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Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65249
Automatic Translation
1, 1
1Lawrence J. Ellison Musculoskeletal Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of California Davis Health

Summary

Die nicht-invasive ACL-Verletzung ist eine zuverlässige und klinisch relevante Methode zur Initiierung der posttraumatischen Osteoarthritis (PTOA) bei Mäusen. Diese Verletzungsmethode ermöglicht auch die In-vivo-Quantifizierung der Proteaseaktivität im Gelenk zu frühen Zeitpunkten nach der Verletzung unter Verwendung von Protease-aktivierbaren Nahinfrarotsonden und Fluoreszenzreflexionsbildgebung.

Abstract

Traumatische Gelenkverletzungen wie der Riss des vorderen Kreuzbandes (ACL) oder Meniskusrisse führen häufig innerhalb von 10 bis 20 Jahren nach der Verletzung zu einer posttraumatischen Arthrose (PTOA). Das Verständnis der frühen biologischen Prozesse, die durch Gelenkverletzungen ausgelöst werden (z. B. Entzündungen, Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Cathepsin-Proteasen, Knochenresorption), ist entscheidend für das Verständnis der Ätiologie von PTOA. Es gibt jedoch nur wenige Möglichkeiten für die In-vivo-Messung dieser biologischen Prozesse, und die frühen biologischen Reaktionen können verfälscht werden, wenn invasive chirurgische Techniken oder Injektionen verwendet werden, um OA zu initiieren. In unseren Studien zu PTOA haben wir kommerziell erhältliche Nahinfrarot-Protease-aktivierbare Sonden in Kombination mit Fluoreszenz-Reflektanz-Bildgebung (FRI) verwendet, um die Proteaseaktivität in vivo nach nicht-invasiver kompressionsinduzierter ACL-Verletzung bei Mäusen zu quantifizieren. Diese nicht-invasive ACL-Verletzungsmethode rekapituliert klinisch relevante Verletzungszustände genau und ist vollständig aseptisch, da sie weder die Haut noch die Gelenkkapsel stört. Die Kombination dieser Verletzungs- und bildgebenden Verfahren ermöglicht es uns, den zeitlichen Verlauf der Proteaseaktivität zu mehreren Zeitpunkten nach einer traumatischen Gelenkverletzung zu untersuchen.

Introduction

Arthrose ist ein weit verbreitetes Gesundheitsproblem, von dem Millionen von Menschen in den Vereinigten Staaten betroffensind 1. Posttraumatische Arthrose (PTOA) ist eine Untergruppe der OA, die durch eine Gelenkverletzung wie einen Riss des vorderen Kreuzbandes (ACL), eine Meniskusverletzung oder eine intraartikuläre Frakturausgelöst wird 2. Der Anteil der symptomatischen OA-Patienten, die als PTOA klassifiziert werden können, beträgt mindestens 12 %3, und diese Ätiologie betrifft typischerweise eine jüngere Population als idiopathische OA4. Mausmodelle von OA sind entscheidende Werkzeuge für die Untersuchung der Krankheitsätiologie und potenzieller OA-Behandlungen in einem viel kürzeren Zeitraum (4-12 Wochen in Mausmodellen im Vergleich zu 10-20 Jahren beim Menschen). Die Methoden zur Initiierung von OA bei Mäusen umfassen jedoch häufig invasive chirurgische Techniken wie die VKB-Durchtrennung 5,6, die Entfernung oder Destabilisierung des Innenmeniskus 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 oder eine Kombination aus beidem 17,18,19, die klinisch relevante Verletzungszustände nicht reproduzieren. Chirurgische Modelle verschlimmern auch die Entzündung im Gelenk aufgrund einer Störung der Gelenkkapsel, was das Fortschreiten der Arthrose beschleunigen könnte.

