Summary
يحدد هذا البحث تقنيتين لعزل مصائد العدلات خارج الخلية الوفيرة (NETs) من نخاع عظم الفئران. تجمع إحدى الطرق بين مجموعة عزل العدلات التجارية والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، بينما تستخدم الطريقة الأخرى الطرد المركزي المتدرج للكثافة فقط. كلا النهجين يتمخضان عن شبكات وظيفية تفوق تلك الموجودة في العدلات الدموية المحيطية.
Abstract
كان الهدف الأساسي من هذا البحث هو تطوير نهج موثوق وفعال لعزل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) من نخاع عظم الفئران. نشأ هذا الجهد بسبب القيود المرتبطة بالطريقة التقليدية لاستخراج الشبكات من الدم المحيطي ، ويرجع ذلك أساسا إلى ندرة العدلات المتاحة للعزل. كشفت الدراسة عن منهجيتين متميزتين للحصول على العدلات الفئران من نخاع العظام: إجراء مبسط من خطوة واحدة أسفر عن مستويات تنقية مرضية ، وعملية من خطوتين أكثر كثافة للوقت أظهرت كفاءة تنقية معززة. الأهم من ذلك ، أن كلتا التقنيتين أسفرت عن كمية كبيرة من العدلات القابلة للحياة ، تتراوح بين 50 إلى 100 مليون لكل فئران. عكست هذه الكفاءة النتائج التي تم الحصول عليها من عزل العدلات من كل من المصادر البشرية والفئران. بشكل ملحوظ ، أظهرت العدلات المشتقة من نخاع عظم الفئران قدرات مماثلة لإفراز الشبكات عند مقارنتها بالعدلات التي تم الحصول عليها من الدم المحيطي. ومع ذلك ، فإن الطريقة القائمة على نخاع العظم أنتجت باستمرار كميات أكبر بشكل ملحوظ من كل من العدلات و NETs. أظهر هذا النهج إمكانية الحصول على كميات أكبر بكثير من هذه المكونات الخلوية لمزيد من التطبيقات النهائية. والجدير بالذكر أن هذه الشبكات المعزولة والعدلات تبشر بمجموعة من التطبيقات ، تغطي مجالات الالتهاب والعدوى وأمراض المناعة الذاتية.
Introduction
تشكل العدلات مجموعة فرعية حرجة من كريات الدم البيضاء التي تلعب دورا محوريا في الاستجابة المناعية الفطرية. وهي تتميز بنوى وحبيبات متعددة الفصوص تحتوي على مختلف البروتياز والببتيدات المضادة للميكروبات1. تعمل العدلات بشكل أساسي من خلال التحلل ، البلعمة ، وتشكيل NETs. تم إجراء ملاحظة الشبكات لأول مرة بواسطة Takei et al. في عام 1996 خلال تجربة حيث تم تحفيز العدلات باستخدام أسيتات فوربول ميريستات (PMA) 2. في وقت لاحق ، تمت صياغة عملية تكوين NET "NETosis" بواسطة Brinkmann et al.3 في عام 2004. سلط بحثهم الضوء على الدور الحاسم لشبكات NETs في استجابات مضادات الميكروبات بوساطة العدلات. الشبكات عبارة عن هياكل تشبه الويب تتكون من الكروماتين والهستونات والبروتينات المضادة للميكروبات التي يتم إطلاقها من العدلات المنشطة استجابة للمحفزات المعدية والالتهابية. يمكن للشبكات شل حركة وقتل مسببات الأمراض الغازية عن طريق محاصرتها وتعريضها لتركيز عال من الببتيدات المضادة للميكروبات والبروتياز 1,3. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم الشبكات في إزالة الخلايا المبرمج والمشاركة في حل الالتهاب. تشير الدراسات الحديثة أيضا إلى أن التكوين المفرط للشبكات أو ضعف تدهور الشبكة يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة ، واضطرابات المناعة الذاتية ، وتكوين الجلطات ، وضعف إعادة التوعي4،5،6،7،8،9،10.
تم إثبات الدور الممرض للشبكات في التليف غير المنضبط بعد احتشاء عضلة القلب وتشكيل تمدد الأوعية الدموية البطيني من خلال توسيع التليف حول الأوعية الدموية4،11. نموذج احتشاء عضلة القلب وعزل العدلات من نخاع العظام في الفئران كلاهما راسخ. الكريات البيض متعددة الأشكال (PMN) ، وهي نوع من خلايا الدم البيضاء الوفيرة في دم الإنسان ، بمثابة مصدر ممتاز لعزل العدلات البشرية. هذه الطريقة تلغي الحاجة إلى حصاد نخاع العظام ، وبالتالي تعزيز السلامة والكفاءة.
تلعب الشبكات أيضا دورا في الرجفان الأذيني المرتبط بإعادة تشكيل القلب. ومع ذلك ، تم استخدام الكبيرة مثل والخنازير لنمذجة الرجفان الأذيني ، حيث تفتقر الفئران إلى الأذين الكبير بما يكفي لإنشاء دورة إعادة الدخول أو نموذج AF ، ما لم يتم هدم أو طرق إشارات محددة أو طردها12. في حين أنه من الممكن إحداث الرجفان الأذيني في الفئران وعزل العدلات من الدم المحيطي للفئران كما هو موضح سابقا ، واجه الباحثون قيدا حيث يمكن عزل 2 × 105-5 × 105 عدلات فقط من الدم المحيطي (10 مل لكل فئران). يتطلب استخراج شبكات كافية في كل نقطة زمنية ما يقرب من 10-25 فأرا (5 × 106 عدلات في المجموع) ، مما يؤدي إلى عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وغالبا ما تكون منخفضة الغلة13. في هذا الصدد ، يقدم Li He وزملاؤه استراتيجية موجهة نحو نخاع العظام للحصول على شبكات كافية من الفئران14. في مقالتهم ، يقدمون وصفا شاملا لعزل العدلات من نخاع عظم الفئران ومقارنة قدرات إفراز NET للعدلات الطرفية ونخاع العظم في الفئران. تلبي الطريقتان التوضيحيتان أهدافا تجريبية متميزة ، وكلاهما ينتج عنه كميات كافية من العدلات في نخاع عظم الفئران مع تقليل عدد الفئران المطلوبة. أظهرت طريقة العزل المكونة من خطوتين تنقية فائقة للعدلات ، بينما أثبتت الطريقة المكونة من خطوة واحدة كفاءتها من حيث الوقت مع مستويات تنقية مقبولة. علاوة على ذلك ، قارن الباحثون NETosis وتشكيل NET بين العدلات في نخاع عظم الفئران ونظيراتها المحيطية ، ووجدوا قوة متساوية مع PMN. تساهم هذه النتائج بشكل كبير في الدراسات المتعلقة بالعدلات حول الرجفان الأذيني وتؤكد على أهمية الاختيار المرن لمصادر مختلفة لعزل العدلات في التجارب المختلفة ذات توزيعات العدلات المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء الدراسة بموجب ترخيص مشروع (رقم 20211404A) ممنوح من قبل لجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان لرعاية واستخدام. وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية ، تم الحفاظ على الفئران المستخدمة في هذه الدراسة في بيئة خاضعة للرقابة مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة ، ودرجة حرارة عند 22-24 درجة مئوية ورطوبة 50٪ -60٪. تم منح الفئران إمكانية الوصول إلى الطعام والماء حسب الطلب. كانت المستخدمة في هذه الدراسة من ذكور الفئران Sprague Dawley (SD) البالغة من العمر 6-8 أسابيع ، ويزن حوالي 250 جراما وخالية من مسببات الأمراض. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. عزل العدلات الفئران
- حصاد نخاع العظم
- ضع الجرذ في وعاء مناسب للتخدير (انظر جدول المواد). تطبيق 3٪ إيزوفلوران للفأر حتى يفقد الوعي. تحقق من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم أو قرصة الذيل لضمان عمق التخدير.
