Summary
Niet-invasief ACL-letsel is een betrouwbare en klinisch relevante methode voor het initiëren van posttraumatische artrose (PTOA) bij muizen. Deze letselmethode maakt het ook mogelijk om in vivo kwantificering van protease-activiteit in het gewricht op vroege tijdstippen na het letsel met behulp van protease-activeerbare nabij-infraroodsondes en fluorescentiereflectiebeeldvorming.
Abstract
Traumatische gewrichtsletsels zoals voorste kruisband (ACL) ruptuur of meniscusscheuren leiden vaak tot posttraumatische artrose (PTOA) binnen 10-20 jaar na letsel. Inzicht in de vroege biologische processen die worden geïnitieerd door gewrichtsletsels (bijv. ontsteking, matrix metalloproteïnasen (MMP's), cathepsineproteasen, botresorptie) is cruciaal voor het begrijpen van de etiologie van PTOA. Er zijn echter weinig opties voor in vivo meting van deze biologische processen, en de vroege biologische reacties kunnen worden verstoord als invasieve chirurgische technieken of injecties worden gebruikt om artrose te initiëren. In onze onderzoeken naar PTOA hebben we in de handel verkrijgbare nabij-infrarood protease-activeerbare sondes gebruikt in combinatie met fluorescentiereflectiebeeldvorming (FRI) om protease-activiteit in vivo te kwantificeren na niet-invasieve compressie-geïnduceerde ACL-schade bij muizen. Deze niet-invasieve ACL-letselmethode recapituleert nauwkeurig klinisch relevante letselaandoeningen en is volledig aseptisch omdat de huid of het gewrichtskapsel niet wordt verstoord. De combinatie van deze letsel- en beeldvormingsmethoden stelt ons in staat om het tijdsverloop van protease-activiteit op meerdere tijdstippen na een traumatisch gewrichtsletsel te bestuderen.
Introduction
Artrose is een alomtegenwoordig gezondheidsprobleem dat miljoenen mensen in deVerenigde Staten treft. Posttraumatische artrose (PTOA) is een subset van artrose die wordt geïnitieerd door een gewrichtsblessure zoals een voorste kruisband (ACL) ruptuur, meniscusletsel of intra-articulaire fractuur2. Het percentage symptomatische artrosepatiënten dat als PTOA kan worden geclassificeerd, is ten minste 12%3, en deze etiologie treft doorgaans een jongere populatie dan idiopathische artrose4. Muismodellen van artrose zijn cruciale hulpmiddelen voor het onderzoeken van de etiologie van de ziekte en mogelijke artrosebehandelingen op een veel kortere tijdlijn (4-12 weken in muismodellen vergeleken met 10-20 jaar bij mensen). De methoden om artrose bij muizen te initiëren omvatten echter gewoonlijk invasieve chirurgische technieken zoals ACL-doorsnede 5,6, verwijdering of destabilisatie van de mediale meniscus 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, of een combinatie van beide 17,18,19, die geen klinisch relevante letselaandoeningen reproduceren. Chirurgische modellen verergeren ook ontstekingen in het gewricht als gevolg van verstoring van het gewrichtskapsel, wat de progressie van artrose zou kunnen versnellen.
Niet-invasieve muismodellen met knieletsel bieden de mogelijkheid om biologische en biomechanische veranderingen op vroege tijdstippen na het letsel te bestuderen en kunnen meer klinisch relevante resultaten opleveren20. Ons laboratorium heeft een niet-invasief letselmodel ontwikkeld dat gebruik maakt van een enkele extern aangebrachte overbelasting van de tibiale compressie om een voorste kruisband (ACL) te induceren bij muizen 21,22,23,24. Deze niet-invasieve letselmethode is in staat om een aseptisch gewrichtsletsel te veroorzaken zonder de huid of het gewrichtskapsel te verstoren.
Fluorescentiereflectiebeeldvorming (FRI) is een optische beeldvormingsmethode waarbij een doelwit wordt opgewekt met infrarood licht op een specifieke golflengte en het gereflecteerde licht dat op een andere golflengte wordt uitgezonden, wordt gekwantificeerd. In de handel verkrijgbare protease-specifieke sondes kunnen in diermodellen worden geïnjecteerd en FRI kan vervolgens worden gebruikt om de protease-activiteit op specifieke plaatsen zoals het kniegewricht te kwantificeren. Deze methode wordt veel gebruikt voor in vivo detectie van biologische activiteiten zoals ontstekingen. De sondes die voor deze toepassing worden gebruikt, worden fluorescerend gedoofd totdat ze relevante proteasen tegenkomen. Die proteasen zullen dan een enzymsplitsingsplaats op de sondes breken, waarna ze een nabij-infrarood fluorescerend signaal zullen produceren. Deze sondes en deze beeldvormingsmethode zijn uitgebreid gevalideerd en gebruikt in onderzoeken naar kanker 25,26,27,28 en atherosclerose 29,30,31,32, en onze groep heeft ze gebruikt voor studies van het bewegingsapparaat om markers van ontsteking en matrixafbraak te meten 23,24,33.
Samen bieden niet-invasieve gewrichtsletsels in combinatie met in vivo FRI- en protease-activeerbare sondes een uniek vermogen om ontstekingen en protease-activiteit na een traumatisch gewrichtsletsel te volgen. Deze analyse kan al uren of zelfs minuten na de verwonding worden uitgevoerd en hetzelfde dier kan meerdere keren worden beoordeeld om het tijdsverloop van protease-activiteit in het gewricht te bestuderen. Belangrijk is dat deze beeldvormingsmethode mogelijk niet haalbaar is in combinatie met chirurgische modellen van artrose, omdat verstoring van de huid en het gewrichtskapsel resulteert in een fluorescentiesignaal dat het signaal van binnenuit het gewricht zou verwarren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of California Davis. Voor de huidige studie werden mannelijke C57BL/6J-muizen van 3 maanden oud gebruikt.
1. Niet-invasief ACL-letsel
OPMERKING: ACL-letsel veroorzaakt door een extern uitgeoefende drukbelasting is een eenvoudige en reproduceerbare methode die ACL-letsels bij mensen nauwkeurig recapituleert. Dit protocol is geschreven voor een in de handel verkrijgbaar instrument met een belastingsframe (zie Materiaaltabel), maar kan worden aangepast voor vergelijkbare systemen.
- Open de software die compatibel is met het load frame-instrument (zie Materiaaltabel) en selecteer een bestaand besturingsbestand of maak een nieuw bestand aan.
- Schakel de stroom van de actuator in.
- Tarreer in het kalibratiemenu de krachtmeting van de loadcel en stel de verplaatsing van de actuator in op 0.
- Gebruik 1%-4% geïnhaleerde isofluraan in zuurstof om de muizen te verdoven en zorg ervoor dat de dieren volledig worden verdoofd door teenknijp en/of staartknijpen.
- Plaats de muis in buikligging op het platform. Plaats het onderbeen verticaal tussen twee laadinrichtingen (Figuur 1) (zie Materiaaltabel). Plaats de voet in de uitsparing van het bovenste armatuur en de knie in de beker van het onderste armatuur.
- Pas de hoogte van het onderste armatuur handmatig aan om een voorspanning van 1-2 N toe te passen (in realtime gecontroleerd op het computerscherm) en draai de stelschroef vast om de positie vast te houden. De voorspanning is nodig om het been in de juiste positie te houden voordat de blessurebelasting wordt toegepast.
- Oefen een enkele drukbelasting uit op een doelkracht (~12-15 N) of doelverplaatsing (~1.5-2.0 mm).
NOTITIE: Het toepassen van de belasting met een lagere laadsnelheid (~1 mm/s) zorgt voor een hoger niveau van real-time monitoring en controle, maar zal waarschijnlijk resulteren in een avulsiefout van de ACL. Het toepassen van een snellere laadsnelheid (~200 mm/s) zal meer kans hebben op een ACL-letsel in het midden van de stof22. Als wordt vastgesteld dat er een scheenbeenfractuur of ander buitensporig letsel is opgetreden, euthanaseer het dier dan met behulp van een door IACUC goedgekeurde methode voordat het dier herstelt van de anesthesie.- Stel de beladingssnelheid in het softwarebesturingsbestand in en bevestig met behulp van de krachtverplaatsingsgegevens.