Nicht-invasive Mausmodelle mit Knieverletzungen bieten die Möglichkeit, biologische und biomechanische Veränderungen zu frühen Zeitpunkten nach der Verletzung zu untersuchen und können klinisch relevantere Ergebnisse liefern20. Unser Labor hat ein nicht-invasives Verletzungsmodell etabliert, das eine einzelne extern angelegte Tibiakompressionsüberlastung verwendet, um bei Mäusen einen Riss des vorderen Kreuzbandes (ACL) zu induzieren 21,22,23,24. Diese nicht-invasive Verletzungsmethode ist in der Lage, eine aseptische Gelenkverletzung hervorzurufen, ohne die Haut oder die Gelenkkapsel zu stören.

Die Fluoreszenzreflexionsbildgebung (FRI) ist ein optisches Bildgebungsverfahren, bei dem ein Ziel mit Infrarotlicht einer bestimmten Wellenlänge angeregt und das reflektierte Licht bei einer anderen Wellenlänge quantifiziert wird. Im Handel erhältliche Protease-spezifische Sonden können in Tiermodelle injiziert werden, und FRI kann dann verwendet werden, um die Proteaseaktivität an bestimmten Stellen wie dem Kniegelenk zu quantifizieren. Diese Methode ist weit verbreitet für den In-vivo-Nachweis biologischer Aktivitäten wie Entzündungen. Die für diese Anwendung verwendeten Sonden werden fluoreszenzabgeschreckt, bis sie auf relevante Proteasen treffen. Diese Proteasen brechen dann eine Enzymspaltstelle auf den Sonden auf, woraufhin sie ein Nahinfrarot-Fluoreszenzsignal erzeugen. Diese Sonden und diese bildgebende Methode wurden umfassend validiert und in Studien zu Krebs 25,26,27,28 und Atherosklerose 29,30,31,32 verwendet, und unsere Gruppe hat sie für Studien des Bewegungsapparates verwendet, um Marker für Entzündungen und Matrixabbau zu messen 23,24,33.

Zusammen bieten nicht-invasive Gelenkverletzungen in Kombination mit in vivo FRI und proteaseaktivierbaren Sonden eine einzigartige Fähigkeit, Entzündungen und Proteaseaktivitäten nach einer traumatischen Gelenkverletzung zu verfolgen. Diese Analyse kann bereits Stunden oder sogar Minuten nach der Verletzung durchgeführt werden, und dasselbe Tier kann mehrmals untersucht werden, um den zeitlichen Verlauf der Proteaseaktivität im Gelenk zu untersuchen. Wichtig ist, dass diese bildgebende Methode in Kombination mit chirurgischen Modellen von OA möglicherweise nicht durchführbar ist, da eine Unterbrechung der Haut und der Gelenkkapsel zu einem Fluoreszenzsignal führt, das das Signal aus dem Gelenk verfälschen würde.

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Protocol

Alle beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California Davis genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden 3 Monate alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet.

1. Nicht-invasive ACL-Verletzung

HINWEIS: ACL-Verletzungen, die durch eine extern angelegte Druckbelastung verursacht werden, sind eine einfache und reproduzierbare Methode, die ACL-Verletzungszustände beim Menschen genau rekapituliert. Dieses Protokoll wurde für ein kommerziell erhältliches Lastrahmengerät geschrieben (siehe Materialtabelle), könnte aber für ähnliche Systeme angepasst werden.

