Summary
여기에서 우리는 닭 배아의 celomic cavity에서 신장 오가노이드의 이식을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 성숙 향상을 유도하고 이러한 과정을 효율적인 방식으로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 신장 오가노이드는 성인 신장의 것과 어느 정도 유사한 네프론 유사 구조를 포함합니다. 불행하게도, 그들의 임상적 적용 가능성은 기능적 맥관 구조의 부족과 결과적으로 시험관 내 성숙이 제한되어 방해를 받습니다. 닭 배아의 celomic cavity에 신장 오가노이드를 이식하면 사구체 모세 혈관 형성을 포함하여 관류 된 혈관에 의한 혈관 형성을 유도하고 성숙을 향상시킵니다. 이 기술은 매우 효율적이어서 많은 수의 오가노이드를 이식하고 분석할 수 있습니다. 이 논문은 닭 배아에서 신장 오가노이드의 뇌내 이식에 대한 자세한 프로토콜을 설명한 후 관류된 혈관 구조를 염색하기 위해 형광 표지된 렉틴을 주입하고 이미징 분석을 위해 이식된 오가노이드를 수집합니다. 이 방법은 오가노이드 혈관화 및 성숙을 유도 및 연구하여 시험관 내에서 이러한 과정을 향상시키고 질병 모델링을 개선하기 위한 단서를 찾는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 신장 오가노이드는 발달 연구 1,2,3,4, 독성 스크리닝 5,6 및 질병 모델링5,7,8,9,10,11,12,13에 대한 잠재력이 있는 것으로 나타났습니다 . 그러나 이러한 목적 및 궁극적인 임상 이식 목적에 대한 적용 가능성은 혈관 네트워크의 부족으로 인해 제한됩니다. 배아 신장 발달 동안 족세포, 간질 세포 및 혈관 내피 세포(EC)가 상호 작용하여 사구체의 복잡한 구조를 형성합니다. 이러한 상호 작용이 없으면 족세포, 사구체 기저막(GBM) 및 EC로 구성된 사구체 여과 장벽이 제대로 발달할 수 없습니다14,15,16. 시험관 내 신장 오가노이드에는 일부 EC가 포함되어 있지만, 이들은 적절한 혈관 네트워크를 형성하지 못하고 시간이 지남에 따라 감소합니다17. 따라서 오가노이드가 미성숙한 상태로 남아 있는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 마우스에서의 이식은 신장 오가노이드 18,19,20,21의 혈관화 및 성숙을 유도한다. 안타깝게도 이것은 많은 수의 오가노이드 분석에 적합하지 않은 노동 집약적인 공정입니다.
닭 배아는 한 세기 이상 혈관 형성과 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다22. 그들은 쉽게 접근 할 수 있고, 유지 보수가 적고, 완전한 기능을 가진 면역 체계가 부족하며, 달걀 껍질을 연 후에 정상적으로 발달 할 수 있습니다23,24,25,26. 융모막(chorioallantoic membrane, CAM)에 오가노이드를 이식하면 혈관 형성이 일어나는 것으로 나타났다27. 그러나 CAM의 이식 기간과 이식편의 성숙 수준은 CAM 형성에 의해 제한되며, 이는 배아 7 일까지 완료됩니다. 따라서 최근 닭 배아에서 뇌내이식을 통해 신장 오가노이드를 효율적으로 혈관화하고 성숙시키는 방법이 개발되었다28. 닭 배아의 백두강은 1930년대부터 배아 조직의 분화에 유리한 환경으로 알려져 왔다29,30. 배아 발달 초기에 접근할 수 있으며 이식편을 모든 방향으로 비교적 무제한으로 확장할 수 있습니다.
이 논문은 4일차 닭 배아의 celomic cavity에 hiPSC 유래 신장 오가노이드를 이식하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 향상된 성숙을 유도합니다. 배아를 희생하기 전에 형광 표지된 수정체 쿨리나리스 응집소(LCA)를 주입하면 컨포칼 현미경을 통해 오가노이드 내의 관류된 혈관을 시각화할 수 있습니다.
