非侵入性前交叉韧带（ACL）损伤是一种可靠且具有临床相关性的方法，可用于在小鼠中诱导创伤后骨关节炎（PTOA）。该损伤方法还可实现 体内 使用蛋白酶可激活的近红外探针和荧光反射成像技术对损伤后早期时间点关节内蛋白酶活性进行定量分析。
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摘要
摘要
创伤性关节损伤（如前交叉韧带（ACL）断裂或半月板撕裂）通常在受伤后10至20年内导致创伤后骨关节炎（PTOA）。了解关节损伤所引发的早期生物学过程（如炎症、基质金属蛋白酶（MMPs）、组织蛋白酶类蛋白酶、骨吸收）对于阐明PTOA的病因至关重要。然而，目前可用于 体内 这些生物过程的测量可能会受到干扰，如果使用侵入性外科技术或注射方法来诱导骨关节炎（OA），则可能混淆早期的生物学反应。在我们对创伤后骨关节炎（PTOA）的研究中，采用了 commercially available 近红外蛋白酶可激活探针结合荧光反射成像（FRI）技术，以定量检测蛋白酶活性 体内 在小鼠中通过非侵入性压迫诱导前交叉韧带（ACL）损伤。这种非侵入性ACL损伤方法能够高度模拟临床相关的损伤情况，且由于不涉及皮肤或关节囊的破坏，整个过程完全无菌。这些损伤与成像方法的结合，使我们能够在创伤性关节损伤后的多个时间点上，研究蛋白酶活性的时间进程。
引言
骨关节炎是一种普遍的健康问题，影响着美国数百万人1。创伤后骨关节炎（PTOA）是骨关节炎的一种亚型，由关节损伤引发，例如前交叉韧带（ACL）断裂、半月板损伤或关节内骨折2。可归类为PTOA的症状性骨关节炎患者比例至少为12%3，且这种病因通常影响的人群比特发性骨关节炎更年轻4。小鼠骨关节炎模型是研究疾病病因和潜在治疗方法的重要工具，其研究周期显著缩短（小鼠模型中为4–12周，而人类则需10–20年）。然而，目前在小鼠中诱导骨关节炎的方法通常涉及侵入性外科手术技术，例如前交叉韧带横断5,6、内侧半月板切除或不稳定化5,7,8,9,10,11,12,....
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方案
所有实验程序均已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的批准。本研究使用了3月龄的雄性C57BL/6J小鼠。
1. 非侵入性前交叉韧带损伤
注意：通过外部施加的压缩载荷导致的前交叉韧带（ACL）损伤是一种简单且可重复的方法，能够很好地模拟人类前交叉韧带损伤的情况。本实验方案针对一种 commercially available load frame instrument（见材料表）编写，但也可根据类似系统进行调整。
- 打开与载荷架仪器兼容的软件（参见材料表），选择一个现有的控制文件或创建一个新文件。
- 打开作动器的电源。
- 在校准菜单中，对载荷传感器的力读数进行去皮归零，并将作动器的位移设置为0。
- 使用含1%–4%异氟烷的氧气麻醉小鼠，并通过脚趾夹捏和/或尾部夹捏确认动物已完全麻醉。
- 将小鼠俯卧位放置在平台上。将下肢垂直置于两个加载夹具之间（图1）（参见材料表）。将足部放入上部夹具的切口内，膝关节放入下部夹具的凹槽内。
- 手动调节下部夹具的高度，施加1–2 N的预载荷（在计....
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结果
在3月龄雄性C57BL/6J小鼠的下肢施加单次压缩力（以1 mm/s的速度加压直至损伤）后，所有小鼠均稳定诱导出前交叉韧带（ACL）损伤。膝关节损伤时的平均压缩力约为10 N（图1）。
FRI 分析显示，在非侵入性前交叉韧带（ACL）损伤后第 7 天，小鼠受损关节中的蛋白酶活性显著升高（图 2）。此外，对在非侵入性 ACL 损伤后立即接受膝关节手术再稳定的小鼠也进行了膝关节的 FRI 分析，该操作方式类似于先前在大鼠中所描述的方法35,36,38。该分析显示，在损伤后 2 周和 4 周时，接受再稳定手术的小鼠比未接受手术的小鼠表现出明显更强的荧光信号。这些数据表明，侵入性外科手术可能会干扰关节内蛋白酶活性的分析。
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讨论
本方案建立并严格描述了一种可重复、非侵入性的小鼠前交叉韧带损伤诱导方法20,21,24,33。这种简单高效的损伤方法仅需几分钟即可完成，有助于开展PTOA的高通量研究。该损伤方法还能较好地模拟与人类前交叉韧带（ACL）损伤相关的病理条件。而用于在小鼠中诱导骨关节炎的手术方法可能限制 体内 用于测量关节损伤后蛋白酶活性的时间进程和强度的成像方法。相比之下，非侵入性骨关节炎小鼠模型（综述见20）结合FRI提供了独特的能力 体内 损伤后小鼠膝关节中蛋白酶活性的成像
损伤后引发的炎症反应在骨关节炎（OA）进展过程中具有关键作用。然而，目前用于分析关节内炎症的方法通常成本高昂、耗时较长，且具有破坏性。例如，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或RNA测序（.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院下属的国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所资助，项目编号为 R01 AR075013。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10倍磷酸盐缓冲液 | Tissue Protech | PBS01-32R | 或同等产品 |
| 气体麻醉系统 | 配备诱导室和鼻罩的异氟烷蒸发器 | ||
| 丁丙诺啡 | 损伤后镇痛剂 | ||
| 脱毛膏 | Veet | B001KYPZ4G | 或同等产品 |
| 固定装置 | 定制的膝关节固定器、踝关节固定器和平台 | ||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | 也可使用性能相当的光学成像系统 |
| 吸水纸巾（Kimwipes） | 金佰利公司（Kimberly-Clark Corporation） | 06-666 | 或同等产品 |
| Living Image 软件 | Perkin Elmer | ||
| 材料测试系统 | TA Instruments | Electroforce 3200 或同等设备 | |
| ProSense680 | Perkin Elmer | NEV10003 | 也可使用其他探针，如 OsteoSense、MMPSense、Cat K、AngioSense 等 |
| 带针头的无菌注射器 | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 550-82231-CS | Covidien 1 mL 结核菌素注射器，配 28 G × 1/2 英寸针头，无菌或同等产品 |
| 单轴力传感器 | TA Instruments | 量程 20 N | |
| Vortex-Genie 2 涡旋振荡器 | Scientific Industries, Inc. | SI-0236 | 或同等产品 |
| WinTest 软件 | TA Instruments | 与 Electroforce 3200 兼容 |
参考文献
- Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research (Hoboken. 68 (12), 1743-1750 (2016).
- Carbone, A., Rodeo, S.
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