  1. Öffnen Sie die mit dem Lastrahmeninstrument kompatible Software (siehe Materialtabelle) und wählen Sie eine vorhandene Steuerdatei aus oder erstellen Sie eine neue Datei.
  2. Schalten Sie den Aktuator ein.
  3. Tarieren Sie im Kalibrierungsmenü den Kraftmesswert der Wägezelle und setzen Sie die Verschiebung des Aktuators auf 0.
  4. Verwenden Sie 1%-4% inhaliertes Isofluran in Sauerstoff, um die Mäuse zu betäuben und sicherzustellen, dass die Tiere durch Zehenkneifen und/oder Schwanzkneifen vollständig betäubt werden.
  5. Legen Sie die Maus in Bauchlage auf die Plattform. Positionieren Sie den Unterschenkel senkrecht zwischen zwei Ladevorrichtungen (Abbildung 1) (siehe Materialtabelle). Stecken Sie den Fuß in den Ausschnitt der oberen Halterung und das Knie in die Schale der unteren Halterung.
  6. Stellen Sie die Höhe der unteren Halterung manuell ein, um eine Vorspannung von 1-2 N aufzubringen (in Echtzeit auf dem Computerbildschirm überwacht), und ziehen Sie die Stellschraube fest, um die Position zu halten. Die Vorspannung ist notwendig, um das Bein in der richtigen Position zu halten, bevor die Verletzungslast aufgebracht wird.
  7. Bringen Sie eine einzelne Drucklast auf eine Zielkraft (~12-15 N) oder eine Zielverschiebung (~1,5-2,0 mm) auf.
    HINWEIS: Das Aufbringen der Last mit einer langsameren Belastungsrate (~1 mm/s) bietet ein höheres Maß an Echtzeitüberwachung und -steuerung, führt jedoch wahrscheinlich zu einem Ausrissausfall der ACL. Die Anwendung einer schnelleren Belastungsrate (~200 mm/s) führt eher zu einer ACL-Verletzung mittlerer Substanz22. Wenn festgestellt wird, dass eine Tibiafraktur oder eine andere übermäßige Verletzung aufgetreten ist, euthanasieren Sie das Tier mit einer von der IACUC zugelassenen Methode, bevor sich das Tier von der Narkose erholt.
    1. Stellen Sie die Belastungsrate in der Software-Steuerdatei ein und bestätigen Sie mit den Kraft-Weg-Daten.
      HINWEIS: Knochenbrüche während der tibialen Kompressionsbelastung sind in der Regel kein Problem, da die Frakturkraft (~20 N) erheblich höher ist als die ACL-Verletzungskraft. Dies sollte jedoch mit Palpation überwacht werden, und die Bildgebung (d. h. Röntgen) kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass keine Tibiafrakturen aufgetreten sind.
  8. Eine Verletzung wird typischerweise durch ein Geräusch ("Klick" oder "Knirschen") und eine Kraftfreisetzung angezeigt, die auf den Kraft-Weg-Diagrammen erkennbar ist (Abbildung 1C). Wenn eine langsamere Belastungsrate verwendet wird, stoppen Sie die Druckbelastung sofort nach der Verletzung, um eine weitere Belastung und mögliche Schäden an anderem Gelenkgewebe zu vermeiden.
    HINWEIS: ACL-Verletzungen treten typischerweise bei 8-15 N auf, abhängig von der Körpermasse34. Es ist wichtig, eine Zielkraft festzulegen, die größer ist als die erwartete ACL-Verletzungskraft.
  9. Bestätigung der VKB-Verletzung durch einen anterior-posterioren Schubladentest 35,36 oder eine vergleichbare Beurteilung der Gelenkinstabilität.
  10. Verabreichen Sie Mäusen nach der Verletzung eine gewichtsabhängige Dosis (z. B. 0,05-0,1 mg/kg SC oder IP von Buprenorphin, siehe Materialtabelle) mit Dauer und Dosis, die von der Heimateinrichtung IACUC empfohlen und genehmigt wurde.
    HINWEIS: NSAIDs können das Fortschreiten der PTOA nach einer Verletzung verändern, daher wird nicht empfohlen, NSAIDs zur Schmerzbehandlung in diesem Verletzungsmodell zu verwenden, es sei denn, dies ist ein spezifisches Ziel der Studie.

2. Tiervorbereitung für die FRI-Bildgebung

HINWEIS: Für die optische Bildgebung ist Tierfell (insbesondere dunkles Fell) sehr effektiv beim Blockieren, Absorbieren und Streuen von Licht, daher muss das Fell vor der Bildgebung so weit wie möglich aus dem Bereich um die Kniegelenke entfernt werden. Eine Enthaarungscreme ist in der Regel wirksamer für die Fellentfernung als eine Haarschneidemaschine. Nackte oder haarlose Mäuse müssen nicht entfernt werden. Für die am häufigsten verwendeten Mausstämme (z. B. C57BL/6) ist jedoch eine Fellentfernung erforderlich. Füttern Sie Mäuse nach Möglichkeit vor der Bildgebung mit fluoreszenzarmem gereinigtem Futter. Standard-Mausfutter enthält Chlorophyll, das mit einer Wellenlänge von etwa 700 nm automatisch fluoresziert und die Datenerfassung aus dem Nahinfrarot-FRI-System beeinträchtigen kann.

