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Biology

तुलनीय क्षमता के साथ चूहे अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए अद्वितीय दृष्टिकोण

Published: April 26, 2024 doi: 10.3791/65506
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1,4, 1,4, 1,4
1Department of Cardiovascular Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan Provincial Pancreatitis Centre, West China Hospital, Sichuan University, 3West China-Liverpool Biomedical Research Centre, West China Hospital, Sichuan University, 4Cardiovascular Surgery Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University
* These authors contributed equally

Summary

यह शोध चूहे अस्थि मज्जा से प्रचुर मात्रा में न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (एनईटीएस) को अलग करने के लिए दो तकनीकों की रूपरेखा तैयार करता है। एक विधि घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ एक वाणिज्यिक न्यूट्रोफिल अलगाव किट को जोड़ती है, जबकि दूसरी केवल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन को नियोजित करती है। दोनों दृष्टिकोण परिधीय रक्त न्यूट्रोफिल से उन लोगों को पार करते हुए कार्यात्मक एनईटीएस उत्पन्न करते हैं।

Abstract

इस शोध का प्राथमिक उद्देश्य चूहे अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (नेट) को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल दृष्टिकोण विकसित करना था। यह प्रयास परिधीय रक्त से एनईटीएस निकालने की पारंपरिक विधि से जुड़ी सीमाओं के कारण उत्पन्न हुआ, मुख्य रूप से अलगाव के लिए उपलब्ध न्यूट्रोफिल की कमी के कारण। अध्ययन में अस्थि मज्जा से चूहे न्यूट्रोफिल प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का पता चला: एक सुव्यवस्थित एक-चरण प्रक्रिया जो संतोषजनक शुद्धि स्तर प्राप्त करती है, और एक अधिक समय-गहन दो-चरण प्रक्रिया जो बढ़ी हुई शुद्धि दक्षता का प्रदर्शन करती है। महत्वपूर्ण रूप से, दोनों तकनीकों ने पर्याप्त मात्रा में व्यवहार्य न्यूट्रोफिल प्राप्त किए, जो प्रति चूहे 50 से 100 मिलियन के बीच थे। इस दक्षता ने मानव और मूत्र दोनों स्रोतों से न्यूट्रोफिल को अलग करने से प्राप्त परिणामों को प्रतिबिंबित किया। गौरतलब है कि चूहे के अस्थि मज्जा से प्राप्त न्यूट्रोफिल ने परिधीय रक्त से प्राप्त न्यूट्रोफिल की तुलना में एनईटी को छिड़कने के लिए तुलनीय क्षमताओं का प्रदर्शन किया। हालांकि, अस्थि मज्जा-आधारित विधि ने लगातार न्यूट्रोफिल और एनईटीएस दोनों की विशेष रूप से बड़ी मात्रा का उत्पादन किया। इस दृष्टिकोण ने आगे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए इन सेलुलर घटकों की काफी अधिक मात्रा प्राप्त करने की क्षमता का प्रदर्शन किया। विशेष रूप से, ये पृथक एनईटी और न्यूट्रोफिल सूजन, संक्रमण और ऑटोइम्यून बीमारियों के दायरे में फैले अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए वादा करते हैं।

Introduction

न्यूट्रोफिल ल्यूकोसाइट्स का एक महत्वपूर्ण उपसमूह है जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। उन्हें मल्टीलोबेड नाभिक और कणिकाओं की विशेषता है जिसमें विभिन्न प्रोटीज और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्सहोते हैं 1. न्यूट्रोफिल मुख्य रूप से क्षरण, फागोसाइटोसिस और एनईटीएस के गठन के माध्यम से कार्य करते हैं। एनईटीएस का अवलोकन पहली बार टेकी एट अल द्वारा 1996 में एक प्रयोग के दौरान किया गया था जहां न्यूट्रोफिल को फोरबोल माइरिस्टेट एसीटेट (पीएमए)2के साथ उत्तेजित किया गया था। इसके बाद, नेट गठन की प्रक्रिया को 2004 में ब्रिंकमैन एट अल.3 द्वारा "नेटोसिस" गढ़ा गया था। उनके शोध ने न्यूट्रोफिल-मध्यस्थता रोगाणुरोधी प्रतिक्रियाओं में एनईटीएस की महत्वपूर्ण भूमिका को और उजागर किया। एनईटीएस क्रोमैटिन, हिस्टोन और रोगाणुरोधी प्रोटीन से बनी वेब जैसी संरचनाएं हैं जो संक्रामक और भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में सक्रिय न्यूट्रोफिल से जारी की जाती हैं। नेट उन्हें फंसाने और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और प्रोटीज 1,3 की एक उच्च एकाग्रता के लिए उन्हें उजागर करके हमलावर रोगजनकों को स्थिर और मार सकते हैं। इसके अतिरिक्त, एनईटीएस एपोप्टोटिक कोशिकाओं की निकासी में योगदान करते हैं और सूजन संकल्प में भाग लेते हैं। हाल के अध्ययनों से यह भी संकेत मिलता है कि एनईटीएस या बिगड़ा हुआ शुद्ध गिरावट का अत्यधिक गठन ऊतक क्षति, ऑटोइम्यून विकार, थ्रोम्बोजेनेसिस, और बिगड़ा हुआ पुनरोद्धार 4,5,6,7,8,9,10 का कारण बन सकता है।

