Summary
本协议描述了利用甲酸铵在QuEChERS中进行相分配，以及气相色谱-质谱法，以成功测定土壤样品中的有机氯农药残留。
Abstract
目前，QuEChERS方法代表了全球使用最广泛的样品制备方案，用于分析官方和非官方实验室中各种基质中的农药残留。使用甲酸铵的QuEChERS方法以前已被证明与原始版本和两个正式版本相比是有利的。一方面，每克样品只需添加0.5 g甲酸铵，就足以诱导相分离，实现良好的分析性能。另一方面，甲酸铵减少了常规分析中的维护需求。本研究采用改进的甲酸铵QuEChERS方法同时分析农业土壤中的有机氯农药（OCP）残留。具体而言，将10 g样品用10 mL水水合，然后用10 mL乙腈萃取。接下来，使用5g甲酸铵进行相分离。离心后，上清液用无水硫酸镁、伯仲胺和十八烷基硅烷进行分散固相萃取净化步骤。采用气相色谱-质谱联用法进行分析。使用甲酸铵的QuEChERS方法被证明是从土壤样品中提取OCP残留物的成功替代方案。
Introduction
增加粮食产量的需要导致过去几十年中全球大量广泛使用杀虫剂。农药被施用于作物以保护它们免受害虫侵害并提高作物产量，但它们的残留物通常最终会进入土壤环境，尤其是在农业地区1.此外，一些农药，如有机氯农药（OCPs），具有非常稳定的结构，因此它们的残留物不易分解，并在土壤中长期存在2。通常，土壤具有很高的农药残留积累能力，特别是当其有机质含量高时3。因此，土壤是受农药残留污染最严重的环境隔间之一。例如，迄今为止的一项完整研究发现，来自欧盟各地的 317 种农业土壤中有 83% 被一种或多种农药残留物污染4。
农药残留造成的土壤污染可能会通过食物链影响非目标物种、土壤功能和消费者健康，因为残留物具有高毒性5，6。因此，评估土壤中的农药残留对于评估其对环境和人类健康的潜在负面影响至关重要，特别是在发展中国家，因为缺乏对农药使用的严格规定7。这使得农药多残留分析变得越来越重要。然而，由于干扰物质数量多，浓度低，物理化学性质多样，土壤中农药残留的快速准确分析是一项艰巨的挑战4。
在所有农药残留分析方法中，QuEChERS方法已成为最快、最简单、最便宜、最有效、最稳健和最安全的选择8。QuEChERS方法包括两个步骤。第一步，通过水层和乙腈层之间的盐析进行基于分配的微尺度萃取。在第二步中，采用分散固相萃取（dSPE）进行清洁过程;该技术使用少量的几种多孔吸附剂组合来去除基质干扰成分，并克服了传统SPE9的缺点。因此，QuEChERS是一种环保的方法，溶剂/化学品几乎没有浪费，可提供非常准确的结果，并最大限度地减少随机和系统错误的潜在来源。事实上，它已成功应用于数百种农药的高通量常规分析，在几乎所有类型的环境、农业食品和生物样品中都具有很强的适用性8，10。这项工作旨在应用和验证QuEChERS方法的新修改，该方法先前开发并与GC-MS偶联以分析农业土壤中的OCP。
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Protocol
1. 储备溶液的制备
注意：建议在整个实验方案期间佩戴丁腈手套、实验室外套和安全眼镜。
- 在 25 mL 容量瓶中以 2，000 mg/L 的 OCP 商业混合物（参见 材料表）制备 400 mg/L 的丙酮储备溶液，加入己烷：甲苯 （1：1） 中。 表 1 显示了每个选定的 OCP。
- 在10 mL容量瓶中制备浓度为50 mg / L，1 mg / L和0.08 mg / L的丙酮后续储备溶液，并将其储存在-18°C的琥珀色玻璃小瓶中。
注意：可以在整个工作中使用相同的溶液，但重要的是在每次使用后立即将它们存放在这些条件下。 - 在10 mL容量瓶中制备浓度为20 mg / L和0.4 mg / L的丙酮储备溶液，浓度为4，4'-DDE-d8，丙酮溶液为100 mg / L，并储存在-18°C的琥珀色玻璃小瓶中。 使用 4，4'-DDE-d8 作为内标 （IS）。
2. 样品采集
- 在玻璃容器中收集约0.5公斤农业土壤的上层10厘米。本研究的土壤对象是在马铃薯作物的传统农业区采集的。
注意：用刮刀进行表面取样。然而，土壤的深度会影响其物理化学特性。因此，如果有机碳含量随深度变化，则需要在不同深度取样。 - 将土壤样品带到实验室，用直径为1毫米的筛子过筛，并将其储存在琥珀色玻璃容器中直到4°C分析。
注意：相同的土壤样品可以在整个工作中使用，但重要的是在每次使用后将其储存在这些条件下。
3. 使用甲酸铵通过改进的QuEChERS方法 制备 样品
注意： 图1 显示了修改后的QuEChERS方法的示意图。
- 在 50 mL 离心管中称取 10 g 土壤样品，并以 20 mg/L 加入 50 μL 的 IS 溶液，得到 100 μg/kg。出于回收目的，还加入步骤1.2中制备的农药溶液，以产生10μg/ kg，50μg/ kg和200μg/ kg（每个n = 3）。