  1. Betäuben Sie Mäuse mit 1%-4% inhaliertem Isofluran in Sauerstoff. Halten Sie Mäuse so oft wie möglich auf einem Heizkissen und tragen Sie Augensalbe auf, um Augenreizungen zu vermeiden.
  2. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um Enthaarungscreme (siehe Materialtabelle) auf die vordere (kraniale) Seite der Beine der Mäuse um das Kniegelenk aufzutragen.
  3. Lassen Sie die Creme ~1 Minute einwirken und entfernen Sie dann mit Tüchern die Creme und das Fell vom Bein. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.
  4. Sobald die Kniegelenke vollständig freigelegt sind, ohne dass der Bereich von Fell bedeckt ist, reinigen Sie die Beine mit Alkoholtüchern, um restliche Enthaarungscreme zu entfernen.
    HINWEIS: Enthaarungscreme kann während einer Studie mehrmals an denselben Mäusen angewendet werden, aber diese Anwendungen sollten mindestens eine Woche auseinander liegen, um unnötige Hautreizungen zu vermeiden.

3. Herstellung der Sondenlösung

  1. Verdünnen Sie die fluoreszenzaktivierbare Sonde ggf. nach Herstellerangaben in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Ein Fläschchen der kommerziell erhältlichen Sonde (siehe Materialtabelle) enthält typischerweise 20 nmol in 0,15 ml 1x PBS. Um die Lösung in der Durchstechflasche zu verdünnen, fügen Sie 1,35 ml 1x PBS hinzu, um 20 nmol in 1,5 ml 1x PBS zu erhalten.
    HINWEIS: Nach der Verdünnung kann eine Durchstechflasche verwendet werden, um zehn Mäuse abzubilden, wenn 0,15 ml pro Maus injiziert werden.
  2. Wirbeln Sie die Lösung mit einer Mindestgeschwindigkeit (~2000 U/min) für 30 s vor, um sicherzustellen, dass die Sonde in Lösung gelöst ist, und zentrifugieren Sie dann kurz, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit aus dem Deckel herauskommt.
    HINWEIS: Die Lösung kann bei 2-8 °C an einem lichtgeschützten Ort bis zu 12 Monate gelagert werden.

4. Retroorbitale Injektion

HINWEIS: Beziehen Sie sich auf Yardeni et al. bezüglich der Details dieses Verfahrens37.

  1. Verwenden Sie 1%-4% inhaliertes Isofluran in Sauerstoff, um Mäuse zu betäuben, und legen Sie die Maus mit der Schnauze in einem Nasenkegel auf die Seite.
  2. Verwenden Sie ~29 g Insulinspritzen zur Injektion der Sondenlösung (hergestellt in Schritt 3).
  3. Halten Sie die Spritze vor Gebrauch abgedeckt, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
  4. Bei der Verabreichung der Injektion:
    1. Injizieren Sie auf die Innenseite des Auges (Tränenkarunkel) und achten Sie darauf, dass die Abschrägung der Spritze zum Auge hin abgewinkelt ist. Für Rechtshänder wird empfohlen, mit dem Tier nach rechts in das rechte Auge der Maus zu injizieren.
    2. Ziehen Sie mit der nicht injizierenden Hand die Haut um das Auge herum vorsichtig zurück, um den Kopf zu stabilisieren und das Auge hervortreten zu lassen.
    3. Winkeln Sie die Spritze parallel zum Mauskörper an.
    4. Führen Sie die Spritze vorsichtig am Auge vorbei, bis sie auf einen starren Widerstand stößt. Versuchen Sie nicht, über diesen Punkt hinauszugehen.
    5. Injizieren Sie die Sondenlösung langsam in den retroorbitalen Sinus und ziehen Sie dann die Nadel langsam aus der Augenhöhle. Wenn mit der Nadel keine Lösung herauskommt, ist die Injektion erfolgreich.
    6. Tragen Sie Kochsalzlösung oder Augensalbe auf das injizierte Auge auf.
      HINWEIS: Basierend auf der mit den bildgebenden Sonden gelieferten Dokumentation liegt die optimale Bildgebungszeit in der Regel zwischen 1 und 2 Tagen nach der Injektion der Sondenlösung. Wenn möglich, wird empfohlen, ein erstes Zeitscreening durchzuführen, um die optimale Bildgebungszeit für jede spezifische Anwendung zu bestimmen. Mäuse metabolisieren die injizierte Sonde innerhalb von etwa 7 Tagen, danach muss eine neue Dosis Sondenlösung injiziert werden, wenn zusätzliche Zeitpunkte gewünscht werden.

5. Fluoreszenz-Reflexions-Bildgebung

HINWEIS: Die Verfahren in diesem Abschnitt sind spezifisch für ein kommerziell erhältliches optisches Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle). Eine ähnliche Bildgebung kann mit vergleichbaren Systemen durchgeführt werden.

  1. Betäuben Sie Mäuse mit 1%-4% inhaliertem Isofluran in Sauerstoff und legen Sie das Tier in Rückenlage mit der Schnauze in einem Nasenkegel in das Bildgebungssystem.
  2. Positionieren Sie die Maus mit gestreckten Unterschenkeln so, dass die Knie leicht in die Luft zeigen (ggf. müssen die Füße abgeklebt werden). Es ist wichtig, dass für alle Tiere eine einheitliche Positionierung verwendet wird.
  3. Öffnen Sie die kompatible Software (siehe Materialtabelle) auf dem Computer des Bildverarbeitungssystems. Das "Acquisition Control Panel" wird angezeigt.
  4. Um das System aufzuwärmen, klicken Sie auf Initialisieren und warten Sie, bis die Temperaturanzeige grün leuchtet.
  5. Klicken Sie auf Imaging-Assistent und stellen Sie sicher, dass das Fenster "Imaging-Assistent" angezeigt wird.
  6. Klicken Sie auf Filterpaar, stellen Sie sicher, dass die Einstellung auf "Epi-Illumination" steht, und drücken Sie dann auf Weiter.
  7. Um die richtigen Anregungs-/Emissionseinstellungen auszuwählen, suchen Sie die gewünschte Sonde aus der Pulldown-Liste. Wenn man die richtige Sonde nicht finden kann, suchen Sie den Namen "Eingang Ex/Em" und geben Sie den Wert von Anregungsspitze und Emissionsspitze basierend auf der Eigenschaft der zu verwendenden Sonde manuell ein (z. B. für Anregungsspitze geben Sie 675 und für Emissionsspitze 720 ein). Klicken Sie auf Weiter.
  8. Wählen Sie Maus für "Motiv abbilden". Stellen Sie unter "Belichtungsparameter" sicher, dass die automatischen Einstellungen aktiviert und die Optionen Fluoreszenz und Foto ausgewählt sind. Wählen Sie D-22,6 cm in der Checkliste "Sichtfeld" aus. Drücken Sie Weiter.
  9. Die Bildgebungseinstellung kann im rechten Bereich des "Acquisition Control Panel" angezeigt und geändert werden. Stellen Sie sicher, dass alle Einstellungen korrekt sind, und drücken Sie die Taste "Sequenz erfassen ". Nachdem das Bild angezeigt wurde, vergewissern Sie sich, dass das Bild ausreichend belichtet war. Wenn nicht, ändern Sie die Einstellung der Belichtungszeit und klicken Sie erneut auf Sequenz erfassen .
  10. Um das Bild zu analysieren, positionieren Sie einen ROI-Kreis (Region of Interest) mit einheitlicher Größe über jedem Kniegelenk auf dem Schwarzweißbild (dies verhindert eine verzerrte Positionierung basierend auf Bereichen des Fluoreszenzsignals).
  11. Berechnen Sie die Gesamtstrahlungseffizienz und/oder die durchschnittliche Strahlungseffizienz für jedes Kniegelenk. Wenn die Strahlungseffizienz auch an den kontralateralen Beinen berechnet wird, normalisieren Sie die Daten, indem Sie die Strahlungseffizienzmessung für das verletzte Bein durch die Strahlungseffizienzmessung des kontralateralen Beins dividieren.
    HINWEIS: Wenn für alle Knie ein Bereich von Interesse mit gleichbleibender Fläche verwendet wird, führen sowohl die Gesamtstrahlungseffizienz als auch die durchschnittliche Strahlungseffizienz zu ähnlichen Ergebnissen. Die Verwendung eines durchschnittlichen Strahlungswirkungsgrads wird empfohlen, wenn Bereiche von Interesse mit unterschiedlichen Größen verwendet werden. Die Normalisierung der Strahlungseffizienzdaten des verletzten Gelenks mit den Daten des unverletzten kontralateralen Knies bietet eine interne Kontrolle, um Unterschiede in der Menge der injizierten Sonde und der Verabreichungseffizienz zwischen verschiedenen Tieren zu berücksichtigen.