रोधगलन और वेंट्रिकुलर धमनीविस्फार के गठन के बाद अनियंत्रित फाइब्रोसिस में एनईटीएस की रोगजनक भूमिका पेरिवस्कुलर फाइब्रोसिस 4,11 के विस्तार के माध्यम से प्रदर्शित किया गया है। मायोकार्डियल रोधगलन मॉडल और चूहों में अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल का अलगाव दोनों अच्छी तरह से स्थापित हैं। पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर (पीएमएन) ल्यूकोसाइट्स, मानव रक्त में प्रचुर मात्रा में सफेद रक्त कोशिका का एक प्रकार, मानव न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए एक उत्कृष्ट स्रोत के रूप में काम करता है। यह विधि अस्थि मज्जा की कटाई की आवश्यकता को समाप्त करती है, इस प्रकार सुरक्षा और दक्षता को बढ़ाती है।

एनईटीएस कार्डियक रीमॉडेलिंग से जुड़े एट्रियल फाइब्रिलेशन में भी भूमिका निभाते हैं। हालांकि, कुत्तों और सूअरों जैसे बड़े जानवरों को एट्रियल फाइब्रिलेशन मॉडल करने के लिए उपयोग किया गया था, क्योंकि चूहों में एक पुन: प्रवेशी चक्र या वायुसेना मॉडल स्थापित करने के लिए पर्याप्त एट्रियम की कमी होती है, जब तक कि विशिष्ट आयन चैनल या सिग्नलिंग रास्ते नीचे खटखटाए नहीं जाते हैं या12 को खटखटाया जाता है। हालांकि चूहों में एट्रियल फाइब्रिलेशन को प्रेरित करना और चूहे के परिधीय रक्त से न्यूट्रोफिल को अलग करना संभव है, जैसा कि पहले वर्णित है, शोधकर्ताओं को एक सीमा का सामना करना पड़ा जिससे केवल 2 x 105-5 x10 5 न्यूट्रोफिल को परिधीय रक्त (10 एमएल प्रति चूहा) से अलग किया जा सकता है। प्रत्येक समय बिंदु पर पर्याप्त नेट निकालने के लिए लगभग 10-25 चूहों (कुल में 5 x 106 न्यूट्रोफिल ) की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप समय लेने वाली, महंगी और अक्सर कम उपज प्रक्रिया13 होती है। इस संबंध में, ली हे और सहयोगियों चूहों14 से पर्याप्त नेट प्राप्त करने के लिए एक अस्थि मज्जा उन्मुख रणनीति पेश करते हैं. अपने लेख में, वे चूहे अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल को अलग करने का व्यापक विवरण प्रदान करते हैं और चूहे परिधीय और अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल की नेट स्राव क्षमताओं की तुलना करते हैं। उल्लिखित दो विधियां अलग-अलग प्रयोगात्मक लक्ष्यों को पूरा करती हैं, दोनों के परिणामस्वरूप आवश्यक चूहों की संख्या को कम करते हुए चूहे अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल की पर्याप्त मात्रा होती है। दो-चरणीय अलगाव विधि ने बेहतर न्यूट्रोफिल शुद्धि का प्रदर्शन किया, जबकि एक-चरणीय विधि स्वीकार्य शुद्धि स्तरों के साथ समय-कुशल साबित हुई। इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने चूहे अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल और उनके परिधीय समकक्षों के बीच नेटोसिस और नेट गठन की तुलना की, पीएमएन के साथ समान शक्ति पाई। ये निष्कर्ष एट्रियल फाइब्रिलेशन के न्यूट्रोफिल से संबंधित अध्ययनों में महत्वपूर्ण योगदान देते हैं और अलग-अलग न्यूट्रोफिल वितरण के साथ विभिन्न प्रयोगात्मक जानवरों में न्यूट्रोफिल अलगाव के लिए लचीले ढंग से विभिन्न स्रोतों का चयन करने के महत्व को रेखांकित करते हैं।

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Protocol

यह अध्ययन पश्चिम चीन अस्पताल, सिचुआन विश्वविद्यालय की पशु आचार समिति द्वारा जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए पश्चिम चीन अस्पताल, सिचुआन विश्वविद्यालय की पशु आचार समिति के दिशानिर्देशों के अनुपालन में दिए गए एक परियोजना लाइसेंस (संख्या 20211404A) के तहत किया गया था। नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार, इस अध्ययन में इस्तेमाल चूहों एक 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र, 22-24 डिग्री सेल्सियस पर तापमान और 50% -60% की आर्द्रता के साथ एक नियंत्रित वातावरण में बनाए रखा गया था. चूहों को भोजन और पानी एड लिबिटम तक पहुंच प्रदान की गई थी। इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए जानवर 6-8 सप्ताह के स्प्रैग डॉली (एसडी) नर चूहे थे, जिनका वजन लगभग 250 ग्राम और विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त था। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें)।

