (sterila 10 cm plattor). För att göra detta, lösa upp 10 g LB-buljong med agar i 400 ml destillerat vatten, rör om och sätt volymen upp till 500 ml. Sterilisera lösningen genom autoklavering, låt sedan lösningen svalna, tillsätt 0,5 ml ampicillin (lager: 150 mg/ml) i lösningen och skaka den för att blanda. Tillsätt omedelbart 18 ml lösning till en steril 10 cm platta nära en alkohollampa, låt stelna i rumstemperatur och förvara plattorna upp och ner vid 4 °C tills vidare användning.
- Förbered LB-media genom att lösa 10 g LB utan agar i 500 ml destillerat vatten. Sterilisera lösningen genom autoklavering, låt lösningen svalna, tillsätt 0,5 ml ampicillin (lager: 150 mg / ml) i lösningen och skaka den för att blanda.
- Förbered flödesbuffert genom att tillsätta 5 ml penicillin / streptomycin och 10 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (hiFBS) i 485 ml 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
OBS: För att inaktivera FBS genom uppvärmning, placera tinade FBS-flaskor i ett 56 ° C vattenbad. Se till att flaskorna inte välter eller på annat sätt blir nedsänkta i vattenbadet. Temperaturen är avgörande för fullständig nedbrytning; För att säkerställa detta, vänta tills temperaturen stabiliseras vid 56 °C efter att flaskorna har satts i vattenbadet. Snurra försiktigt flaskorna var 10: e minut tre gånger. Låt inte serumet inkubera i mer än 30 minuter. - Förbered underhållsmedier genom att tillsätta 50 ml hiFBS, 5 ml L-glutamin och 5 ml penicillin / streptomycin i 440 ml Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM). Förbered transfektionsmedia genom att tillsätta 50 ml hiFBS och 5 ml L-glutamin i 445 ml DMEM-media.
- Förbered lysbuffert för röda blodkroppar (RBC) genom att tillsätta 4,145 gNH4Cl, 0,504 g NaHCO3 och 16,81 mg etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i 500 ml destillerat vatten. Bered ofullständig Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) media genom att tillsätta 75 ml hiFBS, 5 g bovint serumalbumin (BSA), 0,5 ml 10 mg / ml insulin, 2,5 ml 4 mg / ml holo-transferrin, 3,5 μL β-merkaptoetanol, 5 ml L-glutamin och 0,5 ml ciprofloxacin i 416,5 ml IMDM-media.
- Bered 10 ml 2x IMDM-media, i vilket koncentrationen av cytokiner är dubbelt så stor som i 1x IMDM-media, genom tillsats av 10 μL 50 ng/μL mr-SCF, 20 μL 25 ng/μL mr-Flt3L, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μL 10 mg/ml insulin, och 50 μl 4 mg/ml holotransferrin till 9,87 ml ofullständigt IMDM-medium.
OBS: Se till att flödesbuffert, RBC-lysbuffert, underhållsmedia, transfektionsmedia och ofullständiga IMDM-medier är filtersteriliserade före användning.
2. Plasmidtransformation
- Tina 20 μL α-Select kompetenta celler på is. Tillsätt 1 μL (~2 ng) MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plasmid22 till tinade kompetenta celler och blanda försiktigt genom att knacka på röret. Inkubera reaktionen på is i 30 minuter.
- Värmechocka blandningen genom inkubation i 40 s i ett 42 °C värmeblock. Överför omedelbart röret på is i 2 minuter.
- Tillsätt 1 ml LB-media (utan ampicillin) till röret och skaka vid 37 °C och 200 rpm i 1 timme.
- Centrifugera röret vid rumstemperatur vid 500 x g i 4 minuter och kassera 0,9 ml supernatant. Återsuspendera fällningen i återstående 0,1 ml LB-media.
- Sprid de transformerade kompetenta cellerna på förvärmda (37 °C) AP LB-agarplattor. Inkubera plattan upp och ner vid 37 °C i 12–16 timmar.
- Välj en enda koloni och förbruka de transformerade cellerna i 10 ml AP LB-media över natten vid 37 ° C och 200 rpm.
- Tillsätt 5 ml förbrukade transformerade kompetenta celler till 500 ml AP LB-media i en kolv och inkubera kolven över natten vid 37 °C och 200 rpm.
- Extrahera plasmiden med hjälp av en plasmidextraktionssats enligt tillverkarens anvisningar och suspendera i 0,5 ml autoklaverat ultrarent vatten. Kvantifiera plasmiden med hjälp av en spektrofotometer.
3. Transfektion av Phoenix Ecotropic (pECO) celler
- Kultur 2 x 106 pECO celler/platta i underhållsmedia i 10 cm plattor i en fuktad 5% CO2 inkubator vid 37 °C. Se till att pECO-cellerna hålls i exponentiell tillväxtfas och delar sig aktivt före passage.