- بمجرد تخدير الجرذ بعمق ، قم بإجراء خلع عنق الرحم عن طريق وضع الجرذ على ظهره وإمساك ذيله بيد واحدة أثناء إمساك الرأس باليد الأخرى. خلع الرقبة بسرعة وحزم عن طريق تطبيق قوة تصاعدية مفاجئة وقوية على الذيل أثناء سحب الرأس لأسفل حتى يتم قطع العمود الفقري العنقي. انتظر تأكيد الوفاة ، مثل توقف التنفس ونقص ضربات القلب ، قبل الشروع في جمع الأنسجة أو التخلص منها.
- اغمس الفئران في 75٪ من الإيثانول واتركها لبضع دقائق لتعقيم الفراء والجلد. ضع الجرذ على ظهره واقطع الأطراف السفلية عند الورك لحماية رأس عظم الفخذ. استخدم مقص التشريح لقطع الرباط عند مفصل العرقوب وطي مفصل الركبة للخلف لكشف عظم الفخذ والساق.
- باستخدام الملقط والمقص ، قم بإزالة أي عضلات وأوتار وأنسجة أخرى متصلة بالعظام بعناية. اشطف العظام بمحلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) لإزالة أي بقايا أنسجة ودم متبقية. كرر مرتين أخريين ، ليصبح المجموع ثلاث غسلات. ضع العظام النظيفة في وعاء معقم.
- استخدم حقنة سعة 5 أو 10 مل بإبرة لوخز النخاع من خلال طرفي العظم لتخفيف مصفوفة النخاع. اشطف نخاع العظم بوسائط 10-15 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) بحقنة أخرى ، حتى لا يمكن التخلص من نخاع العظم المرئي.
- الطرد المركزي خلايا نخاع العظم عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. أضف 5-10 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (انظر جدول المواد) لإعادة تعليق الخلايا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. أضف 4 أضعاف حجم HBSS إلى الخليط. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 600 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتجاهل الطافي مع ماصة ، واستخدام الحبيبات الناتجة لمزيد من الاستخدام.
- عزل العدلات من نخاع العظم
- بالنسبة للطريقة المكونة من خطوتين ، قم بتنفيذ الخطوات الإضافية التالية:
- عزل خلايا نخاع العظم باستخدام مجموعة عزل العدلات التجارية للفئران باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد تدرج الكثافة عن طريق وضع طبقات 2 مل من كاشف percoll بنسبة 55٪ (انظر جدول المواد) ، و 2 مل من 65٪ من الكاشف ، و 2 مل من كاشف 70٪ ، و 2 مل من كاشف 80٪ في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 800 × جم لمدة 40 دقيقة عند 20 درجة مئوية ، مع ضبط التسارع على 5 وضبط التباطؤ على 0 أو 1.
- اجمع طبقة التدرج بنسبة 70٪ ، بما في ذلك طبقات الخلايا عند الحد بين كاشف التدرج 65٪ و 70٪ ، باستخدام ماصة معقمة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. أضف 15 مل HBSS في الأنبوب واقلب الأنبوب برفق عدة مرات لغسل الخلايا. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا.
- بالنسبة للأسلوب المكون من خطوة واحدة، قم بتنفيذ الخطوات الإضافية التالية:
- إخضاع خلايا نخاع العظم للتدرجات دون استخدام مجموعة عزل العدلات في الفئران.
- اجمع طبقة التدرج بنسبة 70٪ ، بما في ذلك طبقات الخلايا عند الحد بين 65٪ و 70٪ من التدرج ، باستخدام ماصة معقمة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل واغسل الخلايا باستخدام HBSS. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا.
- عد العدلات المعزولة باستخدام مقياس الدم وتقييم الجدوى باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
ملاحظة: يمكن تعديل البروتوكول اعتمادا على عدد الفئران والعدد المطلوب من العدلات المعزولة. يتم الحصول على كمية مقبولة من العظام من ثلاثة فئران عند استخدام هذه الطريقة لأول مرة في بيئة تجريبية جديدة. يجب تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة. يجب إجراء عزل العدلات من نخاع العظم في أسرع وقت ممكن لتقليل تلف الخلايا وفقدان قابليتها للحياة.
- بالنسبة للطريقة المكونة من خطوتين ، قم بتنفيذ الخطوات الإضافية التالية:
2. اقتناء شبكات الفئران
- إعادة تعليق 0.5 × 108-1 × 108 العدلات المعزولة في 4 مل من وسائط RPMI (مكملة بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين) في طبق بتري معقم 10 سم.
- أضف 500 نانومتر PMA (انظر جدول المواد) إلى معلق العدلات للحث على NETosis. احتضان لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- للتحكم السلبي ، أضف DNase I (10 U / mL) إلى تعليق العدلات لتحلل الشبكات المفرزة.
- لحصاد الشبكات ، قم بإزالة الوسائط وغسل الشبكات المرفقة برفق بطبق بتري باستخدام HBSS. بعد ذلك ، استخدم التنظيف المكثف مع 4 مل من الوسائط الطازجة لكل لوحة لفصل الشبكات عن اللوحة.
- اجمع وسط الغسيل والماصة بشكل متكرر لإعادة التعليق الكامل للشبكات.
- أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية لإزالة أي خلايا عائمة.
- انقل المعلق الذي يحتوي على الشبكات إلى أنبوب معقم واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام في غضون أسبوعين.
ملاحظة: الشبكات حساسة للتحلل ، لذلك يوصى باستخدام المواد التي تم حصادها حديثا للحصول على أفضل النتائج.
3. التحقق من وجود الشبكات
- ثبت الخلايا (من الخطوة 2.4) على أغطية تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة وشبكات (من الخطوة 2.7) لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
- اقلب الغطاء على قطرة PBS / PBST على حامل أنبوب اختبار مغطى بغشاء البارافين وكرر عملية الغسيل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
- تتخلل الخلايا بنسبة 0.5٪ Triton-X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتغسل ثلاث مرات في PBS / PBST لمدة 1 دقيقة لكل منهما. ختم الخلايا مع مصل حمار طبيعي 10٪ (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- احتضان الخلايا بالجسم المضاد لإستاز العدلات المضاد للفئران والجسم المضاد للميلوبيروكسيديز المضاد للفئران (انظر جدول المواد) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل غطاء الغطاء في PBS / PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- احتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي A488 المترافق للحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) ، و A594 المترافق للحمار المضاد للفأر IgG (H + L) ، والماعز المترافق A594 المضاد للفأر IgG1 (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام. بعد ذلك ، اغسل غطاء الغطاء في PBS / PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- نوى الخلايا الملطخة والهياكل العظمية الصافية مع 10 ملغ / مل DAPI. بعد ذلك ، اغسل غطاء الغطاء في PBS / PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- ضع قطرة من وسيط التثبيت على شريحة زجاجية واقلب غطاء الغطاء مع وجود خلايا عليه. اتركه يجف لمدة 1 ساعة للتحليل المجهري باستخدام عدسات الغمر ؛ خلاف ذلك ، فهو جاهز للتفتيش.
ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد عند معالجة الشبكات ، حتى بعد التثبيت ، لأنها هشة للغاية ويمكن أن تضيع بسهولة أثناء التحضير.
4. التحديد الكمي للشبكات
- قم بإعداد محلول Tris-EDTA (TE) العازلة وحل عمل PicoGreen (كاشف مقايسة dsDNA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- إعداد المعايير عن طريق تخفيف الحمض النووي للمخزون إلى تركيزات 1 نانوغرام / مل ، 10 نانوغرام / مل ، 100 نانوغرام / مل ، و 1 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: لتحديد تركيز الشبكات ، تم استخدام مجموعة فحص dsDNA (انظر جدول المواد) ، مع الالتزام بإرشادات الشركة المصنعة. تم تحضير المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) وكواشف مقايسة dsDNA باستخدام حجم 19 ضعفا من الماء المقطر المزدوج أو حجم 199 ضعفا من المخزن المؤقت TE ، على التوالي. بعد ذلك ، تم تحضير المحاليل القياسية (1 نانوغرام / مل ، 10 نانوغرام / مل ، 100 نانوغرام / مل ، و 1 ميكروغرام / مل) ، وتم دمج كل 50 ميكرولتر من العينة مع 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. - أضف 50 ميكرولتر من كل عينة إلى 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE.
- أضف 100 ميكرولتر من المعايير أو العينات جنبا إلى جنب مع حجم متساو من محلول عمل كاشف الفحص لكل بئر في لوحة 96 بئرا ، بما في ذلك المعايير والعينات.
- احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق ، وتجنب الضوء المباشر.
- اقرأ العينات باستخدام قارئ صفيحة مجهرية مضان مع طيف انبعاث يبلغ حوالي 530 نانومتر وطيف امتصاص يبلغ حوالي 480 نانومتر.
- احسب تركيز الشبكات في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي الناتج عن المعايير.
5. تحليل إفراز الشبكات عن طريق قياس الخلايا الخلوية
- أضف صبغة النواة (انظر جدول المواد) إلى الخلايا المحتضنة في الصفيحة المكونة من 96 بئرا للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 نانوغرام / مل واحتضانها لمدة 30 دقيقة.
- أضف صبغة الحمض النووي الخالية من الخلايا (cfDNA ، انظر جدول المواد) إلى الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 300 نانومتر واحتضانها لمدة 10 دقائق.
- امزج أصباغ الفلورسنت عن طريق سحب لطيف. لا تتخلص من المادة الطافية أو تغسل الحبيبات.
- قم بتحميل لوحة العينة في أداة مقياس الخلايا.
- اضبط معلمات التركيز ووقت التعرض للقنوات المختلفة: أزرق (على سبيل المثال: 377/50 نانومتر ، em: 470/22 نانومتر) ، عادة مع تعرض 30000 مللي ثانية ، أخضر (على سبيل المثال: 483/32 نانومتر ، eM: 536/40 نانومتر) عادة مع تعرض 5000 مللي ثانية.
- التقط صورا موحدة للغاية للوحة بأكملها في قنوات مختلفة.
- تحليل عدد بقع النواة لمجموعات مختلفة. إذا كانت متشابهة ، يمكن تحديد إفراز NETs من خلال عدد بقع cfDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يحدد البروتوكول الموضح هنا طريقتين متميزتين ، تتميز كل منهما بتنقية محسنة أو خطوات مبسطة. أسفرت كلتا الطريقتين عن حوالي 0.5 × 108-1 × 108 عدلات لكل فئران. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي ، باستخدام مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج V-FITC / PI المرفقة ، صلاحية الخلية أعلى من 90٪ ، مقارنة بنظرائهم من الفئران والبشر (الشكل 1). بينما بدا تلوث الخلايا اللمفاوية أمرا لا مفر منه أثناء عزل العدلات من نخاع العظام ، أظهرت الطريقة المكونة من خطوتين مستوى نقاء محسن بنسبة 90٪ مقارنة ب 50٪ التي حققتها طريقة الخطوة الواحدة (الشكل 2).