OPMERKING: Botbreuk tijdens tibiale compressiebelasting is meestal geen probleem, aangezien de fractuurkracht (~20 N) aanzienlijk hoger is dan de ACL-letselkracht. Dit moet echter worden gecontroleerd met palpatie en beeldvorming (d.w.z. röntgenfoto's) kan worden gebruikt om te bevestigen dat er geen scheenbeenfracturen zijn opgetreden.
- Stel de beladingssnelheid in het softwarebesturingsbestand in en bevestig met behulp van de krachtverplaatsingsgegevens.
- Letsel wordt meestal aangegeven met een geluid ("klik" of "crunch") en een vrijkomende kracht die herkenbaar is op de krachtverplaatsingsgrafieken (figuur 1C). Als een langzamere belasting wordt gebruikt, stop dan onmiddellijk na het letsel met de drukbelasting om verdere belasting en mogelijke schade aan andere gewrichtsweefsels te voorkomen.
OPMERKING: ACL-letsel treedt meestal op bij 8-15 N, afhankelijk van de lichaamsmassa34. Het is belangrijk om een doelkracht in te stellen die groter is dan de verwachte ACL-blessurekracht. - Bevestig de ACL-verwonding met behulp van een anterieure-posterieure ladetest35,36 of een vergelijkbare beoordeling van gewrichtsinstabiliteit.
- Dien een dierlijke, gewichtsafhankelijke dosis (bijv. 0,05-0,1 mg/kg SC of IP van buprenorfine, zie materiaaltabel) toe aan muizen na verwonding, met duur en dosis zoals aanbevolen en goedgekeurd door de thuisinstelling IACUC.
OPMERKING: NSAID's kunnen de progressie van PTOA na letsel veranderen, dus het wordt niet aanbevolen om NSAID's te gebruiken voor pijnbestrijding in dit letselmodel, tenzij dit een specifiek doel van het onderzoek is.
2. Voorbereiding van dieren voor FRI-beeldvorming
OPMERKING: Voor optische beeldvorming is dierenbont (met name donkere vacht) zeer effectief in het blokkeren, absorberen en verstrooien van licht, daarom moet vacht zoveel mogelijk uit het gebied rond de kniegewrichten worden verwijderd voordat het wordt afgebeeld. Een ontharingscrème is doorgaans effectiever voor het verwijderen van vacht dan een tondeuse. Naakte of haarloze muizen hoeven hun vacht niet te verwijderen. Het verwijderen van de vacht is echter noodzakelijk voor de meest gebruikte muizenstammen (bijv. C57BL/6). Voer muizen indien mogelijk met gezuiverd voedsel met een lage fluorescentie voordat u beeldvorming maakt. Standaard muizenvoer bevat chlorofyl, dat automatisch fluoresceert met een golflengte van ongeveer 700 nm en de gegevensverzameling van het nabij-infrarood FRI-systeem kan beïnvloeden.
- Verdoof muizen met 1%-4% geïnhaleerd isofluraan in zuurstof. Houd muizen zoveel mogelijk op een verwarmingskussen en breng oogzalf aan om irritatie van de ogen te voorkomen.
- Gebruik een wattenstaafje om ontharingscrème (zie Materiaaltabel) aan te brengen op het voorste (craniale) aspect van de poten van de muizen rond het kniegewricht.
- Laat de crème ~1 minuut staan en gebruik dan doekjes om de crème en vacht van het been te verwijderen. Herhaal indien nodig.
- Zodra de kniegewrichten volledig zichtbaar zijn zonder dat er vacht op het gebied zit, reinigt u de benen met alcoholdoekjes om eventuele resterende ontharingscrème te verwijderen.
OPMERKING: Ontharingscrème kan tijdens een onderzoek meerdere keren op dezelfde muizen worden gebruikt, maar deze toepassingen moeten ten minste een week uit elkaar liggen om onnodige irritatie van de huid te voorkomen.
3. Bereiding van de sondeoplossing
- Verdun indien nodig de fluorescentie-activeerbare sonde volgens de instructies van de fabrikant in steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Eén injectieflacon van de in de handel verkrijgbare sonde (zie Materiaaltabel) bevat doorgaans 20 nmol in 0,15 ml 1x PBS. Om de oplossing in de injectieflacon te verdunnen, voegt u 1,35 ml 1x PBS toe om 20 nmol te maken in 1,5 ml 1x PBS.