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Protocol
네덜란드 법에 따라이 연구에는 동물 복지위원회의 승인이 필요하지 않았습니다.
1. 이식을 위한 hiPSC 유래 신장 오가노이드 준비
- Takasato et al.4,18,31에 의해 개발된 프로토콜을 사용하여 hiPSC를 신장 오가노이드로 구별합니다. 분화 7일 + 12일까지 0.4μm 공극이 있는 폴리에스터 세포 배양 삽입물(세포 배양 삽입물)에서 이 프로토콜에 따라 오가노이드를 배양합니다. 각 세포 배양 삽입물에는 3개의 오가노이드가 포함됩니다.
- 세포 배양 삽입물에서 오가노이드를 제거합니다.
- 한 쌍의 해부 집게로 세포 배양 삽입물의 막 중간에 구멍을 뚫습니다. 해부 가위를 사용하여 세포 배양 삽입물의 중간에 있는 구멍에서 가장자리까지 막을 세 번 절단하여 오가노이드 사이를 절단합니다. 이렇게 하면 각각 하나의 오가노이드가 부착된 3개의 멤브레인 조각이 생성되며, 이 멤브레인은 여전히 바깥쪽 가장자리의 세포 배양 삽입물에 연결되어 있습니다.
- 한 쌍의 집게로 바깥쪽 가장자리에 가까운 막 조각 중 하나를 잡고 세포 배양 삽입물에서 떼어냅니다. 오가노이드가 부착된 멤브레인 조각을 페트리 접시에 넣습니다. 탈수를 방지하기 위해 칼슘과 마그네슘(DPBS-/-)이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)를 오가노이드에 몇 방울 떨어뜨립니다. 다른 두 오가노이드에 대해 반복합니다.
- 집게로 멤브레인을 제자리에 고정하고 양날 스테인리스 스틸 면도날로 오가노이드를 반으로 절단하여 이등분합니다(전체 오가노이드가 너무 커서 셀롬이 이 발달 단계에서 수용할 수 없음). 경막 해부기로 두 개의 오가노이드 반쪽을 멤브레인에서 부드럽게 밀어냅니다. 멤브레인을 버리고 이식할 때까지 오가노이드를 DPBS-/- 에 그대로 두십시오.
참고: 이식 전에 오가노이드에 대한 스트레스를 피하기 위해 이식을 위해 한 번에 최대 3개의 오가노이드를 준비합니다. 이상적으로는 한 사람이 오가노이드를 준비하고 다른 사람이 이식을 수행하는 것이 좋습니다.
2. 이식을 위한 닭 배아 준비
- 수정 된 흰 레그혼 알을 품으십시오. 이식의 정확한 시기를 보장하기 위해 신장 오가노이드 분화 7 + 8일에 난자의 배양을 시작합니다.
- 수정된 흰 레그혼 알(Gallus domesticus) 을 홀더에 수평으로 놓습니다(그림 1A; day 0), 위쪽을 향한 면의 중간을 연필로 표시합니다.
알림: 맞춤형 플라스틱 홀더 또는 계란 상자를 계란을 배양하는 홀더로 사용할 수 있습니다. - 계란이 든 홀더를 38ºC ± 1ºC의 가습 인큐베이터에 넣습니다(그림 1A; 0일).
- 인큐베이터의 물통을 채운 상태에서 3 일 동안 알을 품으십시오.
- 수정된 흰 레그혼 알(Gallus domesticus) 을 홀더에 수평으로 놓습니다(그림 1A; day 0), 위쪽을 향한 면의 중간을 연필로 표시합니다.
- 부화 3 일째에 달걀 껍질에 창을 만듭니다.
- 배양 3일째에 알의 뾰족한 끝(작은 끝)에 작은 조각(~1cm x 0.5cm)의 투명 테이프를 붙입니다. 투명 테이프 중간의 달걀 껍질에 작은 구멍을 뚫어 해부 가위의 날카로운 끝으로 두드려주세요.
