Summary
Le cellule mononucleate isolate del sangue periferico possono essere utilizzate per l'analisi delle funzioni e dei disturbi immunitari, delle malattie metaboliche o delle funzioni mitocondriali. In questo lavoro, descriviamo un metodo standardizzato per la preparazione di PBMC da sangue intero e la successiva crioconservazione. La crioconservazione rende questo tempo e questo luogo indipendenti.
Abstract
Le funzioni fisiologiche delle cellule eucariotiche si basano sull'energia fornita principalmente dai mitocondri. La disfunzione mitocondriale è legata alle malattie metaboliche e all'invecchiamento. La fosforilazione ossidativa gioca un ruolo decisivo, in quanto è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi energetica. Le PBMC sono state identificate come un campione minimamente invasivo per misurare la funzione mitocondriale e hanno dimostrato di riflettere le condizioni della malattia. Tuttavia, la misurazione della funzione bioenergetica mitocondriale può essere limitata da diversi fattori nei campioni umani. I limiti sono la quantità di campioni prelevati, il tempo di campionamento, che spesso è distribuito su più giorni, e le posizioni. La crioconservazione dei campioni raccolti può garantire una raccolta e una misurazione coerenti dei campioni. È necessario prestare attenzione per garantire che i parametri misurati siano comparabili tra le cellule crioconservate e quelle appena preparate. Qui, descriviamo i metodi per isolare e crioconservare le PBMC da campioni di sangue umano per analizzare la funzione bioenergetica dei mitocondri in queste cellule. Le PBMC crioconservate secondo il protocollo qui descritto mostrano solo lievi differenze nel numero di cellule e nella vitalità, nei livelli di adenosina trifosfato e nell'attività della catena respiratoria misurata rispetto alle cellule appena raccolte. Per i preparati descritti sono necessari solo 8-24 ml di sangue umano, il che consente di raccogliere campioni durante gli studi clinici in modo multicentralizzato e di determinarne la bioenergetica in loco.
Introduction
Le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono utilizzate per varie applicazioni in molti campi scientifici, tra cui lo studio di problematiche immunologiche e bioenergetiche, come quelle legate ai processi di invecchiamento o alle malattie degenerative 1,2. Le PBMC hanno una composizione eterogenea e sono costituite da linfociti (cellule B, cellule T e cellule NK), monociti e cellule dendritiche. Le cellule a volte mostrano grandi differenze e variazioni individuali all'interno di un soggetto, quindi sono necessarie procedure standardizzate per la gestione di queste cellule. Parametri importanti come la vitalità e la purezza dell'isolamento sono i requisiti di base per la sua manipolazione e sono inoltre influenzati da fattori ambientali come l'ora di raccolta, il livello di melatonina, se il soggetto è a digiuno e altri 3,4.
Sulla base di studi sulla bioenergetica delle PBMC, descriviamo qui un metodo per l'isolamento, la crioconservazione e la coltivazione delle PBMC che è adatto anche ad altri metodi. Mentre la biopsia muscolare è considerata il gold standard per il metabolismo energetico mitocondriale5, l'esame delle cellule del sangue è una procedura rapida e minimamente invasiva. Oltre a questo, sempre più studi suggeriscono che i cambiamenti nella funzione mitocondriale nell'invecchiamento e nella malattia di Alzheimer (AD) si verificano non solo nel cervello ma anche nella periferia 6,7,8,9,10. Il metodo consente anche di indagare altre condizioni e malattie, tra cui il diabete mellito e l'obesità 11,12,13. Possono essere analizzati i modelli di espressione genica nei pazienti affetti da sclerosi multipla, o la funzione immunitaria e le influenze su di essa in generale 14,15,16.