- När cellerna blir 80% sammanflytande, tvätta plattorna med 5 ml DPBS två gånger, tillsätt 1 ml trypsin till plattan och inkubera i en fuktad 5% CO 2-inkubator vid 37 ° C i2 minuter. Skörda cellerna med 5 ml underhållsmaterial i ett sterilt 15 ml rör och centrifugera vid 4 °C och 400 x g i 3 minuter. Återsuspendera cellpelleten i 5 ml underhållsmedium.
- Blanda 10 μL cellsuspension och 10 μL trypanblått och fyll 10 μL på en hemocytometer för att räkna cellerna.
Totalt antal celler/ml = (Totalt antal räknade celler x utspädningsfaktor x 104 celler/ml)/ Antal räknade rutor)
Ympa 2 x 10 6 celler/skål i6 cm skålar med 5 ml underhållsmedium för transfektion och odla cellerna i en fuktad 5 % CO2-inkubator vid 37 °C. - Byt ut underhållsmediet med 5 ml transfektionsmedia när cellerna blir 50% -60% sammanflytande efter 18 timmars odling.
- Förvara transfektionsreagenset vid rumstemperatur i minst 30 minuter före transfektion.
- Tillsätt 5,5 μg MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plasmid22 till 0,5 ml vanligt DMEM-medium i ett sterilt 1,5 ml rör. Blanda den försiktigt genom att knacka på tuben och låt den sitta i 10 min.
- Tillsätt 14,6 μl (3x plasmidmängden; v/w) transfektionsreagens till röret och knacka försiktigt på röret var 10:e minut tre gånger.
- Tillsätt blandningen jämnt droppvis till alla delar av diskarna med pECO-cellerna i transfektionsmedia. Flytta försiktigt diskarna framåt och bakåt 10 gånger och i sidled 10 gånger. Inkubera disken i en fuktad 5% CO2-inkubator vid 37 °C i 48 timmar.
- Mät transfektionseffektiviteten genom florescensmikroskopi och flödescytometri för grönt fluorescerande protein (GFP) enligt beskrivningen i22. Cellerna är först gated på FSC-A / FSC-H och FSC-A och SSC-A för att förvärva singlets. GFP+ -populationen är gated på FL1-diagrammet genom att jämföra den med icke-transfekterade celler.
- Samla upp och filtrera supernatanterna genom ett 0,45 μm sprutfilter till ett sterilt 50 ml rör. Använd supernatanterna omedelbart för transduktion eller snäppfrys dem i flytande kväve och förvara dem vid -80 °C tills vidare användning.
OBS: pECO-celler måste blandas ordentligt och sås i skålar jämnt. Låt cellerna spridas genom att flytta diskarna framåt och bakåt 10 gånger och i sidled 10 gånger under sådd. Cellnumret som ska seedas kan variera beroende på variationerna i räkningen. För att hitta det optimala såddcellantalet som kan uppnå 50% -60% sammanflöde efter 18 timmars odling är såddceller med seriella utspädningar till hjälp.
4. Lentiviral transduktion
- Avliva 8-10 veckor gamla CD45.1 kvinnliga C57BL6 / J-möss (två till tre donatormöss per mottagarmus) i en CO2-kammare .
- Sterilisera hela kroppen av mössen med 70% etanol. Placera mössen på en steril kirurgisk kudde på en frigolitbräda och stift benen genom mustasspuddarna.
- Skär huden ovanför bukhålan vid mittlinjen och vidga det subkutana utrymmet mot bakbenen med en steril sax med skarpa ändar.
- Förläng snittet från bukens mittlinje ner till anklarna. Bredda det subkutana utrymmet under bakbenen med knivarna på sterila saxar med skarpa ändar.
- Skär akillessenen med steril sax med skarpa ändar. Håll senan med pincett med tänder och skär den andra änden fäst vid lårbenet för att ta bort gastrocnemiusmuskeln.
- Klipp quadriceps-senan fäst vid knäet med steril sax med skarp ände. Håll senan med pincett med tänder och skär muskelhuvudena fästa vid lårbenet för att ta bort gastrocnemiusmuskeln.
- Skär de andra musklerna som omger lårbenet i änden fäst vid skenbenet med steril sax med skarpa ändar.
- Klipp fotleden med steril sax med skarpa ändar, se till att skenbenet förblir intakt. Håll den distala änden av lårbenet med pincett med tänder och skär höftleden med steril sax med skarpa ändar, så att lårbenshuvudet förblir intakt.
- Överför skenbenet och lårbenet till flödesbuffert i ett sterilt 15 ml rör.
- Separera skenbenet och lårbenet genom att bryta knäet för hand. Ta bort patella, brosk och femorala kondyler för att exponera tibialplatån och distala lårbenet för hand. Ta bort musklerna med en steril gasbindning och blötlägg sedan benen i flödesbuffert.
- Skär lårbenshalsen och spola benmärgscellerna med flödesbuffert från båda ändarna av lårbenet med en 10 ml spruta med en 23 G nål.
- Skär tibial malleolus och spola benmärgscellerna med flödesbuffert från båda ändarna av skenbenet med en 10 ml spruta med en 23 G nål.
- Sprid cellerna genom att pipettera upp och ner med en 10 ml spruta med en 18 G nål. Centrifugera encellssuspensionen vid 4 °C och 400 x g i 3 minuter.
- Kassera supernatanten och suspendera cellerna igen i 5 ml RBC-lysbuffert för att lysera RBC:erna i 3 minuter.
- Tillsätt 5 ml flödesbuffert för att stoppa lysen och centrifugera cellsuspensionen vid 4 °C och 400 x g i 3 minuter.
- Placera en 70 μm cellsil på ett sterilt 50 ml rör. Upphäng pelleten med 5 ml flödesbuffert, blanda och passera genom cellsilen för att samla cellerna.
- Justera cellkoncentrationen med flödesbuffert till 1 x 108 / ml i polypropenrör med rund botten.
- Välj Linceller med hjälp av en hematopoetisk cellisoleringssats för möss enligt tillverkarens anvisningar.
- Håll undan tre rör med 1 x 104 celler i 100 μL buffert för en ofärgad kontroll och två enkla antikroppsfärgade kontroller för APC-konjugerad anti-mus CD117 (c-Kit) och PE-Cy7-konjugerad anti-mus Ly-6A / E (Sca-1). Använd 1 μl antikropp (från 0,2 mg/ml lager) för var och en av de enskilda antikroppsfärgade kontrollerna.
- Färga resten av cellerna i ett rör med båda antikropparna (4 μL av vardera från 0,2 mg/ml lager) i 400 μl. Inkubera rören på is i mörker i 0,5-1 h.
- Efter färgning, tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml flödesbuffert och centrifugera vid 4 °C och 400 x g i 3 minuter.
- Resuspendera cellerna för den ofärgade kontrollen och de enskilda antikroppsfärgade kontrollerna i 100 μL flödesbuffert. Resuspendera dubbla antikroppsfärgade celler i 1 ml flödesbuffert för sortering.
- Sortera hematopoetiska stamceller (HSC) som en LSK-population med hjälp av en cellsorterare som beskrivs i23,24.
- Under färgning, täck en steril 6 cm skål med retronektin enligt följande: Bered 100 μg/ml lager retronektin i PBS och tillsätt 0,9 ml PBS och 0,1 ml retronektin till en 6 cm skål. Täck skålen i en steril huva vid rumstemperatur i 2 timmar. Ta sedan bort retronektinet och blockera skålen med 0,5 ml filtrerad 2% BSA (i PBS) i 30 minuter. Tvätta skålen med 5 ml PBS två gånger och skålen är klar för transduktion.
- Centrifugera de sorterade HSC:erna eller osorterade lincellerna vid 4 °C och 400 x g i 3 minuter och suspendera på nytt i 3 ml 2x (cytokiner) IMDM-media och 3 ml viral supernatant (genererad från steg 3.10) i en retronektinbelagd skål. Inkubera skålen i en fuktad 5 % CO2-inkubator vid 37 °C i 6 eller 24 timmar.
OBS: I den aktuella studien var Lin- celler antingen sorterade eller osorterade beroende på experimentell design.
5. Seriell transplantation (figur 1)
OBS: Primära mottagarmöss var 8-10 veckor gamla manliga C57BL6 / J-möss (CD45.2). De fick vatten ad libitum innehållande antibiotika för att förhindra opportunistiska matsmältningsinfektioner, från 3 dagar före transplantation till 7 dagar efter transplantation. Primära mottagarmöss bestrålades subletralt (4,75 Gy) 3 timmar före transplantation25. Isofluran applicerades inte på möss med intraperitoneal injektion.
- Efter transduktion i 6 eller 24 timmar, skörda cellerna genom centrifugering vid rumstemperatur och 400 x g i 3 minuter. Använd trypsin för att samla cellerna som är fästa vid skålbotten om det behövs. Kassera supernatanten och suspendera cellerna igen i förvärmd PBS. Bestäm volymen av PBS beroende på antalet mottagare (dvs. 0,1 ml / mus och 0,5 ml / mus för mottagare med retroorbitala respektive intraperitoneala injektioner).
- Placera de subletärt bestrålade mottagarmössen i en isoflurankammare (syreflödet är inställt på 1,0 l/min och förångaren av isofluran är satt till 5%). Applicera våt salva i ögonen för att förhindra torrhet under anestesi. Mössen är redo för ytterligare procedurer när hjärtslaget sjunker till 60 slag per minut.
- Injicera celler i primära mottagarmöss retroorbitalt (0,1 ml/mus)7 eller intraperitonealt (0,5 ml/mus)26 med en 27 G1/2 nål. Observera mössen kontinuerligt tills de får tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal liggande. Övervaka mössen dagligen för deras välbefinnande efter transplantation.