- 난황낭이 손상되지 않도록 5mL 주사기에 19G 바늘을 45° 각도로 구멍에 삽입하고 난자에서 2-3mL의 알부민을 흡인하여 난자 내부의 배아를 낮춥니다. 두 번째 투명 테이프(~1cm x 0.5cm)로 구멍을 막습니다.
- 달걀의 연필 표시가 있는 위쪽을 향한 면에 큰 조각(~5cm x 5cm)의 투명 테이프를 붙입니다. 투명 테이프 중간에 달걀 껍질에 구멍을 뚫고 해부 가위의 날카로운 끝으로 두드려 구멍을 뚫습니다(그림 1A; 3일차).
- 이 구멍에서 시작하여 구부러진 해부 가위를 사용하여 달걀 껍질에 작은 원형 창을 자릅니다. 이 창을 통해 배아를 찾은 다음 창을 확대하여 배아에 대한 접근을 최적화합니다(그림 1A; 3일차).
- 집게를 사용하여 배아 위에 떨어졌을 수 있는 큰 달걀 껍질 조각을 제거합니다. 플라스틱 이식 피펫으로 배아에 칼슘과 마그네슘이 함유된 DPBS 몇 방울(DPBS+/+)을 떨어뜨린 다음 달걀 껍질이 있는 DPBS+/+를 피펫으로 흡인하여 더 작은 조각을 제거합니다.
- 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 0.5% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DPBS+/+ 3방울을 계란에 추가합니다.
- 배아가 햄버거-해밀턴 단계 23-24 (HH 23-24)32에 있을 때까지 부화 4일까지 알을 인큐베이터에 다시 넣기 전에 큰 조각(~5cm x 5cm)의 투명 테이프로 창을 조심스럽게 밀봉합니다.
알림: 창을 밀봉하는 것은 배아의 탈수와 죽음을 방지하는 데 매우 중요합니다. - 테이프를 통해 배아를 관찰하여 생존 가능성을 매일 확인하십시오 (탈수를 피하기 위해 테이프를 제거하지 마십시오). 이 부화 첫날 동안 달걀 노른자 색은 배아 사멸 시 밝은 색에서 무광택 노란색으로 변합니다. 죽은 배아는 버리십시오.
- 인큐베이터의 물통을 채우십시오.
3. 부화 4일째 뇌내이식
- celomic cavity에 접근하기
- 구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다.
- 고무 홀더 또는 달걀 상자의 해부 현미경 아래에 달걀을 놓습니다.
- 닭 배아는 이제 HH 23-24에 있으며 왼쪽으로 누워 있고 오른쪽은 관찰자를 향하고 있습니다(그림 1A; 4일차). 배아의 오른쪽 날개와 다리 새싹을 찾으십시오., 이 두 개의 사지 새싹 사이에 셀롬이 접근하기 때문입니다. 오른쪽 날개와 다리 새싹 사이의 영역에서 두 쌍의 해부 집게로 잡고 부드럽게 반대 방향으로 당겨 vitelline 막, chorion 및 양막에 연속적으로 구멍을 만듭니다.
참고: 바이텔린 막은 난자를 연 후 가장 먼저 만나는 막이며, 경우에 따라 3일째에 창을 만든 후 이미 손상되었습니다. 배아가 회전하면 왼쪽이 관찰자를 향하도록 오른쪽으로 누워 있습니다(그림 1A; 4 일째), 이식을 가능하게하기 위해 그것을 돌릴 필요가 있습니다. 이렇게하려면 vitelline과 chorion 막에 큰 구멍을 만든 다음 집게를 사용하여 배아를 조심스럽게 돌립니다. - celomic cavity에 방해받지 않는 접근이 있는지 확인하십시오 : 한 쌍의 해부 집게로 날개와 사지 봉오리 사이의 체벽 가장자리를 부드럽게 잡고 뷰어쪽으로 약간 당깁니다. celomic cavity는 명확하게 볼 수 있어야합니다. 뭉툭하지만 가느다란 기구(예: 마이크로 메스 홀더의 뭉툭한 텅스텐 와이어)를 셀로믹 캐비티에 조심스럽게 삽입합니다.
알림: 무딘 기구를 셀로믹 캐비티에 삽입할 수 없는 경우 하나 이상의 멤브레인이 제대로 열리지 않았음을 의미합니다.
- 이식
- 경막 해부기를 사용하여 알란토스 위에 계란 안에 오가노이드 반을 놓습니다.
- 해부 집게를 사용하여 체벽의 가장자리를 조심스럽게 잡고 보는 사람 쪽으로 약간 당겨 셀롬의 개구부가 보이도록 합니다.
알림: 체벽의 혈관을 손상시키지 마십시오. - 마이크로 메스 홀더의 뭉툭한 텅스텐 와이어를 사용하여 오가노이드를 체벽의 구멍을 통해 셀롬으로 부드럽게 움직입니다. 오가노이드를 두개골로 약간 밀어 셀롬 안에 넣습니다. 이제 날개 봉오리 바로 뒤에서 볼 수 있습니다(그림 1A; 4일차).
- 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 계란에 DPBS+/+ 3방울을 추가합니다.
- 알을 배양 12일(이식 후 8일)까지 인큐베이터에 다시 넣기 전에 큰 조각(~5cm x 5cm)의 투명 테이프로 창을 조심스럽게 밀봉합니다.
- 테이프를 통해 배아를 관찰하여 생존 가능성을 매일 계속 확인하십시오(탈수를 피하기 위해 테이프를 제거하지 마십시오). 죽은 배아는 버리십시오.
참고: 배아와 그들의 융모막이 성장함에 따라 테이프를 통해 더 명확하게 보입니다. 배아의 움직임 부족과 붕괴되거나 희박한 혈관은 배아 사멸의 징후입니다. - 인큐베이터의 물통을 매일 확인하고 채우십시오.
4. 형광 표지된 렉틴 주입
- 주사 준비
- 열 533, 당기기 60, 속도 150, 시간 200 설정으로 마이크로피펫 풀러에서 유리 미세모세관을 당겨 유리 미세 주입 바늘을 만듭니다. 해부 현미경을 통해 보면서 해부 집게를 사용하여 미세 주입 바늘의 끝을 조심스럽게 떼어 내고 구멍을 만듭니다.
알림: 마이크로피펫 풀러에 필요한 설정은 기계에 따라 다를 수 있습니다. - 주입 시스템을 조립합니다. 38cm 실리콘 튜브 두 개를 가져다가 그 사이에 0.2μm 필터를 끼워 서로 연결합니다. 필터 배출구(실리콘 튜브 1)와 연결된 튜브 끝에 마우스피스를 삽입하고 필터 흡입구(실리콘 튜브 2)와 연결된 튜브 끝에 커넥터를 삽입합니다. 마지막으로 미세 주입 바늘을 커넥터에 삽입합니다(그림 1B).
- 형광 표지된 수정체 쿨리나리스 응집소(LCA)를 DPBS-/-로 2.5mL 튜브에서 1mg mL-0.5 농도로 희석하고 미세 원심분리기에서 ~30초 동안 회전시켜 응집체를 튜브 바닥으로 이동합니다.
- 20 μL의 LCA를 파라필름 조각에 피펫팅합니다.
- 파라필름에서 조립된 주입 시스템의 미세모세관 바늘로 20μL의 LCA를 흡인합니다.
- 열 533, 당기기 60, 속도 150, 시간 200 설정으로 마이크로피펫 풀러에서 유리 미세모세관을 당겨 유리 미세 주입 바늘을 만듭니다. 해부 현미경을 통해 보면서 해부 집게를 사용하여 미세 주입 바늘의 끝을 조심스럽게 떼어 내고 구멍을 만듭니다.
- 주사
- 구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다. 고무 홀더의 해부 현미경 아래에 계란을 놓습니다.
- 혈관 구조를 평가하고 약간 더 밝은 붉은 색으로 동맥과 구별할 수 있는 정맥을 찾습니다(그림 1A; 12일째). 혈관 구조에 대한 접근성을 높이려면 구부러진 해부 가위로 절단하여 창을 조심스럽게 확대하십시오. 접근성과 크기에 따라 주사할 정맥을 선택합니다.
- 미세모세관 바늘의 끝을 선택한 정맥에 0°-20º 각도로 삽입합니다. 팁을 좌우로 부드럽게 움직여 바늘이 정맥에 있는지 확인합니다. LCA를 주입하기 위해 주입 시스템에 부드럽고 꾸준히 불어넣습니다(그림 1A; 12일째).
알림: 정맥의 바늘이 올바른 위치에 있으면 정맥의 경계 내에 있어야 합니다. - LCA가 순환할 수 있도록 계란을 인큐베이터에 10분 동안 다시 넣습니다.
알림: 이 시간 동안 계란을 테이프로 밀봉할 필요는 없습니다.
5. 배양 12일째에 이식된 오가노이드 수집
- 닭 배아 희생
- 계란을 벤치의 고무 홀더에 넣으십시오. 구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다. 그런 다음 구부러진 해부 가위로 배아를 둘러싼 막을 자릅니다.
참고: 이 단계에는 해부 현미경이 필요하지 않습니다. - 구멍이 뚫린 숟가락으로 난자에서 배아를 긁어 내고 즉시 가위를 사용하여 배아를 참수하십시오. 배아의 몸을 해부 현미경 아래의 페트리 접시에 놓습니다.
- 계란을 벤치의 고무 홀더에 넣으십시오. 구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다. 그런 다음 구부러진 해부 가위로 배아를 둘러싼 막을 자릅니다.
- 오가노이드 찾기 및 수집
- 배아를 페트리 접시에 넣고 팔다리를 펼칩니다.
- 집게를 사용하여 세로축을 따라 배아의 복벽을 조심스럽게 엽니 다.
- 배아 내부에서 오가노이드를 찾습니다. 오가노이드는 꼬리 끝 또는 흉곽 바로 아래 두개골의 오른쪽 간엽에 가장 자주 부착됩니다(그림 1A; 12일째). 따라서 이러한 위치를 살펴보는 것부터 시작하는 것이 좋습니다.
- 오가노이드를 찾으면 미세 가위로 주위를 잘라 배아에서 제거합니다. 오가노이드와 필연적으로 부착되는 닭 조직을 해부 현미경 아래 페트리 접시에 넣습니다. 양날 스테인리스 스틸 면도날로 닭 조직을 최대한 제거하십시오.
- 원하는 분석에 따라 오가노이드를 처리합니다.
6. 전체 마운트 면역형광 염색
- 이식된 오가노이드를 24웰 플레이트에 넣고 4°C에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드(PFA) 500μL에 고정합니다. DPBS로 3번 세척-/-.
- 실온에서 2시간 동안 300μL의 차단 용액(10% 당나귀 혈청 중 0.3% Triton-X-/- 함유 DPBS-/- )에서 오가노이드를 투과시키고 차단합니다.
- 1차 항체 혼합물 준비: 1개의 오가노이드에 대해 1차 항체 NPHS1(양-α-인간, 1:100 희석), CD31(mouse-α-human, 1:100 희석) 및 LTL(비오틴 접합, 1:300 희석) 300μL의 차단 용액. 항체 혼합물을 오가노이드에 첨가하고 4°C에서 72시간 동안 인큐베이션합니다.
- DPBS-/-에서 3% TritonX로 0.3배 세척합니다.
- 2차 항체 혼합물 준비: 1개의 오가노이드에 대해 2차 항체인 donkey-α-sheep Alexa Fluor 647(1:500 희석), donkey-α-mouse Alexa Fluor 488(1:500 희석) 및 streptavidin Alexa Fluor 405(1:200 희석)를 300μL의 차단 용액에 희석합니다. 2차 항체 혼합물을 오가노이드에 넣고 실온에서 2-4시간 동안 배양합니다. 2차 항체가 빛에 노출되는 것을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다.
- DPBS로 3번 세척-/-.
- 35mm 유리 바닥 접시에 ~30μL의 장착 매체에 오가노이드를 삽입하고 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 밤새 건조시킵니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 컨포칼 현미경을 사용한 이미지.
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Representative Results
hiPSC를 신장 오가노이드로 분화하는 방법과 일정, 수정된 닭 알의 배양, 신장 오가노이드의 이식, LCA 주입 및 오가노이드 수집을 위한 방법이 그림 1A에 요약되어 있습니다. 오가노이드 분화와 닭고기 달걀 부화의 시기를 조정하고 부화 15일 전에 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 배양 0일, 3일, 4일, 12일의 행동은 타임라인 아래의 사진으로 설명됩니다. 오가노이드는 분화 7일째 + 12일째에 4일째(HH 23-24) 닭 배아로 이식됩니다. LCA는 이식 후 8일 후에 배아의 정맥계에 주입하여 관류된 혈관 구조를 염색한 후 배아를 희생하고 오가노이드를 회수합니다. 조립된 사출 시스템은 그림 1B에 나와 있습니다.
닭 배아는 배양 12일째에 희생된다(도 1A). 배아를 조심스럽게 해부하면 이식된 오가노이드가 일반적으로 간에 부착되어 있는 것을 발견할 수 있습니다. 해부 현미경을 통해 보면 혈관이 있는 것처럼 보입니다(그림 1A, 12일, 단계 5.2.3). LCA를 주입하고 네프론 구조 및 인간 EC에 대해 염색한 이식된 오가노이드의 컨포칼 이미징은 관류된 혈관에 의한 혈관 형성을 확인하며(그림 2A), 이는 또한 사구체 구조를 침범합니다(그림 2B). 혈관 구조는 키메라입니다: 관류된 인간 EC(CD31+, LCA+), 관류되지 않은 인간 EC(CD31+, LCA-) 및 관류된 닭 유래 EC(CD31-, LCA+)를 구별할 수 있습니다(그림 2A, 패널 III, IV, V).
그림 1: 뇌내 이식 방법. (A) hiPSC의 신장 오가노이드로의 분화, 수정된 닭고기 알의 배양 및 신장 오가노이드의 뇌내 이식의 타임라인. hiPSC의 신장 오가노이드로의 분화는 닭고기 달걀의 배양이 시작되기 15일 전(분화일 0 = 잠복일 -15)에 시작되어 배양 4일째에 닭 배아에서 분화 7일째 + 12일째에 신장 오가노이드의 이식을 가능하게 합니다. 배양일수: 0일: 수정된 닭고기 달걀을 홀더에 수평으로 배치하고(단계 2.1.1), 홀더를 38ºC ± 1°C의 인큐베이터에 배치합니다(프로토콜 단계 2.1.2). 3 일째 : 한 쌍의 구부러진 해부 가위의 날카로운 끝으로 달걀의 위쪽에 작은 구멍을 만들고(2.2.3단계) 이 구멍에서 시작하여 원형 창을 절단하여 각 달걀에 창을 만듭니다(2.2.4단계). 창은 인큐베이터에 계란을 다시 넣기 전에 투명 테이프로 밀봉됩니다. 4일차: 분화 7일째 + 12일째에 신장 오가노이드의 뇌내 이식을 시행합니다. 배아는 HH 23-24에 있으며 왼쪽으로 누워 있으며 오른쪽은 관찰자를 향하고 있습니다 (3.1.3 단계). 날개와 다리 새싹 사이에는 vitelline 막, 융모막 및 양막에 구멍이 만들어져 celomic cavity에 접근하고 이 구멍을 통해 오가노이드가 celom으로 삽입됩니다. 이식 후 오가노이드는 날개 봉오리 바로 뒤에 위치한 흰색 구조로 보입니다. 열린 vitelline 및 양막 막의 가장자리가 보입니다 (3.2.3 및 3.2.3-Zoom 단계). 어떤 경우에는 배아가 회전하여 왼쪽이 아닌 오른쪽으로 눕고(3.1.3 참고) 이식 전에 뒤집어야 합니다. 12일: 형광 표지된 렉틴을 정맥 주사합니다. 정맥은 색깔에 따라 동맥과 구별됩니다. 정맥의 혈액은 CAM에서 나오는 산소가 풍부하므로 배아에서 나오는 동맥보다 약간 더 밝은 빨간색입니다 (4.2.2., 4.2.2-Zoom 및 4.2.3 단계). 배아를 희생하고 오가노이드를 회수합니다. 오가노이드(동그라미)는 닭 간에 부착되어 혈관이 형성된 것으로 보입니다(단계 5.2.3). 스케일 바 = 1mm. 상단 패널의 뇌내 이식 이미지를 묘사한 개략도 이미지는 Koning et al.28의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. (B) 마우스피스, 38cm 실리콘 튜브 2개, 0.2μm 필터, 커넥터 및 마이크로피펫 풀러에서 유리 미세모세관을 당겨 생성된 유리 미세주입 바늘로 구성된 조립된 주입 시스템의 이미지. 약어: A = 알란토스; Am = 양막; C = 셀롬; C-C = chorion membrane 절단; CHIR = CHIR99021; FGF9 = 섬유아세포 성장 인자 9; hiPSCs = 인간 유도 만능 줄기 세포; IM = 중간 중배엽; Lb = 다리 새싹; O = 오가노이드; PS = 기본 줄무늬; U = 탯줄 고리; V = 비텔린 막; Wb = 날개 봉오리; Y = 노른자 줄기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 혈관 이식 신장 오가노이드. (A) (I) 이식되지 않은 신장 오가노이드 및 (II) 이식된 신장 오가노이드의 면역형광 이미지. 두 조건 모두에서 사구체(NPHS1+, 청록색) 및 관형(LTL+, 노란색) 구조가 보입니다. 이식되지 않은 오가노이드에는 일부 인간 EC(CD31+, 녹색)가 존재합니다. 이식된 오가노이드에서 관류된 혈관 네트워크(CD31+, 녹색, 주입된 로다민 표지 LCA+, 흰색)가 오가노이드 전체에서 볼 수 있습니다. 패널 III, IV 및 V에서는 이식된 오가노이드에서 구별할 수 있는 세 가지 유형의 EC를 보여주기 위해 패널 II의 박스형 영역의 배율을 보여줍니다. 패널 III에는 화살촉으로 표시된 관류된 인간 EC(CD31+, LCA+)가 포함되어 있습니다. 패널 IV에는 화살촉으로 표시된 관류되지 않은 인간 EC(CD31+, LCA-)가 포함되어 있습니다. 패널 V에는 화살촉으로 표시된 관류된 닭 유래 EC(CD31-, LCA+)가 포함되어 있습니다. 스케일 바 = 200 μm. (B) 이식되지 않은 오가노이드(I)에서 EC(CD31+, 녹색)는 사구체 구조(NPHS1+, 청록색)를 둘러싸고 있지만 침범하지는 않습니다. 이식된 오가노이드(II)에서 사구체 구조(NPHS1+, 파란색)는 관류된 모세혈관(LCA+, 흰색; CD31+, 녹색). 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고에서는 닭 배아에서 hiPSC 유래 신장 오가노이드의 뇌내 이식을 위한 프로토콜이 시연됩니다. 이식 시 오가노이드는 인간 오가노이드 유래 EC와 닭 유래 EC의 조합으로 구성된 관류 혈관에 의해 혈관화됩니다. 이들은 오가노이드 전체에 퍼져 사구체 구조를 침범하여 EC와 족세포 사이의 상호 작용을 가능하게 합니다. 이전에 이것이 오가노이드 사구체 및 관형 구조의 성숙을 향상시키는 것으로 나타났다28. 이식은 배아당 ~5분이 소요되는 매우 효율적이며 배아에 필요한 유일한 유지 관리는 인큐베이터의 물동이를 정기적으로 채우는 것입니다. 따라서 이 방법은 많은 수의 오가노이드 분석에 매우 적합합니다.
신장 오가노이드의 혈관화 및 성숙은 이전에 마우스18,20에서의 이식을 통해 입증되었습니다. 이러한 노동 집약적인 마우스 모델에서 오가노이드는 2주에서 최대 12주 동안 이식되었습니다. 여기에 제시된 뇌내 이식 실험에서, 이식 기간은 8일로 제한되었다. 이것은 배아가 통증을 경험하기 시작하는 것으로 생각되는 부화 13일 이전에 배아를 희생할 수 있게 한다33,34. 닭 배아는 21 일에 부화하기 때문에 이식 기간을 15 일로 연장 할 수 있으며 부화를 피하기 위해 19 일에 배아를 희생 할 수 있습니다. 그러나 이것은 마취제의 사용을 필요로 할 것입니다. 이 모델에서 상대적으로 짧은 이식 기간에도 불구하고, 이는 오가노이드 족세포와 침입하는 EC 사이의 GBM 형성을 포함하여 시험관 내 오가노이드에 비해 오가노이드 네프론의 광범위한 혈관화 및 상당한 성숙을 유도합니다28.
뇌내 이식 실험을 수행 할 때 모든 닭 배아가 정상적으로 발달하고 생존하는 것은 아니라는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 일반적으로 0일에 인큐베이터에 배치된 배아의 ~65%가 실험의 종점에 도달합니다. 이는 이식 중 혈관 손상으로 인한 급성 출혈(손의 5%-10%)과 윈도우 및 이식 절차로 인한 스트레스의 조합 때문입니다. 배아가 HH 23-24보다 초기 또는 후기 단계에 있을 때, 이식은 각각 제한된 공간과 더 광범위한 혈관 구조로 인해 복잡해집니다. 배아가 예상 시간에 올바른 단계에 있지 않은 경우, 온도가 높을수록 일반적으로 더 빠른 발달로 이어지기 때문에 배양 온도 때문일 수 있습니다.
또한, 부화하기 전에 수정란을 실온에서 장기간 보관하면 발달에 더 많은 변동성이 유발됩니다. 이를 방지하기 위해 인큐베이터의 온도는 실험 내내 그리고 실험 사이에 안정적으로 유지되어야 하며 수정란을 분만한 후 3일 이내에 배양을 시작해야 합니다. 예기치 않게 높은 비율의 시술 사이의 배아 사망은 탈수로 인해 발생할 수 있습니다. 이를 피하려면 개봉 후와 이식 후 각 난자에 DPBS+/+ 를 두세 방울 떨어뜨리고 테이프로 매우 조심스럽게 밀봉하여 테이프의 주름을 최대한 매끄럽게 하는 것이 중요합니다. 난자가 열리는 횟수를 줄이기 위해 창과 이식 단계를 결합하는 것은 4일째 창구가 배아 사멸을 상당히 증가시키기 때문에 권장되지 않습니다. 이것은 이 단계에서 달걀 껍질에 자주 붙는 혈관 손상의 결과입니다.
결론적으로, 이 방법은 신장 오가노이드의 혈관 형성을 유도하고 성숙을 향상시키는 효율적이고 강력한 도구를 제공합니다. 많은 수의 오가노이드에서 이러한 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 현재 시험관 내에서 얻을 수 있는 것보다 더 높은 수준의 성숙이 필요한 신장 질환을 모델링할 수 있는 가능성이 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
닭 배아 주입에 도움을 준 George Galaris(LUMC, Leiden, Netherlands)에게 감사드립니다. 우리는 Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, the Netherlands), Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, the Netherlands)의 지원을 인정합니다. M. Koning은 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'에 의해 지원됩니다. 이 작업은 Leiden University Fund "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02의 일부 지원을 받았습니다. 이 작업은 RegMedXB (Regenerative Medicine Crossing Borders)와 Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health의 파트너가 지원합니다. C.W. van den Berg와 T.J. Rabelink는 Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine(reNEW)의 지원을 받고, Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine은 Novo Nordisk Foundation 보조금(NNF21CC0073729)의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
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