OPMERKING: Na verdunning kan één injectieflacon worden gebruikt om tien muizen af te beelden bij het injecteren van 0,15 ml per muis. - Draai de oplossing met een minimale snelheid (~2000 tpm) gedurende 30 s om ervoor te zorgen dat de sonde in oplossing is opgelost en centrifugeer vervolgens kort om ervoor te zorgen dat alle vloeistof uit het deksel is.
NOTITIE: De oplossing kan worden bewaard bij 2-8 °C op een plaats die maximaal 12 maanden beschermd is tegen licht.
4. Retro-orbitale injectie
OPMERKING: Zie Yardeni et al. voor de details van deze procedure37.
- Gebruik 1%-4% geïnhaleerde isofluraan in zuurstof om muizen te verdoven en leg de muis op zijn zij met de snuit in een neuskegel.
- Gebruik insulinespuiten van ~29 G voor injectie van sondeoplossing (bereid in stap 3).
- Houd de spuit voor gebruik afgedekt om blootstelling aan licht te voorkomen.
- Bij het toedienen van de injectie:
- Injecteer aan de binnenkant van het oog (traancaruncula) en zorg ervoor dat de schuine kant van de spuit naar het oog is gericht. Voor rechtshandige mensen wordt aanbevolen om in het rechteroog van de muis te injecteren met het dier naar rechts gericht.
- Trek met de niet-injecterende hand voorzichtig de huid rond het oog terug om het hoofd te stabiliseren en het oog uit te laten steken.
- Kantel de spuit evenwijdig aan het lichaam van de muis.
- Beweeg de spuit voorzichtig langs het oog totdat deze op stijve weerstand stuit; Probeer niet voorbij dit punt te duwen.
- Injecteer de sondeoplossing langzaam in de retro-orbitale sinus en trek vervolgens langzaam de naald uit de oogkas. Als er geen oplossing met de naald uitkomt, is de injectie succesvol.
- Breng zoutoplossing of oogzalf aan op het geïnjecteerde oog.
OPMERKING: Op basis van de documentatie die bij de beeldvormingssondes is geleverd, is de optimale beeldvormingstijd doorgaans tussen 1 en 2 dagen na injectie van de sondeoplossing. Indien mogelijk wordt aanbevolen om een eerste tijdscreening uit te voeren om de optimale beeldvormingstijd voor elke specifieke toepassing te bepalen. Muizen zullen de geïnjecteerde sonde binnen ongeveer 7 dagen metaboliseren, waarna een nieuwe dosis sondeoplossing moet worden geïnjecteerd als extra tijdstippen gewenst zijn.
5. Fluorescentiereflectie beeldvorming
OPMERKING: De procedures in dit gedeelte zijn specifiek voor een in de handel verkrijgbaar optisch beeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel). Vergelijkbare beeldvorming kan worden uitgevoerd met vergelijkbare systemen.
- Verdoof muizen met 1%-4% geïnhaleerde isofluraan in zuurstof en plaats het dier in rugligging in het beeldvormingssysteem met de snuit in een neuskegel.
- Plaats de muis met de onderbenen gestrekt zodat de knieën iets in de lucht staan (het kan nodig zijn om de voeten af te plakken). Het is van cruciaal belang dat voor alle dieren een consistente positionering wordt gebruikt.
- Open de compatibele software (zie Materiaaltabel) op de computer van het beeldvormingssysteem; het "Acquisition Control Panel" verschijnt.
- Om het systeem op te warmen, klikt u op Initialiseren en wacht u tot het temperatuurlampje groen wordt.
- Klik op Imaging Wizard en zorg ervoor dat het venster "Imaging Wizard" verschijnt.
- Klik op Filter Pair en zorg ervoor dat de instelling op 'Epi-Illumination' staat en druk vervolgens op Volgende.