1. चूहे न्यूट्रोफिल का अलगाव

  1. अस्थि मज्जा की कटाई
    1. संज्ञाहरण के लिए एक उपयुक्त कंटेनर में चूहे प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें). पशु बेहोश है जब तक चूहे को 3% isoflurane प्रशासन. संज्ञाहरण की गहराई सुनिश्चित करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी या पूंछ चुटकी के लिए एक प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति के लिए जाँच करें।
    2. एक बार चूहे गहरी संवेदनाहारी है, उसकी पीठ पर चूहे रखकर और दूसरे हाथ से सिर लोभी जबकि एक हाथ से अपनी पूंछ पकड़ कर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन. सिर को नीचे की ओर खींचते हुए पूंछ पर अचानक और मजबूत ऊपर की ओर बल लगाकर गर्दन को जल्दी और मजबूती से अव्यवस्थित करें जब तक कि ग्रीवा रीढ़ अलग न हो जाए। मृत्यु की पुष्टि के लिए प्रतीक्षा करें, जैसे कि श्वास की समाप्ति और दिल की धड़कन की कमी, ऊतक संग्रह या निपटान के साथ आगे बढ़ने से पहले।
    3. 75% इथेनॉल में चूहे डुबकी और यह फर और त्वचा निष्फल करने के लिए कुछ मिनट के लिए बैठते हैं. चूहे को उसकी पीठ पर लिटाएं और फीमर सिर की रक्षा के लिए कूल्हे पर निचले अंगों को अलग करें। हॉक संयुक्त पर लिगामेंट के माध्यम से कटौती करने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें और फीमर और टिबिया को उजागर करने के लिए घुटने के जोड़ को पीछे की ओर मोड़ें।
    4. संदंश और कैंची का उपयोग करके, हड्डियों से जुड़ी किसी भी मांसपेशियों, टेंडन और अन्य ऊतकों को ध्यान से हटा दें। हांक के संतुलित नमक समाधान के साथ हड्डियों कुल्ला(HBSS) किसी भी शेष ऊतक मलबे और रक्त को हटाने के लिए. कुल तीन धोने के लिए दो बार दोहराएं। साफ हड्डियों को एक बाँझ कंटेनर में रखें।
    5. मज्जा मैट्रिक्स को ढीला करने के लिए हड्डी के दोनों सिरों के माध्यम से मज्जा को प्रहार करने के लिए एक सुई के साथ 5 या 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। एक और सिरिंज के साथ 10-15 एमएल रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) मीडिया के साथ अस्थि मज्जा कुल्ला, जब तक कोई दृश्य अस्थि मज्जा बाहर फ्लश किया जा सकता है.
    6. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अस्थि मज्जा कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने और 3 मिन के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के लिए 5-10 एमएल लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें। मिश्रण में एचबीएसएस की मात्रा का 4 गुना जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और आगे उपयोग के लिए परिणामी गोली का उपयोग करें।
  2. अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल का अलगाव
    1. दो-चरण विधि के लिए, निम्न अतिरिक्त चरणों का पालन करें:
      1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए व्यावसायिक चूहे न्यूट्रोफिल अलगाव किट का उपयोग करके अस्थि मज्जा कोशिकाओं को अलग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      2. 55% पेर्कोल अभिकर्मक के 2 एमएल ( सामग्री की तालिकादेखें), अभिकर्मक के 65% के 2 एमएल, 70% अभिकर्मक के 2 एमएल, और एक नए 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 80% अभिकर्मक के 2 एमएल लेयरिंग द्वारा घनत्व ढाल तैयार करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिन के लिए 800 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें, त्वरण 5 पर सेट करें और मंदी 0 या 1 पर सेट हो।
      3. एक बाँझ विंदुक का उपयोग कर, 65% और 70% ढाल अभिकर्मक के बीच की सीमा पर सेल परतों सहित 70% ढाल परत लीजिए। सेल निलंबन को एक नई 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब में 15 एमएल एचबीएसएस जोड़ें और कोशिकाओं को धोने के लिए ट्यूब को कई बार धीरे से उलट दें। कोशिकाओं को गोली देने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    2. एक-चरणीय विधि के लिए, निम्न अतिरिक्त चरणों का पालन करें:
      1. चूहे न्यूट्रोफिल अलगाव किट का उपयोग किए बिना ग्रेडिएंट के लिए अस्थि मज्जा कोशिकाओं के अधीन।
      2. एक बाँझ विंदुक का उपयोग कर, 65% और 70% ढाल के बीच की सीमा पर सेल परतों सहित 70% ढाल परत लीजिए. सेल निलंबन को एक नई 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और एचबीएसएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं को गोली देने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
      3. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर पृथक न्यूट्रोफिल की गणना करें और trypan नीले धुंधला का उपयोग व्यवहार्यता का आकलन.
        नोट: प्रोटोकॉल चूहों की संख्या और पृथक न्यूट्रोफिल की वांछित संख्या के आधार पर संशोधित किया जा सकता है. हड्डियों की एक स्वीकार्य मात्रा तीन चूहों से प्राप्त की जाती है जब इस विधि का उपयोग पहली बार एक नई प्रयोगात्मक सेटिंग में किया जाता है। सभी प्रक्रियाओं बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल का अलगाव कोशिका क्षति और व्यवहार्यता के नुकसान को कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए।

2. चूहा नेट का अधिग्रहण

  1. एक बाँझ 10 सेमी पेट्री डिश में 4 एमएल आरपीएमआई मीडिया (10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) में 0.5 x 10 8-1 x 108 पृथक न्यूट्रोफिल को फिर से निलंबित करें।
  2. नेटोसिस को प्रेरित करने के लिए न्यूट्रोफिल निलंबन में 500 एनएम पीएमए ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 3 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, स्रावित नेट को नीचा दिखाने के लिए न्यूट्रोफिल निलंबन में DNase I (10 U/mL) जोड़ें।
  4. नेट फसल के लिए, मीडिया को हटा दें और धीरे HBSS के साथ पेट्री डिश से जुड़े नेट धो लें। फिर, प्लेट से नेट को अलग करने के लिए प्रत्येक प्लेट के लिए ताजा मीडिया के 4 एमएल के साथ तीव्र फ्लशिंग का उपयोग करें।
  5. धोने के माध्यम और विंदुक अक्सर जाल का पूरा निलंबन के लिए लीजिए.
  6. किसी भी अस्थायी कोशिकाओं को हटाने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर निलंबन अपकेंद्रित्र।
  7. एनईटीएस युक्त निलंबन को एक बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2 सप्ताह के भीतर आगे उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: एनईटीएस गिरावट के प्रति संवेदनशील हैं, इसलिए सर्वोत्तम परिणामों के लिए ताजा कटाई वाली सामग्री का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

3. नेट की उपस्थिति का सत्यापन

  1. 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कवरस्लिप पर कोशिकाओं (चरण 2.4 से) को ठीक करें और 30 मिनट से 1 घंटे के लिए नेट (चरण 2.7 से)।
  2. एक पैराफिन फिल्म कवर टेस्ट ट्यूब स्टैंड पर एक पीबीएस / पीबीएसटी छोटी बूंद पर coverslip पलटा और 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोने की प्रक्रिया दोहराएँ.
  3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन-एक्स-100 के साथ कोशिकाओं को पारगम्य करें और प्रत्येक 1 मिनट के लिए पीबीएस/पीबीएसटी में तीन बार धोएं। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 10% सामान्य गधा सीरम ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कोशिकाओं सील.
  4. एंटी-चूहे न्यूट्रोफिल इलास्टेस एंटीबॉडी और एंटी-चूहे मायलोपेरोक्सीडेज एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। फिर, पीबीएस/पीबीएसटी में कवरस्लिप को प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी A488-संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश IgG (एच + एल), A594-संयुग्मित गधा विरोधी माउस IgG (एच + एल), और A594-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस IgG1 ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें अंधेरे में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर। फिर, पीबीएस/पीबीएसटी में कवरस्लिप को प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  6. दाग सेल नाभिक और नेट कंकाल 10 मिलीग्राम / फिर, पीबीएस/पीबीएसटी में कवरस्लिप को प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  7. एक गिलास स्लाइड पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद रखें और उस पर कोशिकाओं के साथ coverslip पलटना. विसर्जन लेंस के साथ सूक्ष्म विश्लेषण के लिए इसे 1 घंटे के लिए सूखने दें; अन्यथा, यह निरीक्षण के लिए तैयार है।
    नोट: निर्धारण के बाद भी, नेट में हेरफेर करते समय बहुत सावधानी बरतनी चाहिए, क्योंकि वे बेहद नाजुक होते हैं और तैयारी के दौरान आसानी से खो सकते हैं।

4. नेट का परिमाणीकरण

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Tris-EDTA (TE) बफर और PicoGreen (dsDNA परख अभिकर्मक) कार्य समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. स्टॉक डीएनए को 1 एनजी/एमएल, 10 एनजी/एमएल, 100 एनजी/एमएल, और 1 माइक्रोग्राम/एमएल की सांद्रता में पतला करके मानक तैयार करें।
    नोट: एनईटीएस की एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए, डीएसडीएनए परख किट ( सामग्री की तालिकादेखें) को निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए नियोजित किया गया था। Tris-EDTA (TE) बफर और dsDNA परख अभिकर्मकों को क्रमशः डबल-डिस्टिल्ड वॉटर की 19-गुना मात्रा या TE बफर की 199-गुना मात्रा का उपयोग करके पढ़ा गया था। इसके बाद, मानक समाधान (1 एनजी/एमएल, 10 एनजी/एमएल, 100 एनजी/एमएल, और 1 माइक्रोग्राम/एमएल) तैयार किए गए, और नमूने के प्रत्येक 50 माइक्रोन को टीई बफर के 450 माइक्रोन के साथ जोड़ा गया।
  3. 450 माइक्रोन ते बफर के लिए प्रत्येक नमूने के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  4. मानकों और नमूनों सहित 96-अच्छी प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से परख अभिकर्मक काम समाधान की एक समान मात्रा के साथ मानकों या नमूनों के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  5. 2-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं, सीधे प्रकाश से परहेज.
  6. लगभग 530 एनएम के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और लगभग 480 एनएम के अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके नमूने पढ़ें।
  7. मानकों द्वारा उत्पन्न मानक वक्र का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में नेट की एकाग्रता की गणना करें।

5. सेल साइटोमेट्री द्वारा एनईटीएस स्राव का विश्लेषण

  1. 10 एनजी/एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट में इनक्यूबेट कोशिकाओं के लिए नाभिक दाग ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
  2. सेल मुक्त डीएनए (सीएफडीएनए, सामग्री की तालिका) कोशिकाओं को दाग जोड़ें 300 एनएम की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने और 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. कोमल पाइपिंग द्वारा फ्लोरोसेंट रंगों को मिलाएं। सतह पर तैरनेवाला त्यागें या गोली धोने नहीं है.
  4. साइटोमीटर उपकरण में नमूना प्लेट लोड करें।
  5. विभिन्न चैनलों के लिए फ़ोकस और एक्सपोज़र समय के लिए पैरामीटर सेट करें: नीला (उदा: 377/50 एनएम, ईएम: 470/22 एनएम), आमतौर पर 30,000 एमएस के एक्सपोज़र के साथ, हरा (उदा: 483/32 एनएम, ईएम: 536/40 एनएम) आमतौर पर 5,000 एमएस के एक्सपोज़र के साथ।
  6. विभिन्न चैनलों पर पूरी थाली की अत्यधिक समान छवियों पर कब्जा.
  7. विभिन्न समूहों के लिए नाभिक दाग मायने रखता है का विश्लेषण करें। यदि वे समान हैं, तो नेट स्राव सीएफडीएनए दाग गिनती द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

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Representative Results

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल दो अलग-अलग तरीकों को चित्रित करता है, प्रत्येक में बेहतर शुद्धि या सुव्यवस्थित चरणों की विशेषता है। दोनों विधियों से लगभग 0.5 x 108-1 x 108 न्यूट्रोफिल प्रति चूहा प्राप्त हुआ। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण, एनेक्सिन वी-एफआईटीसी/पीआई एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट को नियोजित करते हुए, माउस और मानव समकक्षों (चित्रा 1) के बराबर 90% से ऊपर सेल व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। जबकि अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल अलगाव के दौरान लिम्फोसाइट संदूषण अपरिहार्य लग रहा था, दो-चरण विधि ने एक-चरण विधि(चित्रा 2)द्वारा प्राप्त 50% की तुलना में 90% की बढ़ी हुई शुद्धता स्तर का प्रदर्शन किया।

नेट स्राव में तुलनीय प्रतिक्रियाएं पीएमए उत्तेजना(चित्रा 3)के बावजूद परिधीय और अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल के बीच स्पष्ट थीं। इसके अलावा, चूहे नेट एक दूसरे के साथ सीमित पार जोड़ने क्षमताओं का प्रदर्शन (चित्रा 4). चूहे नेटोसिस की प्रक्रिया में गहराई से जाने के प्रयास में, पीएमए को एक संकेतक के रूप में नियोजित किया गया था। नेट सीएफडीएनए धुंधला के माध्यम से पता चला था, और व्यापक छवियों एक सेल इमेजिंग विश्लेषक का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. विशेष रूप से, चूहे न्यूट्रोफिल ने बाहरी उत्तेजना के बिना भी माउस और मानव न्यूट्रोफिल के विपरीत सहज नेटोसिस के लिए एक उच्च प्रवृत्ति का प्रदर्शन किया। पीएमए के साथ इनक्यूबेशन ने 4 घंटे(चित्रा 5)के बाद सीएफडीएनए सामग्री में 10% की वृद्धि की। 500 एनएम पीएमए के संपर्क में आने पर, प्रत्येक चूहे के अस्थि मज्जा ने 8-12 माइक्रोग्राम / एमएल नेट-डीएनए की अंतिम एकाग्रता प्राप्त की। यह उल्लेखनीय है कि नेटोसिस के दौरान चूहे के न्यूट्रोफिल में इंट्रासेल्युलर सामग्री को अपूर्ण रूप से बाहर निकाला गया था, जिसके परिणामस्वरूप कई इंट्रासेल्युलर घटकों का अवलोकन हुआ था। इसके अतिरिक्त, चूहे नेट ने बढ़ी हुई आसंजन प्रवृत्तियों के कारण धुंध जैसी फिल्म बनाने के लिए एक झुकाव का प्रदर्शन किया, जो एक अलग बादल जैसी उपस्थिति पेश करता है।

Figure 1
चित्रा 1: अस्थि मज्जा अलगाव से न्यूट्रोफिल व्यवहार्यता मूल्यांकन। चूहे न्यूट्रोफिल अलगाव के लिए इष्टतम स्रोत अस्थि मज्जा है, जो बाद में न्यूट्रोफिल बाह्य जाल अधिग्रहण की सुविधा प्रदान करता है। यह आंकड़ा He et al.14 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: राइट-गिएम्सा धुंधला के माध्यम से परिधीय रक्त और अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल शुद्धि। (ए) परिधीय रक्त उत्पत्ति। (बी) एक-चरण विधि के माध्यम से अस्थि मज्जा उत्पत्ति। (सी) दो-चरण विधि के माध्यम से अस्थि मज्जा उत्पत्ति। अस्थि मज्जा निष्कर्षण चूहे न्यूट्रोफिल अलगाव और न्यूट्रोफिल बाह्य जाल के आगामी अधिग्रहण के लिए पसंदीदा दृष्टिकोण के रूप में कार्य करता है। स्केल बार = 20 माइक्रोन आवर्धन = 400x। यह आंकड़ा He et al.14 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पीएमए या पीएमए + डीएनएसई आई के साथ इनक्यूबेशन पर नेट स्राव। अस्थि मज्जा निष्कर्षण चूहे न्यूट्रोफिल अलगाव और न्यूट्रोफिल बाह्य जाल के बाद के संग्रह के लिए पसंदीदा मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा He et al.14 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इम्यूनोफ्लोरोसेंट विश्लेषण। नाभिक (नीला, ए), एमपीओ (हरा, बी), और मर्ज छवि (सी) का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला। नेट: न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप; एमपीओ: मायलोपेरोक्सीडेज। अस्थि मज्जा निष्कर्षण चूहे न्यूट्रोफिल अलगाव और न्यूट्रोफिल बाह्य जाल के बाद के एकत्रीकरण के लिए पसंदीदा विधि है। स्केल बार = 50 माइक्रोन आवर्धन = 200x। यह आंकड़ा He et al.14 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न परिस्थितियों में सेल इमेजिंग विश्लेषक के माध्यम से सीएफडीएनए का व्यापक विश्लेषण। सीएफडीएनए (हरा) और नाभिक (नीला) के फ्लोरोसेंट धुंधला। अस्थि मज्जा निष्कर्षण चूहे न्यूट्रोफिल अलगाव और न्यूट्रोफिल बाह्य जाल के आगामी संग्रह के लिए प्राथमिक दृष्टिकोण है। स्केल बार = 500 माइक्रोन. यह आंकड़ा He et al.14 से अनुकूलित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

न्यूट्रोफिल का अलगाव नेटोसिस का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण कदम है, जहां भरोसेमंद परिणाम प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त अलगाव विधि का चयन सर्वोपरि है। वजन करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक अलगाव के दौरान लिम्फोसाइट संदूषण की घटना है। अस्थि मज्जा से चूहे न्यूट्रोफिल को अलग करते समय इस चुनौती को संबोधित करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। लिम्फोसाइटों (1.0814-1.0919, 1.0919-1.0919 पर एक चोटी के साथ) की तुलना में न्यूट्रोफिल (1.0337-1.0765, 1.0526 पर एक चोटी के साथ) की विशिष्ट घनत्व सीमा के बावजूद, लिम्फोसाइटों के साथ संदूषण अपरिहार्य रहता है। यह अस्थि मज्जा में लिम्फोसाइटों की प्रचुरता और अपरिपक्व लिम्फोसाइटों15 की संवर्धित घनत्व के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. घनत्व ढाल पृथक्करण जैसी तकनीकें, जैसे कि पेर्कॉल और फिकोल का उपयोग करना, लिम्फोसाइट संदूषण को रोकने में सहायता कर सकता है, हालांकि पूर्ण लिम्फोसाइट उन्मूलन प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। एक विशिष्ट घनत्व ढाल के लिए कैलिब्रेट किया गया एक विशेष पेर्कॉल समाधान, चूहे न्यूट्रोफिल और अन्य अस्थि मज्जा कोशिकाओं के बीच घनत्व विचरण को भुनाने के द्वारा संदूषण को कम करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इसलिए, शोधकर्ताओं को अपने प्रयोगात्मक परिणामों पर लिम्फोसाइट संदूषण के संभावित प्रभाव का विवेकपूर्ण आकलन करना चाहिए और इसके प्रभाव को कम करने के उपाय करने चाहिए।

यह अध्ययन विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं से मेल खाने के लिए अलगाव विधियों को सिलाई के महत्व को रेखांकित करता है। पहले14 चित्रित विधि में, एक-चरण विधि ने समय और प्रयास के मामले में कम मांग का प्रदर्शन किया। जैसे, नेट स्राव पर लिम्फोसाइटों को दूषित करने के असंगत प्रभाव के कारण नेट अधिग्रहण के लिए इसका समर्थन किया गया था। इन लिम्फोसाइटों को बाद में अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के दौरान समाप्त किया जा सकता है। इसके विपरीत, न्यूट्रोफिल अलगाव और नेटोसिस और नेट स्राव के बाद के मूल्यांकन के प्रयासों के लिए, दो-चरण विधि14 की सिफारिश की गई थी। इस दृष्टिकोण ने न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पादित एनईटीएस की सटीक मात्रा का ठहराव की अनुमति दी, जबकि अन्य सेल संदूषणों से उत्पन्न संभावित भ्रमित कारकों के प्रभाव को कम किया।

उपज और शुद्धता दोनों को बढ़ाने के लिए अलगाव प्रोटोकॉल में संशोधन किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक अनुकूलित घनत्व ढाल अभिकर्मक सेट का उपयोग अधिक न्यूट्रोफिल उत्पन्न कर सकता है। कोमल पाइपिंग और धोने के तरीके भी कोशिका हानि को कम कर सकते हैं और शुद्धता को बढ़ा सकते हैं। सेंट्रीफ्यूजेशन मापदंडों को समायोजित करने के साथ-साथ बफर पीएच और तापमान की निगरानी जैसी समस्या निवारण क्रियाएं, अलगाव प्रक्रिया के दौरान आने वाली चुनौतियों का प्रभावी ढंग से समाधान कर सकती हैं। अस्थि मज्जा अलगाव की एक संबद्ध बाधा अपरिपक्व न्यूट्रोफिल और अन्य अस्थि मज्जा कोशिका संदूषण की संभावना में निहित है, जिससे शुद्धता और उपज दोनों प्रभावित होते हैं। लिम्फोसाइटों को निष्कासित करने के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण तैयार करने से समग्र अलगाव दक्षता बढ़ सकती है। एक और बाधा अस्थि मज्जा अलगाव के लिए पशु बलिदान की आवश्यकता से संबंधित है, जो विवो में चूहे न्यूट्रोफिल में अनुदैर्ध्य जांच के लिए अनुपयुक्त हो सकती है।

मनुष्यों के लिए न्यूट्रोफिल अलगाव मुख्य रूप से परिधीय रक्त पर निर्भर करता है। पारंपरिक तरीकों Ficoll-Paque, Percoll, और immunomagnetic मनका जुदाई 16,17,18 शामिल. फिकोल दृष्टिकोण उछाल के आधार पर ल्यूकोसाइट आबादी को अलग करता है और न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए एक विपरीत एजेंट पर निर्भर करता है। यह सादगी और लागत-प्रभावशीलता प्रदान करता है लेकिन शुद्धता और उपज से समझौता करता है और लाल रक्त कोशिकाओं को खत्म करने में चुनौतियां प्रस्तुत करता है। दूसरी ओर, Percoll घनत्व ढाल शोषण, विशेष उपकरणों की कीमत पर अधिक से अधिक न्यूट्रोफिल शुद्धता और उपज उपज और वृद्धि हुई खर्च औरसमय 19. इम्यूनोमैग्नेटिक बीड पृथक्करण एंटीबॉडी-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने वाली एक नई, अधिक विशिष्ट तकनीक है जो विशेष रूप से अन्य ल्यूकोसाइट्स से न्यूनतम संदूषण के साथ न्यूट्रोफिल से बंधती है। हालांकि स्वचालन के लिए उत्तरदायी, यह विशेष उपकरण की आवश्यकता होती है और मनका खर्च के कारण उच्च लागत वहन करता है। न्यूट्रोफिल अलगाव विधि का चयन करते समय, शोधकर्ताओं को उपज, शुद्धता, लागत और जटिलता का वजन करना चाहिए। वर्तमान में, मानव न्यूट्रोफिल अलगाव के लिए सबसे सुविधाजनक विधि PolymorphPrep20 का उपयोग करना शामिल है. यह दृष्टिकोण एक छोटी अवधि के भीतर महत्वपूर्ण मात्रा में अत्यधिक शुद्ध न्यूट्रोफिल पैदा करता है। पॉलीमॉर्फप्रेप का सिद्धांत घनत्व के अनुसार सेल पृथक्करण पर टिका है।

चूहों में, परिधीय रक्त से न्यूट्रोफिल को अलग करना कम रक्त की मात्रा और बहाव प्रयोगों के लिए पर्याप्त मात्रा और शुद्धता हासिल करने की चुनौती के कारण अनुचित है। चूहों को पर्याप्त रक्त मात्रा (10 एमएल प्रति चूहा) प्रदान करने के बावजूद, उनके परिधीय रक्त की विशेषताएं मनुष्यों और चूहों से भिन्न होती हैं। चूहे स्वाभाविक रूप से न्यूट्रोफिल निष्कर्षण में कमियों का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें मोनोसाइट्स सबसे प्रचुर मात्रा में न्यूक्लियेटेड कोशिकाएं 13,14होती हैं। इसलिए, परिधीय रक्त अलगाव केवल एक चूहे से 2 x 105-5 x 105 न्यूट्रोफिल प्रस्तुत करता है। अस्थि मज्जा एक अधिक व्यवहार्य न्यूट्रोफिल स्रोत के रूप में कार्य करता है, जो पशु की संक्रमण स्थिति की परवाह किए बिना आसानी से उपलब्ध और प्रचुर मात्रा में आपूर्ति प्रदान करता है। वैकल्पिक रूप से, अलगाव के लिए न्यूट्रोफिल घुसपैठ को बढ़ाने के लिए पेट की गुहा या वक्ष में एक भड़काऊ वातावरण को प्रेरित करना अविश्वसनीय और जटिल है। इस तरह के रूप में, अस्थि मज्जा निष्कर्षण चूहा न्यूट्रोफिल अलगाव21 के लिए एक व्यावहारिक, भरोसेमंद मार्ग के रूप में उभरता है.

नेटोसिस में डीएनए डीकंडेनसेशन, ऑटोफैगी और इंट्रासेल्युलर मैट्रिक्स निष्कासन1 को शामिल करने वाली विविध सेलुलर प्रक्रियाएं शामिल हैं। मनुष्यों में, शुद्ध बाहर निकालना व्यापक है, कोशिका झिल्ली के अवशेषों को पीछे छोड़ते हुए। दिलचस्प बात यह है कि चूहे न्यूट्रोफिल अध्ययन अलग-अलग पैटर्न प्रदर्शित करते हैं, जो उत्तेजना के बाद अधिक इंट्रासेल्युलर सामग्री का खुलासा करते हैं। पीएमए उत्तेजना के बावजूद, चूहे न्यूट्रोफिल अपूर्ण शुद्ध बाहर निकालना प्रदर्शित करते हैं, उनके सहज नेटोसिस के साथ संरेखित करते हैं। उत्सुकता से, चूहे एनईटी व्यापक नेटवर्क संरचना के बजाय एकत्रित रूपों (एजीएनईटीएस) के लिए एक झुकाव प्रदर्शित करते हैं, संभवतः क्रॉस-लिंकिंग क्षमता को कम करने के कारण। यह घटना न्यूट्रोफिल एकत्रीकरण को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकती है, चूहों में व्यापक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकती है। अस्थि मज्जा अलगाव के भविष्य के अनुप्रयोगों में नेटोसिस में अलग-अलग सिग्नलिंग मार्गों और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की जांच शामिल हो सकती है। इसके अतिरिक्त, यह विधि विभिन्न रोग मॉडल में नेटोसिस अन्वेषण की सुविधा प्रदान कर सकती है, विभिन्न विकृति विज्ञान में न्यूट्रोफिल की भूमिकाओं को उजागर कर सकती है। अंततः, एनईटी को अलग करने और चिह्नित करने के लिए उपन्यास तकनीकें नेटोसिस को चलाने वाले तंत्र और विभिन्न पशु मॉडलों में इसके कार्यात्मक प्रभावों को उजागर करने का वादा करती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

अनुदान: यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 82004154, 81900311, 82100336 और 81970345) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) Invitrogen, USA A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) Invitrogen, USA A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1  Invitrogen, USA A21125
Anti-rat myeloperoxidase Abcam, England ab134132
Anti-rat neutrophil elastase Abcam, England ab21595
Celigo Image Cytometer Nexelom, USA 200-BFFL-5C
DNase I Sigma, USA 10104159001
fetal bovine serum (FBS) Gibco, USA 10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco, USA C14175500BT
Hoechst Thermofisher, USA 33342
Isoflurane RWD, China R510-22-10
Mowiol Sigma, USA 81381
Normal Donkey Serum Solarbio, China SL050
Paraformaldehyde biosharp, China BL539A
Penicillin-streptomycin Hyclone, USA SV30010
Percoll GE, USA P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma, USA  P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit Invitrogen, USA P11496
Rat neutrophil isolation kit Solarbio, China P9200
Red blood cell lysis buffer Solarbio, China R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media Hyclone, USA SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine RWD, China R500
Sprague Dawley (SD) rats Dashuo, China
SytoxGreen Thermofisher, USA S7020
Tris-EDTA (TE) buffer Solarbio, China T1120
Triton-X-100 Biofroxx, German 1139ML100

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References

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तुलनीय क्षमता के साथ चूहे अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए अद्वितीय दृष्टिकोण
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Gong, X., Sun, Y., Zhang, X., Xiao,… More

Gong, X., Sun, Y., Zhang, X., Xiao, Z., He, L., Qin, C. Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity. J. Vis. Exp. (206), e65506, doi:10.3791/65506 (2024).

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