- 使用涡旋摇动试管30秒，以更好地将尖峰整合到样品中。
- 加入 10 mL 水。使用自动摇床以10 x g 摇动试管5分钟。
- 加入 10 mL 乙腈。再次以10× g 摇动试管5分钟。
- 加入5g甲酸铵（见 材料表），用手剧烈摇动试管1分钟，并以1，800× g 离心5分钟。
- 将 1 mL 乙腈提取物转移到含有 150 mg 无水 MgSO4、50 mg 伯仲胺 （PSA） 和 50 mg 十八烷基硅烷 （C18） 的 2 mL 离心管中，用于通过分散固相萃取 （d-SPE）8 净化目的，涡旋 30 秒，并以 1，800 x g 离心 5 分钟。
- 将 200 μL 提取物转移到带有 300 μL 熔融插入物的适当标记的自动进样器样品瓶中，并使用 GC-MS 系统进行仪器分析（步骤 4）。
注意：基质匹配校准按照与之前使用空白提取物相同的步骤进行，但在d-SPE步骤（步骤3.6）中在15 mL管中清洁5 mL上清液，直到步骤3.7才添加加标和IS溶液。将校准标准溶液加入自动进样器样品瓶中，得到5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg和400 μg/kg，蒸发至干，加入200 μL基质提取物。
4. 气相色谱-质谱仪仪器分析
- 使用带有单个四极杆质谱仪和电子电离界面（−70 eV）的GC-MS系统进行GC-MS分析（参见 材料表）。
- 将MS转移线设置为280°C，将离子源设置为230°C。
- 使用5%苯基甲基聚硅氧烷30 m x 250 μm x 0.25 μm色谱柱（参见 材料表）和超高纯度He作为载气，恒定流速为1.2 mL/min。
- 最初将GC炉保持在60°C下2分钟，然后以25°C / min的速度将温度升至160°C，并保持1分钟。然后，以15°C / min的速度将温度升至175°C，并保持3分钟。然后，以40°C / min的速度升至220°C，并保持3分钟。再次，以30°C / min的速度升至250°C，并保持2分钟。最后，以30°C / min的速度将温度降至310°C，并保持2分钟。总分析时间为 22.125 分钟。
- 在每个序列之前对MS进行全自动调谐以及空气和水检查。
- 打开控制 GC-MS 系统所有参数的 MassHunter 采集软件。
注意：仪器系统默认包括 MassHunter 采集软件。 - 打开工具栏上的“查看”选项，然后单击 真空控制，单击 调谐，然后单击 自动调谐。自动调谐将在几分钟后结束。
- 打开“查看”选项，然后单击 仪器控制。
- 单击“ 是”，然后保存新的调谐文件以进行自动调谐。
- 打开工具栏上的“查看”选项，然后单击 真空控制，再次单击 “调谐 ”，然后单击 “空气和水检查”。空气和水检查将在几秒钟后结束。
- 打开“查看”选项，然后单击 仪器控制。
- 单击“ 是”，然后保存新的曲调文件以进行空气和水检查。
- 打开控制 GC-MS 系统所有参数的 MassHunter 采集软件。
- 在280°C的无分流模式下使用自动进样器（参见 材料表）进行进样，保持进样体积为1.5μL。 进样0.75分钟后，以40 mL/min的流速打开分流。
注意：在两次进样之间，10μL注射器必须用乙酸乙酯洗涤三次，用环己烷洗涤三次。所有注射都是一式两份。 - 在选定的离子监测（SIM）模式下分析分析物。这是具有单个四极杆的MS系统中使用的标准模式。
注意： 表1 显示了保留时间（分钟）和定量参数，基于对OCP和IS使用一种定量和两种鉴定离子。定量分析基于定量离子的峰面积与IS离子的比值。
5. 数据采集
- 打开控制 GC-MS 系统所有参数的 MassHunter 采集软件。
- 打开工具栏上的“序列”选项，然后编辑序列，包括样品名称、样品瓶编号、进样次数、仪器方法和要生成的文件名。根据需要添加任意数量的行。
- 单击“ 确定”，然后保存新序列。
- 再次打开工具栏上的“序列”选项，然后单击下拉菜单中的 “运行序列 ”。将打开一个新窗口，以确认进样方法和保存样品的文件夹。再次单击 “运行序列 ”，注射将开始。
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Representative Results
分析方法在线性、基质效应、回收率和重复性方面进行了全面验证。
线性评估使用六种浓度水平（5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg和400 μg/kg）加标空白样品的基质匹配校准曲线进行线性评估。所有OCP的决定系数（R2）均高于或等于0.99。最低校准水平（LCL）设定为5微克/千克，符合为食品应用监测目的确定的最大允许限值10微克/千克11。
通过比较纯溶剂中OCP校准曲线的斜率和基质匹配的校准曲线进行基质效应评估。矩阵效应使用以下公式12计算：
基质效应（%）=（基质匹配校准曲线的斜率-纯溶剂基校准曲线的斜率）/（纯溶剂基校准曲线的斜率）×100。
图2显示了使用甲酸铵的改进QuEChERS方法应用于土壤样品所研究的OCP的基质效应分布。正矩阵效应百分比对应于信号增强，而负百分比表示存在信号抑制。具体来说，（1）介于-20%和20%之间的值对应于软矩阵效应;（2）介于-20%和-50%之间或介于20%和50%之间的值对应于中等矩阵效应;（3）而高于50%或低于−50%的值意味着存在强矩阵效应。观察到，较多的OCPs遭受软基质或中等基质效应，而较少的OCP遭受强基质效应。
通过在三种浓度水平（10 μg/kg、50 μg/kg和200 μg/kg）下加标空白样品来评估回收率和重复性。 图3 显示了所有农药的总体回收率值和相对标准偏差（RSD）值和加标水平（n = 9）。可以看出，所研究的绝大多数口服避孕药的平均回收率在70%-120%之间，RSD低于20%，但七氯、异狄氏剂和硫丹β除外，它们的平均回收率略高。
图 1：使用甲酸铵从土壤样品中提取农药残留的改进 QuEChERS 方法的表示。 请点击此处查看此图的大图。
图2：17种OCP的基质效应与保留时间（分钟）的分布。 软矩阵效果对应于 −20% 到 20% 之间的值;中等矩阵效应对应于介于 −20% 和 -50% 或 20% 和 50% 之间的值;强矩阵效应对应于大于 50% 或小于 −50% 的值。 请点击此处查看此图的大图。
图3：在土壤样品中加标10 μg/kg、50 μg/kg和200 μg/kg（n = 9）后，17种OCP的平均回收率。 提供了可接受回收率（70%-120%）和RSD（<20%）范围内的分析物数量，以及超出该范围的标记物。 请点击此处查看此图的大图。
| 分析物 | 保留时间（分钟） | 定量离子 | 限定离子 1 | 限定离子 2 |
| α-BHC | 11.35 | 181 | 219 | 111 |
| β-BHC | 11.90 | 181 | 219 | 109 |
| 林丹 | 12.01 | 181 | 183 | 219 |
| δ-BHC | 12.39 | 181 | 219 | 111 |
| 七氯 | 13.24 | 272 | 20秒 | 274 |
| 艾氏剂 | 13.94 | 263 | 66 | 265 |
| 环氧七氯 | 14.86 | 353 | 355 | 81 |
| α硫丹 | 15.71 | 241 | 239 | 195 |
| 4，4'-滴剂-d8 （IS） | 16.09 | 254 | 184 | 326 |
| 4，4'-DDE | 16.12 | 246 | 318 | 248 |
| 狄氏剂 | 16.18 | 79 | 263 | 81 |
| 异狄氏剂 | 16.57 | 263 | 317 | 345 |
| β硫丹 | 16.73 | 195 | 241 | 159 |
| 4，4'-DDD | 16.89 | 235 | 237 | 165 |
| 硫丹硫酸盐 | 17.61 | 387 | 227 | 272 |
| 4，4'-滴滴涕 | 17.65 | 235 | 237 | 165 |
| 异狄氏剂酮 | 18.64 | 317 | 67 | 315 |
| 甲氧基氯 | 18.86 | 227 | 228 | 212 |
表1：OCP的GC-MS分析的保留时间（分钟）和定量参数。 甲型六氯化苯α;β-六氯化苯β;林丹;δ-六氯化苯（δ-BHC）;七氯;艾氏剂;七氯环氧化物;α硫丹;4，4'-二氯二苯基二氯乙烯-d8 （IS）;4，4'-二氯二苯基二氯乙烯;狄氏剂;异狄氏剂;β硫丹;4，4'-二氯二苯基二氯乙烷;硫丹硫酸盐;4，4'-二氯二苯基三氯乙烷;异狄氏剂酮;甲氧基氯。
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Discussion
QuEChERS方法的原始版本9和两个正式版本13，14使用硫酸镁与氯化钠，乙酸盐或柠檬酸盐一起促进提取过程中的乙腈/水混合物分离。然而，这些盐倾向于以固体形式沉积在质谱（MS）源的表面上，这导致需要增加基于液相色谱（LC）-MS的方法的维护。在克服这些缺点方面，González-Curbelo等人15报告说，挥发性更强的甲酸铵在诱导相分离和提取农药残留方面效果很好，用于LC和GC串联质谱（MS / MS）。随后的研究还使用每克样品0.5克甲酸铵从各种复杂基质中提取农药残留16，17，18，19。此外，甲酸铵的使用已被证明可以提供较少量的共提取材料20，这证明了其用于基于GC-MS的方法的合理性。本研究首次报道了该版本以分析土壤中的农药残留21。
