Summary
非侵入性前交叉韧带损伤是小鼠引发创伤后骨关节炎 （PTOA） 的可靠且具有临床相关性的方法。这种损伤方法还允许使用蛋白酶可激活的近红外探针和荧光反射成像在损伤后的早期时间点对关节中的蛋白酶活性 进行体内 定量。
Abstract
前交叉韧带 （ACL） 断裂或半月板撕裂等创伤性关节损伤通常在受伤后 10-20 年内导致创伤后骨关节炎 （PTOA）。了解关节损伤引发的早期生物过程（例如炎症、基质金属蛋白酶 （MMP）、组织蛋白酶蛋白酶、骨吸收）对于了解 PTOA 的病因至关重要。然而，这些生物过程 的体内 测量选择很少，如果使用侵入性手术技术或注射来启动 OA，早期生物学反应可能会混淆。在我们对 PTOA 的研究中，我们使用市售的近红外蛋白酶可激活探针结合荧光反射成像 （FRI） 来量化小鼠非侵入性压缩诱导的 ACL 损伤 后体内 蛋白酶活性。这种非侵入性 ACL 损伤方法紧密概括了临床相关的损伤状况，并且完全无菌，因为它不涉及破坏皮肤或关节囊。这些损伤和成像方法的结合使我们能够研究创伤性关节损伤后多个时间点的蛋白酶活性的时间过程。
Introduction
骨关节炎是一个普遍存在的健康问题，影响着美国数百万人1.创伤后骨关节炎 （PTOA） 是 OA 的一个亚型，由关节损伤引发，例如前交叉韧带 （ACL） 断裂、半月板损伤或关节内骨折2。可归类为 PTOA 的有症状 OA 患者比例至少为 12%3，这种病因通常影响比特发性 OA 更年轻的人群4。OA小鼠模型是在更短的时间内（小鼠模型为4-12周，而人类为10-20年）研究疾病病因和潜在OA治疗的重要工具。然而，在小鼠中启动OA的方法通常涉及侵入性手术技术，例如ACL横断5,6，内侧半月板的切除或不稳定5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16，或两者的组合 17,18,19，它们不会再现临床相关的损伤状况。由于关节囊的破坏，手术模型还会加剧关节炎症，这可能会加速 OA 的进展。
非侵入性膝关节损伤小鼠模型提供了在损伤后早期时间点研究生物学和生物力学变化的机会，并可能产生更多临床相关结果20。我们的实验室已经建立了一个非侵入性损伤模型，该模型使用单个外部施加的胫骨加压超负荷来诱导小鼠前交叉韧带 （ACL） 断裂21、22、23、24。这种非侵入性损伤方法能够在不破坏皮肤或关节囊的情况下产生无菌性关节损伤。
荧光反射成像 （FRI） 是一种光学成像方法，涉及用特定波长的红外光激发目标并量化在另一个波长发射的反射光。市售的蛋白酶特异性探针可以注射到动物模型中，然后可以使用FRI来量化特定部位（如膝关节）的蛋白酶活性。该方法已广泛用于炎症等生物活性的体内检测。用于此应用的探针被荧光淬灭，直到它们遇到相关的蛋白酶。然后，这些蛋白酶将破坏探针上的酶切割位点，之后它们将产生近红外荧光信号。这些探针和这种成像方法已在癌症25,26,27,28和动脉粥样硬化29,30,31,32的研究中得到广泛验证和使用，我们小组已将它们用于肌肉骨骼系统的研究，以测量炎症和基质降解的标志物23,24,33。
总之，非侵入性关节损伤与体内 FRI 和蛋白酶可激活探针相结合，提供了一种独特的能力来跟踪创伤性关节损伤后的炎症和蛋白酶活性。这种分析最早可以在受伤后数小时甚至数分钟内进行，并且可以多次评估同一动物以研究关节中蛋白酶活性的时间过程。重要的是，当与OA的手术模型结合使用时，这种成像方法可能不可行，因为皮肤和关节囊的破坏会导致荧光信号，从而混淆来自关节内的信号。
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Protocol
所描述的所有程序均已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用3个月大的雄性C57BL/6J小鼠。
1.无创ACL损伤
