Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bruke levende celle STED-avbildning for å visualisere mitokondriell indre membran ultrastruktur i nevrale cellemodeller

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65561
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Center for Open Research Resources and Equipment, University of Connecticut, 2Department of Molecular and Cell Biology, University of Connecticut

Summary

Denne protokollen presenterer en arbeidsflyt for forplantning, differensiering og farging av dyrkede SH-SY5Y-celler og primære hippocampus-nevroner fra rotter for mitokondriell ultrastrukturvisualisering og analyse ved bruk av stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi.

Abstract

Mitokondrier spiller mange viktige roller i cellen, inkludert energiproduksjon, regulering av Ca2+ homeostase, lipidbiosyntese og produksjon av reaktive oksygenarter (ROS). Disse mitokondriemedierte prosessene tar på seg spesialiserte roller i nevroner, koordinerer aerob metabolisme for å møte de høye energikravene til disse cellene, modulerer Ca2+ -signalering, gir lipider for aksonvekst og regenerering, og justerer ROS-produksjon for nevronutvikling og funksjon. Mitokondriell dysfunksjon er derfor en sentral driver ved nevrodegenerative sykdommer. Mitokondriell struktur og funksjon er uløselig forbundet. Den morfologisk komplekse indre membranen med strukturelle folder kalt cristae har mange molekylære systemer som utfører signaturprosessene til mitokondrionen. De arkitektoniske egenskapene til den indre membranen er ultrastrukturelle og derfor for små til å bli visualisert ved tradisjonell diffraksjonsbegrenset oppløst mikroskopi. Dermed har de fleste innsikter om mitokondriell ultrastruktur kommet fra elektronmikroskopi på faste prøver. Imidlertid gir nye teknologier i superoppløsningsfluorescensmikroskopi nå oppløsning ned til titalls nanometer, noe som tillater visualisering av ultrastrukturelle egenskaper i levende celler. Superoppløsningsavbildning gir derfor en enestående evne til direkte å avbilde fine detaljer om mitokondriell struktur, nanoskalaproteinfordelinger og cristae-dynamikk, noe som gir grunnleggende ny innsikt som knytter mitokondrier til menneskers helse og sykdom. Denne protokollen presenterer bruken av stimulert utslippsuttømming (STED) superoppløsningsmikroskopi for å visualisere mitokondriell ultrastruktur av levende humane neuroblastomceller og primære rotteneuroner. Denne prosedyren er organisert i fem seksjoner: (1) vekst og differensiering av SH-SY5Y-cellelinjen, (2) isolering, plating og vekst av primære hippocampus-nevroner fra rotter, (3) prosedyrer for farging av celler for levende STED-avbildning, (4) prosedyrer for levende celle STED-eksperimenter ved bruk av et STED-mikroskop som referanse, og (5) veiledning for segmentering og bildebehandling ved hjelp av eksempler for å måle og kvantifisere morfologiske egenskaper av den indre membranen.

Introduction

Mitokondrier er eukaryote organeller av endosymbiotisk opprinnelse som er ansvarlige for å regulere flere viktige cellulære prosesser, inkludert mellomliggende metabolisme og ATP-produksjon, ionhomeostase, lipidbiosyntese og programmert celledød (apoptose). Disse organellene er topologisk komplekse, og inneholder et dobbeltmembransystem som etablerer flere underrom1 (figur 1A). Den ytre mitokondriemembranen (OMM) grensesnitt med cytosolen og etablerer direkte interorganelle kontakter 2,3. Den indre mitokondriemembranen (IMM) er en energibesparende membran som opprettholder iongradienter lagret primært som et elektrisk membranpotensial (ΔΨm) for å drive ATP-syntese og andre energikrevende prosesser 4,5. IMM er videre delt inn i den indre grensemembranen (IBM), som er tett knyttet til OMM, og utstående strukturer kalt cristae som er bundet av cristae-membranen (CM). Denne membranen avgrenser det innerste matriserommet fra det intrakristale rommet (ICS) og intermembranrommet (IMS).

Mitokondrier har en dynamisk morfologi basert på kontinuerlige og balanserte prosesser for fisjon og fusjon som styres av mekanoenzymer av dynamin-superfamilien6. Fusjon muliggjør økt tilkobling og dannelse av retikulære nettverk, mens fisjon fører til mitokondriell fragmentering og muliggjør fjerning av skadede mitokondrier ved mitofagi7. Mitokondriell morfologi varierer etter vevstype8 og utviklingsstadium9 og reguleres for å tillate celler å tilpasse seg faktorer som energiske behov 10,11 og stressorer 12. Standard morfometriske trekk ved mitokondrier, som omfanget av nettverksdannelse (sammenkoblet vs. fragmentert), omkrets, areal, volum, lengde (størrelsesforhold), rundhet og forgreningsgrad, kan måles og kvantifiseres ved standard optisk mikroskopi fordi størrelsene på disse funksjonene er større enn diffraksjonsgrensen for lys (~ 200 nm)13.

Cristae-arkitektur definerer mitokondrienes indre struktur (figur 1B). Mangfoldet av cristae-morfologier kan grovt kategoriseres som flat (lamellar eller diskoidal) eller rørformet-vesikulær14. Alle cristae festes på IBM gjennom rørformede eller sporlignende strukturer kalt cristae junctions (CJs) som kan tjene til å dele IMS fra ICS og IBM fra CM15. Cristae-morfologi reguleres av nøkkelproteinkomplekser i IMM, inkludert (1) mitokondriekontaktstedet og cristae-organiseringssystemet (MICOS) som ligger ved CJs og stabiliserer IMM-OMM-kontakter 16, (2) optisk atrofi 1 (OPA1) GTPase som regulerer cristae-remodellering17,18,19, og (3) F1FO ATP-syntase som danner stabiliserende oligomere samlinger ved cristae-spisser (CTs)20, 21. I tillegg er IMM anriket i ikke-bilags fosfolipider fosfatidyletanolamin og kardiolipin som stabiliserer den høyt buede IMM22. Cristae er også dynamiske, og demonstrerer morfologiske endringer under forskjellige forhold, for eksempel forskjellige metabolske tilstander 23,24, med forskjellige respiratoriske substrater 25, under sult og oksidativt stress 26,27, med apoptose 28,29 og med aldring 30. Nylig har det vist seg at cristae kunne gjennomgå store ombyggingshendelser på en tidsskala på sekunder, noe som understreker deres dynamiske natur31. Flere egenskaper ved cristae kan kvantifiseres, inkludert dimensjoner av strukturer innenfor individuelle cristae (f.eks. CJ-bredde, cristalengde og bredde) og parametere som relaterer individuell crista til andre strukturer (f.eks. intra-cristae-avstand og cristae-hendelsesvinkel i forhold til OMM)32. Disse kvantifiserbare cristae-parametrene viser en direkte sammenheng med funksjon. For eksempel er omfanget av mitokondriell ATP-produksjon positivt relatert til overflod av cristae, kvantifisert som cristae tetthet eller cristae tall normalisert til en annen funksjon (f.eks. cristae per OMM-område) 33,34,35. Fordi IMM-morfologi er definert av nanoskalafunksjoner, består den av mitokondriell ultrastruktur, som krever bildebehandlingsteknikker som gir oppløsning større enn lysdiffraksjonsgrensen. Som beskrevet nedenfor inkluderer slike teknikker elektronmikroskopi og superoppløsningsmikroskopi (nanoskopi).