由于共提取基质组分对农药工具响应的作用，导致测定不准确且灵敏度降低，因此对土壤等复杂基质中农药残留的GC分析存在一定的局限性22，23。因此，已经进行了一些改进以最小化基质效应，包括优化的清理步骤21。尽管如此，矩阵效应仍然存在，应尽可能多地纠正。从这个意义上说，基质匹配校准一直是使用的主要方法，因为它在补偿色谱信号相对于纯溶剂的增强方面非常实用24。因此，在这项研究中，通过在纯乙腈中构建校准曲线并使用土壤提取物来评估线性，并且使用两种方法获得所有OCP的R2 值高于或等于0.99。然而，当比较两条校准曲线时，在–49%至191%的范围内发现了明显的基质效应（图2）。尽管遭受强基质效应的农药数量仅为17种中的3种（异狄氏剂、异狄氏剂酮和甲氧基氯），但随后的研究使用基质匹配的校准曲线进行，以更大程度地补偿基质效应。
土壤中农药残留量没有规定最大残留限量（MRL），但所有OCP的LCL为5微克/千克，低于国际农业食品农药残留分析立法（第396/2005号条例）11设定的10微克/千克的非常苛刻的标准最大残留限量（MRL）。此外，5 μg/kg的LCL为所有OCP提供了约10的信噪比（S/N）。该方法的高灵敏度与其他研究相似甚至更好，这些研究也使用QuEChERS方法和GC-MS分析土壤中的OCP。例如，在一项研究中，使用使用柠檬酸盐缓冲液的正式版本的QuEChERS方法分析了34个OCP，定量限（LOQ）等于或高于7μg/ kg25。特别是，α-BHC、β-BHC、林丹和δ-BHC的LOQ值在206微克/千克至384微克/千克之间。在另一项工作中，使用相同版本的QuEChERS方法分析了林丹和狄氏剂，分别获得了42μg/kg和292μg/kg的LOQ值26。同样，另一项研究工作也使用QuEChERS和GC-MS测定了艾氏剂和七氯，LOQ值分别为13和23μg/ kg，分别为27。
回收率和重现性评估在三个浓度水平（低、中和高）下一式三份（n = 9）进行。为此，通过将使用甲酸铵的QuEChERS方法开始时加标的土壤样品获得的农药峰面积/IS（4，4'-DDE-d8）峰面积比与基质匹配校准的峰面积比进行比较，确定总回收率值。在所有情况下，每个重复以相同的顺序注射两次。应该注意的是，使用IS（一种同位素标记的标准品）可以补偿在整个过程中可能发生的农药损失，以及基质效应和/或仪器中可能的变异性。结果表明，大多数农药均符合70%-120%回收率的可接受性标准，每个加标水平为28时RSD为≤20%，证明了该方法的有效性和重复性。然而，七氯（122%）、异狄氏剂（121%）和硫丹β（130%）的总体回收值（n=9）略高于120%，尽管它们是一致的（RSDs<13%）。从这个意义上说，考虑到三个峰值水平的总体回收率值，已经建立了30%-140%的可接受性标准，RSD值为≤20%28。
综上所述，使用甲酸铵与GC-MS联用的QuEChERS方法可以成功测定农业土壤样品中的OCP。本研究表明，只需添加5 g甲酸铵即可诱导水和乙腈层之间的相分离，从而确保适当提取所选农药的高回收率。然而，基质效应继续发生，因此应在后续工作中研究其他方法，例如添加分析物保护剂。在任何情况下，官方QuEChERS版本的这种替代方案都可用于避免由于使用镁和钠盐而沉积在分析系统中的不良固体，特别是在基于LC-MS的常规分析中。在后一种情况下，它会更有趣，因为甲酸铵是正电喷雾电离的电离辅助剂，并且可以增强铵加合物而不是钠加合物的形成。
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Disclosures
我没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我要感谢哈维尔·埃尔南德斯-博尔赫斯和塞西莉亚·奥尔特加-萨莫拉的宝贵支持。我还要感谢Universidad EAN和Universidad de La Laguna。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL disposable glass conical centrifuge tubes | PYREX | 99502-15 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL centrifuge tubes with screw caps | VWR | 21008-169 | |
| 5977B mass-selective detector | Agilent Technologies | 1617R019 | |
| 7820A gas chromatography system | Agilent Technologies | 16162016 | |
| Acetone | Supelco | 1006582500 | |
| Acetonitrile | VWR | 83642320 | |
| Ammonium formate | VWR | 21254260 | |
| Automatic shaker KS 3000 i control | IKA | 3940000 | |
| Balance | Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co | ENTRIS224I-1S | |
| Bondesil-C18, 40 µm | Agilent Technologies | 12213012 | |
| Bondesil-PSA, 40 µm | Agilent Technologies | 12213024 | |
| Cyclohexane | VWR | 85385320 | |
| EPA TCL pesticides mix | Sigma Aldrich | 48913 | |
| Ethyl acetate | Supelco | 1036492500 | |
| G4567A automatic sampler | Agilent Technologies | 19490057 | |
| HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column | Agilent Technologies | 19091S-433UI | |
| Magnesium sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | 434183-1KG | |
| Mega Star 3.R centrifuge | VWR | 521-1752 | |
| Milli-Q gradient A10 | Millipore | RR400Q101 | |
| p,p'-DDE-d8 | Dr Ehrenstorfer | DRE-XA12041100AC | |
| Pipette tips 2 - 200 µL | BRAND | 732008 | |
| Pipette tips 5 mL | BRAND | 702595 | |
| Pipette tips 50 - 1000 uL | BRAND | 732012 | |
| Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL | BRAND | 704774 | |
| Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL | BRAND | 704780 | |
| Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL | BRAND | 704778 | |
| Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL | BRAND | 704782 | |
| Vials with fused-in insert | Sigma Aldrich | 29398-U | |
| OCPs | CAS registry number | ||
| α-BHC | 319-84-6 | ||
| β-BHC | 319-85-7 | ||
| Lindane | 58-89-9 | ||
| δ-BHC | 319-86-8 | ||
| Heptachlor | 76-44-8 | ||
| Aldrin | 309-00-2 | ||
| Heptachlor epoxide | 1024-57-3 | ||
| α-Endosulfan | 959-98-8 | ||
| 4,4'-DDE-d8 (IS) | 93952-19-3 | ||
| 4,4'-DDE | 72-55-9 | ||
| Dieldrin | 60-57-1 | ||
| Endrin | 72-20-8 | ||
| β-Endosulfan | 33213-65-9 | ||
| 4,4'-DDD | 72-54-8 | ||
| Endosulfan sulfate | 1031-07-8 | ||
| 4,4'-DDT | 50-29-3 | ||
| Endrin ketone | 53494-70-5 | ||
| Methoxychlor | 72-43-5 |
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