- Efter 1 månad, samla blod varje vecka genom retroorbital blödning för att övervaka leukocytos genom att utvärdera fullständig blodstatus (CBC) på en hemavet som beskrivs nedan.
- Placera musen i sidled efter anestesi med isofluran (syreflödet är inställt på 1,0 l/min och förångaren av isoflurans är satt till 5%). Mössen är redo för ytterligare procedurer när hjärtslaget sjunker till 60 slag per minut.
- Proptosera ögat med tummen och pekfingret. Penetrera venös sinus plexus med asteril hemacrit kapillärrör genom den inre canthusen.
- Samla 20-25 μL blod i ett EDTA-bloduppsamlingsrör och stäng ögonlocken för att stoppa blödningen. Applicera en droppe gentamicinsulfat oftalmisk lösning på ögat.
- Vid slutpunkten, när de vita blodkropparna (WBC) når 4 x 10 4 celler / μL, avliva musen i en CO2-kammare och isolera benmärgscellerna genom att spola lårbenen och skenbenet med flödesbuffert, följt av RBC-lys som nämnts i steg4.
- Vid slutpunkten, skörda splenocyterna enligt nedan.
- Avliva musen i en CO2-kammare . Placera mössen på en steril kirurgisk kudde på en frigolitbräda och stift benen genom mustasspuddarna. Sterilisera hela kroppen av mössen med 70% etanol.
- Skär huden och muskeln vid mittlinjen för att exponera bukhålan med steril sax med skarpa ändar. Isolera mjälten med steril sax med skarpa ändar och lägg den i flödesbuffert i ett sterilt 15 ml rör.
- Mesh mjälten genom en 70 μm steril sil i en 6 cm skål med 3 ml flödesbuffert. Överför cellerna från skålen till ett sterilt 15 ml rör och centrifugera encellssuspensionen vid 4 °C och 400 x g i 3 minuter.
- Kassera supernatanten och suspendera cellerna igen i 5 ml RBC-lysbuffert för att lysera RBC:erna i 3 minuter. Tillsätt 5 ml flödesbuffert för att stoppa lysen och centrifugera cellsuspensionen vid 4 °C och 400 x g i 3 minuter.
- Placera en 70 μm cellsil på ett sterilt 50 ml rör. Upphäng pelleten med 5 ml flödesbuffert, blanda och passera genom cellsilen för att samla celler.
- Identifiera primära (1 °) AML-celler genom att färga splenocyterna och benmärgscellerna med FITC-konjugerad anti-mus CD45.1-antikropp och detektera på en flödescytometer. Cellerna är först gated på FSC-A / FSC-H och FSC-A och SSC-A för att förvärva singlets. CD45.1 + -populationen är gated på FL1-diagrammet genom att jämföra den med ofärgade celler.
- För sekundär (2°) transplantation, resuspendera CD45.1 AML-mjältceller från 1° r.o.-mottagare i PBS (0,1 ml/mus) och injicera dem retroorbitalt i CD45.2 manliga C57BL6/J-möss. Parallellt, resuspendera AML-mjältceller från 1 ° i.p. mottagare i PBS (0,5 ml / mus) och injicera dem intraperitonealt i 8-12 veckor gammalt rött fluorescensprotein (RFP) -uttryckande Ai14TdTomato hanmöss27.
- Vid tertiär (3°) transplantation, resuspendera AML-celler isolerade från benmärgen eller bukhålan hos 2° i.p. mottagare och injicera dem intraperitonealt i Ai14TdTomato (RFP+) respektive CD45.2-möss. Resuspendera AML-celler isolerade från bukhålan hos 2° r.o. mottagare och transplantera dem genom r.o. injektion i Ai14TdTomato (RFP+) möss.
OBS: För 2 ° transplantation identifierade vi sjukdomsprogressionen hos 2 ° mottagare genom att övervaka CBC i perifert blod. För att ytterligare bekräfta etableringen av AML samlade vi in helt perifert blod genom hjärtpunktion samt benmärg, mjälte och lever. Dessutom utförde vi i.p. lavage för att samla in ip-celler. Encellssuspensioner förvärvades från benmärg, mjälte och i.p. sköljning som beskrivits ovan. Celler från dessa platser analyserades på en flödescytometer efter RBC-lys. AML-celler erkändes som RFP-negativa (RFP-) celler. För 3 ° transplantation provtog vi blod, benmärg, mjälte, lever och ip-celler vid slutpunkten; RFP- eller CD45.1+ celler identifierades som AML-celler och undersöktes med flödescytometri. Ingen bestrålning eller antibiotikavatten gavs till 2° och 3° mottagarmöss.