Nevrale og gliaceller i sentralnervesystemet (CNS) er spesielt avhengige av mitokondriell funksjon. I gjennomsnitt utgjør hjernen bare 2% av den totale kroppsvekten, men bruker 25% av den totale kroppsglukosen og står for 20% av kroppens oksygenforbruk, noe som gjør den sårbar for nedsatt energimetabolisme36. Progressive nevrodegenerative sykdommer (ND), inkludert Alzheimers sykdom (AD), amyotrofisk lateralsklerose (ALS), Huntingtons sykdom (HS), multippel sklerose (MS) og Parkinsons sykdom (PD), er noen av de mest omfattende studerte patologiene til dags dato, med forskningsinnsats som spenner fra å forstå det molekylære grunnlaget for disse sykdommene til å søke potensiell terapeutisk forebygging og intervensjoner. ND er assosiert med økt oksidativt stress som delvis stammer fra reaktive oksygenarter (ROS) generert av mitokondriell elektrontransportkjede (ETC)37, samt endret mitokondriell kalsiumhåndtering 38 og mitokondriell lipidmetabolisme39. Disse fysiologiske endringene er ledsaget av bemerkede defekter i mitokondriell morfologi som er assosiert med AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50 og PD 51,52,53. Disse strukturelle og funksjonelle defekter kan kobles av komplekse årsak-virkning forhold. For eksempel, gitt at cristae-morfologi stabiliserer OXPHOS-enzymer54, genereres mitokondriell ROS ikke bare av ETC, men de virker også for å skade infrastrukturen der ETC ligger, og fremmer en feed-forward ROS-syklus som forbedrer følsomheten for oksidativ skade. Videre har cristae disorganisering vist seg å utløse prosesser som mitokondriell DNA (mtDNA) frigjøring og inflammatoriske veier forbundet med autoimmune, metabolske og aldersrelaterte lidelser55. Derfor er analyse av mitokondriell struktur nøkkelen til en full forståelse av ND og deres molekylære grunnlag.

Populære metoder for visning av cristae, inkludert transmisjonselektronmikroskopi, elektrontomografi og kryo-elektrontomografi (kryo-ET) og røntgentomografi, spesielt kryo-myk røntgentomografi, har avslørt viktige funn og arbeid med en rekke prøvetyper 56,57,58,59,60. Til tross for nylige fremskritt mot bedre observasjon av organellær ultrastruktur, kommer disse metodene fortsatt med forbehold om å kreve prøvefiksering og kan derfor ikke fange sanntidsdynamikken til cristae direkte. Superoppløsning fluorescensmikroskopi, spesielt i form av strukturert belysningsmikroskopi (SIM), stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM), fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM), ekspansjonsmikroskopi (ExM) og stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi, har blitt populære måter å se strukturer som krever oppløsning under diffraksjonsgrensen som begrenser klassiske metoder for optisk mikroskopi. Når ExM brukes sammen med en annen superoppløsningsteknikk, er resultatene imponerende, men prøven må festes og farges i en gel61. Til sammenligning har SIM, PALM / STORM og STED alle blitt brukt med levende prøver, og nye og lovende fargestoffer som generelt flekker IMM gir en ny og enkel tilnærming for live avbildning av mitokondrier cristae dynamikk 62,63,64,65,66. Nylige fremskritt i levende fargestoffer for STED-avbildning har forbedret fargestoffets lysstyrke og fotostabilitet, og disse fargestoffene retter seg mot IMM i en høyere grad av spesifisitet enn sine forgjengere. Denne utviklingen tillater innsamling av langsiktige timelapse- og z-stack-eksperimenter med superoppløsningsavbildning, og åpner døren for bedre levende celleanalyse av mitokondriell ultrastruktur og dynamikk.

Her er protokoller for levende celleavbildning av udifferensierte og differensierte SH-SY5Y-celler farget med PKmito Orange (PKMO) fargestoff ved bruk av STED63 gitt. SH-SY5Y-cellelinjen er et tre ganger subklonet derivat fra foreldrecellelinjen, SK-N-SH, generert fra en benmargsbiopsi av metastatisk neuroblastom67,68,69,70. Denne cellelinjen er en vanlig in vitro-modell i ND-forskning, spesielt med sykdommer som AD, HD og PD, hvor mitokondriell dysfunksjon er sterkt involvert 10,43,71,72,73. Evnen til å differensiere SH-SY5Y-celler til celler med en nevronlignende fenotype gjennom manipulering av kulturmedier har vist seg å være en egnet modell for nevrovitenskapelig forskning uten å stole på primære nevronceller10,74. I denne protokollen ble retinsyre (RA) tilsatt til cellekulturmediet for å indusere differensiering av SH-SY5Y-celler. RA er et vitamin A-derivat og har vist seg å regulere cellesyklusen og fremme ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer som regulerer nevrondifferensiering75. En protokoll for dyrking og levende celleavbildning av nevroner isolert fra rottehippocampus er også gitt. Hippocampus har vist seg å være påvirket av mitokondriell degenerasjon og, sammen med cortex, spiller en viktig rolle i aldring og ND 76,77,78,79,80.

Protocol

1. Forplantning og differensiering av SH-SY5Y-celler

  1. Klargjøring av medier for cellevekst og vedlikehold
    1. Forbered komplett, høy glukose Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, 4,5 g / L D-glukose, 4 mM L-glutamin, 110 mg / L natriumpyruvat) supplert med en endelig 1% (v / v) antibiotika-antimykotisk (10.000 enheter / ml penicillin, 10.000 μg / ml streptomycin og 25 μg / ml amfotericin B), og varierende mengder føtal bovint serum (FBS) (se materialfortegnelse). FBS-beløp i differensieringsmedier varierer mellom endelige 10%, 5% eller 2% (v / v) FBS.
  2. Cell vedlikehold
    1. Vedlikehold cellene i DMEM supplert med 10% (v / v) FBS og plasser dem ved 37 ° C og 5% CO2, deretter frø i DMEM som inneholder 5% (v / v) FBS for differensiering. Fryste cellelagre ble lagret i FBS med 10% (v/v) dimetylsulfoksid (DMSO) ved 1-2 x 107 celler/ml.
  3. Fremstilling av retinsyre (RA)
    1. Løs opp 7,51 mg all-trans-RA (se materialfortegnelse) i 5 ml nytilberedt 95% etanol for å oppnå 5 ml stamløsning. Kontroller konsentrasjon med absorbans ved 350 nm (ɛ = 44 300 M-1 cm-1), oppnådd fra produktinformasjonsarket fra produsentens protokoll81, ved bruk av en fortynning av stamløsningen ved 5 μM i etanol. Oppbevar 5 mM lager, beskyttet mot lys ved 4 °C i opptil 6 uker.
  4. Fremstilling av poly-D-lysin for coverslip belegg
    MERK: Produktprotokollen poly-D-lysin (PDL), som du finner under delen Dokumenter og nedlastinger på leverandørside82, gir informasjon om belegging av en rekke kulturbeholdere.
    1. Denne protokollen inkluderer volumer basert på et 2-brønns kammerfartøy med et areal på 4 cm2 per brønn med sterile #1.5 borosilikatdekkglassbunner (se materialfortegnelse). Fortynn stamløsningen av PDL dobbelt til 50 μg / ml med Dulbeccos PBS (DPBS; ingen kalsium, ingen magnesium).
      MERK: # 1.5 eller # 1.5H coverglass er begge akseptable tykkelser, som er avgjørende for bildekvaliteten. Andre tykkelser vil indusere sfærisk aberrasjon og bør unngås.
  5. Coverslip belegg med PDL
    MERK: Coverslips kan bli utsatt for ultrafiolett (UV) lys i 10-15 minutter i et biosikkerhetsskap for ytterligere sterilisering.
    1. Påfør 1,2 ml 50 μg/ml PDL-oppløsning på hver brønn med sterile kammerdeksler i et cellekulturskap og inkuber ved romtemperatur i 1 time. Fjern PDL-oppløsningen og skyll tre ganger med 3,6 ml destillert vann. Etter avsluttet vask, la det belagte kammeret tørke i 2 timer utsatt for luft før skylling og bruk umiddelbart eller oppbevares med en lufttett beholder ved 4 °C i opptil 2 uker.
      MERK: Skyll dekslene grundig, da overflødig PDL kan være giftig for cellene.
  6. Differensiering av SH-SY5Y-celler med RA
    MERK: Ikke bruk celler over passasje 15. Cellene passeres ved 80% -90% sammenløp. Differensieringsprosedyrer varierer, men følg lignende trinn. Ytterligere differensiering fra nevroblastomer til modne nevroner oppnås ved videre behandling med hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF)68,83,84,85, men ble ikke utført i denne protokollen.
    VALGFRITT: Etabler celler i minst 24 timer før såing på dekkglass. For å forberede celler fra frosne lagre, tine raskt 1 ml frosset hetteglass med celler og tilsett 9 ml forvarmede medier supplert med 10% FBS, spinn deretter ned ved 350 x g i 10 minutter (ved romtemperatur) og kast supernatant for å fjerne DMSO. Resuspender cellepelleten i 5 ml forvarmede medier og frøceller i en T-25-kolbe. Når cellene når 80% -90% konfluens, passasje celler ved å telle og seeding dem for differensiering når det er aktuelt.
    1. Dag 0: Frøceller.
      1. Frø cellene på et kamret dekkglass fra frosne lagre eller en arbeidskolbe. Bruk en såtetthet på 1,5 x 104 celler/cm2.
        MERK: En enkelt brønn i et standard 2-brønnkammeret dekkglass med 4 cm2 kulturområde vil kreve 6,0 x 104 celler. Celler som vil forbli udifferensiert bør såes med DMEM supplert med 10% (v / v) FBS, og celler som vil bli differensiert bør seedes med DMEM supplert med 5% (v / v) FBS.
    2. Dag 1: Start RA-differensieringsbehandling.
      1. Forbered DMEM supplert med 5% (v / v) FBS, 1% (v / v) antibiotika-antimykotisk og en endelig konsentrasjon på 10 μM RA eller etanol med samme additivvolum for å tjene som kjøretøykontroll for denne differensieringsprosedyren. Fjern mediet i det kammerede dekselglasset som brukes til såing, skyll med 1x PBS, og tilsett den nye DMEM i brønnene.
    3. Dag 3: Bytt ut medier med nye RA- eller etanolholdige medier.
      1. Fjern mediene fra dag 1 og erstatt dem med nye medier supplert med 2 % (v/v) FBS, 1 % (v/v) antibiotika-antimykotisk og enten 10 μM RA eller 95 % etanol med samme tilsetningsvolum for å tjene som kjøretøykontroll for denne differensieringsprosedyren. Fjern mediet i det kamrede dekselglasset som brukes til såing, skyll med 1x PBS og tilsett nye medier i brønnene.
    4. Dag 6: Utfør avbildning av cellene.
      MERK: Celledifferensieringstider varierer etter protokoll, men seks dager med eksponering for RA er tilstrekkelig til å indusere en nevronlignende fenotype i SH-SY5Y-celler86.
      1. Utfør live avbildning, med detaljer i avsnitt 3 og 4 (figur 2).

2. Primær rotte hippocampus neuron kultur

  1. Materialer forberedelse for rotte hippocampus neuron isolasjon.
    1. Forbered fersk supplert DMEM.
      1. Filtrer steriliser en blanding av DMEM (høy glukose, ingen natriumpyruvat) supplert med 10% (v / v) varmeinaktivert FBS, 1% (v / v) natriumpyruvatoppløsning og 1% (v / v) penicillin-streptomycin (10.000 U / ml). Oppbevares i opptil 2 uker ved 4 °C.
    2. Forbered fersk supplert neuron vekstmedier.
      1. Filtersteriliser en blanding av nevronvekstmedier supplert med 2% (v / v) B27-supplement, 0,25% (v / v) glutamintilskudd og 1% (v / v) penicillin-streptomycin (se materialtabell). Oppbevares i opptil 2 uker ved 4 °C.
  2. Forbered primær hippocampus neuron kultur.
    1. Forbered primær hippocampus neuron kultur etter tidligere publisert arbeid87 og fra produktprotokollen på produsentens nettsted hvorfra dissekert E18 rotte hippocampus er oppnådd88 (se materialfortegnelse). Denne protokollen resulterer i en hovedsakelig nevronal populasjon med <2% astrocytter.
      MERK: Dvalemediet som dette vevet sendes med, vil bli brukt til fremtidige trinn i denne protokollen. Ikke kast den.
    2. Forbered materialer og medier for vevsdissosiasjon.
      1. Flamme en Pasteur-pipette for å redusere blenderåpningsdiameteren og oppbevar den i folie for å forhindre forurensning til bruk. Forvarm den tilberedte DMEM, 1X Hanks bufrede saltløsning (HBSS) og nevronvekstmedier til 37 °C. Tilsett 2 flak DNAase med steril pinsett til et 15 ml konisk rør.
    3. Utfør vevsdissosiasjon.
      1. Fjern så mye som mulig av dvalemediet, dissekert E18 rottehippocampus lagres i som mulig før vevet plasseres i det 15 ml koniske røret som inneholder DNAase og ruges kort ved 37 °C. Tilsett 900 μL 1X HBSS etterfulgt av 100 μL 0,5% trypsin. Bløt vevet ved 37 °C i 15 minutter.
        MERK: PDL-belagte plater kan fjernes fra lagring og plasseres i en inkubator til bruk i løpet av denne inkubasjonstiden.
    4. Utfør vevshomogenisering og celletelling.
      1. Etter inkubering med trypsin, fjern mediet og tilsett 1 ml forvarmet dvalemedie-DNAase fra forrige trinn til vevet og homogeniser med Pasteur-pipetten. Mediene vil se ugjennomsiktige ut og deretter gradvis klare etter hvert som homogeniseringen fortsetter.
      2. Legg dissosierte nevroner til et nytt rør med 4 ml forvarmet DMEM og tell deretter cellene ved hjelp av en celleteller.
    5. Utfør cellebelegg og vekst av primære celler.
      1. Plateceller med en tetthet på ca. 1,65 x 104 celler/cm2 i DMEM. For et 2-brønnkammeret dekkglass (4 cm 2), frø 65 000 – 70 000 celler per brønn med2 ml DMEM. Inkuber celler ved 37 °C og 5 %CO2 i 2 timer før du kontrollerer at de fester seg. Når cellene begynner å feste seg, fjern 1 ml media og erstatt det med samme volum dvalemodus, og rør deretter forsiktig for å blande. Når mediet er blandet, gjenta denne prosessen og fjern halvparten av mediet som er tilstede og erstatt med samme volum av nevronvekstmedier, og bland deretter forsiktig.
        MERK: Dagen for plating regnes som dag in vitro (DIV) 0, og cellene er klare til å avbilde ved DIV 7 (figur 2).

3. Fremstilling av celler for levende celleavbildning

MERK: Celletyper og opprinnelse (dvs. dyrkede og primære celler) kan variere i fargekrav; Se publiserte rapporter for flere detaljer62,63.

  1. Tilberedning av PKmito Orange
    MERK: Andre fargestoffer som vanligvis flekker IMM har blitt rapportert64,65,66 og er kommersielt tilgjengelige. PKMO er den eneste som brukes i denne protokollen.
    1. Resuspendere pulver PKMO (se materialfortegnelse) i DMSO i henhold til produsentens instruksjoner89. Aspirer mediet fra celler og vask i forvarmede fenolrøde frie medier. Forbered et lager av PKMO i forvarmet, fenolfritt DMEM supplert med 2% (v / v) FBS eller 10% (v / v) avhengig av differensieringstilstand, HEPES til en endelig konsentrasjon på 20 mM og 1% (v / v) antibiotika-antimykotisk før farging av cellene etter produsentens instruksjoner. Denne formuleringen, uten PKMO, er levende cellebildemedier.
  2. Cellefarging med PKMO
    1. Inkuber cellene med fargestoffet ved 37 ° C og 5% CO2, i 30 minutter. Vask cellene tre ganger med levende celleavbildningsmedier, og til den endelige vasken inkuberes i 30 minutter ved 37 °C, 5% CO2.
    2. Legg til friske, forvarmede bildemedier med levende celler. Cellene er nå klare for avbildning.
      MERK: Akutte behandlinger (f.eks. Narkotika og / eller stressorer), når de brukes, legges til før levende bildebehandling; se diskusjonsdelen og tilleggsfigur 1.

4. Avbildning av levende celler ved STED-mikroskopi

MERK: Denne protokollen bruker et STED-system bygget rundt et invertert mikroskop, med systemet spesifisert i materialfortegnelsen. Dette systemet er utstyrt med pulserende eksitasjonslasere (561 nm laser med nominell effekt ~ 300 μW) og en pulserende 775 nm STED uttømmingslaser (nominell effekt 1.2 W), en kontinuerlig justerbar galvanoskanner og en 615/20 nm filterbasert lavinefotodiodedetektor (APD). En 100x/1.40 olje nedsenking linse for STED brukes her. Lightbox-programvare brukes til bildeoppkjøp. Alle oppgitte detaljer er relatert direkte til denne programvaren og systemoppsettet.

  1. Generelle retningslinjer og trinn for avbildning
    1. Bruk en scene-topp inkubator eller miljøkammer for å opprettholde celle levedyktighet, men kortsiktige romtemperatureksperimenter er også akseptable. Disse trinnene er spesifikke for STED-oppsettet som er beskrevet ovenfor.
    2. Velg laser- og filtersett for avbildning.
      1. Bruk parametere for et oransje fargestoff ved å velge fargestoffet (e) som brukes i fargingen fra fargelisten, eller den med spektrale egenskaper nærmest fargestoffet (e) som brukes. Gjør disse aktive ved å dobbeltklikke eller dra dem til prøvelisten, der det står "Dra fargestoff (er) hit."
    3. Velg et område du vil avbilde.
      1. I en oversikt oppretter du et interesseområde (ROI) rundt en mitokondrie av interesse ved å velge den rektangulære ROI-knappen og klikke og dra for å forme regionen. Avkastningen kan endres og roteres ved hjelp av ROI-hjørner eller buede kanter som vises mens du holder musen over et hjørne.
        MERK: Et sammendrag av de foreslåtte bildeparametrene finnes i tabell 1. Disse parametrene ble empirisk justert ved hjelp av de som tidligere er rapportert for dette STED-oppsettet og fargestoffkombinasjonen63.
    4. Sett opp gating.
      1. Ved siden av Generelt-menyen velger du Gating -menyen eller klikker og holder for å legge til menyen i visningen. Det anbefales at STED-detektorgating justeres til 1-1,05 til 7,8-7,85 ns, som presentert her. Gating ganger kan variere og være så kort som 1-1,05 til 7-7,05 ns.
    5. Juster intensiteten på riktig måte i henhold til prøven.
      MERK: Generelt er eksitasjonskraften som brukes til STED 2-3 ganger kraften som brukes til konfokal, så en prøve som krever 5% eksitasjonslaserkraft for konfokal kan bruke 10% -15% eksitasjonslaserkraft under STED-oppkjøpet.
      1. Sett eksitasjonslaseren for STED til 15%-20% og STED depletion laser til 20%-25% med 10 linjers akkumuleringer. Bruk en pikseloppholdstid på 4 μs med en pikselstørrelse på 20-25 nm. Knappenålshullet ble holdt på 1,0 AU for dyrkede celler og 0,7 AU for primære hippocampusceller fra rotter for å forbedre optisk snitting i de tettere pakket mitokondriene.
        MERK: Konfokale og STED-bilder kan begge anskaffes for sammenligning side om side (figur 3A, B, figur 4A) eller bare STED kan anskaffes.
  2. Tilleggsinformasjon for tidsserier/z-serier
    1. Velg tidsserien.
      1. Velg rullegardinmenyen Tid. Definer antall iterasjoner (5 brukt her) og tidsintervall (25 eller 30 s brukt her) ønsket for en timelapse (figur 3C, D, figur 4B).
        MERK: Hvis intervallet er kortere enn anskaffelsestiden, fortsetter gjentakelsene uten forsinkelse. Når du utfører en timelapse, anbefales det sterkt å engasjere en perfekt fokusenhet eller lignende fokussporing for å unngå potensiell drift.
    2. Still inn volumområdet.
      1. Still inn z-volumområdet etter ønske ved å aktivere Volume-alternativet og justere de to endene av området. Trinnstørrelser som ble brukt i denne protokollen for 2D-avbildning var 150-200 nm. Anbefalt trinnstørrelse med hensyn til Nyquist-prøvetaking som kreves for dekonvolusjon av rå STED kan beregnes med online verktøy90.
        MERK: STED-uttømmingslaserkraften og antall avbildede fly kan øke fargestofffotobleking og lyseksponering for cellen til skadelige nivåer. Se etter tegn på fototoksisitet og fotodamage etter oppkjøp.

5. Prosessering og analyseverktøy for mitokondriell ultrastruktur

MERK: Bildebehandling (dvs. dekonvolusjon) er valgfritt, men brukes vanligvis når du lager og analyserer STED-bilder for publisering. Dekonvolusjon for å forbedre kontrasten og redusere støy er sterkt anbefalt for optimal segmentering av individuelle cristae, som beskrevet nedenfor (figur 2).

  1. STED bilde dekonvolusjon
    MERK: Programvaren som brukes til dekonvolusjon i denne protokollen er gitt i materialfortegnelsen.
    1. Angi de mikroskopiske parametrene til bildet.
      MERK: Kontroller at mikroskopmetadata er riktig angitt i bildet Mikroskopiske parametere. Dette inkluderer montering av medium brytningsindeks; nedsenking medium; piksel størrelse; eksitasjon, utslipp og uttømming bølgelengder; og annen relevant informasjon. Maler med disse parameterne kan lagres for gjenbruk.
    2. Deconvolute rå STED-bilder med programvarealgoritmen.
      1. Tilgang til automatiserte deconvolution algoritmer i deconvolution programvare tillater hands-off deconvolution bildebehandling. Velg Express-knappen og sett dekonvolusjonstypen til Rask, Standard, Aggressiv eller Konservativ for varierende grad av dekonvolusjonskraft. Representative bilder ved bruk av Express Deconvolution med aggressive innstillinger vises (figur 3, figur 4 og figur 5).
      2. Lagre bildene fra deconvolution-programvaren i ICS2-format.
    3. For manuell dekonvolusjon, utfør følgende trinn.
      1. Kort sagt, når du utfører manuell dekonvolusjon, lagre dekonvolusjonsveivisermalene for konsistens og ha muligheten til å laste inn en mal når du starter veiviseren. Bruk informasjon om målepunktspredningsfunksjonen (PSF) hvis generert med anskaffelsesoppsett og parametere.
      2. Beskjær rått STED-bilde, om nødvendig, før du får dekonvolusjonsprogramvaren til å stabilisere bildet automatisk. Add-ons til deconvolution programvarepakker tillater spesifikk kompensasjon av mulige bildeartefakter som termisk drift og kromatiske avvik.
      3. Deretter genererer du et logaritmisk histogram for å utføre bakgrunnssubtraksjon manuelt eller automatisk. Velg den klassiske algoritmen for maksimal sannsynlighetsestimering (CMLE) dekonvolusjon.
        MERK: For dekonvolusjon er nøkkelverdiene som skal justeres, signal-støy-forholdsterskelen, antall iterasjoner og kvalitetsterskelen. Disse verdiene kan justeres, og dekonvolusjonen kan forhåndsvises for å bestemme optimale innstillinger.
  2. Segmentering og partikkelanalyse
    MERK: Denne protokollen bruker FIJI (Is Just ImageJ), en programvare med åpen kildekode (se Tabell over materialer), for segmentering og analyse. Annen sammenlignbar programvare, inkludert CellProfiler, Icy, Ilastik og QuPath, er tilgjengelig for disse formålene.
    1. Klargjøre bilder for segmentering.
      1. Åpne .obf rå STED-bilder eller .ics2-filer fra deconvolution-programvaren ved å gå til File → Open eller klikke og dra filene til ImageJ-verktøylinjen. Herfra kan enhver behandling som gjør bilder enklere å segmentere, utføres før segmentering.
      2. Hvis du vil holde endringene konsekvente, registrerer du funksjoner ved hjelp av pluginmoduler → makroer → Registrer og kopier og lim inn tastekommandoer i en ny makro, fra pluginmoduler → New → Macro. Sørg for å velge bildet som skal behandles før du kjører makroen.
        MERK: Vanlige akseptable endringer for kvantifisering av størrelse og form inkluderer beskjæring, projisering av en z-stabel og bakgrunnssubtraksjon med utjevning deaktivert. Endringer bør utføres konsekvent blant bilder i et datasett og rapporteres.
    2. Juster trenbare Weka-segmenteringsinnstillinger
      MERK: Ytterligere detaljer med trinnvise instruksjoner for bruk av det halvautomatiske segmenteringsverktøyet og nedstrømsanalyser for mitokondrier er publisert91.
      1. Åpne de deconvolved STED-bildene i Trainable Weka Segmentation (TWS)92-plugin , som ligger under Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation. I segmenteringsinnstillingene velger du Gaussisk uskarphet, membranprojeksjoner og Sobel-filterfunksjoner . Standard membrantykkelse er 1, og standard membranlappstørrelse er 19.
      2. Merk enten klasse 1 eller 2 som "Cristae" og den andre som "Bakgrunn" (figur 2). Modeller kan også lagres med knappen Lagre klassifisering . Velg Last inn klassifisering for å bruke disse innstillingene på nytt for andre bilder.
    3. Utfør TWS-klassespor.
      1. Bruk linjeverktøyet eller andre figurer til å fremheve noe av cristae eller bakgrunnen. I det minste bør noen bakgrunnsvalg inkludere mellomrom mellom cristae. Tegn en linje over strukturen for å tilordne til en av klassene, og velg deretter Legg til-knappen på høyre side for enten cristae eller bakgrunn. Dobbeltklikk på en sporing for å fjerne strukturen fra etiketten.
    4. Utfør TWS-klassifiseringstrening.
      1. Velg Train classifier-knappen på venstre side for å generere et kart basert på informasjonen som er gitt til pluginet. Overlegget av segmenterte klasser kan slås av og på med Vis/skjul overlegg-knappen , og opasiteten til overlegget kan justeres i Innstillinger. Klassifiseringen kan omskoleres med flere etiketter. Når du er fornøyd, velger du Få sannsynlighet-knappen .
    5. Mål partiklene.
      1. Bruk cristae-sannsynlighetskartet til å terskelere bildet for å generere en maske, og gå deretter til Analyser → analyser partikler. Vanligvis kan standard terskeltype brukes og området justeres for å sikre at hele kriteriet blir redegjort for. Målingene ved å analysere partikler kan justeres ved å analysere → angi målinger.
        MERK: Eksempler på størrelses- og formparametere som areal, omkrets, sirkularitet og størrelsesforhold for cristae måles og vises basert på de valgte målingene (figur 2, figur 5A, tilleggstabell 1).
      2. VALGFRITT: Velg det rå STED-bildet med samme dimensjoner som det dekonvolvede bildet og bruk avkastningen fra lederen, og velg deretter Mål i ROI-styringen for å få intensitetsverdier.
    6. Få linjeplott.
      1. Linjeplott ble generert fra de deconvolved STED-bildene. Tegn en flerpunktslinje, juster linjetykkelsen til flere piksler bred for å beregne gjennomsnittlig støy, og spline linjen slik at den passer til mitokondriene (figur 2, figur 5B). Det resulterende linjeplottet som genereres, brukes til å måle topp-til-toppavstander for å rapportere periodisiteten og fordelingen av cristae over et bestemt område.
        MERK: Relatert kan cristae tetthet rapporteres som antall uavhengige cristae innenfor et gitt område som bestemt ved å måle den ytre delen av mitokondriene. Det mitokondrielle området kan bestemmes ved å bruke et filter på det deconvolved eller rå STED-bildet for å generere en maske. Forsikre deg om at masken passer nøyaktig til omrisset av mitokondriene før du måler området.

Representative Results

Denne protokollen beskriver cellevekstbetingelser for dyrkede og primære celler med fokus på levende celle STED-avbildning og påfølgende analyser av mitokondriell cristae. Projeksjoner laget med ImageJ av mitokondrier fra udifferensierte SH-SY5Y (figur 3A) og RA-differensierte SH-SY5Y (figur 3B) celler kan samles som z-stabler med tradisjonell konfokal og STED, og de rå STED-bildene kan deretter dekonvolved. Timelapse-avbildning kan også utføres og deretter deconvolved (figur 3C,D). Ved å bruke litt forskjellige avbildningsparametere for primære hippocampusnevroner hos rotter (tabell 1), kan konfokale og rå STED-bilder anskaffes som z-stabler, og de rå STED-bildene kan dekonvolderes (figur 4A). Timelapse-avbildning av mitokondrier fra primære nevroner er også mulig (figur 4B). Generelt bør time-lapse-bildene kunne vise mitokondrielle dynamiske hendelser.

Når rå STED og deconvolved STED z-stack-projeksjoner fra prøvene som brukes til segmentering virker konsistente, utføres kvantitative målinger. TWS-pluginet bruker det deconvolved STED-bildet til å segmentere for å lage en sannsynlighetsmaske, som deretter brukes til å lage en binær maske av cristae for å oppnå størrelses- og formparametere (figur 5A). Områdene fra denne masken lagres i ROI-behandleren og kan brukes på råbildet hvis du ønsker det, for å måle forskjeller i relativ intensitet. De deconvolved STED-projeksjonene kan også brukes til å bestemme cristae-periodisiteten og tettheten i et gitt område (figur 5B).

Figure 1
Figur 1 Mitokondriell morfologi. Mitokondrier har et tomembransystem som definerer forskjellige underrom (A). Cristae er infolds av den indre membranen med definerte egenskaper (B). Forkortelser: OMM, ytre mitokondriemembran; ICS, intracristal plass; IMS, intermembrane plass; CM, cristae membran; IBM, indre grensemembran; IMM, indre mitokondriemembran; CT, cristae spiss; CJ, cristae kryss. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk over arbeidsflyten. SH-SY5Y-celler eller primære rotte hippocampus-nevroner dyrkes på et PDL-belagt dekkglass. SH-SY5Y-celler dyrkes parallelt for å forbli udifferensiert eller utsatt for RA-differensiering i løpet av seks dager. Primære hippocampus-nevroner fra rotter ble dyrket på et PDL-belagt dekkglass etter å ha blitt isolert fra hippocampus-seksjoner i syv dager. Når de var klare til å bli avbildet, ble cellene farget med PKMO og avbildet med STED. Raw STED-bilder blir deretter deconvolved, og de deconvolved bildene behandles i FIJI for å oppnå størrelses- og formmålinger, for eksempel cristae-tetthet, areal, omkrets, sirkularitet og størrelsesforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Avbildning av mitokondrier i SH-SY5Y-celler. Representative konfokale (venstre), rå STED (midten) og Huygens deconvolved STED bilde z-stack projeksjoner (høyre) av mitokondrier fra ikke-differensierte (A) og RA-differensierte (B) SH-SY5Y celler med PKMO-farging er vist. En timelapse med 30 s-intervaller og 5 iterasjoner av RA-differensierte SH-SY5Y-celler vises (C) med utvalgte regioner (hvite bokser) utvidet (D) ved hjelp av skalerte bilder av disse regionene uten interpolering. Skala barer: A, B, 250 nm; C,D, 1 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 Avbildning av mitokondrier i primære hippocampusnevroner hos rotter. Representative konfokale (venstre), rå STED (midten) og Huygens deconvolved STED (høyre) bilde z-stack projeksjoner av mitokondrier fra primære rotte hippocampus nevroner er vist (A). En timelapse med 25 s intervaller og 5 iterasjoner av mitokondrier i disse nevronene er vist (B). Skala barer: A, 250 nm; B, 1 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Behandling av deconvolved STED-bilder i ImageJ. Representativ bruk av Trainable Weka Segmentation plugin for å måle cristae størrelse og form er vist (A). Fra venstre til høyre vises følgende bilder: det deconvolved STED-bildet, sannsynlighetskartet basert på segmentering fra TWS-plugin, masken fra terskel i FIJI ved hjelp av sannsynlighetskartet som inngang, masken med ROIene skissert, og avkastningen overlagt på det opprinnelige deconvolved STED-bildet. De resulterende målingene av areal, perimeter, sirkularitet og sideforhold som tilsvarer disse objektene, finnes i tilleggstabell 1. Et linjeplott som bruker det deconvolved STED-bildet til å måle topp-til-toppavstander som en avlesning for cristae-tetthet vises (B). Skala barer: 0,5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Pikselstørrelse (nm) Oppholdstid (μs) Line iht. 561 nm eksitasjon under STED-oppkjøp (%) 775 nm STED uttømmingskraft (%) Trinnstørrelse (nm) Pinhole (AU) Intervall(er) Timelapse-gjentakelser
Udifferensiert SH-SY5Y 20 4 10 15 20 200 1.0 30 5
RA-Differe-ntiated SH-SY5Y 20-25 4 10-12 15 20-22 150-200 1.0 30 5
Primære nevroner 20-25 4 10 10 25 200 0.7 30 5
MERK: Pikselstørrelsen kan variere basert på bildekrav og intensjon om å deconvolve bilder. Riktig prøvetaking er nødvendig for dekonvolusjon. Pikselstørrelser for rå STED-bilder uten dekonvolusjon kan gå opp til 30 nm.

Tabell 1: Sammendrag av STED-anskaffelsesparametere. Innstillingene som brukes for 2D STED-avbildning for hver celletype, udifferensiert SH-SY5Y, RA-differensiert SH-SY5Y og primære hippocampus-nevroner fra rotter, vises. For alle timelapses ble det tatt 5 iterasjoner med varierende intervaller basert på ROI-størrelse.

Tilleggsfigur 1: Avbildning av SH-SY5Y-celler med amyloid-β (Aβ) addisjon. Representative konfokale (venstre), rå STED (midten) og deconvolved STED (høyre) bilder av RA-differensierte SH-SY5Y-celler med PKMO-flekk (øverst) og Aβ-HiLyte647 (nederst) vises (A). Sammenslåtte z-stack-projeksjoner av rå PKMO STED (grønn) med rå Aβ STED (magenta) (B) eller deconvolved PKMO STED (grønn) med deconvolved Aβ STED (magenta) (C) vises. Skala barer: 0,5 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 1: Størrelses- og formmålinger av segmentert cristae. Størrelses- og formmålene for areal (μm2), omkrets (μm), sirkularitet og størrelsesforhold, tilsvarende objektene skissert i figur 5A fra segmenterte mitokondrier, vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 2: Sammendrag av innsamlingsparametere med amyloid-β prøver. Innstillingene som brukes for 2D STED-avbildning av PKMO og Aβ-HiLyte647 i udifferensierte og RA-differensierte SH-SY5Y-celler, vises. Konfokal av Aβ-HiLyte647 kan brukes alene da det ikke er noen spesifikk struktur å løse; STED-bilder av Aβ-HiLyte647 vises her for mindre partikkelstørrelser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Amyloid-β behandlingsprotokoll. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne protokollen presenterer bruken av human neuroblastomcellelinje SH-SY5Y og primære rotte hippocampus-nevroner med det nye IMM-målrettede PKMO-fargestoffet for levende celle STED-avbildning. På grunn av nyheten av PKMO, er det for tiden lite publisert ved hjelp av dette fargestoffet for live STED bildebehandling. Bruk av disse celletypene for STED-avbildning gir utfordringer, spesielt fordi nevronceller har smalere mitokondrier. En begrensning av denne protokollen er PKMO-fargestoffet som brukes, da det kan være giftig for celler. Ulike celler og cellelinjer reagerer forskjellig på fargestoffet, og det kan derfor være nødvendig med justeringer av fargestoffkonsentrasjon og inkubasjonstid for å optimalisere resultatene for sterkt signal uten å skade celler. En foreslått løsning er å senke konsentrasjonen og øke fargetiden63; Dette kan imidlertid føre til dårligere farging uten å øke cellenes levedyktighet.

På samme måte som PKMO, viser det kommersielle fargestoffet Live Orange mito (Table of Materials) også noe celletoksisitet. Dette fargestoffet ble brukt til en rekke dyrkede celler, men var ikke i stand til å vise sammenlignbar farging i RA-differensierte SH-SY5Y-celler vellykket med de samme parametrene som deres udifferensierte kolleger (våre upubliserte observasjoner). Imidlertid kan amenable fargeprotokoller optimaliseres for denne sonden og valgte celletyper. Med dette fargestoffet ble detektorgatingstider på 1-1,05 til 7-7,05 ns brukt, mens alle andre parametere i tabell 1 forblir de samme. Generelt ga farging av celler med 200-250 nM Live Orange mito i 45 min sammenlignbare resultater som PKMO-resultatene viste. Høyere konsentrasjonsfarging i kortere tid eller lavere konsentrasjonsfarging i samme tid eller litt lenger kan gi forskjellige resultater og kan være gunstig for andre celletyper eller vekstforhold.

Imaging primære rotte hippocampus nevroner skiller seg fra immortaliserte celler på grunn av arten av axon og dendritt fremspring, samt mitokondriell fordeling på tidspunktet for avbildning. En vanskelighet i denne delen av protokollen er at såtettheten avgjør om primærkulturene vil kunne feste seg og vokse sunt, og ved høyere tettheter har projeksjonene en tendens til å gro igjen ved DIV 10. Derfor vil mitokondriene avbildet fra disse primære nevronene sannsynligvis komme fra cellekroppen og ikke fremspringene; Imidlertid gir vellykket vekst fra en lavere startcelletetthet bedre bilderesultater ved senere veksttider. Nøkkelen er å sikre lav bakgrunn og ufokusert lys for å ha den beste kontrasten for STED. For å løse bekymringer angående cellepopulasjon, forhindrer dyrking av primære hippocampusceller i B27-supplerte nevronvekstmedier veksten av gliaceller, og kilden rapporterer at <5% av cellene er astrocytter, og fraværet av NbActiv1-tilskudd i vekstmediet reduserer antall astrocytter i kulturer til <2%87. For både dyrkede SH-SY5Y-celler og primære hippocampus-nevroner fra rotter bidrar PDL-belegget som brukes til vekst til bakgrunnståke i bilder. Tilstrekkelig signal-til-støy oppnås med innstillingene rapportert i (tabell 1), og dekonvolusjon fjerner det meste av bakgrunnen som er observert.

I tillegg til avbildningen som dekkes her, er det også mulig å legge til behandlinger eller stress på celler før eller under bildebehandling. For eksempel induserer tilsetning av tert-butylhydrogenperoksid (tBHP) oksidativt stress, og det er mulig å overvåke endringer i mitokondrier over tid etter tilsetning. Tilsetningen av amyloid-β (Aβ) med en fluorescerende tag tillater overvåking av fordelingen av dette peptidet i forhold til mitokondrier samt mitokondriestrukturen over tid. Mitokondriell helse har vært sterkt involvert i AD og er allment støttet for å spille en rolle i Aβ toksisitet 43,71,72. Spesielt påvirker differensieringsstatusen til SH-SY5Y-celler Aβ-proteinforløperen (AβPP) lokalisering85, og eksperimenter med AβPP bør konstrueres nøye.

Som et eksempel på hvordan denne protokollen kan tilpasses, er det vist at den fluorescerende varianten Aβ(1-42)-HiLyte 647 kan legges til PKMO-fargede celler 15 min før avbildning (tilleggsfigur 1). Bildeparametrene er like (tilleggstabell 2), med hovedforskjellen at et mindre knappenålshull er nødvendig ved avbildning av smalere mitokondrier. Imaging Aβ-HiLyte647 med STED krever mindre generell eksitasjon (6% -8%) og STED-deplesjon (10% -12%) laserkraft og færre akkumuleringer (seks). Detektorgating er også utvidet fra 0,1 til 10 ns. Selv om STED-oppløsning på Aβ ikke er nødvendig, var det totale signal-støy-forholdet og Aβ-partikkelstørrelsen til rå STED bedre enn de konfokale bildene, og etterfølgende dekonvolusjon kan også utføres. Innsamling av STED-bilder og dekonvolving av rå STED z-stack-projeksjoner av Aβ ser ut til å være spesielt nyttig ved sammenslåing med rå STED- eller deconvolved STED-bilder av PKMO-flekken (tilleggsfigur 1B,C). Begge kanalene ble samlet i et enkelt rammetrinn. Målinger av tidsavhengig lokalisering, tilsvarende de som er listet opp i figur 2 og vist i figur 5, der det er aktuelt, og forskjeller i cristae-arkitektur kan oppnås etter stressbehandling eller andre tillegg.

Andre mulige metoder for dobbeltmerking i levende celle STED av mitokondrier som ikke er rapportert her, men har blitt rapportert av andre, inkluderer bruk av SNAP-merkede proteiner93, Halo-merkede proteiner og bruk av andre cellepermeable fargestoffer med generiske mål, for eksempel mtDNA63. Spesielt påvirker merkingsstrategien for SNAP- og Halo-merking den resulterende fluorescenssignalintensiteten og levetiden ved avbildning94. I tillegg, mens denne protokollen presenterer flere eksempler på analyser som kan brukes på segmenterte mitokondrier, er det mange andre analyser som programvarepakker kan utføre på disse bildene.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Primære rotte hippocampus nevroner ble levert av Dr. George Lykotrafitis og Shiju Gu fra Biomedical Engineering Department ved University of Connecticut (Storrs, CT, USA). Abberior STED-instrumentet i Advanced Light Microscopy Facility i Center for Open Research Resources and Equipment ble anskaffet med NIH-stipend S10OD023618 tildelt Christopher O'Connell. Denne forskningen ble finansiert av NIH-stipend R01AG065879 tildelt Nathan N. Alder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
0.4% Trypan blue Invitrogen T10282
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red Gibco 15400054
100 X antibiotic-antimycotic Gibco 15240062
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens Olympus Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4
All-trans-retinoic acid Sigma R2625
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg) AnaSpec AS-64161 Other fluorescent conjugates available
B27 supplement (50 X), serum free Gibco 17504044
Cell Counter (Countess II FL) Life Technologies AMQAF1000
Centrifuge Eppendorf 5804-R
Counter slides Invitrogen C10283
Conical tubes (15 mL) Thermo Fisher Scientific 339650
Cuvettes (Quartz Cells) Starna Cells, Inc. 9-Q-10 Used with Spectrometer as described in Section 1.3
DMEM (high glucose with sodium pyruvate) Gibco 11995073 Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1
DMEM (high glucose no sodium pyruvate) Gibco 11965092 Used for primary cell materials as described in Section 2
DMEM (phenol red-free) Gibco 31053028 Used for imaging as described in Section 3
DMSO Sigma D8418
DNAase I from bovine pancreas Sigma DN25 Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2
DPBS (no calcium, no magnesium) Gibco 14190144
E18 Rat Hippocampus Transnetyx Tissue SDEHP
Ethanol (200 proof) Fisher Bioreagents BP28184
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated Gibco 26140079 For cultured cells, in Section 1
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco 10082147 For primary cell culture, Section 2
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 5660010
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in -- -- Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text
GlutaMAX supplement (100 X) Gibco 35050061 Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers Hausser Scientific 267110
HBSS (no calcium, no magnesium) Gibco 14170120 Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2
HEPES Gibco 15630080
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10) Scientific Volume Imaging (SVI) -- The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus Olympus -- This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4
Lightbox software (V. 16.3.16118) Abberior -- Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4
Live Orange Mito dye Abberior LVORANGE-0146-30NMOL Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion
Neurobasal media Gibco 21103049 Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass Nunc 155379 Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5
Pasteur Pipets (Fisherbrand) Thermo Fisher Scientific 22183632
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
PKmito Orange dye Spirochrome SC053
Poly-D-lysine Gibco A3890401
SH-SY5Y Cell line ATCC CRL2266
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 Used for primary cell materials described in Section 2
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis) Thermo Fisher Scientific 840309000
STED Expert Line microscope Abberior -- STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol
T25 flask (TC-treated, filter cap) Thermo Fisher Scientific 156367 Other culture vessels and sizes available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Iovine, J. C., Claypool, S. M., Alder, N. N. Mitochondrial compartmentalization: emerging themes in structure and function. Trends in Biochemical Sciences. 46 (11), 902-917 (2021).
  2. Gupta, A., Becker, T. Mechanisms and pathways of mitochondrial outer membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1862 (1), 148323 (2021).
  3. Gordaliza-Alaguero, I., Cantó, C., Zorzano, A. Metabolic implications of organelle-mitochondria communication. EMBO Reports. 20 (9), e47928 (2019).
  4. Klecker, T., Westermann, B. Pathways shaping the mitochondrial inner membrane. Open Biology. 11 (12), 210238 (2021).
  5. Navarro, A., Boveris, A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (2), C670-C686 (2007).
  6. Yu, R., Lendahl, U., Nistér, M., Zhao, J. Regulation of mammalian mitochondrial dynamics: opportunities and challenges. Frontiers in Endocrinology. 11, 374 (2020).
  7. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. The Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  8. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Frontiers in Physiology. 11, 541040 (2020).
  9. Bahat, A., et al. MTCH2-mediated mitochondrial fusion drives exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells. Nature Communications. 9 (1), 5132 (2018).
  10. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  11. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial fusion/fission dynamics in neurodegeneration and neuronal plasticity. Neurobiology of Disease. 90, 3-19 (2016).
  12. Zemirli, N., Morel, E., Molino, D. Mitochondrial dynamics in basal and stressful conditions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 564 (2018).
  13. Harwig, M. C., et al. Methods for imaging mammalian mitochondrial morphology: a prospective on mitograph. Analytical Biochemistry. 552, 81-99 (2018).
  14. Pánek, T., Eliáš, M., Vancová, M., Lukeš, J., Hashimi, H. Returning to the fold for lessons in mitochondrial crista diversity and evolution. Current Biology. 30 (10), R575-R588 (2020).
  15. Gottschalk, B., Madreiter-Sokolowski, C. T., Graier, W. F. Cristae junction as a fundamental switchboard for mitochondrial ion signaling and bioenergetics. Cell Calcium. 101, 102517 (2022).
  16. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  17. Frezza, C., et al. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126 (1), 177-189 (2006).
  18. Meeusen, S., et al. Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires the dynamin-related GTPase Mgm1. Cell. 127 (2), 383-395 (2006).
  19. Patten, D. A., et al. OPA1-dependent cristae modulation is essential for cellular adaptation to metabolic demand. The EMBO Journal. 33 (22), 2676-2691 (2014).
  20. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO Journal. 21 (3), 221-230 (2002).
  21. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  22. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of nonbilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  23. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of Cell Biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  24. Dlasková, A., et al. Mitochondrial cristae narrowing upon higher 2-oxoglutarate load. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1860 (8), 659-678 (2019).
  25. Pérez-Hernández, C. A., et al. Mitochondrial ultrastructure and activity are differentially regulated by glycolysis-, krebs cycle-, and microbiota-derived metabolites in monocytes. Biology. 11 (8), 1132 (2022).
  26. Mannella, C. A. Structural diversity of mitochondria: functional implications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1147, 171-179 (2008).
  27. Plecitá-Hlavatá, L., Ježek, P. Integration of superoxide formation and cristae morphology for mitochondrial redox signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 31-50 (2016).
  28. Scorrano, L., et al. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Developmental Cell. 2 (1), 55-67 (2002).
  29. Heath-Engel, H. M., Shore, G. C. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 549-560 (2006).
  30. Brandt, T., et al. Changes of mitochondrial ultrastructure and function during ageing in mice and Drosophilia. eLife. 6, e24662 (2017).
  31. Kondadi, A. K., et al. Cristae undergo continuous cycles of membrane remodelling in a MICOS-dependent manner. EMBO Reports. 21, e49776 (2020).
  32. Quintana-Cabrera, R., Mehrotra, A., Rigoni, G., Soriano, M. E. Who and how in the regulation of mitochondrial cristae shape and function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 94-101 (2018).
  33. Nielsen, J., et al. Plasticity in mitochondrial cristae density allows metabolic capacity modulation in human skeletal muscle: Enlarged mitochondrial cristae density in athletes. The Journal of Physiology. 595 (9), 2839-2847 (2017).
  34. Afzal, N., Lederer, W. J., Jafri, M. S., Mannella, C. A. Effect of crista morphology on mitochondrial ATP output: A computational study. Current Research in Physiology. 4, 163-176 (2021).
  35. Heine, K. B., Parry, H. A., Hood, W. R. How does density of the inner mitochondrial membrane influence mitochondrial performance. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (2), R242-R248 (2023).
  36. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  37. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24, 1583 (2019).
  38. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  39. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  40. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
  41. Petersen, C. A. H., et al. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (35), 13145-13150 (2008).
  42. Gan, X., et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease cybrid cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1842 (2), 220-231 (2014).
  43. Baloyannis, S. J., Costa, V., Michmizos, D. Mitochondrial alterations Alzheimer's disease. American Journal of Alzheimer's Disease & Other Dementias. 19 (2), 89-93 (2004).
  44. Tillement, L., Lecanu, L., Papadopoulos, V. Alzheimer's disease: Effects of β-amyloid on mitochondria. Mitochondrion. 11 (1), 13-21 (2011).
  45. Choi, S. Y., et al. C9ORF72-ALS/FTD-associated poly(GR) binds Atp5a1 and compromises mitochondrial function in vivo. Nature Neuroscience. 22 (6), 851-862 (2019).
  46. Smith, E. F., Shaw, P. J., De Vos, K. J. The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 710, 132933 (2019).
  47. Costa, V., et al. Mitochondrial fission and cristae disruption increase the response of cell models of Huntington's disease to apoptotic stimuli. EMBO Molecular Medicine. 2 (12), 490-503 (2010).
  48. Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington's disease: Mitochondrial and Huntington's disease. The EMBO Journal. 31 (8), 1853-1864 (2012).
  49. Vanisova, M., et al. Mitochondrial organization and structure are compromised in fibroblasts from patients with Huntington's disease. Ultrastructural Pathology. 46 (5), 462-475 (2022).
  50. de Barcelos, I. P., Troxell, R. M., Graves, J. S. Mitochondrial dysfunction and multiple sclerosis. Biology. 8 (2), 37 (2019).
  51. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441, 1157-1161 (2006).
  52. Meng, H., et al. Loss of Parkinson's disease-associated protein CHCHD2 affects mitochondrial crista structure and destabilizes cytochrome c. Nature Communications. 8, 15500 (2017).
  53. Lu, L., et al. CHCHD2 maintains mitochondrial contact site and cristae organizing system stability and protects against mitochondrial dysfunction in an experimental model of Parkinson's disease. Chinese Medical Journal. 135 (13), 1588-1596 (2022).
  54. Cogliati, S., et al. Mitochondrial Cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  55. He, B., et al. Mitochondrial cristae architecture protects against mtDNA release and inflammation. Cell Reports. 41 (10), 111774 (2022).
  56. Polo, C. C., et al. Three-dimensional imaging of mitochondrial cristae complexity using cryo-soft X-ray tomography. Scientific Reports. 10, 21045 (2020).
  57. Rybka, V., et al. Transmission electron microscopy study of mitochondria in aging brain synapses. Antioxidants. 8 (6), 171 (2019).
  58. Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 542-548 (2006).
  59. Fry, M. Y., et al. In situ architecture of Opa1-dependent mitochondrial cristae remodeling. biorxiv. , (2023).
  60. Barad, B. A., Medina, M., Fuentes, D., Wiseman, R. L., Grotjahn, D. A. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. The Journal of Cell Biology. 222 (4), 202204093 (2023).
  61. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617 (2020).
  62. Yang, Z., et al. Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science. 11 (32), 8506-8516 (2020).
  63. Liu, T., et al. Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (52), e2215799119 (2022).
  64. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11, 3699 (2020).
  65. Zheng, S., et al. Long-term, super-resolution HIDE imaging of the inner mitochondrial membrane in live cells with a cell-permeant lipid probe. biorxiv. , (2022).
  66. Wang, C., et al. A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15817-15822 (2019).
  67. Feles, S., et al. Streamlining culture conditions for the neuroblastoma cell line sh-sy5y: a prerequisite for functional studies. Methods and Protocols. 5 (4), 58 (2022).
  68. Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Journal of Visualized Experiments. (108), e53193 (2016).
  69. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Neuronal Cell Culture. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 9-21 (2013).
  70. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  71. Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
  72. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
  73. Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction in aging and alzheimer's disease: strategies to protect neurons. Antioxidants & Redox Signaling. 9 (10), 1647-1658 (2007).
  74. Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
  75. Korecka, J. A., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS ONE. 8 (5), e63862 (2013).
  76. Baghel, M. S., Thakur, M. K. Vdac1 downregulation causes mitochondrial disintegration leading to hippocampal neurodegeneration in scopolamine-induced amnesic mice. Molecular Neurobiology. 56 (3), 1707-1718 (2019).
  77. Jiang, S., et al. Mfn2 ablation causes an oxidative stress response and eventual neuronal death in the hippocampus and cortex. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 5 (2018).
  78. Mu, Y., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 6, 85 (2011).
  79. Rao, Y. L., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer's disease: a review. 3 Biotech. 12 (2), 55 (2022).
  80. Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., Ang, M. J., Kang, S., Kim, J. -S., Moon, C. Structural Plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3349 (2022).
  81. Retinoic acid = 98 HPLC, powder 302-79-4. SigmaAldrich. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/ (2023).
  82. Poly-D-Lysine. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401 (2023).
  83. Dravid, A., Raos, B., Svirskis, D., O'Carroll, S. J. Optimised techniques for high-throughput screening of differentiated SH-SY5Y cells and application for neurite outgrowth assays. Scientific Reports. 11, 23935 (2021).
  84. Hromadkova, L., et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes molecular polarization and differentiation of immature neuroblastoma cells into definitive neurons. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (9), 118737 (2020).
  85. Riegerová, P., et al. Expression and Localization of AβPP in SH-SY5Y cells depends on differentiation state. Journal of Alzheimer's Disease. 82 (2), 485-491 (2021).
  86. Hoffmann, L. F., et al. Neural regeneration research model to be explored: SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neural Regeneration Research. 18 (6), 1265-1266 (2022).
  87. Abiraman, K., Tzingounis, A. V., Lykotrafitis, G. K. Ca 2 channel localization and regulation in the axon initial segment. The FASEB Journal. 32 (4), 1794-1805 (2018).
  88. E18 Rat Hippocampus. Transnetyx Tissue. , Available from: https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4 (2023).
  89. Kmito ORANGE - Probe for live cell imaging of mitochondria. Spirochrome. , Available from: https://spirochrome.com/product/pkmito_orange/ (2023).
  90. Nyquist Calculator. Scientific Volume Imaging. , Available from: https://svi.nl/Nyquist-Calculator (2023).
  91. Segawa, M., et al. Quantification of cristae architecture reveals time-dependent characteristics of individual mitochondria. Life Science Alliance. 3 (7), e2019000620 (2020).
  92. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  93. Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D., Jakobs, S. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae. Scientific Reports. 9, 12419 (2019).
  94. Erdmann, R. S., et al. Labeling strategies matter for super-resolution microscopy: A comparison between HaloTags and SNAP-tags. Cell Chemical Biology. 26 (4), 584-592 (2019).

Tags

Live Cell STED Imaging Mitokondriell indre membran Ultrastruktur Neuronale cellemodeller Mitokondrier Energiproduksjon Ca2+ Homeostase Lipidbiosyntese Reaktive oksygenarter (ROS) Nevroner Aerob metabolisme Ca2+ Signalering Aksonvekst Og Regenerering ROS-produksjon Neurodegenerative sykdommer Mitokondriell dysfunksjon Indre membranstruktur Cristae Molekylære systemer Diffraksjonsbegrenset Løst mikroskopi Elektronmikroskopi Superoppløsning Fluorescensmikroskopi
Bruke levende celle STED-avbildning for å visualisere mitokondriell indre membran ultrastruktur i nevrale cellemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ng, E. L., Reed, A. L.,… More

Ng, E. L., Reed, A. L., O’Connell, C. B., Alder, N. N. Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models. J. Vis. Exp. (196), e65561, doi:10.3791/65561 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter