分离具有相当容量的大鼠骨髓中性粒细胞的独特方法

Summary

这项研究概述了从大鼠骨髓中分离大量中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 的两种技术。一种方法将商用中性粒细胞分离试剂盒与密度梯度离心相结合，而另一种方法仅采用密度梯度离心。这两种方法产生的功能性神经内分泌瘤都超过了外周血中性粒细胞。

Abstract

这项研究的主要目的是开发一种可靠有效的方法，用于从大鼠骨髓中分离中性粒细胞胞外陷阱 （NET）。这种努力是由于与从外周血中提取NET的传统方法相关的局限性而产生的，主要是由于可用于分离的中性粒细胞稀缺。该研究揭示了从骨髓中获取大鼠中性粒细胞的两种不同方法:一种是简化的一步法，可产生令人满意的纯化水平，另一种是更耗时的两步法，其纯化效率更高。重要的是，这两种技术都产生了大量的活中性粒细胞，每只大鼠在5000万到1亿之间。这种效率反映了从人类和小鼠来源分离中性粒细胞所获得的结果。值得注意的是，与从外周血中获得的中性粒细胞相比，来自大鼠骨髓的中性粒细胞表现出相当的分泌NET的能力。然而，基于骨髓的方法始终产生大量中性粒细胞和神经内分泌瘤。这种方法证明了获得更多数量的这些细胞成分用于进一步下游应用的潜力。值得注意的是，这些分离的神经内分泌瘤和中性粒细胞有望用于一系列应用，涵盖炎症、感染和自身免疫性疾病领域。

Introduction

中性粒细胞是白细胞的一个关键亚群，在先天免疫反应中起着关键作用。它们的特征是含有各种蛋白酶和抗菌肽的多叶细胞核和颗粒¹。中性粒细胞主要通过脱颗粒、吞噬作用和神经内分泌瘤的形成发挥作用。1996 年，Takei 等人在用肉豆蔻酸佛波醇酯 （PMA） ^刺激中性粒细胞的实验中首次观察到了 NET。随后，Brinkmann 等人 ³ 在 2004 年创造了 NET 形成过程"NETosis"。他们的研究进一步阐明了NETs在中性粒细胞介导的抗菌反应中的关键作用。NET是由染色质、组蛋白和抗菌蛋白组成的网状结构，这些蛋白在感染和炎症刺激下从活化的中性粒细胞中释放出来。NET可以通过捕获入侵的病原体并将其暴露于高浓度的抗菌肽和蛋白酶来固定和杀死入侵的病原体^1,3。此外，神经内分泌瘤有助于细胞凋亡的清除并参与炎症消退。最近的研究还表明，神经内分泌瘤的过度形成或神经内分泌瘤降解受损可导致组织损伤、自身免疫性疾病、血栓形成和血运重建受损4,5,6,7,8,9,10。

NETs在心肌梗死后不受控制的纤维化和室性动脉瘤形成中的致病作用已通过血管周围纤维化的扩展得到证实^4,11。心肌梗死模型和从小鼠骨髓中分离中性粒细胞都是公认的。多形核 （PMN） 白细胞是一种富含人体血液的白细胞，是分离人类中性粒细胞的极好来源。这种方法消除了采集骨髓的需要，从而提高了安全性和效率。

神经内分泌瘤在与心脏重塑相关的心房颤动中也起作用。然而，大型动物（如狗和猪）被用来模拟心房颤动，因为小鼠缺乏足够大的心房来建立折返周期或AF模型，除非特定的离子通道或信号通路被敲低或敲除¹²。虽然如前所述，可以在大鼠中诱导心房颤动并从大鼠外周血中分离中性粒细胞，但研究人员遇到了一个限制，即只能从外周血中分离出 2 x 10^5-5 x 10^{5 中} 性粒细胞（每只大鼠 10 mL）。在每个时间点提取足够的 NET 需要大约 10-25 只大鼠（总共 5 x 10⁶ 个中性粒细胞），导致耗时、昂贵且通常产量低的过程¹³。在这方面，Li He及其同事提出了一种以骨髓为导向的策略，以从大鼠中获得足够的^NETs14。在他们的文章中，他们全面描述了从大鼠骨髓中分离中性粒细胞，并比较了大鼠外周和骨髓中性粒细胞的NET分泌能力。概述的两种方法迎合了不同的实验目标，都产生了足够数量的大鼠骨髓中性粒细胞，同时减少了所需大鼠的数量。两步分离法的中性粒细胞纯化性能优异，而一步法则在可接受的纯化水平下具有时间效率。此外，研究人员比较了大鼠骨髓中性粒细胞与其外周对应物之间的NETosis和NET形成，发现与PMN的效力相同。这些发现对心房颤动的中性粒细胞相关研究做出了重大贡献，并强调了在具有不同中性粒细胞分布的各种实验动物中灵活选择不同来源进行中性粒细胞分离的重要性。

Protocol

该研究是在四川大学华西医院动物伦理委员会授予的项目许可（编号20211404A）下进行的，符合四川大学华西医院动物伦理委员会关于动物护理和使用的指南。根据伦理准则，本研究中使用的大鼠保持在受控环境中，光/暗循环为12小时，温度为22-24°C，湿度为50%-60%。老鼠可以随意获得食物和水。本研究中使用的动物是 6-8 周龄的 Sprague Dawley （SD） 雄性大鼠，体重约 250 g，无特定病原体。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1.大鼠中性粒细胞的分离

1. 骨髓采集
   1. 将大鼠置于适当的容器中进行麻醉（见 材料表）。给大鼠施用3%异氟醚，直到动物失去知觉。检查是否对脚趾捏或尾巴捏没有反应，以确保麻醉深度。
   2. 一旦大鼠被深度麻醉，通过将大鼠放在其背上并用一只手握住它的尾巴，同时用另一只手抓住头部来进行颈椎脱位。通过对尾巴施加突然而强大的向上力，同时向下拉动头部，直到颈椎被切断，从而快速而牢固地使颈部脱臼。等待确认死亡，例如停止呼吸和心跳不畅，然后再进行组织收集或处置。
   3. 将大鼠浸入75%乙醇中，静置几分钟，对皮毛和皮肤进行消毒。将大鼠仰卧并切断臀部的下肢以保护股骨头。用解剖剪刀切开膝关节处的韧带，将膝关节向后折叠，露出股骨和胫骨。
   4. 使用镊子和剪刀，小心地去除任何与骨骼相连的肌肉、肌腱和其他组织。用 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 冲洗骨骼，以去除任何残留的组织碎片和血液。再重复两次，总共洗涤三次。将清洗干净的骨头放入无菌容器中。
   5. 使用 5 或 10 mL 注射器和针头刺穿骨髓两端，使骨髓基质松弛。用另一个注射器用 10-15 mL 罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 培养基冲洗骨髓，直到没有可见的骨髓可以冲洗掉。
   6. 在20°C下以300× g 离心骨髓细胞10分钟。 加入 5-10 mL 红细胞裂解缓冲液（参见 材料表）重悬细胞并在室温下孵育 3 分钟。向混合物中加入 4 倍体积的 HBSS。在室温下以600× g 离心细胞5分钟，用移液管弃去上清液，并使用所得沉淀进一步使用。
2. 从骨髓中分离中性粒细胞
   1. 对于两步法，请执行以下附加步骤:
      1. 按照制造商的说明使用商业化的大鼠中性粒细胞分离试剂盒分离骨髓细胞（参见 材料表）。
      2. 通过在新的 15 mL 离心管中分层 2 mL 55% percoll 试剂（参见 材料表）、2 mL 65% 试剂、2 mL 70% 试剂和 2 mL 80% 试剂来制备密度梯度。在20°C下以800× g 离心管40分钟，加速度设置为5，减速设置为0或1。
      3. 使用无菌移液管收集70%梯度层，包括65%和70%梯度试剂边界处的细胞层。将细胞悬液转移到新的 15 mL 离心管中。将 15 mL HBSS 加入试管中，轻轻倒置试管数次以洗涤细胞。在室温下以300× g 离心管10分钟以沉淀细胞。
   2. 对于一步法，请执行以下附加步骤:
      1. 在不使用大鼠中性粒细胞分离试剂盒的情况下将骨髓细胞置于梯度下。
      2. 使用无菌移液管收集70%梯度层，包括65%和70%梯度之间边界的细胞层。将细胞悬液转移到新的 50 mL 离心管中，并用 HBSS 洗涤细胞。在室温下以400× g 离心管5分钟以沉淀细胞。
      3. 使用血细胞计数器计数分离的中性粒细胞，并使用台盼蓝染色评估活力。
         注意:可以根据大鼠的数量和所需的分离中性粒细胞数量修改方案。当这种方法首次在新的实验环境中使用时，从三只大鼠身上获得了可接受的骨骼量。所有程序都应在无菌条件下进行。应尽快从骨髓中分离中性粒细胞，以尽量减少细胞损伤和活力丧失。

2. 大鼠神经内分泌瘤的获取

1. 在无菌的10cm培养皿中，将0.5×108^分离的中性粒细胞重悬于4mLRPMI培养基（补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素 - 链霉素）中。
2. 将500nM PMA（参见 材料表）添加到中性粒细胞悬浮液中以诱导NETosis。在37°C和5%CO₂下孵育3小时。
3. 对于阴性对照，将 DNase I （10 U/mL） 加入中性粒细胞悬浮液中以降解分泌的 NET。
4. 要收获 NET，请取出培养基并用 HBSS 轻轻清洗附着在培养皿上的 NET。然后，对每个板使用 4 mL 新鲜培养基进行强烈冲洗，以将 NET 从板上分离。
5. 经常收集洗涤介质和移液管，以完全重悬 NET。
6. 将悬浮液在20°C下以300× g 离心10分钟以除去任何漂浮的细胞。
7. 将含有NET的悬浮液转移到无菌管中，并储存在-20°C下，以便在2周内进一步使用。
   注意:NET对降解很敏感，因此建议使用新鲜收获的材料以获得最佳效果。

3. 验证是否存在神经内分泌瘤

1. 将细胞（从步骤2.4开始）固定在带有4%多聚甲醛的盖玻片上15分钟，将NET（从步骤2.7开始）固定30分钟至1小时。
2. 将盖玻片倒置在石蜡膜覆盖的试管架上的PBS / PBST液滴上，并重复洗涤过程三次，每次5分钟。
3. 在室温下用0.5%Triton-X-100透化细胞10分钟，并在PBS / PBST中洗涤3次，每次1分钟。用10%正常驴血清（参见 材料表）在室温下密封细胞1小时。
4. 将细胞与抗大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶抗体和抗大鼠髓过氧化物酶抗体（参见 材料表）在4°C下孵育过夜。 然后，在PBS / PBST中洗涤盖玻片三次，每次5分钟。
5. 将细胞与二抗A488偶联的驴抗兔IgG（H + L），A594偶联的驴抗小鼠IgG（H + L）和A594偶联的山羊抗小鼠IgG1（参见 材料表）在室温下在黑暗中孵育1小时。然后，在PBS / PBST中洗涤盖玻片三次，每次5分钟。
6. 用 10 mg/mL DAPI 染色细胞核和 NET 骨架。然后，在PBS / PBST中洗涤盖玻片三次，每次5分钟。
7. 将一滴封固剂放在载玻片上，然后将带有细胞的盖玻片倒置在其上。让它干燥1小时，用浸入式透镜进行显微镜分析;否则，它就可以进行检查了。
   注意:操作NET时必须格外小心，即使在固定后也是如此，因为它们非常脆弱，在准备过程中很容易丢失。

4. NETs的定量

1. 根据制造商的说明制备Tris-EDTA（TE）缓冲液和PicoGreen（dsDNA测定试剂）工作溶液（参见 材料表）。
2. 通过将储备 DNA 稀释至 1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL 和 1 μg/mL 的浓度来制备标准品。
   注意:为了量化NET的浓度，采用了dsDNA检测试剂盒（见 材料表），并遵循制造商的指南。分别使用 19 倍体积的双蒸水或 199 倍体积的 TE 缓冲液制备 Tris-EDTA （TE） 缓冲液和 dsDNA 检测试剂。随后，制备标准溶液（1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL 和 1 μg/mL），并将每 50 μL 样品与 450 μL TE 缓冲液混合。
3. 将每个样品的 50 μL 加入 450 μL TE 缓冲液中。
4. 向 96 孔板中的每个孔中加入 100 μL 标准品或样品以及等体积的测定试剂工作溶液，包括标准品和样品。
5. 将板在室温下孵育2-5分钟，避免直射。
6. 使用发射光谱约为 530 nm、吸光度光谱约为 480 nm 的荧光酶标仪读取样品。
7. 使用标准品生成的标准曲线计算每个样品中NET的浓度。

5. 细胞细胞术分析NETs分泌

1. 将细胞核染色剂（参见 材料表）添加到在96孔板中孵育的细胞中，以达到10ng / mL的终浓度并孵育30分钟。
2. 向细胞中加入游离DNA（cfDNA，参见 材料表）染色剂，以达到300nM的终浓度并孵育10分钟。
3. 通过轻柔的移液混合荧光染料。不要丢弃上清液或洗涤沉淀。
4. 将样品板装入细胞仪中。
5. 设置不同通道的对焦和曝光时间参数:蓝色（例如:377/50 nm，em:470/22 nm），通常曝光时间为 30,000 毫秒，绿色（例如:483/32 nm，eM:536/40 nm），通常曝光时间为 5,000 毫秒。
6. 在不同通道下捕获整个板的高度均匀图像。
7. 分析不同组的细胞核染色计数。如果它们相似，则可以通过cfDNA染色计数来确定NETs的分泌。

Results

本文概述的方案描述了两种不同的方法，每种方法都以改进的纯化或简化的步骤为特征。两种方法每只大鼠产生约0.5 x 10^8-1 x 10⁸ 中性粒细胞。采用膜联蛋白 V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒进行流式细胞术分析，细胞活力超过 90%，与小鼠和人类细胞活力相当（图 1）。虽然在从骨髓中分离中性粒细胞的过程中，淋巴细胞污染似乎是不可避免的，但与一步法的 50% 相比，两步法的纯度提高了 90%（图 2）。

无论PMA刺激如何，外周和骨髓中性粒细胞之间的NET分泌反应相当（图3）。此外，大鼠神经内分泌瘤彼此之间的交联能力有限（图4）。为了更深入地研究大鼠NETosis的过程，PMA被用作诱导剂。 通过 cfDNA染色检测NETs，并使用细胞成像分析仪捕获综合图像。值得注意的是，与小鼠和人类中性粒细胞相比，大鼠中性粒细胞表现出更高的自发性NETosis倾向，即使没有外部刺激。与PMA孵育导致4小时后cfDNA含量增加10%（图5）。当暴露于500nM PMA时，每只大鼠的骨髓产生8-12μg/ mL净DNA的最终浓度。值得注意的是，在NETosis期间，大鼠中性粒细胞的细胞内内容物未完全挤出，导致观察到许多细胞内成分。此外，由于粘附倾向增强，大鼠NETs表现出形成纱布状薄膜的倾向，呈现出明显的云状外观。

图 1:骨髓分离的中性粒细胞活力评估。 大鼠中性粒细胞分离的最佳来源是骨髓，它有助于随后的中性粒细胞胞外陷阱获取。该图改编自He et ^al.14。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 通过 Wright-Giemsa 染色从外周血和骨髓中纯化中性粒细胞。 （A） 外周血来源。（B） 通过 一步法进行骨髓来源。（C） 通过 两步法进行骨髓来源。骨髓提取是大鼠中性粒细胞分离和随后获取中性粒细胞胞外陷阱的首选方法。比例尺 = 20 μm。 放大倍率 = 400 倍。该图改编自He et ^al.14。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:与 PMA 或 PMA + DNase I 孵育时的 NET 分泌。 骨髓提取是大鼠中性粒细胞分离和随后收集中性粒细胞胞外陷阱的首选途径。该图改编自He et ^al.14。 请点击这里查看此图的较大版本.

图4:免疫荧光分析。 细胞核（蓝色， A）、MPO（绿色， B）和合并图像（C）的免疫荧光染色。NET:中性粒细胞胞外陷阱;MPO:髓过氧化物酶。骨髓提取是大鼠中性粒细胞分离和随后收集中性粒细胞胞外陷阱的首选方法。比例尺 = 50 μm，放大倍率 = 200 倍。该图改编自He et ^al.14。 请点击这里查看此图的较大版本.

图5: 通过 细胞成像分析仪在各种条件下对cfDNA进行全面分析。 cfDNA（绿色）和细胞核（蓝色）的荧光染色。骨髓提取是大鼠中性粒细胞分离和随后收集中性粒细胞胞外陷阱的主要方法。比例尺 = 500 μm。该图改编自He et ^al.14。 请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

中性粒细胞的分离是研究NETosis的关键步骤，其中选择适当的分离方法对于获得可靠的结果至关重要。需要权衡的一个重要因素是分离过程中淋巴细胞污染的发生。在从骨髓中分离大鼠中性粒细胞时，应对这一挑战尤为重要。尽管中性粒细胞（1.0814-1.0919，峰值为1.0919）与淋巴细胞（1.0337-1.0765，峰值为1.0526）相比具有不同的密度范围，但淋巴细胞污染仍然不可避免。这在一定程度上可以归因于骨髓中淋巴细胞的丰度和未成熟淋巴细胞密度的增加¹⁵。密度梯度分离等技术，如使用 Percoll 和 Ficoll，可以帮助遏制淋巴细胞污染，尽管实现完全消除淋巴细胞可能具有挑战性。可以使用专门的 Percoll 解决方案，根据特定的密度梯度进行校准，通过利用大鼠中性粒细胞和其他骨髓细胞之间的密度差异来最大限度地减少污染。因此，研究人员应明智地评估淋巴细胞污染对其实验结果的潜在影响，并采取措施减轻其影响。

本研究强调了定制分离方法以匹配特定实验要求的重要性。在前面^{描述的方法 14} 中，一步法在时间和精力方面要求较低。因此，由于污染淋巴细胞对 NET 分泌的影响无关紧要，它被批准用于 NET 采集。这些淋巴细胞随后可以在最后的离心阶段被消除。相反，对于需要分离中性粒细胞和随后评估 NETosis 和 NET 分泌的努力，建议采用两步法¹⁴。这种方法可以精确定量中性粒细胞产生的内分泌瘤，同时最大限度地减少来自其他细胞污染的潜在混杂因素的影响。

可以对分离方案进行修改，以提高产量和纯度。例如，使用优化的密度梯度试剂组可以产生更多的中性粒细胞。温和的移液和清洗方法同样可以减少细胞损失并提高纯度。监测缓冲液pH值和温度等故障排除措施，以及调整离心参数，可以有效解决分离过程中遇到的挑战。骨髓分离的一个相关制约因素在于未成熟中性粒细胞和其他骨髓细胞污染的可能性，从而影响纯度和产量。设计一种简化的方法来排出淋巴细胞可以提高整体分离效率。另一个限制因素涉及动物牺牲骨髓分离的必要性，这可能不适合对 体内大鼠中性粒细胞进行纵向研究。

人类的中性粒细胞分离主要依赖于外周血。常规方法包括 Ficoll-Paque、Percoll 和免疫磁珠^{分离 16、17、18}。Ficoll 方法根据浮力分离白细胞群，并依靠造影剂来区分中性粒细胞。它提供了简单性和成本效益，但在纯度和产量方面有所妥协，并在消除红细胞方面提出了挑战。另一方面，Percoll 利用密度梯度，以牺牲专用设备和增加的费用和时间为代价，产生更高的中性粒细胞纯度和产量¹⁹。免疫磁珠分离是一种更新、更特异性的技术，利用抗体偶联的磁珠，这些磁珠与中性粒细胞特异性结合，对其他白细胞的污染最小。虽然适合自动化，但它需要专门的设备，并且由于珠子费用而产生更高的成本。在选择中性粒细胞分离方法时，研究人员必须权衡产量、纯度、成本和复杂性。目前，最方便的人中性粒细胞分离方法是使用 PolymorphPrep²⁰。这种方法可在短时间内产生大量高度纯化的中性粒细胞。PolymorphPrep的原理取决于根据密度进行细胞分离。

在小鼠中，不建议从外周血中分离中性粒细胞，因为血容量低，并且很难为下游实验确保足够的数量和纯度。尽管大鼠提供足够的血液量（每只大鼠10毫升），但它们的外周血特征与人类和小鼠不同。大鼠天生表现出中性粒细胞提取的缺陷，单核细胞是最丰富的有核细胞^13,14。因此，外周血分离仅提供来自一只大鼠的 2 x 10^5-5 x 10^{5 中}性粒细胞。骨髓是一种更可行的中性粒细胞来源，无论动物的感染状况如何，都能提供现成且丰富的供应。或者，在腹腔或胸部诱导炎症环境以增强中性粒细胞浸润以进行分离是不可靠且复杂的。因此，骨髓提取成为大鼠中性粒细胞分离的实用、可靠的途径²¹。

NETosis 涉及多种细胞过程，包括 DNA 解聚、自噬和细胞内基质排出¹。在人类中，NET挤压是全面的，留下了细胞膜的残余物。有趣的是，大鼠中性粒细胞研究表现出不同的模式，揭示了刺激后更多的细胞内内容。尽管有PMA刺激，但大鼠中性粒细胞表现出不完全的NET挤压，与它们的自发性NETosis一致。奇怪的是，大鼠神经内分泌瘤表现出聚集形式（aggNETs）的倾向，而不是广泛的网络结构，这可能是由于交联能力降低。这种现象可能会显着影响中性粒细胞聚集，影响大鼠更广泛的免疫反应。骨髓分离的未来应用可能涉及探测NETosis中不同的信号通路和免疫细胞。此外，该方法可以促进NETosis在各种疾病模型中的探索，揭示中性粒细胞在不同病理中的作用。最终，用于分离和表征NETs的新技术有望揭示驱动NETosis的机制及其在不同动物模型中的功能影响。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488 偶联的驴抗兔 IgG（H + L）	Invitrogen， USA	A32790
A594 偶联的驴抗小鼠 IgG（H + L）	Invitrogen， USA	A32744
A594 偶联的山羊抗小鼠 IgG1	Invitrogen，美国	A21125
抗大鼠髓过氧化物酶	Abcam，英国	ab134132
抗大鼠中性粒细胞弹性蛋白酶	Abcam，英国	ab21595
Celigo 图像细胞仪	Nexelom，美国	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma，美国	10104159001
牛血清 （FBS）	Gibco，美国	10099141C
汉克s 平衡盐溶液 （HBSS）	Gibco，美国	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher，美国	33342
异氟醚	RWD，中国	R510-22-10
Mowiol	Sigma，美国	81381
正常驴血清	Solarbio，中国	SL050
多聚甲醛	biosharp，中国	BL539A
青霉素-链霉素	海克隆，美国	SV30010
Percoll	GE，美国	P8370-1L
佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯 （PMA）	Sigma，美国	P1585
Picogreen dsDNA 检测试剂盒	Invitrogen，美国	P11496
大鼠中性粒细胞分离试剂盒	Solarbio，中国	P9200
红细胞裂解缓冲液	Solarbio，中国	R1010
罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 培养基	Hyclone，美国	SH30809.01B
RWD 通用动物麻醉机	RWD，中国	R500
Sprague Dawley （SD） 大鼠	Dashuo，中国
SytoxGreen	Thermofisher，美国	S7020
Tris-EDTA （TE） 缓冲液	Solarbio，中国	T1120
Triton-X-100	Biofroxx，德国	1139ML100