كانت الاستجابات المماثلة في إفراز NET واضحة بين العدلات المحيطية ونخاع العظم ، بغض النظر عن تحفيز PMA (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، أظهرت شبكات الفئران قدرات محدودة على الربط المتبادل مع بعضها البعض (الشكل 4). في محاولة للتعمق في عملية NETosis الفئران ، تم استخدام PMA كمحفز. تم الكشف عن الشبكات عن طريق تلطيخ cfDNA ، وتم التقاط صور شاملة باستخدام محلل تصوير الخلية. والجدير بالذكر أن العدلات في الفئران أظهرت ميلا أعلى ل NETosis العفوي على عكس العدلات البشرية والفئران ، حتى بدون تحفيز خارجي. أدت الحضانة مع PMA إلى زيادة بنسبة 10٪ في محتوى cfDNA بعد 4 ساعات (الشكل 5). عند التعرض ل 500 نانومتر PMA ، أسفر نخاع العظم لكل فأر عن تركيز نهائي قدره 8-12 ميكروغرام / مل صافي الحمض النووي. من الجدير بالذكر أن المحتويات داخل الخلايا تم بثقها بشكل غير كامل في العدلات في الفئران أثناء NETosis ، مما أدى إلى ملاحظة العديد من المكونات داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت شبكات الفئران ميلا لتشكيل فيلم يشبه الشاش بسبب ميول الالتصاق المحسنة ، مما يوفر مظهرا مميزا يشبه السحابة.
الشكل 1: تقييم صلاحية العدلات من عزل نخاع العظم. المصدر الأمثل لعزل العدلات الفئران هو نخاع العظام ، مما يسهل اكتساب مصيدة العدلات خارج الخلية اللاحقة. هذا الرقم مقتبس من He et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تنقية العدلات من الدم المحيطي ونخاع العظم عن طريق تلطيخ رايت جيمسا. أ: أصل الدم المحيطي. ب: أصل نخاع العظم بطريقة الخطوة الواحدة. ج: أصل نخاع العظم بطريقة الخطوتين. يعمل استخراج نخاع العظم كنهج مفضل لعزل العدلات في الفئران وما يترتب على ذلك من اكتساب مصائد العدلات خارج الخلية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. التكبير = 400x. هذا الرقم مقتبس من He et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صافي الإفراز عند الحضانة مع PMA أو PMA + DNase I. يمثل استخراج نخاع العظم الطريق المفضل لعزل العدلات في الفئران والمجموعة اللاحقة من مصائد العدلات خارج الخلية. هذا الرقم مقتبس من He et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل الفلورسنت المناعي. تلطيخ مناعي للنواة (أزرق ، A) ، MPO (أخضر ، B) ، ودمج الصورة (C). NET: مصيدة العدلات خارج الخلية. MPO: الميلوبيروكسيداز. استخراج نخاع العظم هو الطريقة المفضلة لعزل العدلات في الفئران والتجمع اللاحق لمصائد العدلات خارج الخلية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. التكبير = 200x. هذا الرقم مقتبس من He et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل شامل ل cfDNA عبر محلل التصوير الخلوي في ظل ظروف مختلفة. تلطيخ الفلورسنت من cfDNA (الأخضر) والنواة (الأزرق). استخراج نخاع العظم هو النهج الأساسي لعزل العدلات في الفئران وما يترتب على ذلك من مجموعة من مصائد العدلات خارج الخلية. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. هذا الرقم مقتبس من He et al.14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يشكل عزل العدلات خطوة محورية في دراسة NETosis ، حيث يكون اختيار طريقة العزل المناسبة أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها. أحد العوامل المهمة التي يجب وزنها هو حدوث تلوث الخلايا اللمفاوية أثناء العزل. تعتبر معالجة هذا التحدي مهمة بشكل خاص عند عزل عدلات الفئران عن نخاع العظام. على الرغم من نطاق الكثافة المميز للعدلات (1.0814-1.0919 ، مع ذروة عند 1.0919) مقارنة بالخلايا الليمفاوية (1.0337-1.0765 ، مع ذروة عند 1.0526) ، لا يزال التلوث بالخلايا الليمفاوية أمرا لا مفر منه. يمكن أن يعزى ذلك جزئيا إلى وفرة الخلايا الليمفاوية في نخاع العظام وزيادة كثافة الخلايا الليمفاوية غير الناضجة15. يمكن أن تساعد تقنيات مثل فصل تدرج الكثافة ، مثل استخدام Percoll و Ficoll ، في الحد من تلوث الخلايا الليمفاوية ، على الرغم من أن تحقيق القضاء التام على الخلايا الليمفاوية قد يكون أمرا صعبا. يمكن استخدام محلول Percoll متخصص ، تمت معايرته إلى تدرج كثافة محدد ، لتقليل التلوث من خلال الاستفادة من تباين الكثافة بين العدلات في الفئران وخلايا نخاع العظم الأخرى. لذلك ، يجب على الباحثين تقييم التأثير المحتمل لتلوث الخلايا الليمفاوية بحكمة على نتائجهم التجريبية واتخاذ تدابير للتخفيف من تأثيره.
تؤكد هذه الدراسة على أهمية تصميم طرق العزل لتتناسب مع متطلبات تجريبية محددة. في الطريقة المحددة سابقا14 ، أظهرت طريقة الخطوة الواحدة أنها أقل تطلبا من حيث الوقت والجهد. على هذا النحو ، تم اعتماده لاكتساب NET بسبب التأثير غير المنطقي للخلايا الليمفاوية الملوثة على إفراز NET. يمكن القضاء على هذه الخلايا الليمفاوية لاحقا خلال مرحلة الطرد المركزي النهائية. على العكس من ذلك ، بالنسبة للمساعي التي تنطوي على عزل العدلات والتقييم اللاحق ل NETosis وإفراز NET ، تمت التوصية بالطريقة المكونة من خطوتين14. سمح هذا النهج بالتحديد الكمي الدقيق للشبكات التي تنتجها العدلات مع تقليل تأثير العوامل المربكة المحتملة الناجمة عن تلوث الخلايا الأخرى.
يمكن إجراء تعديلات على بروتوكول العزل لتعزيز كل من المحصول والنقاء. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي استخدام مجموعة كاشف تدرج الكثافة الأمثل إلى إنتاج المزيد من العدلات. يمكن لطرق السحب والغسيل اللطيفة أن تخفف أيضا من فقدان الخلايا وتعزز النقاء. يمكن لإجراءات استكشاف الأخطاء وإصلاحها مثل مراقبة درجة الحموضة ودرجة الحرارة في المخزن المؤقت ، إلى جانب ضبط معلمات الطرد المركزي ، أن تعالج بشكل فعال التحديات التي تواجهها أثناء عملية العزل. يكمن القيد المرتبط بعزل نخاع العظم في احتمال حدوث العدلات غير الناضجة وغيرها من تلوث خلايا نخاع العظم ، مما يؤثر على كل من النقاء والمحصول. يمكن أن يؤدي وضع نهج مبسط لطرد الخلايا الليمفاوية إلى تعزيز كفاءة العزل الشاملة. هناك قيد آخر يتعلق بضرورة التضحية بالحيوانات لعزل نخاع العظم ، والتي قد تكون غير مناسبة للتحقيقات الطولية في عدلات الفئران في الجسم الحي.
يعتمد عزل العدلات للبشر في الغالب على الدم المحيطي. تشمل الطرق التقليدية Ficoll-Paque و Percoll وفصل الخرزة المغناطيسيةالمناعية 16،17،18. يفصل نهج Ficoll مجموعات الكريات البيض على أساس الطفو ويعتمد على عامل تباين للتمييز بين العدلات. إنه يوفر البساطة والفعالية من حيث التكلفة ولكنه يتنازل عن النقاء والعائد ويمثل تحديات في القضاء على خلايا الدم الحمراء. من ناحية أخرى ، يستغل Percoll تدرجات الكثافة ، مما ينتج عنه نقاء وعائد أكبر للعدلات على حساب المعدات المتخصصة وزيادة النفقات والوقت19. فصل الخرزة المغناطيسية المناعية هو تقنية أحدث وأكثر تحديدا تستخدم حبات مغناطيسية مقترنة بالأجسام المضادة ترتبط على وجه التحديد بالعدلات مع الحد الأدنى من التلوث من كريات الدم البيضاء الأخرى. على الرغم من أنها قابلة للأتمتة ، إلا أنها تتطلب معدات متخصصة وتتحمل تكاليف أعلى بسبب نفقات الخرز. عند اختيار طريقة عزل العدلات ، يجب على الباحثين تقييم العائد والنقاء والتكلفة والتعقيد. حاليا ، تتضمن الطريقة الأكثر ملاءمة لعزل العدلات البشرية استخدام PolymorphPrep20. ينتج عن هذا النهج العدلات عالية النقاء بكميات كبيرة في غضون فترة قصيرة. يتوقف مبدأ PolymorphPrep على فصل الخلايا وفقا للكثافة.
في الفئران ، لا ينصح بعزل العدلات عن الدم المحيطي بسبب انخفاض أحجام الدم والتحدي المتمثل في تأمين كمية ونقاء كافيين للتجارب النهائية. على الرغم من أن الفئران توفر كميات كافية من الدم (10 مل لكل فئران) ، إلا أن خصائص دمها المحيطية تختلف عن البشر والفئران. تظهر الفئران بطبيعتها أوجه قصور في استخراج العدلات ، مع كون الخلايا الوحيدة هي الخلايا النواة الأكثر وفرة13,14. وبالتالي ، فإن عزل الدم المحيطي يوفر فقط 2 × 105-5 × 105 العدلات من فأر واحد. يعمل نخاع العظم كمصدر أكثر قابلية للتطبيق للعدلات ، حيث يوفر إمدادات وفيرة ومتاحة بسهولة بغض النظر عن حالة إصابة. بدلا من ذلك ، فإن إحداث بيئة التهابية في تجويف البطن أو الصدر لتعزيز تسلل العدلات للعزل أمر غير موثوق ومعقد. على هذا النحو ، يظهر استخراج نخاع العظم كطريق عملي يمكن الاعتماد عليه لعزل العدلاتفي الفئران 21.
يتضمن NETosis عمليات خلوية متنوعة تشمل تكثيف الحمض النووي ، والالتهام الذاتي ، وطرد المصفوفة داخل الخلايا1. في البشر ، يكون البثق الصافي شاملا ، تاركا وراءه بقايا غشاء الخلية. ومن المثير للاهتمام أن دراسات العدلات في الفئران تظهر أنماطا متباينة ، وتكشف عن المزيد من المحتوى داخل الخلايا بعد التحفيز. على الرغم من تحفيز PMA ، تظهر العدلات الفئران قذفا صافيا غير مكتمل ، يتماشى مع NETosis التلقائي. ومن الغريب أن شبكات الفئران تظهر ميلا للأشكال المجمعة (aggNETs) بدلا من بنية الشبكة الواسعة ، ربما بسبب انخفاض القدرة على الربط المتقاطع. يمكن أن تؤثر هذه الظاهرة بشكل كبير على تراكم العدلات ، مما يؤثر على الاستجابة المناعية الأوسع في الفئران. يمكن أن تتضمن التطبيقات المستقبلية لعزل نخاع العظم فحص مسارات إشارات مميزة وخلايا مناعية في NETosis. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه الطريقة تسهيل استكشاف NETosis في نماذج الأمراض المتنوعة ، وكشف أدوار العدلات عبر الأمراض المختلفة. وفي نهاية المطاف، تبشر التقنيات الجديدة لعزل وتوصيف الشبكات بكشف الآليات التي تقود التهاب الخلايا المميتة وآثارها الوظيفية عبر النماذج الحيوانية المتنوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام 82004154 و 81900311 و 82100336 و 81970345).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
| A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
| A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
| Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
| Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
| DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
| Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
| Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
| Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
| Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
| Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
| Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
| Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
| Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
| RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
| SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
| Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |
References
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
- Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
- Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
- Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11 (2018).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
- Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488 (2020).
- Schüttler, D., et al.
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687 (2015).
- He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
- Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
- Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
- Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994 (2022).
- Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).
