Summary
Deze studie ontwikkelde een niet-invasieve en real-time methode om de verdeling van geprogrammeerde dood-ligand 1 in het hele lichaam te evalueren, gebaseerd op positronemissie-tomografische beeldvorming van [68Ga] D-dodecapeptide-antagonist. Deze techniek heeft voordelen ten opzichte van conventionele immunohistochemie en verbetert de efficiëntie van het identificeren van geschikte patiënten die baat zullen hebben bij immuuncheckpointblokkadetherapie.
Abstract
De ontwikkeling van immuuncheckpointblokkadetherapie op basis van geprogrammeerd celdood-eiwit 1 (PD-1)/geprogrammeerde dood-ligand 1 (PD-L1) heeft de afgelopen jaren een revolutie teweeggebracht in kankertherapieën. Slechts een fractie van de patiënten reageert echter op PD-1/PD-L1-remmers, als gevolg van de heterogene expressie van PD-L1 in tumorcellen. Deze heterogeniteit vormt een uitdaging bij de nauwkeurige detectie van tumorcellen door de veelgebruikte immunohistochemie (IHC) benadering. Deze situatie vraagt om betere methoden om patiënten te stratificeren die baat zullen hebben bij immuuncheckpointblokkadetherapie, om de werkzaamheid van de behandeling te verbeteren. Positronemissietomografie (PET) maakt real-time visualisatie van de PD-L1-expressie van het hele lichaam op een niet-invasieve manier mogelijk. Daarom is er behoefte aan de ontwikkeling van radioactief gelabelde tracers om PD-L1-distributie in tumoren te detecteren door middel van PET-beeldvorming.
In vergelijking met hun L-tegenhangers hebben dextroroterende (D)-peptiden eigenschappen zoals proteolytische resistentie en opmerkelijk verlengde metabole halfwaardetijden. Deze studie ontwierp een nieuwe methode om PD-L1-expressie te detecteren op basis van PET-beeldvorming van 68Ga-gelabelde PD-L1-gerichte D-peptide, een D-dodecapeptide-antagonist (DPA), in tumordragende muizen. De resultaten toonden aan dat de [68Ga]DPA specifiek kan binden aan PD-L1-overexpressie tumoren in vivo, en toonde een gunstige stabiliteit en een uitstekend beeldvormingsvermogen, wat suggereert dat [68Ga]DPA-PET een veelbelovende benadering is voor de beoordeling van de PD-L1-status in tumoren.
Introduction
De ontdekking van immuuncheckpoint-eiwitten was een doorbraak in tumortherapie en heeft geleid tot grote vooruitgang in de ontwikkeling van immuuncheckpointblokkadetherapie. Geprogrammeerd celdood-eiwit 1 (PD-1) en geprogrammeerd dood-ligand 1 (PD-L1) zijn potentiële medicijndoelen met verschillende antilichamen die zijn goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA). PD-1 wordt tot expressie gebracht door tumor-infiltrerende immuuncellen, zoals CD4+, CD8+ T-cellen en regulerende T-cellen. PD-L1 is een van de PD-1-liganden, die tot overexpressie wordt gebracht in een verscheidenheid aan tumorcellen 2,3. De interactie tussen PD-1 en PD-L1 inactiveert PD-1, waardoor de antitumor immuunrespons wordt onderdrukt4. Deze bevindingen suggereren dat de remming van PD-L1 het dodende effect van immuuncellen kan verbeteren en tumorcellen kan elimineren5. Momenteel is chromogene immunohistochemie (IHC) de meest gebruikte benadering om patiënten te identificeren die het meest waarschijnlijk zullen reageren op immuuncheckpointtherapie 6,7. Vanwege de heterogene expressie van PD-L1 in tumorcellen kunnen IHC-resultaten van biopsieën echter geen nauwkeurige informatie geven over PD-L1-expressie bij patiënten8. Eerdere studies hebben gemeld dat slechts 20%-40% van de patiënten op lange termijn baat heeft bij immuuncheckpointblokkadetherapie 1,9,10. Er is daarom dringend behoefte aan een nieuwe methode om de vals-negatieve resultaten te omzeilen die worden veroorzaakt door de heterogene expressie van deze immuuncheckpoint-eiwitten.
Moleculaire beeldvormingstechnologie, zoals positronemissietomografie (PET), maakt real-time visualisatie van het hele lichaam op een niet-invasieve manier mogelijk en kan dus beter presteren dan de conventionele IHC-methode 11,12,13. Radioactief gelabelde antilichamen, peptiden en kleine moleculen zijn veelbelovende tracers voor het monitoren van PD-L1-expressie bij kankerpatiënten 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. De FDA heeft drie PD-L1 therapeutische monoklonale antilichamen goedgekeurd: avelumab, atezolizumab en durvalumab26. Immuno-PET-tracers op basis van deze antilichamen zijn goed gedocumenteerd 27,28,29,30,31,32. Klinische onderzoeken in een vroege fase hebben een beperkte waarde voor klinische toepassing aan het licht gebracht, vanwege de ongunstige farmacokinetiek30. Vergeleken met antilichamen vertonen peptiden een snellere bloed- en orgaanklaring uit gezonde organen en kunnen ze gemakkelijk chemisch worden gemodificeerd33. Er zijn meerdere peptiden met een hoge affiniteit voor PD-1/PD-L1 gerapporteerd2; WL12 is een gerapporteerd peptide dat een specifieke binding aan PD-L134 vertoont. Van radioactief gelabelde tracers, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 en [18F]FPyWL12, is gemeld dat ze een hoog in vivo specifiek tumorgericht vermogen vertonen, waardoor hoogwaardige beelden van PD-L1-expressie in tumoren kunnen worden geoogst 26,35,36,37. Bovendien heeft de eerste in-menselijke evaluatie van radioactief gelabeld WL12 aangetoond dat [68Ga]WL12 (gecheleerd door NOTA) een veilig en efficiënt potentieel heeft voor klinische tumorbeeldvorming38. Vanwege de hoge hydrofobiciteit en hoge opname in de gezonde lever heeft WL12 een beperkt klinisch gebruik. Andere radioactief labelende peptiden, zoals TPP1 en SETSKSF, die specifiek binden aan PD-L1, hebben ook potentiële stabiliteit en specificiteit aangetoond om PD-L1-expressie van het hele lichaamte visualiseren 39,40. Niet-gemodificeerde peptiden worden echter gemakkelijk afgebroken door proteasen en worden snel gemetaboliseerd door de nieren. Dextrorotary(D)-peptiden zijn op grote schaal gebruikt als effectieve mediatoren, vanwege de slechte stabiliteit van linkshandige (L)-peptiden 41,42,43. D-peptiden zijn hyperresistent tegen proteolytische afbraak en hebben opmerkelijk verlengde metabole halfwaardetijden. Vergeleken met hun L-tegenhangers vertonen D-peptiden meestal specifieke bindingscapaciteiten 44,45,46.
Deze studie ontwierp een nieuwe methode om PD-L1-expressie te detecteren, gebaseerd op PET-beeldvorming van een 68Ga-gelabelde PD-L1-gerichte D-peptide, D-dodecapeptide-antagonist (DPA), in een tumordragend muismodel47. De stabiliteit van [68Ga]DPA werd eerst bestudeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en muizenserum, waarna de bindingsaffiniteit van [68Ga]DPA in PD-L1-overexpressietumoren werd getest. Daarna werd PET-beeldvorming uitgevoerd in glioblastoom-xenotransplantaatmodellen om te bevestigen of [68Ga]DPA een ideale PET-tracer was om PD-L1-expressie in tumoren te volgen. De combinatie van PET-beeldvorming en DPA biedt niet alleen een nieuwe aanpak om de uitdagingen te overwinnen die gepaard gaan met de heterogene expressie van PD-L1, maar legt ook de basis voor de ontwikkeling van op D-peptide gebaseerde radiotracers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Nanjing Medical University of de National Institutes of Quantum Science and Technology. Muizenexperimenten werden strikt uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van de Commissie voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Peptide synthese
- Zwel 100 mg 4-methylbenzhydrylamine (MBHA)-hars (laadcapaciteit van 0,37 mmol/g) in 1 ml N-methyl-2-pyrrolidon (NMP) gedurende 30 minuten onder mildeN2-borrelen.
- Bereid een verse voorraadbuffer bestaande uit Fmoc-beschermde aminozuren (5.0 equiv), HCTU (4.9 equiv) en DIPEA (10.0 equiv) in 1 ml NMP en voeg toe aan de hars (100 mg). Laat de koppelingsreactie 1,5-2 uur doorgaan.
- Bereid een deprotectiebuffer voor die bestaat uit 50% (vol/vol) morfoline in NMP. Was de hars (100 mg) 2 x 30 min met 1 ml van de deprotectiebuffer in elke wasbeurt om de Fmoc-groep op de aminegroep te verwijderen. Was de hars met dichloormethaan (DCM; 1 ml) gedurende 1 minuut, verwijder de DCM en was de hars opnieuw met NMP (1 ml) gedurende nog eens 1 minuut. Verwijder vervolgens de NMP en was de hars opnieuw met DCM gedurende 1 minuut.
NOTITIE: Alle wasprocedures worden uitgevoerd onder milde N2-bubbels . De bovenstaande procedures worden herhaald tot het laatste aminozuur. - Voor het toevoegen van 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraazijnzuur (DOTA) aan het peptide, activeert u de DOTA vooraf met N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidehydrochloride (EDC· HCl) en N-hydroxysuccinimide (NHS). Incubeer de voorraadbuffer van DOTA/EDC· HCl/NHS bij een molaire verhouding van 1:1:1 in dimethylsulfoxide (DMSO) gedurende 3 uur, met een uiteindelijke DOTA-concentratie van 1 M. Voeg vervolgens de voorraadbuffer (1 ml) toe aan de hars (100 mg) en laat de reactie gedurende 2 uur doorgaan met zachtN2-borrelen.
OPMERKING: 1,4,7-triazacyclononaan-1,4,7-triazijnzuur (NOTA) kan ook worden gebruikt als chelator voor 68Ga-complexatie. Dezelfde procedures kunnen worden gebruikt voor NOTA-koppeling. - Spoel de hars grondig van bovenaf met DCM en pas een vacuüm toe om tegelijkertijd de resterende reactieoplossing te verwijderen. Spoel de hars 3x af met DCM (1,5 ml) en spoel vervolgens af met MeOH (1,5 ml) om de hars te laten krimpen. Zet de hars een nacht onder stikstof, of minimaal 4 uur onder hoog vacuüm, totdat de hars droog wordt.
- Plaats de gedroogde DPA-peptidehoudende hars in een polypropyleen bakje van 2 ml met een schroefdop. Voeg de juiste splitsingscocktail toe (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O in volume; 1 ml/100 mg hars) en sluit de container goed af met een schroefdop. Schud de reactie voorzichtig op een orbitale schudder in een zuurkast bij 20-25 °C gedurende 2 uur.
LET OP: Bereid trifluorazijnzuur (TFA) in een zuurkast met beschermende kleding aan, vanwege de zeer corrosieve aard ervan. - Verwijder het grootste deel van de TFA door verdamping onder stikstof in de zuurkast. Sla de peptiden neer door diethylether (~1,5 ml/100 mg hars) toe te voegen.
- Draai het mengsel om de peptiden te tritureren en centrifugeer het bij kamertemperatuur (10.000 × g, 5 min). Giet het oplosmiddel voorzichtig uit de container. Herhaal stap 1.7-1.8.
- Laat het residu 10 minuten aan de lucht drogen in de open container. Voeg 50% (vol/vol) waterig acetonitril toe en draai gedurende 1-2 s om de producten op te lossen (1 ml/100 mg hars).
- Verwijder de hars door het mengsel te filteren en was de hars vervolgens 2x met 0,2 ml 50% (vol/vol) waterig acetonitril. Meng de filtraten voor high-performance liquid chromatography (HPLC)-zuivering. Gebruik de volgende HPLC-voorwaarden. Kolom: YMC-Triat-C18 (4,6 mm inwendige diameter [i.d.], 150 mm, 5 mm); oplosmiddelgradiënt: oplosmiddel A-gedeïoniseerd water; oplosmiddel B-acetonitril (0,1% TFA); Stroomtijd: 20 min, met acetonitril van 10% tot 90%; debiet: 1 ml/min.
- Vries de verzamelde HPLC-eluenten een nacht in bij -80 °C en vries ze (-50 °C en <1 pa). Los voor radioactieve labeling het vaste peptide op in natriumacetaatbuffer (100 mM, pH 5,0) in een eindconcentratie van 1 mg/ml als voorraadbuffer.
2. 68Ga radioactieve etikettering
NOTITIE 68Ga werd intern gegenereerd in het Nanjing First Hospital (Nanjing, China) met behulp van een 68Ge/68Ga-generator.
- Pipetteer 5 μL bouillonbuffer in een polypropyleen container van 1,5 ml met een schroefdop. Voeg 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) toe aan de container.
- Draai het mengsel 5 s vortex. Meet de pH met behulp van pH-teststrips. Stel de pH in op 4-4,5 met NaOH (0,1 M).
OPMERKING: Een geschikte pH is van cruciaal belang voor complexatie tussen 68Ga en DOTA. - Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten. Onderwerp het reactiemengsel aan radioactief HPLC voor analyse van het rendement van radioactieve labeling onder de volgende omstandigheden: kolom: YMC-Triat-C18 (4,6 mm binnendiameter, 150 mm, 5 mm); oplosmiddelgradiënt: oplosmiddel A-gedeïoniseerd water; oplosmiddel B-acetonitril (0,1% TFA); Stroomtijd: 20 min, met acetonitril van 10% tot 90%; debiet: 1 ml/min.
OPMERKING: Radiochromatografie met dunne lagen (TLC) kan worden gebruikt als een alternatieve benadering om de opbrengst van radioactieve labeling te onderzoeken. De voorgestelde TLC-elutiebuffer is 0,1 M Na3C6H5O7, pH 4.
3. Tracer stabiliteitstest
- Tracerstabiliteitstest in PBS
- Voeg [68Ga]DPA (10 μL, 3,7 MBq, in NaOAc) toe aan de PBS (990 μL). Incubeer bij 37 °C gedurende 1, 2 en 4 uur met lichte beweging.
- Verzamel 200 μL van de oplossing op elk tijdstip. Injecteer het in de radio-HPLC voor analyse.
- Tracerstabiliteit in muizenserum
- Voeg [68Ga]DPA (10 μL, ~3,7 MBq, in NaOAc) toe aan het muizenserum (90 μL, vers bereid). Incubeer bij 37 °C gedurende 1, 2 en 4 uur met lichte beweging.
- Verzamel op elk tijdstip 20 μL van de oplossing. Voeg MeCN en water (100 μL, 1:1, v/v) toe.
- Centrifugeer het mengsel gedurende 10 minuten (5.000 × g, 25 °C). Analyseer het supernatans met behulp van radio-HPLC.
4. Analyse van PD-L1-expressie door middel van flowcytometrie
- Bereid kweekmedium voor door RPMI-1640 medium aan te vullen met 10% (vol/vol) foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine (vol/vol). Resuspendeer de U87MG-cellen in kweekmedium en zaad in platen met 12 putjes met een dichtheid van 105 cellen/putje. Plaats de cellen in een incubator (5% CO2, 37 °C) en kweek ze gedurende ten minste 24 uur zonder te storen.
- Was de cellen met 0,5 ml PBS en voeg 250 μl trypsine-EDTA (0,25%) toe. Plaats de cellen terug in de incubator (5% CO2, 37 °C) gedurende 2 min.
- Voeg 1 ml kweekmedium toe om de celdissociatie te stoppen. Voeg medium toe aan de cellen om ze los te maken van de vaat door op en neer te pipetteren en vang ze op in buisjes van 1,5 ml. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten (100 × g).
- Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in 1 ml PBS. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten (100 × g). Herhaal deze stap nog een keer.
- Verdun het fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerde PD-L1-antilichaam met 3% runderserumalbumine (BSA) tot 20 nmol/l. Voeg toe aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten (100 × g), gevolgd door tweemaal wassen met koud PBS. Analyseer de PD-L1-positieve cellen met behulp van een flowcytometer en analysesoftware.
5. Immunocytochemie
- Zaai de U87MG-cellen in kweekschaaltjes met glazen bodem (35 mm) met een dichtheid van 2,5 × 10,5 cellen per putje. Wanneer 60% confluentie is bereikt, zuigt u het kweekmedium op en voegt u 1 ml PBS toe. Schud een paar keer voorzichtig en zuig op. Voer de wasstap 3x uit.
- Voeg 500 μL 4% paraformaldehyde toe aan de vaat. Plaats de cellen op kamertemperatuur en fixeer ze gedurende 30 min.
- Was de cellen 3x met PBS. Voeg 1 ml 3% BSA (gew./vol, in PBS) toe en blokkeer de vaste cellen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de 3% BSA en incubeer de cellen direct met primair anti-PD-L1-antilichaam (mAb, 1:100, verdund in 3% BSA) 's nachts bij 4 °C.
OPMERKING: Na het blokkeren van de cellen met BSA, niet wassen met PBS. - Was de cellen 3x met 3% BSA buffer. Incubeer de cellen met FITC-geconjugeerd anti-humaan IgG Fc secundair antilichaam (1:500, verdund in PBS) gedurende 1 uur.
- Was de cellen 3x met PBS. Voeg 0,5 ml DAPI (1 μg/ml) toe aan de cellen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de gekleurde cellen 3x met PBS en observeer met een confocale fluorescentiemicroscoop.
6. Cellulaire opname en remmingsexperiment
- Cellulaire opname-experiment
- Kweek de U87MG-cellen in platen met 12 putjes totdat 80% confluentie is bereikt. Verwijder het medium en was de cellen met 0,5 ml PBS.
- Verdun de [68Ga]DPA in vers medium tot een concentratie van 74 KBq/ml. Voeg 0,5 ml van de verdunde [68Ga]DPA-buffer toe aan elk putje.
- Incubeer de cellen met [68Ga]DPA bij 37 °C gedurende verschillende tijdsduur (10, 30, 40 en 120 min). Zuig het medium op met behulp van een pipet. Was de cellen drie keer met PBS (0,5 ml).
- Voeg NaOH-oplossing (0,5 M, 300 μL per putje) toe om de cellen te lyseren. Vang na 30 s de stroperige cellysaten op in buisjes van 1,5 ml.
- Was de plaat twee keer met 0.4 ml PBS. Vang de wasoplossing op in de bovenstaande tube van 1.5 ml.
- Start de ingebouwde computer van de automatische gammateller; Plaats de buizen in de ingebouwde plank. Nadat u alle monsters op de transportband hebt geladen, drukt u op de START-knop. Resultaten worden berekend in de interne software. De uitlezing registreert de verval-gecorreleerde tellingen per minuut (CPM) van elke buis.
- Concurrerende bindingstest
- Kweek de U87MG-cellen in platen met 12 putjes totdat 80% confluentie is bereikt. Verwijder het medium en was de cellen met 0,5 ml PBS.
- Verdun [68Ga]DPA in vers medium tot een concentratie van 74 KBq/ml. Los een geschikte hoeveelheid BMS202-verbindingen op in 10% DMSO om een concentratie van 10 mM (400 μL) te verkrijgen.
- Verdun 4 μL van 10 mM BMS202 in 396 μL PBS om een concentratie van 100 μM te verkrijgen. Herhaal deze stap om verschillende concentraties BMS202 te verkrijgen (1 μM, 10 nM, 100 pM en 1 pM).
- Voeg 0,5 ml van de verdunde [68Ga]DPA-buffer toe aan elk putje (0,37 MBq per putje). Voeg 5 μL van de BMS202-oplossingen toe aan elk putje (drie putjes voor elke concentratie). Incubeer de cellen in een celincubator bij 37 °C gedurende 120 min.
- Zuig het medium op met behulp van een pipet. Was de cellen met 3 x 0,5 ml PBS.
- Voeg de NaOH-oplossing (0,5 M, 300 μL per putje) toe om de cellen te lyseren. Verzamel na 30 s de stroperige cellysaten in buisjes van 1,5 ml. Was de plaat met 2 x 0,4 ml PBS.
- Vang de wasoplossing op in de bovenstaande tube van 1.5 ml. Plaats de buizen in de ingebouwde plank van de automatische gammateller.
- Volg dezelfde procedures als stap 6.1.6.
7. PET-beeldvorming
NOTITIE: Voer PET-beeldvorming van kleine dieren uit met behulp van een micro-PET-scanner die 159 transversale axiale secties biedt met een onderlinge afstand van 0.796 mm (hart op hart), met een horizontaal gezichtsveld van 10 cm en een axiaal gezichtsveld van 12.7 cm. Alle gegevens die in de lijstmodus worden verzameld, zijn georganiseerd in driedimensionale sinogrammen. De Fourier wordt vervolgens weer samengevoegd tot tweedimensionale sinogrammen (frame × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).
- Gebruik mannelijke, 5-8 weken oude BALB/C naaktmuizen in dit onderzoek. Verzamel de U87MG-cellen volgens stap 4.1-4.4 en zuig de cellen op in een spuit van 0.5 ml. Injecteer de cellen subcutaan in de muizen (1 × 106 cellen per tumor, twee tumoren per muis). Bewaak de tumorgroei na injectie totdat het tumorvolume 100-300 mm is3.
- Verdoof de muizen met 1%-2% (v/v) isofluraan (1 ml/min). Zet het verwarmingsapparaat aan en houd het dierenbed van PET op 37 °C.
- Zet de verdoofde muizen in de juiste positie op het dierenbed van de PET-machine. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
LET OP: Houd de muizen in buikligging om overlijden tijdens het scannen te voorkomen. Dien tijdens het hele beeldvormingsproces isofluraanstroom (1,0 ml/min) toe via de neus met behulp van een vooraf geïnstalleerde buis. - Pas de positie van het dierenbed aan via het bedieningspaneel. Injecteer de tracers (10-17 MBq/100-200 μL) intraveneus via een vooraf geïnstalleerde staartaderkatheter.
- Maak een scanworkflow op een hostcomputer met behulp van de software waarnaar wordt verwezen (zie Materiaaltabel) Maak een studiemap en stel het acquisitieprotocol in volgens het protocol van de fabrikant. Voer dynamische scans uit (60 minuten voor elke muis) op alle muizen in de 3D-lijstmodus.
- Definieer een histogramprotocol en een reconstructieprotocol volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik het filter van Hanning met een Nyquist-cutoff van 0,5 cyclus/pixel om dynamische PET-beelden (25-30 min en 55-60 min) te reconstrueren door middel van gefilterde back-projectie. Genereer MIP-beelden (Maximum Intensity Projection Display) voor alle muizen.
- Combineer de protocollen in een workflow en voer de workflow uit. Analyseer de resulterende driedimensionale beelden met behulp van de software, volgens het protocol van de fabrikant.
OPMERKING: Gebruik de simulatiesoftware om de gewenste volumes te selecteren. Radioactiviteit wordt gecorrigeerd voor verval naar de injectietijd en weergegeven als het percentage van de totale injectiedosis/per gram weefsel (% ID/g).
8. Ex vivo biodistributie
- Dien [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μL) toe aan de U87MG-dragende BALB/C naakte muizen via staartaderinjectie. Verdoof de muizen met 1%-2% (v/v) isofluraan (1 ml/min) en offer vervolgens drie muizen via cervicale dislocatie na injectie gedurende 5, 30, 60 en 120 minuten.
OPMERKING: De personen die deze procedure demonstreren, moeten worden getraind in de technische vaardigheden van cervicale dislocatie om ervoor te zorgen dat het bewustzijnsverlies snel wordt geïnduceerd. Dit zal ervoor zorgen dat de euthanasieprocedures in dit experiment allemaal humaan worden uitgevoerd. - Nadat de dood is bevestigd, opent u de borstwand van de muizen. Open dan het hart. Gebruik een spuit van 1 ml om bloed af te nemen; knijp het bloed uit de spuit in een radio-immunoassay (RIA) buisje (13 mm in diameter) voor de gammateller.
- Snijd de belangrijkste organen en tumoren weg en plaats ze in RIA-buisjes (13 mm in diameter) voor de gammateller. Belangrijke organen zijn het totale bloed, hart, thymus, lever, milt, botten, maag, nieren, spieren, darmlymfeklieren, dunne darm, alvleesklier, testis, hersenen en longen. Weeg alle organen.
- Meet de radioactiviteit in de verzamelde organen met behulp van een autogammateller en corrigeer de waarden. Bereken het percentage geïnjecteerde dosis per gram nat weefsel (% ID/g).
9. Immunohistochemie
- Verzamel de glioomdoekjes en was ze 3x met PBS. Doe de verse weefsels in 4% paraformaldehyde en fixeer ze een nacht bij 4 °C.
- Veranker de vaste weefsels in paraffine en snijd ze in secties tot een dikte van 10 μm. Plaats de secties in een incubator (60 °C) en incubeer gedurende 2 uur. Ontwas en hydrateer de secties door ze elk 10 minuten te incuberen in het volgende: xyleen (tweemaal), absolute alcohol, 95% alcohol, 90% alcohol, 80% alcohol, 75% alcohol.
- Leg de secties in 0,01 M natriumcitraat en verwarm ze tot 92-95 °C. Houd de temperatuur 40 minuten vast om antigeen op te halen.
- Voeg 200 μLH2O2-oplossing (3%) toe aan de secties en inactiveer de endoperoxidasen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Blokkeer de niet-specifieke plaatsen door behandeling met 3% BSA gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de secties in primair anti-PD-L1-antilichaam (mAb, 1:100, verdund in 3% BSA) 's nachts bij 4 °C.
NOTITIE: Na het blokkeren met BSA, niet wassen met PBS. - Was de secties 3x met PBS. Incubeer de secties met HRP-gelabeld geit anti-konijn secundair antilichaam (1:500, verdund in PBS) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was de cellen 3x met PBS. Voeg 200 μl 3,3-diaminobenzidine (DAB) werkoplossing (oplossing A: oplossing B: oplossing C = 1:1:18) toe aan de secties en incubeer gedurende 5 minuten in het donker.
- Was de secties 3x met PBS. Voeg 500 μL hematoxyline-oplossing (100%) toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de secties gedurende 30 s met water. Leg de secties gedurende 30 s in differentiatieoplossing (75% alcohol: HCL = 99:1). Was de secties gedurende 1 minuut met water.
- Dehydrateer de monsters door ze achtereenvolgens te incuberen met 75% alcohol, 80% alcohol, 90% alcohol, 95% alcohol, absolute alcohol en xyleen (tweemaal) (elk 10 minuten). Monteer alle secties met neutrale hars en observeer ze onder een optische microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[68Ga]DPA radioactieve labeling en stabiliteit
Het modelpeptide, DPA, is een effectieve PD-L1-antagonist. DOTA-DPA werd verkregen met een zuiverheid van >95% en een rendement van 68%. De massa van DOTA-DPA is experimenteel waargenomen bij 1.073,3 ([M+2H]2+). 68 okt.Gallium wordt beschouwd als een geschikte radionuclide om peptiden te labelen voor PET-beeldvorming, en werd daarom gekozen voor deze studie. Om DPA radioactief te labelen met 68Ga (halfwaardetijd: 68 min), werd DOTA-PEG3-DPA gesynthetiseerd (Figuur 1A). DOTA werd gebruikt als chelator voor de 68Ga-radiolabeling. Om DOTA en DPA te spacen, werd PEG3 gebruikt als linker. De [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA (in de volgende tekst aangeduid als [68Ga]DPA) vertoonde een hoge radiochemische opbrengst (>95%) en radiochemische zuiverheid (>95%) (tabel 1). Er werd ook een tracerstabiliteitstest uitgevoerd met behulp van HPLC, en de resultaten toonden aan dat [68Ga]DPA een grote stabiliteit had, zowel in PBS als in muizenserum. De 68Ga-afbraak of peptidehydrolyse werd niet gedetecteerd na een incubatietijd van 4 uur bij 37 °C (figuur 1B).
Expressie van PD-L1 in U87MG-cellen
Een eerdere studie toonde aan dat een verhoogde expressie van PD-L1 correleerde met een slechte overleving van de patiënt bij glioblastoomtumoren, wat aangeeft dat PD-L1 een opmerkelijke prognostische biomarker en therapeutisch doelwit kan zijn bij glioblastoom48. Daarom werd een menselijke glioblastoomcellijn, U87MG, gebruikt om een tumormodel op te stellen om de werkzaamheid van [68Ga]DPA in PET/CT voor PD-L1-tumorbeeldvorming te bepalen. De resultaten van de flowcytometrie suggereerden dat ongeveer 60% van de U87MG-cellen PD-L1-positief was (figuur 2A). Bovendien bevestigde immunofluorescerende kleuring de sterke expressie van PD-L1 in de U87MG-cellen (Figuur 2B). Samen toonden deze gegevens aan dat de U87MG-cellijn geschikt was voor dit onderzoek.
Cellulaire opname en specificiteit van [68Ga]DPA
De opname van [68Ga]DPA door U87MG-cellen vertoonde een tijdsafhankelijk patroon. Wanneer een PD-L1-remmer, BMS202, als blokker werd gebruikt, werden het bindingsgedeelte en de opname van [68Ga]DPA aanzienlijk verminderd (Figuur 3A). Een competitieve bindingstest onderzocht verder de bindingsaffiniteit (Ki) van BMS202 aan de U87MG-cellen. De geschatte bindingsaffiniteit was 43,8 ± 8,6 nmol/L voor BMS202 wanneer [68Ga]DPA als concurrent werd gebruikt (Figuur 3B).
[68Ga]DPA PET-beeldvorming van tumormodellen
PET-beeldvorming van [68Ga]DPA werd uitgevoerd bij U87MG tumordragende BALB/C naakte muizen. [68Ga] DPA werd toegediend via intraveneuze injectie totdat de U87MG-tumor groeide tot 100mm3. PET-beelden van het hele lichaam toonden een hoge [68Ga]DPA-accumulatie in de tumor na 30 en 60 minuten injectie, en toonden de hoogste accumulatie in de nier en blaas (Figuur 4A). Om te bevestigen of [68Ga]DPA specifiek accumuleerde in PD-L1-positieve tumoren, werd een ander muismodel met de PanNET-cellijn Bon-1 gebruikt als negatieve controle. Een parallel experiment toonde weinig [68Ga]DPA-accumulatie aan in Bon-1-tumoren 60 minuten na injectie (Figuur 4B).
Om dit verschil te verduidelijken, werd immunohistochemische kleuring uitgevoerd om PD-L1-expressie in tumorweefsels te analyseren. De resultaten toonden aan dat de U87MG-cellen een aanzienlijke PD-L1-expressie vertoonden (Figuur 5A,C), maar niet de Bon-1-tumor (Figuur 5B,C). Deze gegevens kwamen overeen met de PET-resultaten. Daarom is het mogelijk dat de verschillende groeistatussen van tumorcellen resulteerden in verschillende PD-L1-expressie (bijv. weefselnecrose). Om dit te verifiëren werd hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring uitgevoerd. Zoals verwacht werd een vergelijkbare celmorfologie waargenomen tussen de twee tumorweefsels (Figuur 5D).
Ex vivo biodistributie van [68Ga]DPA in U87MG-tumoren
Het ex vivo biodistributieonderzoek werd ook uitgevoerd met U87MG-dragende muizen (tabel 2). De resultaten toonden een snelle klaring in het bloed en de meeste geanalyseerde organen, waaronder het hart, de lever, de longen en de spieren. De nier accumuleerde de hoogste hoeveelheid radioactiviteit en vertoonde een klaringspercentage van 0,12% ID/(g∙min) van 5 min tot 120 min. De tumor vertoonde opname van de op één na hoogste traceropname op alle tijdstippen. Bovendien vertoonde de tumor van 5 minuten tot 60 minuten na injectie een lager tracerklaringspercentage van 0,027% ID/(g∙min). Voor bloed was de klaringssnelheid 0,069% ID/(g∙min), terwijl voor spieren de klaringssnelheid 0,037% ID/(g∙min) was.
Figuur 1: [68Ga]DPA radiolabeling en stabiliteit. (A) De chemische structuur van [68Ga]DPA en de schematische weergave van de binding ervan aan PD-L1 die tumorcellen tot expressie brengen. (B) HPLC-curven die de radioactiviteit van [68Ga]DPA laten zien na incubatie met PBS of muizenserum gedurende 0,5, 2 en 4 uur. Dit cijfer is aangepast van Hu et al.47. Afkortingen: DPA = dodecapeptide antagonist; PD-L1 = geprogrammeerde dood-ligand 1; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; HPLC = krachtige vloeistofchromatografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Expressie van PD-L1 in de U87MG-cellijn. (A) De expressie van PD-L1 in de U87MG-cellijn werd gemeten door middel van flowcytometrie-analyse. (B) De expressie van PD-L1 in U87MG-cellen werd gemeten door middel van een immunofluorescentiekleuringstest. Schaalbalk = 100 μm. Dit cijfer is aangepast van Hu et al.47. Afkortingen: PD-L1 = geprogrammeerde dood-ligand 1; SSC = zijwaartse spreiding; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cellulaire opname en remming van [68Ga]DPA. (A) De opname van U87MG-cellen bij incubatie met [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) of [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) + BMS202 (100 μmol/l) gedurende verschillende duur. (B) Competitieve binding van [68Ga]DPA (0,74 MBq /ml) aan de U87MG-cellen na incubatie met BMS202. De Ki-waarde wordt weergegeven in het paneel. Dit cijfer is aangepast van Hu et al.47. Afkortingen: DPA = dodecapeptide antagonist; %AD = toegediende dosis (met betrekking tot het bindende gedeelte). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: PET-beeldvorming van [68Ga]DPA in PD-L1-overexpressie van U87MG-tumoren. (A,B) PET-CT-beelden die de verdeling van [68Ga]DPA tonen bij U87MG-dragende muizen (A) en Bon-1-dragende muizen (negatieve controle, B) na intraveneuze injectie (~18,5 MBq) gedurende 30 minuten en 60 minuten. Representatieve maxiumum-intensiteitsprojectie (MIP) (bovenste paneel) en transversale PET-CT-beelden (onderste paneel) worden gepresenteerd. De tumorposities worden gemarkeerd door witte gestippelde cirkels. Dit cijfer is aangepast van Hu et al.47. Afkortingen: DPA = dodecapeptide antagonist; PD-L1 = geprogrammeerde dood-ligand 1; PET-CT = positronemissietomografie-computertomografie; MIP = projectie van maximale intensiteit; P.I. = na injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Immunohistochemische analyse van [68Ga]DPA-behandelde tumoren. (A,B) Immunohistochemische beelden van PD-L1 in (A) U87MG- en (B) Bon-1-tumoren met volledige sectie. (C) Uitvergrote foto's van de gemarkeerde gebieden in A en B. (D) H&E-kleuring van U87MG en Bon-1 tumor. Schaalbalken = 100 μm (C,D). Dit cijfer is aangepast van Hu et al.47. Afkortingen: DPA = dodecapeptide antagonist; PD-L1 = geprogrammeerde dood-ligand 1; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tracers | [68Ga] DPA |
| Radiochemisch rendement (%) | >95 |
| Molaire activiteit (GBq μmol-1) | 37 ± 8 |
| Radiochemische zuiverheida (%) | >95 |
Tabel 1: Radiolabeling en kwaliteitscontrole van [68Ga]DPA. Radiochemische opbrengst, molaire activiteit en radiochemische zuiverheid van [68Ga]DPA. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD (n = 7). Deze tabel is aangepast van Hu et al.47. Afkorting: DPA = dodecapeptide antagonist. eenDe radiochemische zuiverheid van [68Ga]DPA werd geanalyseerd door middel van HPLC in omgekeerde fase onder een geoptimaliseerde omstandigheid: 1) kolom: YMC-Triat-C18 (4,6 mm binnendiameter, 150 mm, 5 mm); 2) oplosmiddelgradiënt: oplosmiddel A-gedeïoniseerd water; oplosmiddel B-acetonitril (0,1% trifluorazijnzuur); Stroomtijd: 20 min, met acetonitril van 10% tot 90%; debiet van 1 ml/min.
| [68Ga] DPA | ||||||||
| 5 min | 30 min | 60 minuten | 120 min | |||||
| bloed | 3.89 | ±0,43 | 1.55 | ±1.07 | 0.11 | ±0,02 | 0.05 | ±0,01 |
| hart | 1.19 | ±0,39 | 0.52 | ±0,33 | 0.06 | ±0,02 | 0.05 | ±0,02 |
| lever | 1.06 | ±0,26 | 0.59 | ±0,43 | 0.19 | ±0,02 | 0.16 | ±0,04 |
| milt | 0.98 | ±0,14 | 0.68 | ±0,67 | 0.14 | ±0,06 | 0.09 | ±0,03 |
| long | 1.64 | ±0,42 | 1.03 | ±0,9 | 0.13 | ±0,05 | 0.09 | ±0,02 |
| nier | 19.23 | ±1,95 | 16.13 | ±1,51 | 11.5 | ±0,44 | 5.2 | ±0.31 |
| maag | 1.54 | ±0,1 | 0.61 | ±0,35 | 0.08 | ±0,01 | 0.08 | ±0,03 |
| Intestinale | 0.72 | ±0,27 | 0.47 | ±0,35 | 0.08 | ±0,02 | 0.06 | ±0,03 |
| alvleesklier | 1.88 | ±0,28 | 0.77 | ±0,75 | 0.16 | ±0,03 | 0.13 | ±0,03 |
| spier | 2.21 | ±0,27 | 0.71 | ±0,37 | 0.18 | ±0,02 | 0.14 | ±0,04 |
| bot | 2.18 | ±0,11 | 0.85 | ±0,51 | 0.26 | ±0,09 | 0.14 | ±0,06 |
| hersenen | 0.19 | ±0,04 | 0.11 | ±0,08 | 0.03 | ±0,01 | 0.02 | ±0,01 |
| tumor | 4.5 | ±0,32 | 3.77 | ±0,27 | 2.99 | ±0,03 | 0.89 | ±0,19 |
| vet | 2.09 | ±0,49 | 0.81 | ±0,12 | 0.27 | ±0,07 | 0.1 | ±0,07 |
Tabel 2: Biodistributie van [68Ga]DPA in U87MG tumordragende muizen na toediening voor verschillende duur (n = 3 per tijdstip). Deze tabel is aangepast van Hu et al.47. Afkorting: DPA = dodecapeptide antagonist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritieke stappen die in deze methode worden beschreven, omvatten de efficiënte etikettering van 68Ga naar DPA en het kiezen van een geschikt tijdvenster voor PET-beeldvorming, dat perfect moet passen bij het farmacodynamische patroon van DPA in de tumor.
In tegenstelling tot IHC maakt PET-beeldvorming real-time detectie van PD-L1-expressie in het hele lichaam op een niet-invasieve manier mogelijk, waardoor de visualisatie van elk positief gebied in een heterogene tumor mogelijk is 6,7. Peptiden werden gekozen als liganden om de nadelen van antilichamen en kleine moleculen te vermijden. Antilichamen met een groot molecuulgewicht hebben over het algemeen een lange circulerende halfwaardetijd, wat een hogere toxiciteit voor gezonde organen veroorzaakt. De klaring van kleine moleculen is meestal te snel om de vereiste tumorretentie te bereiken. Het molecuulgewicht van peptiden varieert tussen dat van antilichamen en kleine moleculen. Dit stelt op peptiden gebaseerde radiotracers in staat om zowel langdurige tumorretentie als een goede weefselpenetratie te bereiken met minimale toxiciteit 13,49,50,51,52,53. Belangrijk is dat het nut van de D-peptide DPA, in plaats van de algemeen gerapporteerde L-peptiden, de [68Ga]DPA een opmerkelijk verlengde metabole halfwaardetijd geeft. Bovendien is DPA positief geladen en hydrofiel in vivo, en heeft het daarom een hoge oplosbaarheid en kan het niet-specifieke targeting in bloed vermijden, waardoor het genereren van PET-beelden met een hoge beeldkwaliteit wordt vergemakkelijkt.
Met name succesvolle 68Ga-radiolabeling vereist een specifieke pH en geen interferentie van overgangsmetaalionen, zoals Cu (II) en Fe (III) kationen. In sommige gevallen leidt de Cu2+ besmetting tot een lage radiochemische opbrengst. Daarom is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alle containers en pipetpunten niet verontreinigd zijn. Bovendien werd bij deze methode U87MG gebruikt voor tumorinoculatie. Hoewel de expressie van PD-L1 in U87MG-xenotransplantaten in eerdere studies werd geverifieerd, varieert de expressie ervan tussen individuele dieren. Daarom varieerde de absolute opname van de tracer in de U87MG-tumoren tussen individuele muizen. Om een effectieve opname van tracers in de tumoren te garanderen, moeten dieren met een geschikte tumorgrootte (500mm3 < volume < 100mm3) worden geselecteerd voor PET-scanning.
Een van de beperkingen van [68Ga]DPA is dat de bindingsaffiniteit van DPA aan PD-L1 relatief laag is in vergelijking met verschillende andere PD-L1-gerichte peptiden, zoals WL12, waardoor het ongeschikt is voor tumoren met een relatief lage PD-L1-expressie26,47. Verdere modificatie van het D-peptide zal het specifieke bindingsvermogen verbeteren. Om het beeldvormende effect van [68Ga]DPA te versterken, kan bovendien de formulering van de injectiestrategie worden geoptimaliseerd, bijvoorbeeld door gelijktijdig niet-gelabelde DPA te injecteren vóór [68Ga]DPA om de niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren 54,55,56.
Concluderend ontwikkelde deze studie een niet-invasieve en real-time methode om de PD-L1-distributie in het hele lichaam van levende dieren te volgen met behulp van [68Ga]DPA als radiotracer. De resultaten onthulden een relatief hoge, in vivo specifieke bindingsaffiniteit, gunstige stabiliteit en uitstekende beeldvormingscapaciteit van [68Ga]DPA, wat suggereert dat [68Ga]DPA-PET een veelbelovende benadering is voor het visualiseren van PD-L1-overexpressietumoren. Bovendien kan deze techniek ook worden toegepast op de behandeling van PD-L1-positieve tumoren bij het labelen van DPA met andere radionucliden, zoals 177Lu en 225Ac. Daarom overwint de DPA-radiolabelingtechniek niet alleen de beperking van IHC-afhankelijke diagnose, maar biedt het ook een nieuwe optie voor behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er worden geen tegenstrijdige belangen opgegeven.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Non-profit Central Research Institute Fund van de Chinese Academie voor Medische Wetenschappen (nr. 2022-RC350-04) en het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nrs. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 en 2022-I2M-2-002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) | Merck | 60239-18-1 | 68Ga chelation |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit | Sigma-Aldrich | D7304-1SET | Immunohistochemistry |
| anti-PD-L1 monoclonal antibody | Wuhan Proteintech | 17952-1-ap | Immunohistochemistry: primary antibody |
| BMS202 | Selleck | 1675203-84-5 | Competitive binding assay: inhibitor |
| BSA | Merck | V900933 | Immunofluorescent : blocking |
| DAPI | Merck | D9542 | Immunofluorescent: staining of nucleus |
| Dichloromethane (DCM) | Merck | 34856 | Solvent |
| DIPEA | Merck | 3439 | Peptide coupling |
| EDC·HCl | Merck | E6383 | Activation of DOTA |
| FBS | Gibco | 10099 | Cell culture: supplement |
| FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody | Biolegend | 409310 | Immunofluorescent: secondary antibody |
| FITC-conjugated anti PD-L1 antibody | Biolegend | 393606 | Flow cytometry: direct antibody |
| HCTU | Energy Chemical | E070004-25g | Peptide coupling |
| HRP labeled goat anti-rabbit antibody | Servicebio | GB23303 | Immunohistochemistry: secondary antibody |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Merck | 130672 | Activation of DOTA |
| MeCN | Merck | PHR1551 | Solvent |
| Morpholine | Merck | 8.06127 | Fmoc- deprotection |
| NMP | Merck | 8.06072 | Solevent |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Fixation of tissues |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture: buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 10378016 | Cell culture: supplement |
| RIA tube | PolyLab | P10301A | As tissue sample container |
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875093 | Cell culture: basic medium |
| Sodium acetate | Merck | 1.06264 | Salt for buffer |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture: dissociation agent |
| U87MG cell line | Procell Life Science & Technology Co | CL-0238 | Cell model |
| Equipment | |||
| 68Ge/68Ga generator | Isotope Technologies Munich, ITM | Not applicable | Generation of [68Ga] |
| Autogamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | Detection of radioactivity |
| Confocal fluorescent microscopy | Keyence | Observation of immunofluorescent results | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson, BD | LSRII | Monitoring the PD-L1 positive cells |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | SHIMAZU | LC-20AT | Purification of DPA peptide |
| PET scanner | Siemens Medical Solutions | Inveon MultiModality System | PET imaging |
| Optical microscopy | Nikon | Eclipse E100 | Observation of immunohistochemistry results |
| Solid phase peptide synthesizer | Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold | LOT#11101 | Synthesis of DPA-DOTA peptide |
| Software | |||
| ASIPro | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Analysis of PET-CT results |
| FlowJo | Becton Dickinson, BD | FlowJo 7.6.1 | Analysis of the flow cytometer results |
| Inveon Acquisition Workplace (IAW) | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Management of PET mechine |
| Prism | Graphpad | Prism 8.0 | Analysis of the data |
References
- Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
- Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747 (2022).
- Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297 (2022).
- Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
- Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
- Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
- Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535 (2019).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
- Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538 (2022).
- Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
- Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664 (2018).
- Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
- Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
- Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
- Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
- Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
- Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
- Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
- Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294 (2021).
- Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572 (2020).
- Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
- Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
- Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
- Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
- Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738 (2020).
- Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
- Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
- Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
- (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
- Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
- De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189 (2019).
- Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
- Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
- Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
- Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
- Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
- Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
- Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
- Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
- Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
- Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
- Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
- Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
- Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
- Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
- Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
- Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
- Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).