- Om de juiste excitatie-/emissie-instellingen te selecteren, zoekt u de betreffende sonde in de vervolgkeuzelijst. Als men de juiste sonde niet kan vinden, zoek dan de naam 'Input Ex/Em' en typ handmatig de waarde van Excitatie Piek en Emissiepiek in op basis van de eigenschap van de sonde die moet worden gebruikt (bijv. voor Excitatie Piek, voer 675 in, en voor Emissie Piek, voer 720 in). Klik op Volgende.
- Kies Muis voor "Beeldvormingsonderwerp". Zorg ervoor dat in "Belichtingsparameters" de automatische instellingen zijn aangevinkt en dat de opties Fluorescerend en Foto zijn geselecteerd. Selecteer D-22.6 cm in de checklist van "Gezichtsveld". Druk op Volgende.
- De beeldvormingsinstelling is te zien en te wijzigen op het rechterpaneel van het "Acquisition Control Panel". Zorg ervoor dat alle instellingen correct zijn en druk op de knop Volgorde verkrijgen . Nadat de afbeelding is weergegeven, controleert u of de afbeelding voldoende is belicht. Als dit niet het geval is, wijzigt u de instelling voor de belichtingstijd en klikt u nogmaals op Sequentie verkrijgen .
- Om het beeld te analyseren, plaatst u een cirkel van belang (ROI) met een consistente grootte over elk kniegewricht op het zwart-witbeeld (dit voorkomt een bevooroordeelde positionering op basis van gebieden met een fluorescerend signaal).
- Bereken het totale stralingsrendement en/of het gemiddelde stralingsrendement voor elk kniegewricht. Als de stralingsefficiëntie ook wordt berekend op de contralaterale benen, normaliseer dan de gegevens door de stralingsefficiëntiemeting voor het geblesseerde been te delen door de stralingsefficiëntiemeting van het contralaterale been.
OPMERKING: Als voor alle knieën een interessegebied met een consistent gebied wordt gebruikt, zullen zowel de totale stralingsefficiëntie als de gemiddelde stralingsefficiëntie vergelijkbare resultaten opleveren. Het gebruik van een gemiddelde stralingsefficiëntie wordt aanbevolen als interessegebieden met verschillende groottes worden gebruikt. Het normaliseren van stralingsefficiëntiegegevens van het geblesseerde gewricht met de gegevens van de niet-gewonde contralaterale knie zal een interne controle bieden om rekening te houden met eventuele verschillen in de hoeveelheid geïnjecteerde sonde en de toedieningsefficiëntie tussen verschillende dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het uitoefenen van een enkele drukkracht (1 mm/s tot verwonding) op de onderbenen van mannelijke C57BL/6J-muizen van 3 maanden oud, werd bij alle muizen consequent ACL-letsel geïnduceerd. De gemiddelde drukkracht bij knieletsel was ongeveer 10 N (figuur 1).
FRI-analyse toonde een significant grotere protease-activiteit in de gewonde gewrichten van muizen die 7 dagen na het letsel werden onderworpen aan niet-invasieve ACL-schade (Figuur 2). FRI-analyse van kniegewrichten werd ook uitgevoerd bij muizen die onmiddellijk na niet-invasief ACL-letsel chirurgische restabilisatie van het kniegewricht ondergingen, vergelijkbaar met wat eerder is beschreven bij ratten 35,36,38. Deze analyse toonde een aanzienlijk groter fluorescerend signaal bij muizen die een restabilisatieoperatie ondergingen dan muizen die zowel 2 als 4 weken na het letsel niet werden geopereerd. Deze gegevens suggereren dat invasieve chirurgische ingrepen de analyse van protease-activiteit in het gewricht kunnen verwarren.