Figur 1: Schematisk bild av MLL-AF9-virustransduktion i benmärgs HSC och serietransplantation (1°, 2° och 3°). Sortering av Sca-1 och c-Kit dubbel positiv population med hjälp av en cellsorterare som visas i den prickade skuggrutan anses vara valfri, om resurserna tillåter det. Figuren skapades med BioRender (https://biorender.com/). Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Intra-peritoneal sköljning
- Injicera 5 ml ofullständigt IMDM-medium i bukhålan två gånger för att samla cellerna i ett 15 ml sterilt rör. Centrifugera cellsuspensionen vid rumstemperatur och 400 x g i 3 minuter. Transplantera AML-celler (4 x 105 celler/mus) från bukhålan hos 2° mottagare via i.p. injektion i 3° CD45.2 mottagarmöss (n = 3).
7. Histologisk analys 28
- Isolera mjälte, lever och lårben från möss vid eutanasi. Fixa dem i 5 ml 10% (v / v) buffrat formalin. Prova mjälte och lever från friska motsvarigheter för jämförelser.
- Bädda in fasta vävnader i paraffin och skär dem i sektioner. Färga sektionerna med hematoxylin och eosin (H &E) färgämnen.
- Hämta bilderna under ett mikroskop med 20x förstoring installerat med en kompatibel programvara för histologisk analys.
8. Utföra semikvantitativ PCR (qPCR)
- Förbered RNA i RNA-reagens enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd 0,5-1,0 μg RNA för att syntetisera cDNA med användning av ett cDNA omvänd transkriptionssats enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd cDNA för att utföra qPCR med ett qPCR-kit och kör exemplen i ett qPCR-system. Använd följande förvaliderade TaqMan-prober: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 och 18S ribosomalt RNA (Hs99999901_s1).
- Ladda KMT2A- och 18S-amplicons på en 2% agarosgel för att visualisera uttrycket. Hämta bilder i en imager installerad med det kompatibla programmet.
9. Behandling av uppgifter
- Analysera resultat med hjälp av statistisk analysprogramvara och presentera resultaten som medelvärde ± SEM. Generera siffror med hjälp av ett kommersiellt illustratörsverktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jämförelse av transplantationseffektiviteten hos murina AML-celler med hjälp av r.o. och i.p. transplantationsvägar
Tidigare rapporterades etablering av 1° AML hos mottagarmöss retroorbitalt transplanterade med MLL-AF9-transducerade LSK-celler, och transplanterbarheten hos 1° AML-celler visades genom serietransplantation30. Den aktuella studien är den första som utvärderar möjligheten att använda benmärgs linceller för att utföra transplantation. Förekomsten av avvikande leukocytos (figur 2A) och ökad infiltration av leukemiska celler (CD45.1+) i benmärg och mjälte (figur 2B) stöder möjligheten att använda benmärgs linceller för att generera 1 ° AML. För att jämföra sjukdomsinduktionsperioden avlivades två donatormöss per mottagare för att isolera antingen LSK- eller Lin-celler. Från resultaten observerades inga signifikanta skillnader hos 1° mottagare transplanterade med LSK eller Lin-celler (Figur 2C).
Under undersökningen av metastaser av 1° AML upptäcktes att AML-cellerna sprids i bukhålan hos 1° mottagare av MLL-AF9-transducerade linceller (kompletterande figur 1). Detta fynd inspirerade undersökningen för att testa om i.p. injektion kunde antas vid generering av murin AML, vilket kan fungera som en ny och enklare transplantationsväg. På grund av framgången med att använda benmärgs Lin-populationen som AML-donatorceller, bekräftade aktuella data etableringen av 1 ° AML via i.p. injektion av MLL-AF9-transducerade benmärgslinceller, vilket ses i form av leukocytos (figur 2D) och närvaron av AML-celler (CD45.1+) i benmärgen och mjälten hos mottagarmöss (figur 2E). Transplantation via intravenös injektion tog dock längre tid att utveckla AML än via r.o.-injektion, trots att mottagarna fick lika många donatorceller (figur 2F). Dessutom verkade möss transplanterade retroorbitalt med fler Lin-celler (5,125 x 10 6 celler/mus) i figur 2F utveckla AML snabbare än de som transplanterades med färre Lin-celler (3,69 x 106 celler/mus) i figur 2C.
På grund av den inneboende inkonsekvensen i inkubationstiden hos 1° AML-mottagare (figur 2F) gjordes ett försök att testa den i.p. transplantationen hos 2° mottagare. För 2° transplantation utfördes intra injektion med 8 x 105 AML-celler isolerade från intraperitonealt transplanterade 1° mottagare. De 2° mottagarna visade leukocytos (figur 2G) och signifikant hepatosplenomegali (figur 2H) mindre än 1 månad efter transplantation, en tydlig utveckling från 1° transplantation. I överensstämmelse med denna observation detekterades AML-celler (RFP-) också i perifert blod, benmärg och mjälte (figur 2I), liksom i bukhålan (kompletterande figur 1). Dessutom bekräftade uttrycket av onkogenen KMT2A i blod, mjälte och lever hos 2 ° -mottagare också den framgångsrika generationen av AML (figur 2J). Dessutom visade histologisk analys ytterligare infiltrationen av leukemiska celler i mjälten och levern hos intraperitonealt transplanterade möss (figur 2K). Dessa data bekräftar att i.p. injektionsgenererade 1° AML-celler är transplanterbara i 2° mottagare. Dessutom uppnådde i.p. injektion av 8 x 10 5 AML-celler per mus i mottagare jämförbar engraftment med r.o. injektion av 8 x 105 AML-celler per mus i mottagare (figur 2L).
En av de viktigaste egenskaperna hos LSC är seriell transplanterbarhet; Således, för att ytterligare fastställa etableringen av AML hos 2 ° -mottagare, försökte detta protokoll verifiera om AML-celler från 2 ° i.p. transplantation förblev seriellt transplanterbara, liksom genomförbarheten av stamcellstransplantation genom i.p. injektion vid 3 ° transplantation. AML-celler isolerade från antingen benmärg (8 x 10 5 leukemiska celler/mus i 0,5 ml PBS) eller i.p. sköljning (4 x 10 5 leukemiska celler/mus i0,5 ml PBS) av 2° mottagare injicerades i 3° mottagare. Även om de transplanterades med donatorceller genererade från olika källor, uppvisade 3 ° mottagarmöss akut AML-tecken (inom 3 och 4 veckor för benmärgsceller respektive ip-celler), inklusive leukocytos (figur 3A) och hepatosplenomegali (figur 3B), närvaron av leukemiska celler i blodet, benmärgen och mjälten (figur 3C) och uttrycket av KMT2A (figur 3D ). Histologisk observation av lårbenet och mjälten visade vidare infiltration av leukemiska celler (figur 3E). Som en jämförelse var r.o. injektion av leukemiska splenocyter (4 x 105 celler) från 2 ° mottagare också lika kapabel att transplantera och utveckla AML hos 3 ° mottagare, kännetecknad av leukocytos (kompletterande figur 2A), hepatosplenomegali (kompletterande figur 2B) och infiltration av AML-celler i blodet, benmärgen och mjälten (kompletterande figur 2C).
Intraperitoneal transplantation är effektiv även för 3° transplantation av AML-celler
Jämfört med 2° och 3° transplantationerna kunde man lätt dra slutsatsen att 3° transplantation (figur 3F) framskred mycket snabbare än 2° transplantation (figur 2L) för både i.p. och r.o. injektioner. I synnerhet utvecklade i.p. injektion av 4 x 105 AML-celler/mus AML senare än r.o. injektion av samma antal AML-celler i 6 dagar (figur 3F), vilket möjligen indikerar den tid som spenderas på migreringen från bukhålan till benmärgsnischen. Intressant nog föreslog den höga frekvensen av leukemiska celler i bukhålan (kompletterande figur S2) i de 3 ° transplanterade mössen att bukhålan också kan ge nischen för snabb expansion av leukemiska celler. Dessutom indikerade närvaron av leukemiska celler i bukhålan hos 1 ° och 3 ° mottagare transplanterade retroorbitalt den ömsesidiga cirkulationen av leukemiska celler mellan bukhålan och blodsystemet, vilket motiverade ip-transplantationen. Sammantaget validerar dessa fynd användningen av intravenös injektion vid serietransplantation av AML.
Figur 2: Generering av murin AML-modell vid 1° och 2° transplantation. (A) Fullständig blodstatus (CBC; 1 x 10 3 celler/μl blod), WBC, neutrofil (NE), lymfocyt (LY), monocyt (MO), eosinofil (EO) och basofil (BA) profil hos 1° mottagarmöss transplanterade retroorbitalt med MLL-AF9-transducerade benmärgslinceller (5,125 x 106 celler/mus) av hemavet (n =3). (B) Flödescytometrisk analys av frekvensen av AML-celler (CD45.1+) i benmärgen och mjälten hos 1° CD45.2-mottagarmöss transplanterade retroorbitalt med MLL-AF9-transducerade benmärgs-Lin- (5,125 x 106 celler/mus) celler (n = 3). (C) Inkubationstid på 1° AML hos mottagare transplanterade retroorbitalt med MLL-AF9-transducerade benmärgs LSK-celler (3,16 x 105 celler/mus isolerade från två donatorer, n = 4) eller Linceller (3,69 x 106 celler/mus isolerade från två givare, n = 3). Varje mottagare fick celler isolerade från två givare. (D) CBC-analys av 1° mottagarmöss transplanterade intraperitonealt med MLL-AF9-transducerade benmärgslinceller (5,125 x 106 celler/mus) med hemavet (n = 4). (E) Flödescytometrisk analys av frekvensen av AML-celler (CD45.1+) i benmärgen och mjälten hos 1° CD45.2-mottagarmöss transplanterade intraperitonealt med MLL-AF9-transducerade benmärgslinceller (5,125 x 106 celler/mus, n = 3). (F) Inkubationstid på 1° AML hos mottagare transplanterade retroorbitalt (n = 3) eller intraperitonealt (n = 3) med MLL-AF9-transducerade benmärgslinceller. Varje mottagare fick samma mängd donatorceller (5,125 x 106 celler/mus). (G) CBC-analys av 2° mottagare transplanterade intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isolerade från mjälten med 1° i.p. transplanterade