Le PBMC si basano generalmente sulla fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per generare adenosina trifosfato (ATP)17,18. Pertanto, le PBMC coprono un'ampia gamma di applicazioni come surrogati. In precedenti rapporti, il metabolismo energetico delle PBMC è stato utilizzato per affrontare le disfunzioni d'organo, come nell'insufficienza cardiaca precoce19, nello shock settico20 o nelle differenze associate al sesso4 nella funzione mitocondriale. Un metodo generalizzato per la crioconservazione, l'isolamento e la coltivazione di PBMC avrebbe vantaggi nella comparabilità dei risultati ottenuti in diversi istituti. C'è una grande variazione nei protocolli per ogni fase21,22, l'obiettivo di questo metodo è quello di fornire una linea guida per le misurazioni bioenergetiche nelle PBMC.
In questo articolo descriviamo un metodo per misurare i parametri bioenergetici nelle PBMC. Spieghiamo i metodi per isolare, crioconservare e misurare la bioenergetica delle PBMC dal sangue umano. Questo metodo può essere utilizzato per determinare i parametri bioenergetici nei pazienti e valutarli in un contesto clinico. Per applicare queste misurazioni, i ricercatori hanno bisogno di accedere a una popolazione di pazienti da cui è possibile ottenere campioni di sangue fresco.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i protocolli descritti in questo manoscritto per la raccolta, l'isolamento e l'analisi del sangue sono stati esaminati e approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Giessen, in Germania. È stato ottenuto il consenso dei pazienti per includere i loro campioni nello studio. Tutte le fasi per l'isolamento e la coltura cellulare vengono eseguite in una cabina di sicurezza biologica.
1. Puntura venosa
- Preparare tutta l'attrezzatura necessaria per la raccolta del sangue, tra cui spray disinfettante, tampone sterile, cannula per la raccolta del sangue con tubo da 80 mm e adattatore multiplo, laccio emostatico/bracciale per la pressione sanguigna, Monovette 9 mL di litio-eparina.
NOTA: Anche l'EDTA come anticoagulante è efficace. - Prelevare il sangue dalla vena del braccio più appropriata, di solito la vena mediana cubiti o la vena cefalica.
- Applicare un laccio emostatico/bracciale per la pressione sanguigna con una leggera pressione, intorno a 80 mm/Hg.
- Disinfettare i guanti e il sito di puntura con uno spray disinfettante contenente alcol. Lasciare asciugare all'aria il sito di puntura disinfettato.
- Le vene sporgono a causa della pressione del bracciale di pressione. Inserire l'ago (diametro della cannula (esterna) 21G / 0,8 mm, lunghezza 19 mm) con un angolo di 15°-20° della vena, cercando di evitare traumi e riducendo al minimo il sondaggio.
- Prelevare il sangue con un sistema appropriato, 4 provette contenenti 9 mL di sangue (più di 7-8 provette sono problematiche da isolare correttamente per uno sperimentatore).
- Dopo il prelievo di sangue, posizionare le provette di raccolta al buio per 5 minuti per garantire un'anticoagulazione uniforme.
2. Isolamento PBMC
- Preparare tutte le soluzioni necessarie come descritto di seguito.
- Portare la soluzione salina bilanciata di Dulbecco (DPBS; concentrazione 1x) e il terreno di isolamento linfocitario (1,077 g/mL) a temperatura ambiente (20-25 °C).
- Preparare il siero fetale bovino (FBS) a temperatura ambiente e conservare una provetta conica sterile da 50 ml con FBS su ghiaccio. Per ogni campione di sangue sono necessari 2 mL di FBS.
- Conservare il contenitore di congelamento a 4 °C e preraffreddare i criotubi a 4 °C.
- Terreno di coltura cellulare caldo a 37 °C, il terreno è costituito da RPMI 1640 con 50 mL di FBS e penicillina 50 U/mL streptomicina 50 U/mL. Questa soluzione può essere conservata a 3 °C per un massimo di 2 mesi.
- Aggiungere 8 mL di DPBS in provette coniche sterili da 50 mL. Aggiungere 15 mL di terreno di isolamento linfocitario in una provetta conica sterile da 50 mL (il terreno è sensibile alla luce, aggiungerlo prima di iniziare l'isolamento).
