Summary
In dieser Studie wurde eine nicht-invasive Echtzeitmethode entwickelt, um die Verteilung des programmierten Todesliganden 1 im gesamten Körper zu bewerten, basierend auf der positronenemissionstomographischen Bildgebung des [68Ga] D-Dodecapeptid-Antagonisten. Diese Technik hat Vorteile gegenüber der herkömmlichen Immunhistochemie und verbessert die Effizienz bei der Identifizierung geeigneter Patienten, die von einer Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie profitieren.
Abstract
Die Entwicklung der Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie auf Basis des programmierten Zelltodproteins 1 (PD-1)/des programmierten Todesliganden 1 (PD-L1) hat in den letzten Jahren die Krebstherapie revolutioniert. Aufgrund der heterogenen Expression von PD-L1 in Tumorzellen spricht jedoch nur ein Bruchteil der Patienten auf PD-1/PD-L1-Inhibitoren an. Diese Heterogenität stellt eine Herausforderung bei der präzisen Detektion von Tumorzellen durch den häufig verwendeten immunhistochemischen Ansatz (IHC) dar. Diese Situation erfordert bessere Methoden zur Stratifizierung von Patienten, die von einer Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie profitieren, um die Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern. Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der PD-L1-Expression des gesamten Körpers auf nicht-invasive Weise. Daher besteht ein Bedarf an der Entwicklung radioaktiv markierter Tracer, um die PD-L1-Verteilung in Tumoren durch PET-Bildgebung nachzuweisen.
Im Vergleich zu ihren L-Gegenstücken haben dextrorotierende (D)-Peptide Eigenschaften wie proteolytische Resistenz und bemerkenswert verlängerte metabolische Halbwertszeiten. In dieser Studie wurde eine neue Methode zum Nachweis der PD-L1-Expression entwickelt, die auf der PET-Bildgebung von 68Ga-markierten PD-L1-gerichteten D-Peptiden, einem D-Dodecapeptid-Antagonisten (DPA), in tumortragenden Mäusen basiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die [68Ga]DPA spezifisch an PD-L1-überexprimierende Tumore in vivo binden kann und zeigte eine günstige Stabilität sowie eine ausgezeichnete Bildgebungsfähigkeit, was darauf hindeutet, dass [68Ga]DPA-PET ein vielversprechender Ansatz für die Beurteilung des PD-L1-Status in Tumoren ist.
Introduction
Die Entdeckung von Immun-Checkpoint-Proteinen war ein Durchbruch in der Tumortherapie und hat zu großen Fortschritten in der Entwicklung der Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie geführt1. Das programmierte Zelltodprotein 1 (PD-1) und der programmierte Todesligand 1 (PD-L1) sind potenzielle Angriffspunkte für Medikamente mit mehreren Antikörpern, die von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen sind. PD-1 wird von tumorinfiltrierenden Immunzellen wie CD4+, CD8+ T-Zellen und regulatorischen T-Zellen exprimiert. PD-L1 ist einer der PD-1-Liganden, der in einer Vielzahl von Tumorzellen überexprimiert wird 2,3. Die Interaktion zwischen PD-1 und PD-L1 inaktiviert PD-1 und unterdrückt so die Antitumor-Immunantwort4. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hemmung von PD-L1 die abtötende Wirkung von Immunzellen verbessern und Tumorzellen eliminieren kann5. Derzeit ist die chromogene Immunhistochemie (IHC) der am häufigsten verwendete Ansatz, um Patienten zu identifizieren, die am ehesten auf eine Immun-Checkpoint-Therapie ansprechen 6,7. Aufgrund der heterogenen Expression von PD-L1 in Tumorzellen können IHC-Ergebnisse aus Biopsien jedoch keine genauen Informationen über die PD-L1-Expression bei Patienten liefern8. Frühere Studien haben berichtet, dass nur 20%-40% der Patienten einen langfristigen Nutzen aus der Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie ziehen 1,9,10. Es besteht daher ein dringender Bedarf, eine neue Methode zu entwickeln, um die falsch-negativen Ergebnisse zu umgehen, die durch die heterogene Expression dieser Immun-Checkpoint-Proteine verursacht werden.
Molekulare Bildgebungstechnologien, wie z. B. die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), ermöglichen die Echtzeit-Visualisierung des gesamten Körpers auf nicht-invasive Weise und können damit die herkömmliche IHC-Methode übertreffen 11,12,13. Radioaktiv markierte Antikörper, Peptide und kleine Moleküle sind vielversprechende Tracer für die Überwachung der PD-L1-Expression bei Krebspatienten 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Die FDA hat drei therapeutische monoklonale PD-L1-Antikörper zugelassen: Avelumab, Atezolizumab und Durvalumab26. Immuno-PET-Tracer, die auf diesen Antikörpern basieren, sind gut dokumentiert 27,28,29,30,31,32. Klinische Studien in der Frühphase haben gezeigt, dass sie aufgrund der ungünstigen Pharmakokinetik nur einen begrenzten Wert für die klinische Anwendung haben30. Im Vergleich zu Antikörpern weisen Peptide eine schnellere Blut- und Organausscheidung aus gesunden Organen auf und können leicht chemisch modifiziert werden33. Es wurde über mehrere Peptide mit hoher Affinität zu PD-1/PD-L1 berichtet2; WL12 ist ein berichtetes Peptid, das eine spezifische Bindung an PD-L134 zeigt. Es wurde berichtet, dass radioaktiv markierte Tracer, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 und [18F]FPyWL12, eine hohe In-vivo-spezifische Tumor-Targeting-Fähigkeit aufweisen, was die Gewinnung qualitativ hochwertiger Bilder der PD-L1-Expression in Tumorenermöglicht 26,35,36,37. Darüber hinaus hat die erste Evaluierung von radioaktiv markiertem WL12 am Menschen gezeigt, dass [68Ga]WL12 (chelatisiert durch NOTA) ein sicheres und effizientes Potenzial für die klinische Tumorbildgebung hat38. Aufgrund seiner hohen Hydrophobizität und hohen Aufnahme in die gesunde Leber hat WL12 nur einen begrenzten klinischen Nutzen. Andere radioaktiv markierende Peptide wie TPP1 und SETSKSF, die spezifisch an PD-L1 binden, haben ebenfalls potenzielle Stabilität und Spezifität gezeigt, um die PD-L1-Expression des gesamten Körpers sichtbar zu machen39,40. Unmodifizierte Peptide werden jedoch leicht von Proteasen abgebaut und schnell von der Niere verstoffwechselt. Dextrorotary(D)-Peptide werden aufgrund der schlechten Stabilität von linkshändigen (L)-Peptiden häufig als wirksame Mediatoren eingesetzt 41,42,43. D-Peptide sind hyperresistent gegen proteolytischen Abbau und haben bemerkenswert verlängerte metabolische Halbwertszeiten. Im Vergleich zu ihren L-Pendants zeigen D-Peptide meist spezifische Bindungsfähigkeiten 44,45,46.
In dieser Studie wurde eine neue Methode zum Nachweis der PD-L1-Expression entwickelt, die auf der PET-Bildgebung eines 68Ga-markierten PD-L1-gerichteten D-Peptids, des D-Dodecapeptid-Antagonisten (DPA), in einem tumortragenden Mausmodellbasiert 47. Die Stabilität von [68Ga]DPA wurde zunächst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Mausserum untersucht, danach wurde die Bindungsaffinität von [68Ga]DPA in PD-L1-überexprimierenden Tumoren getestet. Danach wurde eine PET-Bildgebung in Glioblastom-Xenograft-Modellen durchgeführt, um zu bestätigen, ob [68Ga]DPA ein idealer PET-Tracer zur Überwachung der PD-L1-Expression in Tumoren ist. Die Kombination von PET-Bildgebung und DPA bietet nicht nur einen neuen Ansatz zur Bewältigung der Herausforderungen, die mit der heterogenen Expression von PD-L1 verbunden sind, sondern legt auch die Grundlage für die Entwicklung von D-Peptid-basierten Radiotracern.
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Protocol
Die tierexperimentellen Verfahren wurden von der Tierethikkommission der Nanjing Medical University oder den National Institutes of Quantum Science and Technology genehmigt. Die Mäuseversuche wurden streng nach den institutionellen Richtlinien des Ausschusses für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.
1. Peptidsynthese
- 100 mg 4-Methylbenzhydrylamin (MBHA)-Harz (Beladungskapazität von 0,37 mmol/g) in 1 ml N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) für 30 Minuten unter mildemN2-Blasenbildung aufquellen lassen.
- Bereiten Sie einen frischen Stammpuffer aus Fmoc-geschützten Aminosäuren (5,0 Äquiv), HCTU (4,9 Äquiv) und DIPEA (10,0 Äquiv) in 1 ml NMP vor und fügen Sie ihn dem Harz (100 mg) hinzu. Lassen Sie die Kupplungsreaktion 1,5-2 Stunden lang andauern.
- Bereiten Sie einen Entschützungspuffer vor, der zu 50 % (vol/vol) aus Morpholin in NMP besteht. Waschen Sie das Harz (100 mg) 2 x 30 min mit 1 ml des Entschützungspuffers in jeder Wäsche, um die Fmoc-Gruppe auf der Amingruppe zu entfernen. Waschen Sie das Harz 1 Minute lang mit Dichlormethan (DCM; 1 ml), entfernen Sie das DCM und waschen Sie das Harz erneut mit NMP (1 ml) für weitere 1 Minute. Entfernen Sie als Nächstes das NMP und waschen Sie das Harz 1 Minute lang mit DCM.
HINWEIS: Alle Waschvorgänge werden unter mildemN2-Blasenbildung durchgeführt. Die oben genannten Vorgänge werden bis zur letzten Aminosäure wiederholt. - Um dem Peptid 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) zuzusetzen, wird das DOTA mit N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC· HCl) und N-Hydroxysuccinimid (NHS). Inkubieren Sie den Vorratspuffer von DOTA/EDC· HCl/NHS in einem molaren Verhältnis von 1:1:1 in Dimethylsulfoxid (DMSO) für 3 h, mit einer DOTA-Endkonzentration von 1 M. Als nächstes wird der Stammpuffer (1 ml) zum Harz (100 mg) gegeben und die Reaktion 2 h lang mit sanftemN2-Blasenbildung fortgesetzt.
HINWEIS: 1,4,7-Triazacyclononan-1,4,7-triessigsäure (NOTA) kann auch als Chelator für die 68-Ga-Komplexierungverwendet werden. Die gleichen Verfahren können für die NOTA-Kopplung verwendet werden. - Spülen Sie das Harz gründlich von oben mit DCM ab und wenden Sie gleichzeitig ein Vakuum an, um die Reste der Reaktionslösung zu entfernen. Spülen Sie das Harz 3x mit DCM (1,5 ml) und spülen Sie es dann mit MeOH (1,5 ml) ab, um das Harz zu schrumpfen. Stellen Sie das Harz über Nacht oder mindestens 4 h lang unter Hochvakuum, bis das Harz trocken ist.
- Geben Sie das getrocknete DPA-peptidhaltige Harz in einen 2-ml-Polypropylenbehälter mit Schraubverschluss. Geben Sie den entsprechenden Spaltcocktail hinzu (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2 Oim Volumen; 1 ml/100 mg Harz) und verschließen Sie den Behälter mit einem Schraubverschluss fest. Die Reaktion wird auf einem Orbitalschüttler in einem Abzug bei 20-25 °C für 2 h vorsichtig gerührt.
VORSICHT: Bereiten Sie Trifluoressigsäure (TFA) in einem Abzug mit Schutzkleidung zu, da sie stark ätzend ist. - Entfernen Sie den größten Teil der TFA durch Verdampfung unter Stickstoff im Abzug. Fällt die Peptide durch Zugabe von Diethylether (~1,5 ml/100 mg Harz) aus.
- Die Mischung wird vorgewirbelt, um die Peptide zu trituieren und bei Raumtemperatur (10.000 × g, 5 min) zu zentrifugieren. Gießen Sie das Lösungsmittel vorsichtig aus dem Behälter. Wiederholen Sie die Schritte 1.7 bis 1.8.
- Trocknen Sie die Rückstände 10 Minuten lang im offenen Behälter an der Luft. Fügen Sie 50% (vol/vol) wässriges Acetonitril hinzu und wirbeln Sie 1-2 s lang vor, um die Produkte aufzulösen (1 ml/100 mg Harz).
- Entfernen Sie das Harz, indem Sie die Mischung filtrieren, und waschen Sie das Harz dann 2x mit 0,2 ml 50% (vol/vol) wässrigem Acetonitril. Mischen Sie die Filtrate für die Aufreinigung mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Verwenden Sie die folgenden HPLC-Bedingungen. Säule: YMC-Triat-C18 (4,6 mm Innendurchmesser, 150 mm, 5 mm); Lösungsmittelgradient: Lösungsmittel-A-deionisiertes Wasser; Lösungsmittel B-Acetonitril (0,1 % TFA); Fließzeit: 20 min, mit Acetonitril von 10% bis 90%; Durchflussrate: 1 ml/min.
- Die gesammelten HPLC-Eluenten werden über Nacht bei -80 °C eingefroren und lyophilisiert (-50 °C und <1 pa). Für die radioaktive Markierung wird das feste Peptid in Natriumacetatpuffer (100 mM, pH 5,0) in einer Endkonzentration von 1 mg/ml als Stammpuffer gelöst.
2. 68Ga radioaktive Markierung
ANMERKUNG: 68Ga wurde intern im Nanjing First Hospital (Nanjing, China) mit einem 68Ge/68Ga-Generator erzeugt.
- Pipettieren Sie 5 μl Stammpuffer in einen 1,5-ml-Polypropylenbehälter mit Schraubverschluss. 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μl) in den Behälter geben.
- Die Mischung 5 s lang vortexen. Messen Sie den pH-Wert mit pH-Teststreifen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH (0,1 m) auf 4-4,5 ein.
HINWEIS: Ein geeigneter pH-Wert ist entscheidend für die Komplexierung zwischen 68Ga und DOTA. - Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten. Das Reaktionsgemisch wird einer Radio-HPLC unterzogen, um die radioaktive Markierungsausbeute unter den folgenden Bedingungen zu analysieren: Säule: YMC-Triat-C18 (4,6 mm Innendurchmesser, 150 mm, 5 mm); Lösungsmittelgradient: Lösungsmittel-A-deionisiertes Wasser; Lösungsmittel B-Acetonitril (0,1 % TFA); Fließzeit: 20 min, mit Acetonitril von 10% bis 90%; Durchflussrate: 1 ml/min.
HINWEIS: Die Radiodünnschichtchromatographie (DC) kann als alternativer Ansatz zur Untersuchung der radioaktiven Markierungsausbeute verwendet werden. Der vorgeschlagene TLC-Elutionspuffer beträgt 0,1 M Na3C6H5O7, pH4.
3. Prüfung der Tracerstabilität
- Tracer-Stabilitätstest bei PBS
- [68Ga]DPA (10 μl, 3,7 MBq, in NaOAc) zum PBS (990 μl) geben. Bei 37 °C für 1, 2 und 4 h unter leichtem Rühren inkubieren.
- Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt 200 μl der Lösung. Injizieren Sie es zur Analyse in die Radio-HPLC.
- Tracerstabilität im Mäuseserum
- [68Ga]DPA (10 μl, ~3,7 MBq, in NaOAc) zum Mausserum (90 μl, frisch zubereitet) geben. Bei 37 °C für 1, 2 und 4 h unter leichtem Rühren inkubieren.
- Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt 20 μl der Lösung. MeCN und Wasser (100 μl, 1:1, v/v) zugeben.
- Die Mischung wird 10 min zentrifugiert (5.000 × g, 25 °C). Analysieren Sie den Überstand mittels Radio-HPLC.
4. Analyse der PD-L1-Expression mittels Durchflusszytometrie
- Bereiten Sie das Nährmedium vor, indem Sie das RPMI-1640-Medium mit 10 % (vol/vol) fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin (vol/vol) ergänzen. Resuspendieren Sie die U87MG-Zellen in Kulturmedium und säen Sie sie in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 105 Zellen/Well. Die Zellen werden in einen Inkubator (5 % CO2, 37 °C) gegeben und mindestens 24 Stunden lang ohne Störung kultiviert.
- Waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml PBS und fügen Sie 250 μl Trypsin-EDTA (0,25 %) hinzu. Die Zellen werden für 2 min in den Inkubator (5% CO2, 37 °C) zurückgelegt.
- Fügen Sie 1 ml Kulturmedium hinzu, um die Zelldissoziation zu stoppen. Geben Sie Medium zu den Zellen, um sie durch Auf- und Abpipettieren von den Schalen zu lösen, und sammeln Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min (100 × g).
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PBS. Die Zellen 5 min zentrifugieren (100 × g). Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
- Der Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierte PD-L1-Antikörper wird mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) auf 20 nmol/L verdünnt. Zu den Zellen geben und bei 4 °C für 1 h inkubieren.
- Die Zellen werden 5 Minuten lang zentrifugiert (100 × g), gefolgt von zweimaligem Waschen mit kaltem PBS. Analysieren Sie die PD-L1-positiven Zellen mit einem Durchflusszytometer und einer Analysesoftware.
5. Immunzytochemie
- Die U87MG-Zellen werden in Zellkulturschalen mit Glasboden (35 mm) mit einer Dichte von 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Wenn eine Konfluenz von 60 % erreicht ist, wird das Nährmedium abgesaugt und 1 ml PBS hinzugefügt. Mehrmals vorsichtig schütteln und absaugen. Führen Sie den Waschschritt 3x durch.
- Geben Sie 500 μl 4%iges Paraformaldehyd in das Geschirr. Stellen Sie die Zellen auf Raumtemperatur und fixieren Sie sie für 30 Minuten.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Fügen Sie 1 ml 3 % BSA (Gew./Vol., in PBS) hinzu und blockieren Sie die fixierten Zellen für 2 h bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die 3%ige BSA und inkubieren Sie die Zellen direkt mit einem primären Anti-PD-L1-Antikörper (mAb, 1:100, verdünnt in 3% BSA) über Nacht bei 4 °C.
HINWEIS: Nachdem Sie die Zellen mit BSA blockiert haben, waschen Sie sie nicht mit PBS. - Waschen Sie die Zellen 3x mit 3% BSA-Puffer. Die Zellen werden 1 h lang mit FITC-konjugiertem anti-humanem IgG-Fc-Sekundärantikörper (1:500, verdünnt in PBS) inkubiert.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Geben Sie 0,5 ml DAPI (1 μg/ml) zu den Zellen und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die gefärbten Zellen 3x mit PBS und beobachten Sie sie mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop.
6. Zelluläres Aufnahme- und Hemmungsexperiment
- Experiment zur zellulären Aufnahme
- Kultivieren Sie die U87MG-Zellen in 12-Well-Platten, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml PBS.
- Die [68Ga]DPA wird in frischem Medium auf eine Konzentration von 74 KBq/ml verdünnt. Geben Sie 0,5 ml des verdünnten [68Ga]DPA-Puffers in jede Vertiefung.
- Die Zellen werden mit [68Ga]DPA bei 37 °C für unterschiedliche Zeiträume (10, 30, 40 und 120 min) inkubiert. Saugen Sie das Medium mit einer Pipette an. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS (0,5 ml).
- Fügen Sie NaOH-Lösung (0,5 M, 300 μl pro Well) hinzu, um die Zellen zu lysieren. Nach 30 s werden die viskosen Zelllysate in 1,5-ml-Röhrchen gesammelt.
- Waschen Sie die Platte zweimal mit 0,4 ml PBS. Sammeln Sie die Waschlösung in dem obigen 1,5-ml-Röhrchen.
- Starten Sie den eingebauten Computer des automatischen Gamma-Zählers; Legen Sie die Röhrchen in das eingebaute Regal. Nachdem Sie alle Proben auf das Förderband geladen haben, drücken Sie die START-Taste. Die Ergebnisse werden in der internen Software berechnet. Die Auslesung zeichnet die zerfallskorrelierte Anzahl pro Minute (CPM) jedes Röhrchens auf.
- Kompetitiver Bindungsassay
- Kultivieren Sie die U87MG-Zellen in 12-Well-Platten, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml PBS.
- [68Ga]DPA wird in frischem Medium auf eine Konzentration von 74 KBq/ml verdünnt. Eine angemessene Menge an BMS202-Verbindungen wird in 10%igem DMSO gelöst, um eine Konzentration von 10 mM (400 μl) zu erhalten.
- Verdünnen Sie 4 μl 10 mM BMS202 in 396 μl PBS, um eine Konzentration von 100 μM zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Schritt, um verschiedene Konzentrationen von BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM und 1 pM) zu erhalten.
- Geben Sie 0,5 ml des verdünnten [68Ga]DPA-Puffers in jede Vertiefung (0,37 MBq pro Vertiefung). Geben Sie 5 μl der BMS202-Lösungen in jede Vertiefung (drei Vertiefungen für jede Konzentration). Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellinkubator bei 37 °C für 120 min.
- Saugen Sie das Medium mit einer Pipette an. Waschen Sie die Zellen mit 3 x 0,5 ml PBS.
- Fügen Sie die NaOH-Lösung (0,5 M, 300 μl pro Well) hinzu, um die Zellen zu lysieren. Nach 30 s werden die viskosen Zelllysate in 1,5-ml-Röhrchen gesammelt. Waschen Sie die Platte mit 2 x 0,4 ml PBS.
- Sammeln Sie die Waschlösung in dem obigen 1,5-ml-Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen in die eingebaute Ablage des automatischen Gammazählers.
- Gehen Sie wie in Schritt 6.1.6 vor.
7. PET-Bildgebung
HINWEIS: Führen Sie PET-Bildgebung bei kleinen Tieren mit einem Mikro-PET-Scanner durch, der 159 axiale Querschnitte im Abstand von 0,796 mm (von Mitte zu Mitte) mit einem horizontalen Sichtfeld von 10 cm und einem axialen Sichtfeld von 12,7 cm bietet. Alle Daten, die im Listenmodus gesammelt werden, sind in dreidimensionalen Sinogrammen organisiert. Der Fourier wird dann wieder zu zweidimensionalen Sinogrammen zusammengesetzt (Rahmen × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).
- Verwenden Sie in dieser Studie männliche, 5-8 Wochen alte BALB/C-Nacktmäuse. Entnehmen Sie die U87MG-Zellen gemäß den Schritten 4.1-4.4 und saugen Sie die Zellen in eine 0,5-ml-Spritze ab. Subkutan injizieren Sie die Zellen in die Mäuse (1 × 106 Zellen pro Tumor, zwei Tumore pro Maus). Überwachen Sie das Tumorwachstum nach der Injektion, bis das Tumorvolumen 100-300 mm beträgt3.
- Betäuben Sie die Mäuse mit 1%-2% (v/v) Isofluran (1 ml/min). Schalten Sie das Heizgerät ein und halten Sie das Tierbett aus PET bei 37 °C.
- Bringen Sie die betäubten Mäuse in die richtige Position auf das Tierbett der PET-Maschine. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.
VORSICHT: Halten Sie die Mäuse in Bauchlage, um den Tod während des Scannens zu vermeiden. Während des gesamten Bildgebungsprozesses wird der Isofluran-Fluss (1,0 ml/min) über die Nase mit einem vorinstallierten Röhrchen verabreicht. - Stellen Sie die Position des Tierbettes über das Bedienfeld ein. Die Tracer (10-17 MBq/100-200 μL) werden intravenös durch einen vorinstallierten Schwanzvenenkatheter injiziert.
- Erstellen eines Scan-Workflows auf einem Host-Computer mit der referenzierten Software (siehe Materialtabelle) Erstellen Sie einen Studienordner und legen Sie das Erfassungsprotokoll gemäß dem Protokoll des Herstellers fest. Führen Sie dynamische Scans (60 Minuten für jede Maus) auf allen Mäusen im 3D-Listenmodus durch.
- Definieren Sie ein Histogrammprotokoll und ein Rekonstruktionsprotokoll gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie Hannings Filter mit einem Nyquist-Cutoff von 0,5 Zyklen/Pixel, um dynamische PET-Bilder (25-30 min und 55-60 min) durch gefilterte Rückprojektion zu rekonstruieren. Generieren Sie MIP-Bilder (Maximum Intensity Projection) für alle Mäuse.
- Kombinieren Sie die Protokolle in einem Workflow, und führen Sie den Workflow aus. Analysieren Sie die resultierenden dreidimensionalen Bilder mit der Software gemäß dem Protokoll des Herstellers.
HINWEIS: Verwenden Sie die Simulationssoftware, um die gewünschten Volumina auszuwählen. Die Radioaktivität wird auf den Injektionszeitpunkt korrigiert und als Prozentsatz der gesamten Injektionsdosis/pro Gramm Gewebe (% ID/g) dargestellt.
8. Ex-vivo-Bioverteilung
- Verabreichung von [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μl) an die U87MG-tragenden BALB/C-Nacktmäuse durch Schwanzveneninjektion. Betäuben Sie die Mäuse mit 1%-2% (v/v) Isofluran (1 ml/min) und opfern Sie dann drei Mäuse durch Zervixluxation nach der Injektion für 5, 30, 60 und 120 Minuten.
HINWEIS: Die Personen, die dieses Verfahren vorführen, sollten in den technischen Fähigkeiten der zervikalen Luxation geschult werden, um sicherzustellen, dass der Bewusstseinsverlust schnell eingeleitet wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Euthanasieverfahren in diesem Experiment alle human durchgeführt werden. - Nachdem der Tod bestätigt wurde, öffnen Sie die Brustwand der Mäuse. Öffne dann das Herz. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um Blut zu entnehmen. Drücken Sie das Blut aus der Spritze in ein Radioimmunoassay-Röhrchen (RIA) (13 mm Durchmesser) für den Gamma-Zähler.
- Entfernen Sie die wichtigsten Organe und Tumore und legen Sie sie in RIA-Röhrchen (13 mm Durchmesser) für den Gamma-Zähler. Zu den wichtigsten Organen gehören das gesamte Blut, das Herz, die Thymusdrüse, die Leber, die Milz, der Knochen, der Magen, die Nieren, die Muskeln, der Darmlymphknoten, der Dünndarm, die Bauchspeicheldrüse, die Hoden, das Gehirn und die Lunge. Wiegen Sie alle Organe.
- Messen Sie die Radioaktivität in den gesammelten Organen mit einem Autogamma-Zähler und korrigieren Sie die Werte. Berechnen Sie den Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Feuchtgewebe (% ID/g).
9. Immunhistochemie
- Sammeln Sie das Gliomgewebe und waschen Sie es 3x mit PBS. Das frische Gewebe wird in 4% Paraformaldehyd eingelegt und über Nacht bei 4 °C fixiert.
- Betten Sie das fixierte Gewebe in Paraffin ein und schneiden Sie es auf eine Dicke von 10 μm. Die Abschnitte in einen Inkubator (60 °C) geben und 2 h inkubieren. Entwachsen und hydratisieren Sie die Abschnitte, indem Sie jeweils 10 Minuten lang inkubieren: Xylol (zweimal), absoluter Alkohol, 95% Alkohol, 90% Alkohol, 80% Alkohol, 75% Alkohol.
- Die Abschnitte werden in 0,01 M Natriumcitrat eingelegt und auf 92-95 °C erhitzt. Halten Sie die Temperatur 40 Minuten lang, um eine Antigengewinnung zu erreichen.
- Geben Sie 200 μlH2O2-Lösung(3 %) zu den Abschnitten und inaktivieren Sie die Endoperoxidasen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Blockieren Sie die unspezifischen Stellen durch Behandlung mit 3% BSA für 2 h bei Raumtemperatur.
- Die Schnitte werden über Nacht bei 4 °C in einem primären Anti-PD-L1-Antikörper (mAb, 1:100, verdünnt in 3% BSA) inkubiert.
HINWEIS: Nach dem Blockieren mit BSA nicht mit PBS waschen. - Waschen Sie die Partien 3x mit PBS. Die Schnitte werden mit HRP-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500, verdünnt in PBS) bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. 200 μl 3,3-Diaminobenzidin (DAB)-Arbeitslösung (Lösung A: Lösung B: Lösung C = 1:1:18) zu den Abschnitten geben und 5 min im Dunkeln inkubieren.
- Waschen Sie die Partien 3x mit PBS. 500 μl Hämatoxylinlösung (100 %) zugeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Partien 30 s lang mit Wasser. Die Abschnitte werden für 30 s in Differenzierungslösung (75%iger Alkohol: HCL = 99:1) gegeben. Waschen Sie die Abschnitte 1 Minute lang mit Wasser.
- Dehydrieren Sie die Proben durch sequenzielles Inkubieren mit 75 % Alkohol, 80 % Alkohol, 90 % Alkohol, 95 % Alkohol, absolutem Alkohol und Xylol (zweimal) (jeweils 10 Minuten). Montieren Sie alle Schnitte mit Neutralharz und beobachten Sie sie unter einem Lichtmikroskop.
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Representative Results
[68Ga]DPA-Radiomarkierung und Stabilität
Das Modellpeptid DPA ist ein wirksamer PD-L1-Antagonist. DOTA-DPA wurde mit einer Reinheit von >95 % und einer Ausbeute von 68 % erhalten. Die Masse von DOTA-DPA liegt experimentell bei 1.073,3 ([M+2H]2+). 68Gallium gilt als geeignetes Radionuklid zur Markierung von Peptiden für die PET-Bildgebung und wurde daher für diese Studie ausgewählt. Zur radioaktiven Markierung von DPA mit 68Ga (Halbwertszeit: 68 min) wurde DOTA-PEG3-DPA synthetisiert (Abbildung 1A). DOTA wurde als Chelator für die 68Ga-Radiomarkierung verwendet. Um DOTA und DPA in den Weltraum zu bringen, wurde PEG3 als Linker verwendet. Die [68Ga]-DOTA-PEG3-DPA (im folgenden Text als [68Ga]DPA bezeichnet) zeigte eine hohe radiochemische Ausbeute (>95%) und radiochemische Reinheit (>95%) (Tabelle 1). Ein Tracer-Stabilitätstest wurde ebenfalls mittels HPLC durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass [68Ga]DPA sowohl in PBS als auch im Mausserum eine große Stabilität aufwies. Die 68Ga-Zersetzung oder Peptidhydrolyse wurde nach einer 4-stündigen Inkubation bei 37 °C nicht nachgewiesen (Abbildung 1B).
Expression von PD-L1 in U87MG-Zellen
Eine frühere Studie zeigte, dass eine erhöhte Expression von PD-L1 mit einem schlechten Überleben der Patienten bei Glioblastomtumoren korreliert, was darauf hindeutet, dass PD-L1 ein bemerkenswerter prognostischer Biomarker und ein therapeutisches Ziel beim Glioblastom sein könnte48. Daher wurde eine humane Glioblastom-Zelllinie, U87MG, verwendet, um ein Tumormodell zu etablieren, um die Wirksamkeit von [68Ga]DPA in PET/CT für die PD-L1-Tumorbildgebung zu bestimmen. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie deuteten darauf hin, dass etwa 60 % der U87MG-Zellen PD-L1-positiv waren (Abbildung 2A). Darüber hinaus bestätigte die Immunfluoreszenzfärbung die starke Expression von PD-L1 in den U87MG-Zellen (Abbildung 2B). Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass die U87MG-Zelllinie für diese Studie geeignet war.
Zelluläre Aufnahme und Spezifität von [68Ga]DPA
Die Aufnahme von [68Ga]DPA durch U87MG-Zellen zeigte ein zeitabhängiges Muster. Wenn ein PD-L1-Inhibitor, BMS202, als Blockierungsmittel verwendet wurde, waren der Bindungsanteil und die Aufnahme von [68Ga]DPA signifikant reduziert (Abbildung 3A). Ein kompetitiver Bindungsassay untersuchte außerdem die Bindungsaffinität (Ki) von BMS202 an die U87MG-Zellen. Die geschätzte Bindungsaffinität betrug 43,8 ± 8,6 nmol/L für BMS202, wenn [68Ga]DPA als Konkurrent verwendet wurde (Abbildung 3B).
[68Ga]DPA-PET-Bildgebung von Tumormodellen
Die PET-Bildgebung von [68Ga]DPA wurde an U87MG-tumortragenden BALB/C-Nacktmäusen durchgeführt. [68Ga] DPA wurde durch intravenöse Injektion verabreicht, bis der U87MG-Tumor auf 100mm 3 angewachsen war. Ganzkörper-PET-Bilder zeigten eine hohe [68Ga]DPA-Akkumulation im Tumor nach 30 und 60 Minuten Injektion und die höchste Akkumulation in Niere und Blase (Abbildung 4A). Um zu bestätigen, ob [68Ga]DPA spezifisch in PD-L1-positiven Tumoren akkumuliert, wurde ein weiteres Mausmodell mit der PanNET-Zelllinie Bon-1 als Negativkontrolle verwendet. Ein paralleles Experiment zeigte eine geringe [68Ga]DPA-Akkumulation in Bon-1-Tumoren 60 Minuten nach der Injektion (Abbildung 4B).
Um diesen Unterschied zu klären, wurde eine immunhistochemische Färbung durchgeführt, um die PD-L1-Expression in Tumorgeweben zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die U87MG-Zellen eine beträchtliche PD-L1-Expression aufwiesen (Abbildung 5A,C), nicht jedoch der Bon-1-Tumor (Abbildung 5B,C). Diese Daten stimmten mit den PET-Ergebnissen überein. Daher ist es möglich, dass die unterschiedlichen Wachstumsstadien der Tumorzellen zu einer unterschiedlichen PD-L1-Expression (z.B. Gewebenekrose) geführt haben. Um dies zu überprüfen, wurde eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) durchgeführt. Wie erwartet, wurde eine ähnliche Zellmorphologie zwischen den beiden Tumorgeweben beobachtet (Abbildung 5D).
Ex vivo Biodistribution von [68Ga]DPA in U87MG Tumoren
Die Ex-vivo-Bioverteilungsstudie wurde ebenfalls mit U87MG-tragenden Mäusen durchgeführt (Tabelle 2). Die Ergebnisse zeigten eine schnelle Clearance im Blut und in den meisten analysierten Organen, einschließlich Herz, Leber, Lunge und Muskeln. Die Niere akkumulierte die höchste Menge an Radioaktivität und zeigte eine Clearance-Rate von 0,12% ID/(g∙min) von 5 min bis 120 min. Der Tumor wies zu allen Zeitpunkten die zweithöchste Traceraufnahme auf. Darüber hinaus wies der Tumor von 5 Minuten bis 60 Minuten nach der Injektion eine niedrigere Tracer-Clearance-Rate von 0,027 % ID/(g∙min) auf. Für Blut betrug die Clearance-Rate 0,069 % ID/(g∙min), während die Clearance-Rate für Muskeln 0,037 % ID/(g∙min) betrug.
Abbildung 1: [68Ga]DPA-Radiomarkierung und -Stabilität. (A) Die chemische Struktur von [68Ga]DPA und die schematische Darstellung seiner Bindung an PD-L1-exprimierende Tumorzellen. (B) HPLC-Kurven, die die Radioaktivität von [68Ga]DPA nach Inkubation mit PBS oder Mausserum für 0,5, 2 und 4 Stunden zeigen. Diese Abbildung wurde von Hu et al.47 modifiziert. Abkürzungen: DPA = Dodecapeptid-Antagonist; PD-L1 = programmierter Todesligand 1; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; HPLC = Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Expression von PD-L1 in der U87MG-Zelllinie. (A) Die Expression von PD-L1 in der U87MG-Zelllinie wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. (B) Die Expression von PD-L1 in U87MG-Zellen wurde mittels Immunfluoreszenz-Färbeassay gemessen. Maßstabsbalken = 100 μm. Diese Abbildung wurde von Hu et al.47 modifiziert. Abkürzungen: PD-L1 = programmierter Todesligand 1; SSC = seitliche Streuung; FITC = Fluoresceinisothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zelluläre Aufnahme und Hemmung von [68Ga]DPA. (A) Die Aufnahme von U87MG-Zellen bei Inkubation mit [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) oder [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) + BMS202 (100 μmol/l) für unterschiedliche Zeiträume. (B) Wettbewerbsfähige Bindung von [68Ga]DPA (0,74 MBq/ml) an die U87MG-Zellen nach Inkubation mit BMS202. Der Ki-Wert wird im Panel angezeigt. Diese Abbildung wurde von Hu et al.47 modifiziert. Abkürzungen: DPA = Dodecapeptid-Antagonist; %AD = verabreichte Dosis (bezogen auf den Bindungsanteil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: PET-Bildgebung von [68Ga]DPA in PD-L1-überexprimierenden U87MG-Tumoren. (A,B) PET-CT-Aufnahmen zeigen die Verteilung von [68Ga]DPA in U87MG-tragenden Mäusen (A) und Bon-1-tragenden Mäusen (Negativkontrolle, B) nach intravenöser Injektion (~18,5 MBq) für 30 min und 60 min. Repräsentative Maxiumum-Intensitäts-Projektion (MIP) (oberes Bild) und transversale PET-CT-Bilder (unteres Bild) werden präsentiert. Die Tumorpositionen sind durch weiß gestrichelte Kreise markiert. Diese Abbildung wurde von Hu et al.47. Abkürzungen: DPA = Dodecapeptid-Antagonist; PD-L1 = programmierter Todesligand 1; PET-CT = Positronen-Emissions-Tomographie-Computertomographie; MIP = Projektion mit maximaler Intensität; P.I. = Post-Injektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Immunhistochemische Analyse von [68Ga]DPA-behandelten Tumoren. (A,B) Immunhistochemische Ganzschnittaufnahmen von PD-L1 in (A) U87MG und (B) Bon-1 Tumoren. (C) Vergrößerte Bilder der markierten Bereiche in A und B. (D) H&E-Färbung von U87MG- und Bon-1-Tumoren. Maßstabsbalken = 100 μm (C,D). Diese Abbildung wurde von Hu et al.47 modifiziert. Abkürzungen: DPA = Dodecapeptid-Antagonist; PD-L1 = programmierter Todesligand 1; H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Tracer | [68Ga] DPA |
| Radiochemische Ausbeute (%) | >95 |
| Molare Aktivität (GBq μmol-1) | 37 ± 8 |
| Radiochemische Reinheita (%) | >95 |
Tabelle 1: Radioaktive Markierung und Qualitätskontrolle von [68Ga]DPA. Radiochemische Ausbeute, molare Aktivität und radiochemische Reinheit von [68Ga]DPA. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 7) dargestellt. Diese Tabelle wurde von Hu et al.47 modifiziert. Abkürzung: DPA = Dodecapeptid-Antagonist. einDie radiochemische Reinheit von [68Ga]DPA wurde mittels Umkehrphasen-HPLC unter optimierten Bedingungen analysiert: 1) Säule: YMC-Triat-C18 (4,6 mm i.d., 150 mm, 5 mm); 2) Lösungsmittelgradient: Lösungsmittel-A-deionisiertes Wasser; Lösungsmittel B-Acetonitril (0,1 % Trifluoressigsäure); Fließzeit: 20 min, mit Acetonitril von 10% bis 90%; Durchflussrate von 1 ml/min.
| [68Ga] DPA | ||||||||
| 5 Minuten | 30 min | 60 Minuten | 120 min | |||||
| Blut | 3.89 | ±0,43 | 1.55 | ±1.07 | 0.11 | ±0,02 | 0.05 | ±0,01 |
| Herz | 1.19 | ±0,39 | 0.52 | ±0,33 | 0.06 | ±0,02 | 0.05 | ±0,02 |
| Leber | 1.06 | ±0,26 | 0.59 | ±0,43 | 0.19 | ±0,02 | 0.16 | ±0,04 |
| Milz | 0.98 | ±0,14 | 0.68 | ±0,67 | 0.14 | ±0,06 | 0.09 | ±0,03 |
| Lunge | 1.64 | ±0,42 | 1.03 | ±0,9 | 0.13 | ±0,05 | 0.09 | ±0,02 |
| Niere | 19.23 | 1,95 ± | 16.13 | ±1,51 | 11.5 | ±0,44 | 5.2 | ±0,31 |
| Magen | 1.54 | ±0,1 | 0.61 | ±0,35 | 0.08 | ±0,01 | 0.08 | ±0,03 |
| Darm | 0.72 | ±0,27 | 0.47 | ±0,35 | 0.08 | ±0,02 | 0.06 | ±0,03 |
| Bauchspeicheldrüse | 1.88 | ±0,28 | 0.77 | ±0,75 | 0.16 | ±0,03 | 0.13 | ±0,03 |
| Muskel | 2.21 | ±0,27 | 0.71 | ±0,37 | 0.18 | ±0,02 | 0.14 | ±0,04 |
| Knochen | 2.18 | ±0,11 | 0.85 | ±0,51 | 0.26 | ±0,09 | 0.14 | ±0,06 |
| Gehirn | 0.19 | ±0,04 | 0.11 | ±0,08 | 0.03 | ±0,01 | 0.02 | ±0,01 |
| Tumor | 4.5 | ±0,32 | 3.77 | ±0,27 | 2.99 | ±0,03 | 0.89 | ±0,19 |
| Fett | 2.09 | ±0,49 | 0.81 | ±0,12 | 0.27 | ±0,07 | 0.1 | ±0,07 |
Tabelle 2: Bioverteilung von [68Ga]DPA in U87MG-Tumor-tragenden Mäusen nach Verabreichung über unterschiedliche Zeiträume (n = 3 pro Zeitpunkt). Diese Tabelle wurde von Hu et al.47 modifiziert. Abkürzung: DPA = Dodecapeptid-Antagonist.
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Discussion
Zu den kritischen Schritten, die bei dieser Methode beschrieben werden, gehören die effiziente Markierung von 68Ga zu DPA und die Auswahl eines geeigneten Zeitfensters für die PET-Bildgebung, das perfekt zum pharmakodynamischen Muster der DPA im Tumor passen muss.
Im Gegensatz zur IHC ermöglicht die PET-Bildgebung die nichtinvasive Detektion der PD-L1-Expression des gesamten Körpers in Echtzeit und ermöglicht die Visualisierung jedes positiven Bereichs in einem heterogenen Tumor 6,7. Als Liganden wurden Peptide gewählt, um die Nachteile von Antikörpern und kleinen Molekülen zu vermeiden. Antikörper mit großen Molekulargewichten haben im Allgemeinen eine lange zirkulierende Halbwertszeit, was zu einer höheren Toxizität für gesunde Organe führt. Die Clearance von kleinen Molekülen ist in der Regel zu schnell, um die erforderliche Tumorretention zu erreichen. Das Molekulargewicht von Peptiden liegt zwischen dem von Antikörpern und kleinen Molekülen. Dies ermöglicht es peptidbasierten Radiotracern, sowohl eine langfristige Tumorretention als auch eine gute Gewebepenetration bei minimaler Toxizität zu erreichen 13,49,50,51,52,53. Wichtig ist, dass der Nutzen des D-Peptids DPA im Gegensatz zu den häufig berichteten L-Peptiden dem [68Ga]DPA eine bemerkenswert verlängerte metabolische Halbwertszeit verleiht. Darüber hinaus ist DPA in vivo positiv geladen und hydrophil und hat daher eine hohe Löslichkeit und kann unspezifisches Targeting im Blut vermeiden, was die Erzeugung von PET-Bildern mit hoher Bildgebungsqualität erleichtert.
Insbesondere erfordert eine erfolgreiche radioaktiveMarkierung von 68 Ga einen spezifischen pH-Wert und keine Interferenz durch Übergangsmetallionen wie Cu(II)- und Fe(III)-Kationen. In einigen Fällen führt die Cu2+ Kontamination zu einer geringen radiochemischen Ausbeute. Daher ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Behälter und Pipettenspitzen nicht verunreinigt sind. Darüber hinaus wurde bei dieser Methode U87MG zur Tumorinokulation verwendet. Obwohl die PD-L1-Expression in U87MG-Xenotransplantaten in früheren Studien verifiziert wurde, variiert ihre Expression zwischen einzelnen Tieren. Daher variierte die absolute Aufnahme des Tracers in den U87MG-Tumoren zwischen den einzelnen Mäusen. Um eine effektive Traceraufnahme in den Tumoren zu gewährleisten, müssen Tiere mit einer geeigneten Tumorgröße (500mm3 < Volumen < 100 mm3) für die PET-Untersuchung ausgewählt werden.
Eine der Einschränkungen von [68Ga]DPA besteht darin, dass die Bindungsaffinität von DPA zu PD-L1 im Vergleich zu mehreren anderen PD-L1-Targeting-Peptiden, wie z. B. WL12, relativ gering ist, was es für Tumore mit relativ niedriger PD-L1-Expression ungeeignet macht26,47. Eine weitere Modifikation des D-Peptids wird seine spezifische Bindungskapazität verbessern. Um den bildgebenden Effekt von [68Ga]DPA zu verbessern, kann die Formulierung der Injektionsstrategie optimiert werden, beispielsweise durch gleichzeitige Injektion von unmarkiertem DPA vor [68Ga]DPA, um die unspezifischen Bindungsstellen54, 55, 56 zu blockieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Studie eine nicht-invasive Echtzeitmethode entwickelt wurde, um die PD-L1-Verteilung im gesamten Körper lebender Tiere unter Verwendung von [68Ga]DPA als Radiotracer zu verfolgen. Die Ergebnisse zeigten eine relativ hohe, in vivo spezifische Bindungsaffinität, günstige Stabilität und ausgezeichnete Bildgebungskapazität von [68Ga]DPA, was darauf hindeutet, dass [68Ga]DPA-PET ein vielversprechender Ansatz zur Visualisierung von PD-L1-überexprimierenden Tumoren ist. Darüber hinaus kann diese Technik auch auf die Behandlung von PD-L1-positiven Tumoren angewendet werden, wenn DPA mit anderen Radionukliden wie 177Lu und 225Ac markiert wird. Daher überwindet die DPA-Radiomarkierungstechnik nicht nur die Einschränkung der IHC-abhängigen Diagnose, sondern bietet auch eine neue Behandlungsoption.
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Disclosures
Es werden keine konkurrierenden Interessen deklariert.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Non-profit Central Research Institute Fund der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (Nr. 2022-RC350-04) und dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (Nr. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 und 2022-I2M-2-002) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) | Merck | 60239-18-1 | 68Ga chelation |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) Kit | Sigma-Aldrich | D7304-1SET | Immunohistochemistry |
| anti-PD-L1 monoclonal antibody | Wuhan Proteintech | 17952-1-ap | Immunohistochemistry: primary antibody |
| BMS202 | Selleck | 1675203-84-5 | Competitive binding assay: inhibitor |
| BSA | Merck | V900933 | Immunofluorescent : blocking |
| DAPI | Merck | D9542 | Immunofluorescent: staining of nucleus |
| Dichloromethane (DCM) | Merck | 34856 | Solvent |
| DIPEA | Merck | 3439 | Peptide coupling |
| EDC·HCl | Merck | E6383 | Activation of DOTA |
| FBS | Gibco | 10099 | Cell culture: supplement |
| FITC-conjugated anti-human IgG Fc Antibody | Biolegend | 409310 | Immunofluorescent: secondary antibody |
| FITC-conjugated anti PD-L1 antibody | Biolegend | 393606 | Flow cytometry: direct antibody |
| HCTU | Energy Chemical | E070004-25g | Peptide coupling |
| HRP labeled goat anti-rabbit antibody | Servicebio | GB23303 | Immunohistochemistry: secondary antibody |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Merck | 130672 | Activation of DOTA |
| MeCN | Merck | PHR1551 | Solvent |
| Morpholine | Merck | 8.06127 | Fmoc- deprotection |
| NMP | Merck | 8.06072 | Solevent |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Fixation of tissues |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture: buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 10378016 | Cell culture: supplement |
| RIA tube | PolyLab | P10301A | As tissue sample container |
| RPMI-1640 medium | Gibco | 11875093 | Cell culture: basic medium |
| Sodium acetate | Merck | 1.06264 | Salt for buffer |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell culture: dissociation agent |
| U87MG cell line | Procell Life Science & Technology Co | CL-0238 | Cell model |
| Equipment | |||
| 68Ge/68Ga generator | Isotope Technologies Munich, ITM | Not applicable | Generation of [68Ga] |
| Autogamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | Detection of radioactivity |
| Confocal fluorescent microscopy | Keyence | Observation of immunofluorescent results | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson, BD | LSRII | Monitoring the PD-L1 positive cells |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | SHIMAZU | LC-20AT | Purification of DPA peptide |
| PET scanner | Siemens Medical Solutions | Inveon MultiModality System | PET imaging |
| Optical microscopy | Nikon | Eclipse E100 | Observation of immunohistochemistry results |
| Solid phase peptide synthesizer | Promega Vac-Man Laboratory Vacuum Manifold | LOT#11101 | Synthesis of DPA-DOTA peptide |
| Software | |||
| ASIPro | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Analysis of PET-CT results |
| FlowJo | Becton Dickinson, BD | FlowJo 7.6.1 | Analysis of the flow cytometer results |
| Inveon Acquisition Workplace (IAW) | Siemens Medical Solutions | Not applicable | Management of PET mechine |
| Prism | Graphpad | Prism 8.0 | Analysis of the data |
References
- Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
- Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747 (2022).
- Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297 (2022).
- Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
- Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
- Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
- Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
- Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535 (2019).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
- Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538 (2022).
- Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
- Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664 (2018).
- Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
- Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
- Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
- Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
- Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
- Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
- Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
- Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294 (2021).
- Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572 (2020).
- Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
- Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
- Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
- Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
- Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738 (2020).
- Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
- Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
- Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
- (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
- Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
- De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
- Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189 (2019).
- Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
- Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
- Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
- Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
- Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
- Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
- Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
- Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
- Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
- Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
- Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
- Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
- Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
- Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
- Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
- Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
- Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).