mottagare med hemavet (n = 3). H) Mjältens och levervikterna hos 2° mottagarmöss transplanterade intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isolerade från mjälten hos 1° i.p. transplanterade mottagare. De skuggade områdena representerar de normala viktintervallen för mjälte och lever. Representativ bild av mjälte och lever från 2° mottagarmöss och friska motsvarigheter. (I) Flödescytometrisk analys av frekvensen av AML-celler (RFP-) i blod, benmärg och mjälte hos 2° RFP+-mottagarmöss transplanterade intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isolerade från mjälten hos 1° i.p. transplanterade mottagare (n = 3). (J) Genuttryck av KMT2A och 18S presenterat som ett DNA-band. RNA isolerades från blod, benmärg, mjälte och lever hos 2° mottagarmöss transplanterade intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isolerade från mjälten hos 1° i.p. transplanterade mottagare. (K) Representativa bilder av histologiska förändringar i mjälten (vänster panel) och lever (höger panel) hos 2° mottagare transplanterade intraperitonealt med AML-celler (8 x 105 celler/mus) isolerade från mjälten hos 1° i.p. transplanterade mottagare och friska motsvarigheter. (L) Inkubationstid på 2° AML hos mottagare som transplanterats retroorbitalt (4 x 10 5/mus, n = 9) eller intraperitonealt (8 x 105/mus, n = 4) med AML-celler isolerade från 1° r.o. respektive i.p. transplanterade mottagare. Resultaten är medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: 3° transplantation av AML-celler via i.p. transplantation. (A-E) 3° RFP+- eller CD45.2-mottagarmöss. Vänster: i.p. injektion av AML-celler (8 x 105 celler/mus) från benmärgen hos 2° mottagare. Höger: i.p. injektion av AML-celler (4 x 105 celler/mus) från bukhålan (i.p.) hos 2° mottagare (n = 3). (A) CBC-analys av 3° mottagarmöss med hemavet. B) Mjältens och leverens vikt (mg) hos möss med 3° mottagare. De skuggade områdena representerar mjältens och leverens normala viktintervall. (C) Flödescytometrisk analys av frekvensen av AML-celler (vänster: RFP-; höger: CD45.1+) i blod, benmärg och mjälte hos 3° mottagarmöss. (D) Genuttryck av KMT2A och 18S presenterat som ett DNA-band. RNA isolerades från blod, benmärg, mjälte och lever hos 3 ° mottagarmöss. (E) Representativa bilder av histologiska förändringar i mjälten (vänster panel) och lårbenet (höger panel) hos möss med 3° mottagare. (F) Inkubationstid på 3° AML hos mottagare transplanterade retroorbitalt (4 x 10 5 celler/mus, n = 3) eller intraperitonealt (4 x 105 celler/mus, n = 3) med AML-celler isolerade från 2° r.o. respektive i.p. transplanterade mottagare. Resultaten är medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Flödescytometrisk analys av AML-cellinfiltration i bukhålan. Frekvens av AML-celler i peritonealsköljningen hos 1° mottagare transplanterade retroorbitalt (1° RO, n = 2), 2° mottagare transplanterade intraperitonealt (2° IP, n = 2) och 3° mottagare transplanterade via i.p. injektion med benmärgs AML-celler (3° BM-IP, n = 3) och i.p. AML-celler (3° IP-IP, n = 3), samt 3° mottagare transplanterade via r.o. injektion av AML-splenocyter (3° SP-RO, n = 3). Resultaten är medelvärde ± SEM. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: 3° transplantation av AML-splenocyter via r.o. injektion. (A) CBC-analys av 3° mottagarmöss retroorbitalt transplanterade med AML-celler (4 x 105 celler/mus) från mjälten hos 2° mottagarmöss. B) Mjältens och levervikterna av 3° retroorbitalt transplanterade mottagarmöss. De skuggade områdena representerar mjältens och leverens normala viktintervall. (C) Frekvens av AML-celler (RFP-) i blod, benmärg och mjälte hos 3° retroorbitalt transplanterade mottagarmöss (n = 3). Resultaten är medelvärde ± SEM. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dessa ovan beskrivna studier ger stödjande bevis för att transplantationen av linceller är jämförbar med LSK-celler vid generering av 1° murin AML. Dessutom visar aktuella data också att intravenös (eller r.o.) injektion är en effektiv och bekväm metod för att fastställa murin AML jämfört med intravenös (eller r.o.) injektion.
Förutom LSK-celler har andra populationer såsom granulocytmonocytprogenitor (GMP), vanlig lymfoid stamfader (CLP) och vanlig myeloisk stamfader (CMP) rapporterats ersättas som donatorceller vid generering av 1° MLL-AF9-inducerad AML med olika inkubationstider31,32, även om kvantitativ jämförelse saknas för att föreslå det optimala valet. I den aktuella studien hade Lin- och LSK isolerad från samma donatormöss ingen uppenbar skillnad i genereringen av 1° MLL-AF9-inducerad AML, eftersom transducerade myeloida stamceller (Sca-1-) kunde initiera AML33. Med tanke på kostnaden och tiden som krävs för flödescytometribaserad sortering av LSK-populationen, stöder dessa studier användningen av Lin-populationen som donatorceller för 1°-transplantation. Således är stegen från 4.19 till 4.23 i detta protokoll inte nödvändiga men valfria och påverkar inte slutresultatet.
När det gäller mängden donatormöss vid 1 ° transplantation kunde en donator tillhandahålla ~ 1,0 till 1,5 x 105 LSK-celler, och en mottagare transplanterad med denna mängd LSK-celler utvecklade 1 ° AML på cirka 4 månader. Att öka antalet givare för att bygga upp LSK-celler upp till ~ 3 x 105 celler per mottagare kan dock förkorta inkubationstiden till ~ 70 dagar. Således bör två givare räcka för att snabbt generera 1 ° AML. Denna princip gäller även linceller , där ~1,0 till 2,5 x 106 Linceller kan isoleras från varje donatormus. Men när donatorcelltätheten ökades var behandlingstiden för leukemogenes betydligt kortare. Dessa data bör beaktas vid beslut om antalet donatormöss i steg 4.1.
Jämfört med r.o. injektion tog i.p. injektion cirka ~ 20 dagar att utveckla den fullblåsta 1 ° AML, men denna begränsning övervanns genom att öka donatorcellerna för i.p. injektion. Trots en sådan uppenbar skillnad visade båda metoderna liknande engraftmenthastighet (>80%) i benmärgen och mjälten vid slutpunkten, vilket indikerar den allmänna tillämpligheten av i.p. injektion vid 1° transplantation vid AML. Den relativt långa inkubationstiden för 1° transplantation, liksom dess oförutsägbara sjukdomsprogression när det gäller inkonsekvens av latens hos mottagarmöss, är en stor begränsning för kontrollerade experiment, såsom farmakologiska ingrepp och mekanistiska studier. Det rekommenderas därför att använda 1° leukemiceller för transplantation vid efterföljande serietransplantationer, vanligtvis 2° transplantation (figur 1). Eftersom upp till 3 x 108 leukemiska celler i mjälten (och 6 x 107 celler i benmärgen) kan genereras från varje enskild 1 ° mottagare vid slutpunkten, vilket skulle vara tillräckligt för att genomföra 2 ° transplantation på mer än 300 möss, föreslås att transplantera så många celler som möjligt till färre mottagare för att förkorta latensen och öka engraftmenthastigheten för 1 ° transplantation, vilket är viktigt för steg 4.1 och steg 5.2.
Med tanke på dess konsekventa och korta latens kan 2 ° transplantation användas i flera applikationer, inklusive in vivo-experiment som nämns ovan. Dessutom underlättar i.p. injektion också proceduren för riklig transplantation för oerfarna tekniker. Jämfört med r.o. injektionsvägen, som i allmänhet genererar AML på 3 veckor, tog i.p. injektionsmetoden något längre tid (~ 4 veckor) med samma antal donatorceller för att etablera en fullblåst AML. Även om det är relativt lättare och bekvämare, kan ökning av antalet transplanterade celler eller utförande av tertiär transplantation också påskynda utvecklingen av AML genom intravenös injektion.
Sammanfattningsvis är den största begränsningen med denna teknik den längre inkubationstiden än intravenös injektion med samma mängd donatorceller i både 1° och 2° transplantationer. Det kan emellertid lätt övervinnas genom att öka cellantalet som ska transplanteras. Förutom de uppenbara fördelarna har denna teknik också några andra tillämpningar. Till exempel kan förmågan att använda i.p. transplantationsmetoder också tjäna till att rutinmässigt odla dessa celler utan behov av dyra in vitro-odlingsmedier . För att utöka tillämpningen av denna teknik i andra hematologiska maligniteter, såsom lymfoid leukemi och kronisk myeloisk leukemi, och patient-härledda xenotransplantat, måste ytterligare studier göras i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar Huck Institute's Flow Cytometry Core Facility och Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Pennsylvania State University, för att ge snabb teknisk support. Detta arbete stöddes av bidrag från American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA-projekt 4771, anslutningsnummer 00000005 till K.S.P. och RFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