注意：由外部施加的压缩载荷产生的 ACL 损伤是一种简单且可重复的方法，可以密切概括人类的 ACL 损伤状况。该协议是为市售的负载框架仪器编写的（参见 材料表），但可以适用于类似的系统。
- 打开与载荷框架仪器兼容的软件（参见 材料表），然后选择现有控制文件或创建新文件。
- 打开执行器的电源。
- 在校准菜单中，将称重传感器的力读数去皮，并将执行器的位移设置为 0。
- 使用1%-4%吸入异氟醚的氧气麻醉小鼠，并确保通过捏脚趾和/或捏尾巴完全麻醉动物。
- 将鼠标置于平台上的俯卧位。将小腿垂直放置在两个装载夹具之间（图 1）（参见 材料表）。将脚插入顶部固定装置的切口中，将膝盖插入底部固定装置的杯子中。
- 手动调整底部夹具的高度以施加 1-2 N 的预紧力（在电脑屏幕上实时监控）并拧紧固定螺钉以保持该位置。在施加伤害负荷之前，需要预紧力将腿保持在正确的位置。
- 对目标力 （~12-15 N） 或目标位移 （~1.5-2.0 mm） 施加单个压缩载荷。
注意： 以较慢的加载速率 （~1 mm/s） 施加负载将提供更高水平的实时监测和控制，但可能会导致 ACL 撕脱失败。应用更快的加载速率（~200 mm/s）更有可能产生中物质 ACL 损伤22。如果确定发生了胫骨骨折或其他过度损伤，请在动物从麻醉中恢复之前使用 IACUC 批准的方法对动物实施安乐死。- 在软件控制文件中设置加载速率，并使用力位移数据进行确认。
注意：胫骨加压负荷期间的骨折通常不是问题，因为骨折力 （~20 N） 远高于 ACL 损伤力。然而，应通过触诊进行监测，影像学检查（即 X 线）可用于确认没有发生胫骨骨折。
- 在软件控制文件中设置加载速率，并使用力位移数据进行确认。
- 损伤通常用声音（“咔哒”或“嘎吱”）和力释放来表示，这在力-位移图上是可识别的（图1C）。如果使用较慢的负荷率，则在受伤后立即停止压缩负荷，以防止进一步负荷和可能对其他关节组织造成损害。
注意：ACL 损伤通常发生在 8-15 N，具体取决于体重34。重要的是要设定一个大于预期的前交叉韧带损伤力的目标力。 - 使用前后抽屉试验35,36 或类似的关节不稳定评估来确认 ACL 损伤。
- 在受伤后对小鼠施用动物体重依赖性剂量（例如，0.05-0.1mg / kg SC或丁丙诺啡的IP，参见 材料表），持续时间和剂量根据推荐和批准由家庭机构IACUC批准。
注意：非甾体抗炎药可能会改变损伤后 PTOA 的进展，因此不建议在此损伤模型中使用非甾体抗炎药进行疼痛管理，除非这是研究的特定目的。
2. FRI成像的动物制剂
注意：对于光学成像，动物皮毛（尤其是深色皮毛）在阻挡、吸收和散射光线方面非常有效，因此，在成像前必须尽可能从膝关节周围区域去除毛皮。脱毛霜通常比理发器更有效地去除毛发。裸鼠或无毛小鼠不需要去除皮毛。然而，对于最常用的小鼠品系（例如，C57BL/6），去除毛发是必要的。如果可能，在成像前用低荧光纯化食物喂养小鼠。标准小鼠食物含有叶绿素，叶绿素的波长约为 700 nm，可能会影响近红外 FRI 系统的数据收集。
- 用1%-4%吸入异氟醚的氧气麻醉小鼠。尽可能将小鼠放在加热垫上，并涂抹眼药膏以防止刺激眼睛。
- 使用棉签将脱毛膏（见 材料表）涂抹在膝关节周围小鼠腿的前部（颅骨）上。
- 让乳霜静置 ~1 分钟，然后用湿巾去除腿上的乳霜和毛发。如有必要，重复上述步骤。
- 一旦膝关节完全暴露在没有任何毛皮覆盖该区域，请用酒精湿巾清洁腿部以去除任何残留的脱毛膏。
注意：在整个研究过程中，脱毛霜可以多次用于同一只小鼠，但这些应用应至少间隔一周，以防止对皮肤造成不必要的刺激。
3.探针溶液的制备
- 如有必要，根据制造商的说明在无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释荧光活化探针。一小瓶市售探针（参见 材料表）通常含有 20 nmol 的 0.15 mL 1x PBS。要稀释小瓶中的溶液，加入 1.35 mL 1x PBS 以在 1.5 mL 1x PBS 中制备 20 nmol。
注意：稀释后，当每只小鼠注射0.15mL时，可以使用一个小瓶对10只小鼠进行成像。 - 以最低速度（~2000 rpm）涡旋溶液30秒，以确保探针溶解在溶液中，然后短暂离心以确保所有液体都从盖子中取出。
注意：溶液可以在2-8°C下储存在避光的地方长达12个月。
4.眶后注射
注：有关此程序的详细信息，请参阅 Yardeni 等人37.
- 使用1%-4%吸入异氟醚的氧气麻醉小鼠，并将小鼠侧卧，鼻子放在鼻锥中。
- 使用~29G胰岛素注射器注射探针溶液（在步骤3中制备）。
- 使用前请盖好注射器，以防止暴露在光线下。
- 注射时：
- 注射在眼睛内侧（泪腺），并确保注射器的斜面朝向眼睛。对于惯用右手的人，建议将动物朝右注射到鼠标的右眼中。
- 用非注射的手轻轻拉回眼睛周围的皮肤，以稳定头部并使眼睛突出。
- 将注射器与鼠标主体平行的角度。
- 轻轻地将注射器推进过眼睛，直到它遇到刚性阻力;不要试图超越这一点。
- 缓慢地将探针溶液注入眶后窦，然后缓慢地将针头从眼窝中拉出。如果针头没有溶液，则注射成功。
- 将生理盐水或眼药膏涂抹在注射的眼睛上。
注意：根据成像探头随附的文档，最佳成像时间通常在注射探针溶液后 1 到 2 天之间。如果可能，建议进行初始时间筛选，以确定每个特定应用的最佳成像时间。小鼠将在大约 7 天内代谢注射的探针，之后如果需要额外的时间点，则需要注射新剂量的探针溶液。
5. 荧光反射成像
注意：本节中的程序特定于市售光学成像系统（参见 材料表）。类似的成像可以使用类似的系统进行。
- 用1%-4%吸入异氟醚的氧气麻醉小鼠，并将动物仰卧在成像系统中，鼻子在鼻锥中。
- 放置鼠标时，小腿伸展，使膝盖略微指向空中（可能需要用胶带固定脚）。对所有动物使用一致的定位至关重要。
- 在成像系统计算机上打开兼容软件（见 材料表）;将出现“采集控制面板”。
- 要预热系统，请单击 “初始化 ”并等待温度指示灯变为绿色。
- 单击 “映像向导”，并确保出现“映像向导”窗口。
- 单击 滤光片对，并确保设置在“Epi-Illumination”上，然后按 下一步。
- 要选择正确的激发/发射设置，请从下拉列表中找到感兴趣的探头。如果找不到正确的探头，请找到名称“输入 Ex/Em”，然后根据要使用的探头的属性手动输入“激发峰”和“发射峰”的值（例如，对于“激发峰”，输入 675，对于“发射峰”，输入 720）。单击 “下一步”。
- 选择鼠 标 作为“成像主体”。在“曝光参数”中，确保选中自动 设置 ，并选择 荧光 和 照片 选项。在“视野”清单中选择 D-22.6 cm 。按 下一步。
- 可以在“采集控制面板”的右侧面板上查看和修改成像设置。确保所有设置正确，然后按 “采集序列 ”按钮。图像显示后，确认图像具有足够的曝光。如果没有，请更改曝光时间设置，然后再次单击 “获取序列 ”。
- 要分析图像，请在黑白图像的每个膝关节上放置一个大小一致的感兴趣区域 （ROI） 圆圈（这可以防止基于荧光信号区域的偏置定位）。
- 计算每个膝关节的总辐射效率和/或平均辐射效率。如果还计算了对侧腿的辐射效率，则通过将受伤腿的辐射效率测量值除以对侧腿的辐射效率测量值来归一化数据。
注意：如果所有膝盖都使用面积一致的感兴趣区域，则总辐射效率和平均辐射效率将产生相似的结果。如果使用不同大小的感兴趣区域，建议使用平均辐射效率。将来自受伤关节的辐射效率数据与来自未受伤的对侧膝关节的数据归一化将提供内部控制，以解释不同动物之间探针注射量和输送效率的任何差异。
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Representative Results
在对 3 个月大的雄性 C57BL/6J 小鼠的小腿施加单一压缩力（1 mm/s 直到受伤）后，所有小鼠的 ACL 损伤始终如一。膝关节损伤时的平均压缩力约为10 N（图1）。
FRI分析显示，在受伤后7天，遭受非侵入性ACL损伤的小鼠受伤关节中的蛋白酶活性显着提高（图2）。膝关节的FRI分析也对在非侵入性ACL损伤后立即接受膝关节手术重新稳定的小鼠进行，类似于先前在大鼠35,36,38中描述的。该分析显示，在受伤后 2 周和 4 周内接受再稳定手术的小鼠中，接受再稳定手术的小鼠的荧光信号明显更大。这些数据表明，侵入性外科手术可能会混淆关节中蛋白酶活性的分析。
图 1：非侵入性 ACL 损伤设置和损伤期间的力时间图。 （A，B） 鼠标的小腿在系统中垂直放置，脚踝放置在顶部固定装置的凹槽中，膝关节放置在底部固定装置的浅杯中。手动施加 1-2 N 的预紧力后，用固定螺钉将底部夹具锁定到位。 （C） 力位移图，显示大约 9 N 处的 ACL 损伤。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：检测小鼠膝关节蛋白酶活性的荧光反射成像。 （A，B）受伤后未受伤（A）和受伤（B）小鼠的代表性图像。（C） 非侵入性 ACL 损伤后一周未受伤和受伤小鼠双膝关节的平均辐射效率。与对侧关节和未受伤小鼠的关节相比，受伤关节的平均辐射效率高出43%。（D） 非侵入性损伤小鼠和也接受关节再稳定手术的损伤小鼠的归一化总辐射效率 （R/L）。在受伤后 1-4 周，与对侧关节相比，受伤关节的辐射效率高出 ~30%-80%。相比之下，与对侧关节相比，手术手术关节在第 4 周表现出 ~300% 的辐射效率，这表明手术具有显着的混杂效应。**P < 0.01。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议已经建立并严格描述了一种可重复的、非侵入性的方法来诱导小鼠 ACL 损伤 20,21,24,33。这种简单有效的损伤方法可以在短短几分钟内完成，这有利于 PTOA 的高通量研究。这种损伤方法还密切概括了与人体前交叉韧带损伤相关的损伤状况。用于诱导小鼠OA的手术方法可能排除使用体内成像方法来测量损伤后关节中蛋白酶活性的时间过程和大小。相比之下，非侵入性 OA 小鼠模型（在 20 中回顾）与 FRI 相结合，为损伤后小鼠膝关节中蛋白酶活性的体内成像提供了独特的能力。
损伤后的炎症反应在 OA 进展中至关重要。然而，用于分析关节炎症的方法通常昂贵、耗时且具有破坏性。例如，逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 或 RNAseq 等技术可用于定量整个关节、单个组织或单个细胞中的各种基因。然而，这种方法需要对小鼠实施安乐死以获得受伤和未受伤的膝关节。这些小鼠不能在多个时间点进行分析，例如蛋白酶反应峰值期间的早期时间点（即受伤后 3-14 天）和 OA 更严重的较晚时间点（即受伤后 4-6 周）。相比之下，FRI与非侵入性关节损伤相结合，提供了在体内分析小鼠膝关节中多个时间点的蛋白酶活性的能力39。这允许对相同的小鼠进行纵向分析，并使FRI成为比RT-PCR或RNAseq成本相对较低的结果。此外，可以同时对多个探针或目标进行不同波长的成像，从而为不同的目的提供多种结果。使用 FRI 测量关节中的蛋白酶活性并不能对 OA 进展过程中发生的所有炎症过程进行严格的定量，但该方法提供的体内和纵向数据可能仍可用于跟踪关节损伤后炎症蛋白酶活性的幅度和时间过程。
用于蛋白酶活性的 FRI 成像的荧光可激活探针溶液必须静脉内递送 （IV）。在小鼠中进行静脉注射的最常见方法是尾静脉注射和眼眶后注射。与尾静脉注射相比，眶后注射通常更容易进行，并且更容易促进必要的注射量。文献还表明，与尾静脉注射相比，眶后递送可能对小鼠造成较小的压力，在药物递送或疗效方面没有差异40。这些发现表明，眼眶后注射适用于注射荧光可激活探针溶液进行FRI成像。
与其他一些成像技术相比，FRI 的分辨率相对较低，但定量结果可以提供有关 OA 进展期间炎症蛋白酶反应的时间过程和程度的足够信息。该技术的局限性是组织自发荧光可能会影响结果，但这个问题可以在实验前通过彻底的计划（探针类型、小鼠品系、动物定位等）来解决。与其他临床前成像方法（例如，microPET、microSPECT、microCT、MRI）不同，由于小鼠和人类之间的体型存在巨大差异，因此 FRI 无法直接转化为临床成像方式，因为光穿透深度有限。然而，在使用啮齿动物模型的临床前研究中，膝关节靠近皮肤，软组织覆盖率最低。因此，FRI是检测小鼠膝关节蛋白酶活性的有效工具。
总之，非侵入性ACL损伤提供了一种简单且可重复的方法，可以在小鼠中启动PTOA。这种损伤方法还有助于使用蛋白酶可激活探针和荧光反射成像在体内测量 OA 进展期间小鼠关节中炎症蛋白酶活性的时间过程和大小。未来的研究可以使用这些技术和多种市售的近红外荧光可激活探针来研究不同年龄、性别和遗传背景的小鼠的 OA 进展机制，或评估减缓或预防关节损伤后 OA 进展的潜在疗法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物中报告的研究得到了美国国立卫生研究院下属的国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所的支持，奖项编号为 R01 AR075013。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline | Tissue Protech | PBS01-32R | or equivalent |
| Air Anesthetia System | Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone | ||
| Buprenorphine | Analgesic post-injury | ||
| Depilatory Cream | Veet | B001KYPZ4G | or equivalent |
| Fixtures | Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform | ||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Can also use comparable optical imaging system |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 06-666 | or equivalent |
| Living Image software | Perkin Elmer | ||
| Materials testing systems | TA Instruments | Electroforce 3200 or equivalent | |
| ProSense680 | Perkin Elmer | NEV10003 | Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc. |
| Sterile Syringe with Needle | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 550-82231-CS | Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent |
| Uniaxial load cell | TA Instruments | 20 N capacity | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | SI-0236 | or equivalent |
| WinTest software | TA Instruments | compatible with Electroforce 3200 |
References
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