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Representative Results

Nach Anwendung einer einzelnen Druckkraft (1 mm/s bis zur Verletzung) auf die Unterschenkel von 3 Monate alten männlichen C57BL/6J-Mäusen wurde bei allen Mäusen konsistent eine ACL-Verletzung induziert. Die durchschnittliche Druckkraft bei Knieverletzungen betrug etwa 10 N (Abbildung 1).

Die FRI-Analyse zeigte eine signifikant höhere Proteaseaktivität in den verletzten Gelenken von Mäusen, die 7 Tage nach der Verletzung einer nicht-invasiven ACL-Verletzung ausgesetzt waren (Abbildung 2). Die FRI-Analyse von Kniegelenken wurde auch an Mäusen durchgeführt, die unmittelbar nach einer nicht-invasiven ACL-Verletzung einer chirurgischen Restabilisierung des Kniegelenks unterzogen wurden, ähnlich wie zuvor bei Rattenbeschrieben 35,36,38. Diese Analyse zeigte ein deutlich höheres Fluoreszenzsignal bei Mäusen, die einer Restabilisierungsoperation unterzogen wurden, als bei Mäusen, die sowohl 2 als auch 4 Wochen nach der Verletzung nicht operiert wurden. Diese Daten deuten darauf hin, dass invasive chirurgische Eingriffe die Analyse der Proteaseaktivität im Gelenk verwirren können.

Figure 1
Abbildung 1: Nicht-invasiver ACL-Verletzungsaufbau und ein Kraft-Zeit-Diagramm während der Verletzung. (A,B) Der Unterschenkel der Maus ist vertikal im System positioniert, wobei der Knöchel in einer Kerbe der oberen Halterung und das Kniegelenk in einer flachen Schale an der unteren Halterung platziert ist. Die untere Halterung wird mit einer Stellschraube verriegelt, nachdem manuell eine Vorspannung von 1-2 N aufgebracht wurde. (C) Kraft-Weg-Diagramm, das eine ACL-Verletzung bei ca. 9 N zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Fluoreszenzreflexionsbildgebung zur Detektion der Proteaseaktivität in Kniegelenken von Mäusen. (A,B) Repräsentative Bilder von unverletzten (A) und verletzten (B) Mäusen nach Verletzungen. (C) Durchschnittliche Strahlungseffizienz beider Kniegelenke bei unverletzten und verletzten Mäusen eine Woche nach nicht-invasiver ACL-Verletzung. Verletzte Gelenke zeigten eine um 43 % höhere durchschnittliche Strahlungseffizienz im Vergleich zu kontralateralen Gelenken und Gelenken von unverletzten Mäusen. (D) Normalisierte Gesamtstrahlungseffizienz (R/L) für nicht-invasiv verletzte Mäuse und verletzte Mäuse, die auch einer Gelenkrestabilisierungsoperation unterzogen wurden. Eine ~30%-80% höhere Strahlungseffizienz wurde bei verletzten Gelenken im Vergleich zu kontralateralen Gelenken 1-4 Wochen nach der Verletzung beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten chirurgisch operierte Gelenke in Woche 4 eine ~300% höhere Strahlungseffizienz im Vergleich zu kontralateralen Gelenken, was auf einen bemerkenswerten Störeffekt der Operation hindeutet. **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll hat eine reproduzierbare, nicht-invasive Methode zur Induktion von ACL-Verletzungen bei Mäusen etabliert und rigoros beschrieben 20,21,24,33. Diese einfache und effiziente Verletzungsmethode kann in nur wenigen Minuten durchgeführt werden, was Hochdurchsatzstudien von PTOA erleichtert. Diese Verletzungsmethode rekapituliert auch die Verletzungsbedingungen, die für menschliche VKB-Verletzungen relevant sind. Chirurgische Methoden zur Induktion von OA bei Mäusen können die Verwendung von In-vivo-Bildgebungsverfahren zur Messung des zeitlichen Verlaufs und des Ausmaßes der Proteaseaktivität im Gelenk nach einer Verletzung ausschließen. Im Gegensatz dazu bieten nicht-invasive OA-Mausmodelle (überprüft in20) in Kombination mit FRI eine einzigartige Fähigkeit zur In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität in Mauskniegelenken nach Verletzungen.

Die Entzündungsreaktion nach einer Verletzung ist für das Fortschreiten der Arthrose von entscheidender Bedeutung. Die Methoden zur Analyse von Entzündungen im Gelenk sind jedoch in der Regel teuer, zeitaufwändig und zerstörerisch. So können beispielsweise Techniken wie die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder RNAseq verwendet werden, um eine Vielzahl von Genen in ganzen Gelenken, einzelnen Geweben oder einzelnen Zellen zu quantifizieren. Bei dieser Methode müssen Mäuse jedoch eingeschläfert werden, um verletzte und unverletzte Kniegelenke zu erhalten. Diese Mäuse können nicht zu mehreren Zeitpunkten analysiert werden, z. B. zu einem frühen Zeitpunkt während der maximalen Proteasereaktion (d. h. 3-14 Tage nach der Verletzung) und zu einem späteren Zeitpunkt, zu dem die OA schwerwiegender ist (d. h. 4-6 Wochen nach der Verletzung). Im Gegensatz dazu bietet FRI in Kombination mit nicht-invasiven Gelenkverletzungen die Möglichkeit, die Proteaseaktivität zu mehreren Zeitpunkten in den Kniegelenken von Mäusen in vivo zu analysieren 39. Dies ermöglicht eine Längsschnittanalyse derselben Mäuse und macht FRI zu einem relativ kostengünstigeren Ergebnis als RT-PCR oder RNAseq. Darüber hinaus können mehrere Sonden oder Targets gleichzeitig bei unterschiedlichen Wellenlängen abgebildet werden, was mehrere Ergebnisse für unterschiedliche Zwecke liefern kann. Die Messung der Proteaseaktivität im Gelenk mittels FRI liefert keine strenge Quantifizierung aller Entzündungsprozesse, die während der OA-Progression auftreten, aber die von dieser Methode gelieferten In-vivo- und Längsschnittdaten können dennoch nützlich sein, um das Ausmaß und den zeitlichen Verlauf der entzündlichen Proteaseaktivität nach Gelenkverletzungen zu verfolgen.

Die fluoreszenzaktivierbare Sondenlösung, die für die FRI-Bildgebung der Proteaseaktivität verwendet wird, muss intravenös (IV) verabreicht werden. Die gebräuchlichsten Methoden zur Durchführung einer IV-Injektion bei Mäusen sind die Schwanzveneninjektion und die retroorbitale Injektion. Die retroorbitale Injektion ist oft einfacher durchzuführen und erleichtert das notwendige Injektionsvolumen leichter als die Schwanzveneninjektion. Die Literatur weist auch darauf hin, dass die retroorbitale Verabreichung Mäusen weniger Stress bereiten kann, ohne dass sich die Arzneimittelabgabe oder -wirksamkeit im Vergleich zur Schwanzveneninjektion unterscheidet40. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die retroorbitale Injektion für die Injektion der fluoreszenzaktivierbaren Sondenlösung für die FRI-Bildgebung geeignet ist.

Die Auflösung der FRI ist im Vergleich zu einigen anderen bildgebenden Verfahren relativ gering, aber die quantitativen Ergebnisse können ausreichende Informationen über den zeitlichen Verlauf und das Ausmaß der entzündlichen Proteasereaktion während der OA-Progression liefern. Eine Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass die Autofluoreszenz des Gewebes die Ergebnisse beeinflussen kann, aber dieses Problem kann mit einem gründlichen Plan vor dem Experiment gelöst werden (Sondentyp, Mäusestamm, Tierpositionierung usw.). Im Gegensatz zu anderen präklinischen Bildgebungsverfahren (z. B. microPET, microSPECT, microCT, MRT) kann FR aufgrund der drastischen Größenunterschiede zwischen Mäusen und Menschen nicht direkt in eine klinische Bildgebungsmodalität übertragen werden, da die Lichteindringtiefe begrenzt ist. In präklinischen Studien mit Nagetiermodellen liegt das Kniegelenk jedoch nahe an der Haut mit minimaler Weichteilabdeckung. Folglich ist FRI ein wirksames Instrument zum Nachweis der Proteaseaktivität im Kniegelenk von Mäusen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die nicht-invasive ACL-Verletzung eine einfache und reproduzierbare Methode zur Initiierung von PTOA bei Mäusen darstellt. Diese Verletzungsmethode ermöglicht auch die Verwendung von Protease-aktivierbaren Sonden und Fluoreszenz-Reflektanz-Bildgebung zur In-vivo-Messung des Zeitverlaufs und des Ausmaßes der entzündlichen Proteaseaktivität in Mausgelenken während der OA-Progression. Zukünftige Studien könnten diese Techniken und die zahlreichen kommerziell erhältlichen Nahinfrarot-Fluoreszenz-aktivierbaren Sonden verwenden, um OA-Progressionsmechanismen bei Mäusen unterschiedlichen Alters, Geschlechts und genetischem Hintergrund zu untersuchen oder potenzielle Therapien zur Verlangsamung oder Verhinderung des OA-Fortschreitens nach Gelenkverletzungen zu bewerten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, Teil der National Institutes of Health, unter der Award-Nummer R01 AR075013 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate-Buffered Saline Tissue Protech PBS01-32R or equivalent
Air Anesthetia System Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine Analgesic post-injury 
Depilatory Cream Veet B001KYPZ4G or equivalent
Fixtures Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 06-666 or equivalent
Living Image software  Perkin Elmer
Materials testing systems  TA Instruments Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680 Perkin Elmer NEV10003 Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle Spectrum Chemical Mfg. Corp. 550-82231-CS Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell TA Instruments 20 N capacity
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc. SI-0236 or equivalent
WinTest software  TA Instruments compatible with Electroforce 3200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) In-vivo-Bildgebung Proteaseaktivität Mäuse traumatische Gelenkverletzungen Posttraumatische Osteoarthritis (PTOA) biologische Prozesse Entzündungen Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) Cathepsin-Proteasen Knochenresorption Ätiologie von PTOA In-vivo-Messung chirurgische Techniken Injektionen aktivierbare Nahinfrarot-Protease-Sonden Fluoreszenz-Reflektanz-Bildgebung (FRI) Quantifizierung der Proteaseaktivität nicht-invasive ACL-Verletzung Methode klinisch relevante Verletzungszustände aseptisch Hautaufriss Gelenkkapsel
Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und <em>In-vivo-Bildgebung</em> der Proteaseaktivität bei Mäusen
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Lin, Y. Y., Christiansen, B. A. Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice. J. Vis. Exp. (199), e65249, doi:10.3791/65249 (2023).

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