- Aggiungere 8 mL di sangue a 8 mL di DPBS e miscelare con cura con una pipetta Pasteur in plastica da 3 mL.
- Stratificare delicatamente la miscela sangue/DPBS con una pipetta Pasteur in plastica da 3 mL sopra il terreno di isolamento dei linfociti. Per applicare il primo strato sul terreno, inclinare il tubo di 20°-30°, il che si tradurrà in una minore penetrazione della miscela sangue-PBS nello strato del mezzo.
- Stratificare con cura la miscela sangue-PBS sulla parete laterale della provetta sul terreno di isolamento dei linfociti. Usa una velocità costante per mantenere costante il flusso sanguigno.
- Nella fase successiva, portare lentamente il tubo in posizione verticale, il sangue rimanente viene accuratamente stratificato sulla parete laterale del tubo sullo strato sanguigno.
- Centrifugare per 10 minuti a 1000 x g a temperatura ambiente in una centrifuga con rotore a secchiello oscillante con freni disattivati. Dopo la centrifugazione, la miscela sangue/PBMC viene separata in quattro strati. Lo strato superiore è costituito da plasma e piastrine, il secondo strato è lo strato PBMC, seguito da uno strato medio di isolamento linfocitario e, infine, eritrociti e granulociti nello strato inferiore. I diversi livelli sono mostrati nella Figura 1.
- Rimuovere 2/3 dello strato di plasma con una pipetta Pasteur in plastica.
- Utilizzando una pipetta da 1 ml, raccogliere le PBMC sullo strato di terreno di isolamento dei linfociti facendo attenzione a non far entrare alcun terreno nel campione.
- Posizionare la punta 1 mm sopra lo strato PBMC. Lo strato PBMC non deve essere perforato, altrimenti il mezzo scorrerà sulle cellule. L'aspirazione della pipetta tira i PBMC fino a questo punto in modo che possano essere raccolti più volte in questo punto.
NOTA: Per massimizzare il numero di PBMC raccolte, alla fine della procedura cercare il resto sulla superficie e cercare di raccogliere le cellule anche lì. Per stabilizzare la procedura, il tubo può essere posizionato su una superficie. - Trasferire le PBMC passo dopo passo in una nuova provetta da 50 ml fino a quando lo strato non è completamente raccolto. Aggiungere DPBS fino a 25 mL, lavare via il terreno di isolamento dei linfociti e altri residui.
- Centrifugare per 10 minuti a 100 x g a temperatura ambiente con i freni tirati. Rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto o simile, facendo attenzione a non danneggiare il pellet cellulare.
- Risospendere il pellet in 1 mL di DPBS e aggiungere DPBS al segno di 25 mL. Ripetere il lavaggio ancora una volta e poi risospendere in un mezzo appropriato per i passaggi successivi.
Figura 1: Rappresentazione schematica di una centrifugazione a gradiente di densità per illustrare i diversi strati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Crioconservazione
- Raffreddare un contenitore per congelare a 4 °C, raffreddare FBS su ghiaccio.
- Risospendere il pellet PBMC in 1 mL di FBS con una pipetta da 1 mL, l'FBS deve essere a temperatura ambiente.
- Miscelare il DMSO con l'FBS preraffreddato su ghiaccio 1:5, concentrazione finale 20% DMSO, quindi rimettere la miscela FBS: DMSO sul ghiaccio. Preparare sempre la soluzione fresca.
- Trasferire la sospensione cellulare PBMC in FBS in criotubi da 2 mL ben etichettati. Utilizzare un criotubo per provetta di raccolta. Regolare il numero di cellule tra 1 x 107 e 5 x 107 per ml. Utilizza un contatore di cellule automatizzato per determinare il numero di cellule e la vitalità.
- Aggiungere 1 mL di miscela FBS: DMSO goccia a goccia con una pipetta da 1 mL, circa 1-2 gocce per s, nella provetta. L'aggiunta goccia a goccia porta a una miscelazione continua e coerente.
- Mettere le provette nel contenitore di congelamento preraffreddato. Mettere il contenitore di congelamento in un congelatore a -80 °C per 24 ore. Il contenitore di congelamento fornisce un raffreddamento controllato di -1 °C al minuto.
- Rimuovere i tubi dal congelatore a -80 °C. Dopo la rimozione dal congelatore, conservare le provette in fase gassosa di azoto liquido. Documentare la posizione di ogni campione.
4. Scongelamento
- Preparare tutte le soluzioni necessarie: terreno di coltura cellulare RPMI 1640 con 50 mL di FBS e penicillina 50 U/mL, streptomicina 50 U/mL. Questa soluzione può essere conservata a 3°C per un massimo di 2 mesi.
- Preriscaldare il terreno di coltura cellulare a 37 °C. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato in provette coniche sterili da 50 mL.
- Rimuovere il campione dal serbatoio dell'azoto liquido. Scongelare i campioni a bagnomaria a 37 °C per circa 3,5 minuti, quindi rimuoverli dal bagnomaria non appena l'ultimo ghiaccio si scioglie. Un pezzo di ghiaccio delle dimensioni di una capocchia di spillo dovrebbe essere ancora visibile nel tubo.
NOTA: Il DMSO è dannoso per il funzionamento dei PBMC il più rapidamente possibile. - Rimuovere la miscela cell:FBS:DMSO con una pipetta da 1 mL dal criotubo. Miscelare i campioni PBMC con il terreno di coltura cellulare nelle provette da 50 mL preparate. Lavare le provette con 5 mL di terreno di coltura in tre fasi da 2 mL, 2 mL e 1 mL.
- Trasferire il mezzo nelle provette. Questo viene eseguito per trasferire eventuali residui cellulari. Centrifugare per 10 min a 100 x g a temperatura ambiente.
- Scartare il surnatante e aggiungere 1 mL di terreno appropriato per l'uso previsto. Le cellule sono pronte per i successivi esperimenti.
NOTA: Tuttavia, con i test funzionali su cellule fresche o congelate, un periodo di riposo in un'incubatrice (in genere durante la notte) è spesso raccomandato dopo l'isolamento basato sul terreno di isolamento dei linfociti o lo scongelamento cellulare.
5. Colture cellulari
- Dopo l'isolamento o lo scongelamento delle cellule di coltura per una notte a 37 °C in aria al 5% di CO2/95%.
- Risospendere le cellule in 1 mL di terreno RPMI integrato con FBS al 10%, penicilina 50 U/mL, streptomicina 50 U/mL. Per un ulteriore utilizzo ci sono molte possibilità, trattare le cellule secondo necessità per i saggi.
- Per la conservazione generale, utilizzare piastre sterili per colture cellulari a 6 pozzetti e raccogliere cellule dopo il periodo di riposo. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare con una pipetta da 1 mL in un pozzetto e aggiungere 4 mL di terreno di coltura cellulare.
NOTA: La quantità di PBMC isolate varia notevolmente da individuo a individuo, un pozzetto con 5 mL di terreno di coltura cellulare è sufficiente per ogni 8 mL di sangue isolato. Tuttavia, quando si isolano le PBMC dai buffy coat, la quantità di PBMC è significativamente superiore rispetto ai campioni di sangue intero e le cellule devono quindi essere suddivise in diversi pozzetti. - Lasciare riposare le cellule 24 ore in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C. Questa incubazione viene eseguita sia per le cellule appena isolate che per le cellule crioconservate.
6. Dosaggio dell'ATP
- Risospendere le PBMC scongelate in 1 mL di terreno RPMI integrato con FBS al 10%, penicillina 50 U/mL, streptomicina 50 U/mL.
- Prelevare un campione e determinare il numero di cellule, quindi eseguire una discriminazione tra vivi e morti con il blu di tripano. Prelevare 10 μL dalle cellule risospese e miscelare con terreno di coltura cellulare da 90 μL. Quindi prelevare 10 μL e mescolare con 10 μL di blu di tripano. Posizionare le cellule in una camera di conteggio delle cellule o in un contatore automatico di cellule e determinare il numero di cellule vive/morte.
- Piastra 100 μL di cellule a una densità di 1 x 105 cellule/100 μL per pozzetto in una piastra di polistirene bianco a 96 pozzetti.
- Lasciare riposare le cellule per 24 ore in atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C.
- Determinare le concentrazioni di ATP con un test ATP.
- Utilizzare l'emissione di luce che si verifica quando l'ATP è combinato con la luciferina. La luce emessa può essere valutata con un lettore di targhe. Rimuovere le piastre per far raffreddare l'incubatrice a temperatura ambiente per 15 minuti. Lisare le cellule e lasciarle agire per 5 minuti. Quindi applicare il reagente di monitoraggio alle cellule e misurare secondo le istruzioni del produttore. Uno standard interno viene utilizzato per determinare il livello di ATP.
7. Respirometria ad alta risoluzione
- Accendere l'ossigrafo ad alta risoluzione e lasciarlo riscaldare per 30 minuti.
- Trattare le cellule secondo un protocollo descritto nella Figura 1. Preparare tutte le scorte necessarie come indicato nella tabella 1.
- Pipettare 2,1 mL di tampone respiratorio (Tabella 1) in entrambe le camere ossigrafiche ad alta risoluzione e agitare continuamente il tampone utilizzando una barra di agitazione magnetica presente nelle camere (750 giri/min) a 37 °C per 30 minuti fino a ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile del sensore di ossigeno polarografico.
NOTA: Nelle camere dell'ossigrafo, il consumo di ossigeno in tempo reale (flusso) e la saturazione di ossigeno della camera vengono misurati con l'ausilio di elettrodi polarografici di ossigeno. La calibrazione di fondo deve essere eseguita per evitare il rumore di fondo e per garantire risultati affidabili. - Eseguire una calibrazione dell'aria del sensore polarografico di ossigeno secondo i protocolli del produttore23.
- Risospendere le PBMC isolate in 1 mL di mezzo respiratorio mitocondriale (MIR05 la composizione è mostrata nella Tabella 1) e diluire a 8 x 106 cellule/mL.
- Dopo la calibrazione dell'aria, aspirare il mezzo respiratorio dalla camera dell'ossigrafo e aggiungere 2,1 mL di sospensione cellulare in ciascuna campanatura del respirometro. Se necessario, durante la misurazione, riossigenare le camere (vedere Aprire al punto h nella Figura 2), la saturazione di ossigeno delle camere non deve scendere al di sotto di 100 μM.
- Chiudere le camere inserendo i tappi, le camere sono progettate per contenere un volume di 2,0 mL. Aspirare la sospensione cellulare emergente.
- Miscelare continuamente la sospensione cellulare a 37 °C con un agitatore magnetico (750 giri/min) situato nella camera. Attendere circa 20 minuti fino a ottenere un segnale stabile. Determinare la respirazione endogena ((a) nella Figura 2).
- Per determinare le diverse attività complesse della catena respiratoria, iniettare i substrati e gli inibitori per la respirazione mitocondriale attraverso le porte di iniezione in titanio dei tappi. Utilizzare la seguente concentrazione finale nella camera.
- Per rompere le membrane cellulari, aggiungere 5 μL di digitonina da 8,1 mM, attraverso la porta di iniezione in titanio del tappo della camera, per rimuovere i substrati naïve (b) nella Figura 2 mentre le membrane mitocondriali rimangono intatte.
- Aggiungere substrati di glutammato 2 M e malato 800 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti.
NOTA: È anche possibile utilizzare substrati aggiuntivi come il piruvato. - