Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo's. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen en kan worden gebruikt om deze processen op een efficiënte manier te bestuderen.
Abstract
Nierorganoïden afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen bevatten nefronachtige structuren die tot op zekere hoogte lijken op die in de volwassen nier. Helaas wordt hun klinische toepasbaarheid belemmerd door het ontbreken van een functionele vasculatuur en bijgevolg beperkte rijping in vitro. De transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo's induceert vascularisatie door geperfuseerde bloedvaten, inclusief de vorming van glomerulaire haarvaten, en verbetert hun rijping. Deze techniek is zeer efficiënt, waardoor de transplantatie en analyse van grote aantallen organoïden mogelijk is. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor de intracelomische transplantatie van nierorganoïden in kippenembryo's, gevolgd door de injectie van fluorescerend gelabeld lectine om de perfuseerde vasculatuur te kleuren en de verzameling getransplanteerde organoïden voor beeldvormingsanalyse. Deze methode kan worden gebruikt om organoïde vascularisatie en rijping te induceren en te bestuderen om aanwijzingen te vinden voor het verbeteren van deze processen in vitro en het verbeteren van ziektemodellering.
Introduction
Van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC)-afgeleide nierorganoïden is aangetoond dat ze potentieel hebben voor ontwikkelingsstudies 1,2,3,4, toxiciteitsscreening 5,6 en ziektemodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Hun toepasbaarheid voor deze en eventuele klinische transplantatiedoeleinden wordt echter beperkt door het ontbreken van een vasculair netwerk. Tijdens de embryonale nierontwikkeling interageren podocyten, mesangiale cellen en vasculaire endotheelcellen (EC's) om de ingewikkelde structuur van de glomerulus te vormen. Zonder deze interactie kan de glomerulaire filtratiebarrière, bestaande uit podocyten, het glomerulaire keldermembraan (GBM) en EC's, zich niet goed ontwikkelen14,15,16. Hoewel nierorganoïden in vitro sommige EC's bevatten, vormen deze geen goed vasculair netwerk en verminderen ze na verloop van tijd17. Het is dan ook niet verwonderlijk dat de organoïden onvolgroeid blijven. Transplantatie bij muizen induceert vascularisatie en rijping van de nierorganoïden 18,19,20,21. Helaas is dit een arbeidsintensief proces dat niet geschikt is voor de analyse van grote aantallen organoïden.
Kippenembryo's worden al meer dan een eeuw gebruikt om vascularisatie en ontwikkeling te bestuderen22. Ze zijn gemakkelijk toegankelijk, vereisen weinig onderhoud, missen een volledig functioneel immuunsysteem en kunnen zich normaal ontwikkelen na het openen van de eierschaal23,24,25,26. De transplantatie van organoïden op hun chorioallantoïsche membraan (CAM) heeft aangetoond dat het leidt tot vascularisatie27. De duur van de transplantatie op de CAM, evenals het niveau van rijping van het transplantaat, worden echter beperkt door CAM-vorming, die tot embryonale dag 7 duurt om te voltooien. Daarom is onlangs een methode ontwikkeld om nierorganoïden efficiënt te vasculariseren en rijpen door intracelomische transplantatie in kippenembryo's28. De celomische holte van kippenembryo's is sinds de jaren 1930 bekend als een gunstige omgeving voor de differentiatie van embryonale weefsels29,30. Het is vroeg in de embryonale ontwikkeling toegankelijk en maakt een relatief onbeperkte uitbreiding van het transplantaat in alle richtingen mogelijk.
Dit artikel schetst een protocol voor de transplantatie van hiPSC-afgeleide nierorganoïden in de celomische holte van dag 4 kippenembryo's. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen. Injectie van fluorescerend gelabelde lens culinaris agglutinine (LCA) voorafgaand aan het opofferen van de embryo's maakt visualisatie van geperfuseerde bloedvaten in de organoïden mogelijk door middel van confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volgens de Nederlandse wet was voor dit onderzoek geen goedkeuring van de dierenwelzijnscommissie nodig.
1. Voorbereiden van hiPSC-afgeleide nierorganoïden voor transplantatie
- Differentieer hiPSC's tot nierorganoïden met behulp van het protocol ontwikkeld door Takasato et al.4,18,31. Kweek de organoïden volgens dit protocol op polyester celkweekinzetstukken met 0,4 μm poriën (celkweekinzetstukken) tot dag 7 + 12 van differentiatie. Elke celkweekinzet bevat drie organoïden.
- Verwijder de organoïden uit de celkweekinzet.
- Maak een gat in het midden van het membraan van de celkweekinzet met een paar ontleedtangen. Maak met een ontleedschaar drie sneden in het membraan van het gat in het midden tot de rand van de celkweekinzet, snijdend tussen de organoïden. Dit zal resulteren in drie stukken membraan, elk met één organoïde bevestigd, die nog steeds verbonden zijn met de celkweekinzet aan hun buitenrand.
- Pak een van de stukjes membraan dicht bij de buitenrand vast met een tang en scheur het los van de celkweekinzet. Plaats het stukje membraan met de aangehechte organoïde in een petrischaaltje. Voeg een paar druppels Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder calcium en magnesium (DPBS-/-) toe aan de organoïde om uitdroging te voorkomen. Herhaal dit voor de andere twee organoïden.
- Bisect de organoïden door hun membraan op hun plaats te houden met een tang en ze in tweeën te snijden met een dubbelzijdig roestvrijstalen scheermesje (een hele organoïde is te groot voor de celom om in dit stadium van ontwikkeling te accommoderen). Duw de twee organoïde helften voorzichtig van het membraan met een dura-dissector. Gooi het membraan weg en laat de organoïden in DPBS-/- tot transplantatie.
OPMERKING: Bereid maximaal drie organoïden tegelijk voor transplantatie om stress voor de organoïden voorafgaand aan de transplantatie te voorkomen. Idealiter bereidt één persoon de organoïden voor, terwijl een ander de transplantatie uitvoert.
2. Kippenembryo's voorbereiden voor transplantatie
- Incubeer bevruchte witte leghorneieren. Start de incubatie van de eieren op nierorganoïde differentiatie dag 7 + 8 om de juiste timing van de transplantatie te garanderen.
- Leg de bevruchte witte leghorneieren (Gallus domesticus) horizontaal op een houder (figuur 1A; dag 0), markeert het midden van de naar boven gerichte zijde met een potlood.
OPMERKING: Op maat gemaakte plastic houders of eierdozen kunnen worden gebruikt als houders om de eieren uit te broeden. - Plaats de houder met de eieren in een bevochtigde broedmachine bij 38 ± 1 ºC (figuur 1A; dag 0).
- Incubeer de eieren gedurende 3 dagen en houd het waterbassin in de broedmachine gevuld.
- Leg de bevruchte witte leghorneieren (Gallus domesticus) horizontaal op een houder (figuur 1A; dag 0), markeert het midden van de naar boven gerichte zijde met een potlood.
- Maak een venster in de eierschaal op dag 3 van de incubatie.
- Plaats op dag 3 van de incubatie een klein stukje (~ 1 cm x 0,5 cm) transparante tape op de puntige punt van het ei (klein uiteinde). Maak een klein gaatje in de eierschaal in het midden van de transparante tape door erop te tikken met het scherpe uiteinde van een ontleedschaar.
- Steek een naald van 19 G op een spuit van 5 ml in het gat onder een hoek van 45 °, vermijd schade aan de dooierzak en zuig 2-3 ml albumine uit het ei om het embryo in het ei te laten zakken. Sluit het gat af met een tweede stuk (~1 cm x 0,5 cm) transparante tape.
- Plaats een groot stuk (~ 5 cm x 5 cm) transparante tape op de met potlood gemarkeerde, naar boven gerichte kant van het ei. Maak een gat in de eierschaal in het midden van de transparante tape door erop te tikken met het scherpe uiteinde van een ontleedschaar (figuur 1A; dag 3).
- Begin vanuit dit gat en knip een klein cirkelvormig venster in de eierschaal met een gebogen ontleedschaar. Kijk door dit venster om het embryo te lokaliseren en vergroot vervolgens het venster om de toegang tot het embryo te optimaliseren (figuur 1A; dag 3).
- Verwijder grote stukken eierschaal die mogelijk bovenop het embryo zijn gevallen met een tang. Verwijder kleinere stukjes door een paar druppels DPBS met calcium en magnesium (DPBS+/+) met een plastic transferpipet op het embryo te plaatsen en vervolgens de DPBS+/+ met de eierschaal in de pipet te zuigen.
- Voeg drie druppels DPBS+/+ aangevuld met 0,5% penicilline/streptomycine toe aan het ei met behulp van een plastic transferpipet.
- Sluit het venster zorgvuldig af met een groot stuk (~ 5 cm x 5 cm) transparante tape voordat u het ei terug in de broedmachine plaatst tot dag 4 van de incubatie, wanneer het embryo zich in Hamburger-Hamilton stadium 23-24 (HH 23-24) bevindt.
OPMERKING: Het verzegelen van het raam is erg belangrijk om uitdroging en de dood van het embryo te voorkomen. - Controleer de embryo's dagelijks op levensvatbaarheid door ze door de tape te bekijken (verwijder de tape niet om uitdroging te voorkomen). Tijdens deze eerste dagen van incubatie verandert de kleur van de eierdooier van helder naar matgeel bij embryodood. Gooi overleden embryo's weg.
- Houd het waterbassin in de incubator gevuld.
3. Intracelomische transplantatie op dag 4 van de incubatie
- Toegang krijgen tot de celomische holte
- Knip de tape uit het raam met een gebogen ontleedschaar.
- Leg het ei onder een ontleedmicroscoop op een rubberen houder of eierdoos.
- Het kippenembryo bevindt zich nu in HH 23-24 en ligt aan de linkerkant, met de rechterkant naar de kijker gericht (figuur 1A; dag 4). Lokaliseer de rechtervleugel en beenknop van het embryo, omdat de celom toegankelijk is tussen deze twee ledemaatknoppen. Maak in het gebied tussen de rechtervleugel en de beenknop achtereenvolgens een opening in het vitellinemembraan, het chorion en het amnion, door ze vast te houden met twee paar ontleedtangen en ze voorzichtig in tegengestelde richtingen te trekken.
OPMERKING: Het vitelline-membraan is het eerste membraan dat wordt aangetroffen na het openen van het ei en is in sommige gevallen al beschadigd na het maken van het venster op dag 3. Als het embryo wordt gedraaid, liggend aan de rechterkant met de linkerkant naar de kijker gericht (figuur 1A; dag 4), is het noodzakelijk om het om te draaien om transplantatie mogelijk te maken. Maak hiervoor een grote opening in de vitelline en het chorionmembraan en draai het embryo vervolgens voorzichtig rond met een tang. - Controleer of er onbelemmerde toegang is tot de celomische holte: pak voorzichtig de rand van de lichaamswand tussen de vleugel en de ledemaatknop vast met een tang en trek deze iets naar de kijker toe. De celomische holte moet duidelijk zichtbaar zijn. Steek voorzichtig een stomp maar slank instrument (bijvoorbeeld een stompe wolfraamdraad in een microscalpelhouder) in de celomische holte.
OPMERKING: Als het inbrengen van het stompe instrument in de celomische holte niet mogelijk is, betekent dit dat een of meer van de membranen niet goed zijn geopend.
- Transplantatie
- Plaats een halve organoïde in het ei bovenop de allantois met behulp van een dura-dissector.
- Gebruik een ontleedtang en pak voorzichtig de rand van de lichaamswand vast en trek deze iets naar de kijker toe om de opening naar de celom zichtbaar te maken.
OPMERKING: Vermijd beschadiging van de bloedvaten in de lichaamswand. - Beweeg de organoïde voorzichtig naar en door de opening in de lichaamswand in de celom met een stompe wolfraamdraad in een microscalpelhouder. Duw de organoïde iets craniaal om hem in de celom te plaatsen. Het is nu zichtbaar net achter de vleugelknop (figuur 1A; dag 4).
- Voeg drie druppels DPBS+/+ toe aan het ei met behulp van een plastic transferpipet.
- Sluit het venster zorgvuldig af met een groot stuk (~ 5 cm x 5 cm) transparante tape voordat u het ei terug in de broedmachine plaatst tot dag 12 van de incubatie (8 dagen na transplantatie).
- Blijf de embryo's dagelijks controleren op levensvatbaarheid door ze door de tape te bekijken (verwijder de tape niet om uitdroging te voorkomen). Gooi overleden embryo's weg.
OPMERKING: Naarmate de embryo's en hun chorioallantoïsche membranen groeien, worden ze duidelijker zichtbaar door de tape. Een gebrek aan beweging door het embryo en ingeklapte of schaarse bloedvaten zijn een teken van embryodood. - Controleer dagelijks het waterbassin in de incubator en houd het gevuld.
4. Injectie van fluorescerend gelabeld lectine
- Voorbereiding op injectie
- Maak glazen microinjectienaalden door glazen microcapillairen in een micropipettrekker te trekken met de volgende instellingen: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Terwijl u door de ontleedmicroscoop kijkt, breekt u voorzichtig de uiteinden van de microinjectienaalden met behulp van een ontleedtang om een opening te maken.
OPMERKING: De vereiste instellingen voor de micropipettrekker kunnen per machine verschillen. - Monteer het injectiesysteem. Neem twee stukken siliconenslang van 38 cm en verbind ze met elkaar door er een filter van 0,2 μm tussen te plaatsen. Steek een mondstuk in het uiteinde van de buis die is verbonden met de filteruitlaat (siliconenbuis 1) en een connector aan het einde van de buis die is verbonden met de filterinlaat (siliconenbuis 2). Steek ten slotte de micro-injectienaald in de connector (figuur 1B).
- Verdun fluorescerend gelabelde lens culinaris agglutinine (LCA) met DPBS-/ - tot een concentratie van 2,5 mg ml-1 in een buis van 0,5 ml en draai gedurende ~ 30 s in een microcentrifuge om de aggregaten naar de bodem van de buis te verplaatsen.
- Pipetteer 20 μL LCA op een stuk parafilm.
- Zuig de 20 μL LCA van de parafilm in de microcapillaire naald van het geassembleerde injectiesysteem.
- Maak glazen microinjectienaalden door glazen microcapillairen in een micropipettrekker te trekken met de volgende instellingen: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Terwijl u door de ontleedmicroscoop kijkt, breekt u voorzichtig de uiteinden van de microinjectienaalden met behulp van een ontleedtang om een opening te maken.
- Injectie
- Knip de tape uit het raam met een gebogen ontleedschaar. Leg het ei onder een ontleedmicroscoop in een rubberen houder.
- Evalueer de vasculatuur en lokaliseer de aderen, die van de slagaders kunnen worden onderscheiden door hun iets helderdere rode kleur (figuur 1A; dag 12). Om de toegang tot de vasculatuur te verbeteren, vergroot u het venster zorgvuldig door te knippen met een gebogen ontleedschaar. Selecteer een ader voor injectie op basis van toegankelijkheid en grootte.
- Steek de punt van de microcapillaire naald in de geselecteerde ader onder een hoek van 0°-20º. Zorg ervoor dat de naald in de ader zit door de punt voorzichtig van links naar rechts te bewegen. Blaas voorzichtig en gestaag in het injectiesysteem om de LCA te injecteren (figuur 1A; dag 12).
OPMERKING: Als de naald in de ader zich in de juiste positie bevindt, moet deze binnen de grenzen van de ader blijven. - Plaats het ei gedurende 10 minuten terug in de broedmachine om de LCA te laten circuleren.
OPMERKING: Het is niet nodig om het ei gedurende deze tijd met tape te verzegelen.
5. Het verzamelen van getransplanteerde organoïden op dag 12 van de incubatie
- Het kippenembryo opofferen
- Leg het ei in een rubberen houder op de bank. Knip de tape uit het raam met een gebogen ontleedschaar. Knip vervolgens door de membranen rond het embryo met een gebogen ontleedschaar.
OPMERKING: Een ontleedmicroscoop is niet vereist voor deze stap. - Schep het embryo met een geperforeerde lepel uit het ei en onthoofd het embryo onmiddellijk met een schaar. Plaats het lichaam van het embryo in een petrischaaltje onder de dissectiemicroscoop.
- Leg het ei in een rubberen houder op de bank. Knip de tape uit het raam met een gebogen ontleedschaar. Knip vervolgens door de membranen rond het embryo met een gebogen ontleedschaar.
- Lokaliseren en verzamelen van organoïden
- Plaats het embryo op zijn rug in de petrischaal en spreid zijn ledematen.
- Open voorzichtig de buikwand van het embryo langs de lengteas met behulp van een tang.
- Lokaliseer de organoïde in het embryo. De organoïde wordt meestal gehecht aan de rechter leverkwab, hetzij aan de caudale punt of craniaal net onder de ribbenkast (figuur 1A; dag 12). Het is daarom aan te raden om eerst op deze locaties te gaan kijken.
- Zodra de organoïde is gelokaliseerd, verwijdert u deze uit het embryo door er met een microschaar omheen te knippen. Plaats de organoïde en het kippenweefsel dat er onvermijdelijk aan vastzit in een petrischaaltje onder de ontleedmicroscoop. Verwijder zoveel mogelijk kippenweefsel met een dubbelzijdig roestvrijstalen scheermesje.
- Verwerk de organoïde afhankelijk van de gewenste analyse.
6. Immunofluorescentiekleuring met hele montage
- Plaats een getransplanteerde organoïde in een plaat met 24 putten en fixeer gedurende 24 uur in 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C. 3x wassen met DPBS-/-.
- Permeabiliseer en blokkeer de organoïde in 300 μL blokkerende oplossing (0,3% Triton-X in DPBS-/- met 10% ezelsserum) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid het primaire antilichaammengsel voor: verdun voor één organoïde primaire antilichamen NPHS1 (schaap-α-mens, verdunning van 1:100), CD31 (muis-α-mens, verdunning van 1:100) en LTL (biotine-geconjugeerd, verdunning van 1:300) in 300 μL blokkerende oplossing. Voeg het antilichaammengsel toe aan de organoïde en incubeer gedurende 72 uur bij 4 °C.
- Was 3x met 0,3% TritonX in DPBS-/-.
- Bereid de secundaire antilichaammix voor: voor één organoïde, verdun secundaire antilichamen ezel-α-schaap Alexa Fluor 647 (verdunning van 1:500), ezel-α-muis Alexa Fluor 488 (verdunning van 1:500) en streptavidin Alexa Fluor 405 (verdunning van 1:200) in 300 μL blokkerende oplossing. Voeg de secundaire antilichaammix toe aan de organoïde en incubeer gedurende 2-4 uur bij kamertemperatuur. Dek af met aluminiumfolie om blootstelling van de secundaire antilichamen aan licht te voorkomen.
- 3x wassen met DPBS-/-.
- Sluit de organoïde in ~ 30 μL montagemedium in een schaal met glazen bodem van 35 mm en laat een nacht drogen bij kamertemperatuur, bedekt met aluminiumfolie. Bewaren bij 4 °C.
- Beeld met behulp van een confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De methode en tijdlijn voor de differentiatie van hiPSC's naar nierorganoïden, incubatie van bevruchte kippeneieren, transplantatie van nierorganoïden, injectie van LCA en verzameling van de organoïden zijn samengevat in figuur 1A. Het is belangrijk om de timing van organoïde differentiatie en kippenei-incubatie te coördineren, waarbij differentiatie 15 dagen vóór de incubatie wordt gestart. De acties op dag 0, 3, 4 en 12 van de incubatie worden geïllustreerd met foto's onder de tijdlijn. Organoïden worden getransplanteerd op dag 7 + 12 van differentiatie in dag 4 (HH 23-24) kippenembryo's. LCA wordt 8 dagen na transplantatie in het veneuze systeem van het embryo geïnjecteerd om de doordrenkte vasculatuur te kleuren, voordat het embryo wordt opgeofferd en de organoïde wordt opgehaald. Het geassembleerde injectiesysteem is weergegeven in figuur 1B.
Kippenembryo's worden geofferd op dag 12 van de incubatie (figuur 1A). Na zorgvuldige dissectie van het embryo kan de getransplanteerde organoïde meestal aan de lever worden bevestigd. Als we door een dissectiemicroscoop kijken, lijkt het gevasculariseerd (figuur 1A; dag 12; stap 5.2.3). Confocale beeldvorming van getransplanteerde organoïden geïnjecteerd met LCA en gekleurd voor nefronstructuren en menselijke EC's bevestigt vascularisatie door geperfuseerde bloedvaten (figuur 2A), die ook glomerulaire structuren binnendringen (figuur 2B). De vasculatuur is chimerisch: geperfuseerde menselijke EC's (CD31+, LCA+), niet-geperfuseerde menselijke EC's (CD31+, LCA-) en van geperfuseerde kip afgeleide EC's (CD31-, LCA+) kunnen worden onderscheiden (Figuur 2A, panelen III, IV, V).
Figuur 1: Intracelomische transplantatiemethode. (A) Tijdlijn van de differentiatie van hiPSC's naar nierorganoïden, incubatie van bevruchte kippeneieren en intracelomische transplantatie van nierorganoïden. Differentiatie van hiPSC's naar nierorganoïden wordt gestart 15 dagen voordat de incubatie van de kippeneieren wordt gestart (differentiatiedag 0 = incubatiedag -15) om transplantatie van de nierorganoïden op dag 7 + 12 van differentiatie in kippenembryo's op dag 4 van de incubatie mogelijk te maken. Incubatiedagen: Dag 0: Bevruchte kippeneieren worden horizontaal op houders geplaatst (stap 2.1.1), die in een broedmachine worden geplaatst bij 38 ºC ± 1 °C (protocolstap 2.1.2). Dag 3: In elk ei wordt een venster gemaakt door met het scherpe uiteinde van een gebogen ontleedschaar een klein gaatje te maken in de naar boven gerichte zijde van het ei (stap 2.2.3) en een cirkelvormig venster te knippen vanaf dit gat (stap 2.2.4). Het venster wordt afgesloten met transparante tape voordat het ei terug in de broedmachine wordt geplaatst. Dag 4: Intracelomische transplantatie van nierorganoïden op dag 7 + 12 van differentiatie wordt uitgevoerd. Het embryo bevindt zich in HH 23-24 en ligt aan de linkerkant, met de rechterkant naar de kijker gericht (stap 3.1.3). Tussen de vleugel- en beenknop wordt een opening gemaakt in het vitellinemembraan, chorion en amnion om toegang te krijgen tot de celomische holte, en de organoïde wordt door deze openingen in de celom ingebracht. Na transplantatie is de organoïde zichtbaar als een witte structuur net achter de vleugelknop. De randen van de geopende vitelline en amnionmembranen zijn zichtbaar (stappen 3.2.3 en 3.2.3-Zoom). In sommige gevallen worden de embryo's gedraaid, liggend op hun rechterzij in plaats van op hun linkerkant (3.1.3 OPMERKING), en moeten ze vóór de transplantatie worden omgedraaid. Dag 12: Fluorescerend gelabeld lectine wordt intraveneus geïnjecteerd. Aderen onderscheiden zich van slagaders door hun kleur; het bloed in de aderen is zuurstofrijk, afkomstig van de CAM, dus ze zijn iets helderder rood dan de slagaders die uit het embryo komen (stappen 4.2.2., 4.2.2-Zoom en 4.2.3.). Het embryo wordt geofferd en de organoïde wordt teruggehaald. De organoïde (omcirkeld) is gehecht geraakt aan de kippenlever en lijkt gevasculariseerd te zijn (stap 5.2.3). Schaalbalk = 1 mm. De schematische afbeelding van het intracelomische transplantatiebeeld op het bovenpaneel is met toestemming van Koning et al.28 herdrukt. (B) Afbeelding van het geassembleerde injectiesysteem, bestaande uit een mondstuk, twee stukken siliconenslang van 38 cm, een filter van 0,2 μm, een connector en een glazen microinjectienaald die werd gegenereerd door glazen microcapillairen in een micropipettrekker te trekken. Afkortingen: A = allantois; Ben = amnion; C = celom; CC = gesneden chorionmembraan; CHIR = CHIR99021; FGF9 = fibroblast groeifactor 9; hiPSC's = door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen; IM = intermediair mesoderm; Lb = beenknop; O = organoïde; PS = primitieve streep; U = navelstreng; V = vitelline membraan; Wb = vleugelknop; Y = dooierstengel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gevasculariseerde getransplanteerde nierorganoïden. (A) Immunofluorescente beelden van (I) een niet-getransplanteerde nierorganoïde en (II) een getransplanteerde nierorganoïde. In beide omstandigheden zijn glomerulaire (NPHS1+, cyaan) en buisvormige (LTL+, gele) structuren zichtbaar. In de niet-getransplanteerde organoïden zijn enkele menselijke EC's (CD31+, groen) aanwezig. In de getransplanteerde organoïde is een doordrenkt vasculair netwerk (CD31+, groen; geïnjecteerd rhodamine-gelabeld LCA+, wit) zichtbaar in de hele organoïde. In panelen III, IV en V worden vergrotingen van de ingepakte gebieden in paneel II getoond, om de drie soorten EC's te demonstreren die kunnen worden onderscheiden in getransplanteerde organoïden. Paneel III bevat perfuseerde menselijke EC's (CD31+, LCA+), gemarkeerd met pijlpunten. Paneel IV bevat niet-doordrenkte menselijke EC's (CD31+, LCA-), gemarkeerd met pijlpunten. Paneel V bevat perfuseerde van kip afgeleide EC's (CD31-, LCA+), gemarkeerd met pijlpunten. Schaalbalk = 200 μm. (B) In niet-getransplanteerde organoïden (I) omringen EC's (CD31+, groen) glomerulaire structuren (NPHS1+, cyaan) maar dringen ze niet binnen. In getransplanteerde organoïden (II) worden glomerulaire structuren (NPHS1+, blauw) gevasculariseerd door geperfuseerde haarvaten (LCA+, wit; CD31+, groen). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript wordt een protocol voor intracelomische transplantatie van hiPSC-afgeleide nierorganoïden in kippenembryo's gedemonstreerd. Bij transplantatie worden organoïden gevasculariseerd door geperfuseerde bloedvaten die bestaan uit een combinatie van van menselijke organoïden afgeleide en van kippen afgeleide EC's. Deze zijn verspreid over de organoïde en dringen de glomerulaire structuren binnen, waardoor interactie tussen de EC's en podocyten mogelijk wordt. Eerder werd aangetoond dat dit leidt tot een verbeterde rijping van de organoïde glomerulaire en buisvormige structuren28. De transplantatie is zeer efficiënt, duurt ~ 5 minuten per embryo, en het enige onderhoud dat de embryo's nodig hebben, is een regelmatige aanvulling van het waterbassin in de couveuse. Deze methode is daarom zeer geschikt voor de analyse van grote aantallen organoïden.
Vascularisatie en rijping van nierorganoïden zijn eerder aangetoond door transplantatie bij muizen18,20. In deze arbeidsintensieve muismodellen werden organoïden gedurende 2 tot maximaal 12 weken getransplanteerd. In de hier getoonde intracelomische transplantatie-experimenten was de duur van de transplantatie beperkt tot 8 dagen. Dit maakt het mogelijk om de embryo's te offeren vóór dag 13 van de incubatie, wanneer men denkt dat ze pijn beginnen te ervaren33,34. Omdat kippenembryo's op dag 21 uitkomen, kan de duur van de transplantatie worden verlengd tot 15 dagen, waarbij de embryo's op dag 19 worden opgeofferd om te voorkomen dat ze uitkomen. Dit zou echter het gebruik van anesthetica vereisen. Ondanks de relatief korte transplantatieduur in dit model, induceert het uitgebreide vascularisatie en significante rijping van organoïde nefronen in vergelijking met in vitro organoïden, inclusief de vorming van een GBM tussen organoïde podocyten en de binnendringende EC's28.
Bij het uitvoeren van intracelomische transplantatie-experimenten is het belangrijk om te bedenken dat niet alle kippenembryo's zich normaal ontwikkelen en overleven. Gewoonlijk bereikt ~ 65% van de embryo's die op dag 0 in de couveuse worden geplaatst het eindpunt van het experiment. Dit komt door een combinatie van acute bloedingen veroorzaakt door vaatschade tijdens transplantatie (5% -10% in onze handen) en de stress die wordt veroorzaakt door de venster- en transplantatieprocedures. Wanneer embryo's zich in een eerder of later stadium bevinden dan HH 23-24, wordt transplantatie gecompliceerd vanwege respectievelijk beperkte ruimte en uitgebreidere vasculatuur. Als embryo's zich niet in het juiste stadium bevinden op het verwachte tijdstip, kan dit te wijten zijn aan de temperatuur van de incubatie, omdat een hogere temperatuur over het algemeen leidt tot een snellere ontwikkeling.
Bovendien induceert het langdurig op kamertemperatuur houden van bevruchte eieren vóór incubatie meer variabiliteit in ontwikkeling. Om dit te voorkomen, moet de temperatuur van de broedmachine stabiel worden gehouden tijdens en tussen experimenten en moet de incubatie binnen 3 dagen na levering van de bevruchte eieren worden gestart. Onverwacht hoge percentages embryosterfte tussen procedures kunnen worden veroorzaakt door uitdroging. Om dit te voorkomen, is het essentieel om twee of drie druppels DPBS +/+ aan elk ei toe te voegen na het openen en na transplantatie en het ei zeer zorgvuldig af te sluiten met tape, waarbij vouwen in de tape zoveel mogelijk worden gladgestreken. Het combineren van de venster- en transplantatiestappen om het aantal keren dat de eieren worden geopend te verminderen, wordt niet aanbevolen, omdat vensters op dag 4 de embryosterfte aanzienlijk verhogen. Dit is het gevolg van schade aan bloedvaten die in dit stadium vaak aan de eierschaal zijn gehecht.
Kortom, deze methode biedt een efficiënt en krachtig hulpmiddel om vascularisatie te induceren en de rijping in nierorganoïden te verbeteren. Het kan worden gebruikt om deze processen in grote aantallen organoïden te bestuderen en heeft potentieel voor het modelleren van nierziekten die een hoger niveau van rijping vereisen dan momenteel in vitro kan worden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Wij danken George Galaris (LUMC, Leiden) voor zijn hulp bij de injectie van kippenembryo's. We erkennen de steun van Saskia van der Wal-Maas (Afdeling Anatomie & Embryologie, LUMC, Leiden, Nederland), Conny van Munsteren (Afdeling Anatomie & Embryologie, LUMC, Leiden, Nederland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederland) en Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederland). M. Koning wordt ondersteund door 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door het Leids Universiteits Fonds "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fonds" GWF2019-02. Dit werk wordt ondersteund door de partners van Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) en Health Holland, Topsector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg en T.J. Rabelink worden ondersteund door The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wordt ondersteund door Novo Nordisk Foundation grants (NNF21CC0073729).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E.
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E.
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