Figuur 1: Niet-invasieve ACL-blessure-opstelling en een kracht-tijdplot tijdens letsel. (A,B) Het onderbeen van de muis is verticaal in het systeem geplaatst, met de enkel in een inkeping van het bovenste armatuur en het kniegewricht in een ondiepe beker op het onderste armatuur. De onderste armatuur wordt op zijn plaats vergrendeld met een stelschroef na het handmatig toepassen van een voorspanning van 1-2 N. (C) Krachtverplaatsingsplot, die ACL-letsel toont bij ongeveer 9 N. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Fluorescentiereflectiebeeldvorming die protease-activiteit detecteert in kniegewrichten van muizen. (A,B) Representatieve beelden van niet-gewonde (A) en gewonde (B) muizen na verwonding. (C) Gemiddelde stralingsefficiëntie van beide kniegewrichten voor niet-gewonde en gewonde muizen een week na niet-invasief ACL-letsel. Gewonde gewrichten vertoonden een 43% hogere gemiddelde stralingsefficiëntie in vergelijking met contralaterale gewrichten en gewrichten van niet-gewonde muizen. (D) Genormaliseerde totale stralingsefficiëntie (R/L) voor niet-invasief gewonde muizen en gewonde muizen die ook werden onderworpen aan gewrichtsrestabilisatiechirurgie. Een ~30%-80% grotere stralingsefficiëntie werd waargenomen in geblesseerde gewrichten in vergelijking met contralaterale gewrichten 1-4 weken na het letsel. Daarentegen vertoonden chirurgisch geopereerde gewrichten ~300% grotere stralingsefficiëntie in week 4 in vergelijking met contralaterale gewrichten, wat wijst op een opmerkelijk verstorend effect van chirurgie. **P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol heeft een reproduceerbare, niet-invasieve methode voor het induceren van ACL-letsel bij muizen vastgesteld en rigoureus beschreven 20,21,24,33. Deze eenvoudige en efficiënte verwondingsmethode kan in slechts enkele minuten worden uitgevoerd, wat high-throughput studies van PTOA mogelijk maakt. Deze letselmethode geeft ook nauwkeurig een samenvatting van letselomstandigheden die relevant zijn voor ACL-letsel bij de mens. Chirurgische methoden die worden gebruikt om artrose bij muizen te induceren, kunnen het gebruik van in vivo beeldvormingsmethoden uitsluiten om het tijdsverloop en de omvang van de protease-activiteit in het gewricht na letsel te meten. Niet-invasieve artrosemuismodellen (beoordeeld in20) in combinatie met FRI bieden daarentegen een unieke mogelijkheid voor in vivo beeldvorming van protease-activiteit in kniegewrichten van muizen na letsel.
De ontstekingsreactie na een blessure is van cruciaal belang bij de progressie van artrose. De methoden die worden gebruikt om ontstekingen in het gewricht te analyseren, zijn echter doorgaans duur, tijdrovend en destructief. Technieken zoals reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) of RNAseq kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om een breed scala aan genen in hele gewrichten, individuele weefsels of afzonderlijke cellen te kwantificeren. Deze methode vereist echter dat muizen worden geëuthanaseerd om gewonde en niet-gewonde kniegewrichten te krijgen. Deze muizen kunnen niet op meerdere tijdstippen worden geanalyseerd, zoals een vroeg tijdstip tijdens de piekproteaserespons (d.w.z. 3-14 dagen na het letsel) en een later tijdstip waarop artrose ernstiger is (d.w.z. 4-6 weken na het letsel). FRI daarentegen in combinatie met niet-invasief gewrichtsletsel biedt de mogelijkheid om protease-activiteit op meerdere tijdstippen in de kniegewrichten van muizen in vivo te analyseren 39. Dit maakt longitudinale analyse van dezelfde muizen mogelijk en maakt FRI een relatief goedkopere uitkomst dan RT-PCR of RNAseq. Bovendien kunnen meerdere sondes of doelen tegelijkertijd op verschillende golflengten worden afgebeeld, wat meerdere resultaten voor verschillende doeleinden kan opleveren. Het meten van protease-activiteit in het gewricht met behulp van FRI biedt geen rigoureuze kwantificering van alle ontstekingsprocessen die optreden tijdens artroseprogressie, maar de in vivo en longitudinale gegevens die door deze methode worden verstrekt, kunnen nog steeds nuttig zijn voor het volgen van de omvang en het tijdsverloop van inflammatoire protease-activiteit na gewrichtsletsel.
De fluorescentie-activeerbare sondeoplossing die wordt gebruikt voor FRI-beeldvorming van protease-activiteit moet intraveneus worden toegediend (IV). De meest gebruikelijke manieren om IV-injectie bij muizen uit te voeren, zijn staartaderinjectie en retro-orbitale injectie. Retro-orbitale injectie is vaak gemakkelijker uit te voeren en vergemakkelijkt het benodigde injectievolume gemakkelijker dan injectie van staartaders. Literatuur geeft ook aan dat retro-orbitale toediening minder stress kan veroorzaken bij muizen zonder verschil in medicijnafgifte of werkzaamheid in vergelijking met de injectie van de staartader40. Deze bevindingen suggereren dat retro-orbitale injectie geschikt is voor het injecteren van de fluorescentie-activeerbare sondeoplossing voor FRI-beeldvorming.
De resolutie van FRI is relatief laag in vergelijking met sommige andere beeldvormingstechnieken, maar de kwantitatieve resultaten kunnen voldoende informatie geven over het tijdsverloop en de omvang van de inflammatoire proteaserespons tijdens artroseprogressie. Een beperking van deze techniek is dat weefselautofluorescentie de resultaten kan beïnvloeden, maar dit probleem kan worden opgelost met een grondig plan vóór het experiment (sondetype, muizenstam, positionering van het dier, enz.). In tegenstelling tot andere preklinische beeldvormingsmethoden (bijv. microPET, microSPECT, microCT, MRI), kan FRI niet direct worden vertaald naar een klinische beeldvormingsmodaliteit vanwege de drastische verschillen in grootte tussen muizen en mensen, aangezien de diepte van de lichtpenetratie beperkt is. In preklinische studies met knaagdiermodellen bevindt het kniegewricht zich echter dicht bij de huid met minimale bedekking van zacht weefsel. Bijgevolg is FRI een effectief hulpmiddel voor het detecteren van protease-activiteit in het kniegewricht van muizen.
Kortom, niet-invasieve ACL-schade biedt een eenvoudige en reproduceerbare methode om PTOA bij muizen te initiëren. Deze letselmethode vergemakkelijkt ook het gebruik van protease-activeerbare sondes en fluorescentiereflectiebeeldvorming voor in vivo meting van het tijdsverloop en de omvang van inflammatoire protease-activiteit in muizengewrichten tijdens artroseprogressie. Toekomstige studies zouden deze technieken en de meerdere in de handel verkrijgbare nabij-infrarood fluorescentie-activeerbare sondes kunnen gebruiken om OA-progressiemechanismen te onderzoeken bij muizen van verschillende leeftijden, geslachten en genetische achtergronden of om mogelijke therapieën te evalueren voor het vertragen of voorkomen van artroseprogressie na gewrichtsletsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, onderdeel van de National Institutes of Health, onder toekenningsnummer R01 AR075013.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline | Tissue Protech | PBS01-32R | or equivalent |
| Air Anesthetia System | Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone | ||
| Buprenorphine | Analgesic post-injury | ||
| Depilatory Cream | Veet | B001KYPZ4G | or equivalent |
| Fixtures | Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform | ||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Can also use comparable optical imaging system |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 06-666 | or equivalent |
| Living Image software | Perkin Elmer | ||
| Materials testing systems | TA Instruments | Electroforce 3200 or equivalent | |
| ProSense680 | Perkin Elmer | NEV10003 | Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc. |
| Sterile Syringe with Needle | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 550-82231-CS | Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent |
| Uniaxial load cell | TA Instruments | 20 N capacity | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | SI-0236 | or equivalent |
| WinTest software | TA Instruments | compatible with Electroforce 3200 |
References
- Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research (Hoboken. 68 (12), 1743-1750 (2016).
- Carbone, A., Rodeo, S. Review of current understanding of post-traumatic osteoarthritis resulting from sports injuries. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 397-405 (2017).
- Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M.
- Wang, L. J., Zeng, N., Yan, Z. P., Li, J. T., Ni, G. X. Post-traumatic osteoarthritis following ACL injury. Arthritis Research & Therapy. 22 (1), 57 (2020).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Kamekura, S. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 18 (4), 572-580 (2010).
- Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nature Medicine. 16 (6), 687-693 (2010).
- Moodie, J. P., Stok, K. S., Muller, R., Vincent, T. L., Shefelbine, S. J. Multimodal imaging demonstrates concomitant changes in bone and cartilage after destabilisation of the medial meniscus and increased joint laxity. Osteoarthritis Cartilage. 19 (2), 163-170 (2011).
- Li, J., et al. Knockout of ADAMTS5 does not eliminate cartilage aggrecanase activity but abrogates joint fibrosis and promotes cartilage aggrecan deposition in murine osteoarthritis models. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 516-522 (2011).
- Shapiro, F., Glimcher, M. J. Induction of osteoarthrosis in the rabbit knee joint. Clinical Orthopaedics and Related Research. 147, 287-295 (1980).
- Meacock, S. C., Bodmer, J. L., Billingham, M. E.
- Armstrong, S. J., Read, R. A., Ghosh, P., Wilson, D. M. Moderate exercise exacerbates the osteoarthritic lesions produced in cartilage by meniscectomy: a morphological study. Osteoarthritis Cartilage. 1 (2), 89-96 (1993).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- Wancket, L. M., et al. Anatomical localization of cartilage degradation markers in a surgically induced rat osteoarthritis model. Toxicologic Pathology. 33 (4), 484-489 (2005).
- Karahan, S., Kincaid, S. A., Kammermann, J. R., Wright, J. C. Evaluation of the rat stifle joint after transection of the cranial cruciate ligament and partial medial meniscectomy. Comparative Medicine. 51 (6), 504-512 (2001).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 13 (7), 632-641 (2005).
- Jones, M. D., et al. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis & Rheumatology. 62 (9), 2726-2735 (2010).
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
- Lockwood, K. A., Chu, B. T., Anderson, M. J., Haudenschild, D. R., Christiansen, B. A. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 32 (1), 79-88 (2014).
- Satkunananthan, P. B., et al. In vivo fluorescence reflectance imaging of protease activity in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1461-1469 (2014).
- Hsia, A. W., et al. Post-traumatic osteoarthritis progression is diminished by early mechanical unloading and anti-inflammatory treatment in mice. Osteoarthritis Cartilage. 29 (12), 1709-1719 (2021).
- Zhang, H., et al. Biochromoendoscopy: molecular imaging with capsule endoscopy for detection of adenomas of the GI tract. Gastrointestinal Endoscopy. 68 (3), 520-527 (2008).
- Gounaris, E., et al. Live imaging of cysteine-cathepsin activity reveals dynamics of focal inflammation, angiogenesis, and polyp growth. PLoS One. 3 (8), e2916 (2008).
- Sheth, R. A., Mahmood, U. Optical molecular imaging and its emerging role in colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (4), G807-G820 (2010).
- Clapper, M. L., et al. Detection of colorectal adenomas using a bioactivatable probe specific for matrix metalloproteinase activity. Neoplasia. 13 (8), 685-691 (2011).
- Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circulation Research. 100 (8), 1218-1225 (2007).
- Jaffer, F. A., et al. Optical visualization of cathepsin K activity in atherosclerosis with a novel, protease-activatable fluorescence sensor. Circulation. 115 (17), 2292-2298 (2007).
- Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1017-1024 (2009).
- Razansky, D., et al. Multispectral optoacoustic tomography of matrix metalloproteinase activity in vulnerable human carotid plaques. Molecular Imaging and Biology. 14 (3), 277-285 (2012).
- Hsia, A. W., et al. Osteophytes and fracture calluses share developmental milestones and are diminished by unloading. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 699-710 (2018).
- Blaker, C. L., Little, C. B., Clarke, E. C. Joint loads resulting in ACL rupture: Effects of age, sex, and body mass on injury load and mode of failure in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 35 (8), 1754-1763 (2017).
- Murata, K., et al. Controlling joint instability delays the degeneration of articular cartilage in a rat model. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 297-308 (2017).
- Murata, K., et al. Controlling Abnormal joint movement inhibits response of osteophyte formation. Cartilage. 9 (4), 391-401 (2018).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kokubun, T., et al. Effect of changing the joint kinematics of knees with a ruptured anterior cruciate ligament on the molecular biological responses and spontaneous healing in a rat model. The American Journal of Sports Medicine. 44 (11), 2900-2910 (2016).
- Bhatti, F. U., et al. Characterization of non-invasively induced post-traumatic osteoarthritis in mice. Antioxidants (Basel). 11 (9), 1783 (2022).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Laboratory Animals (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
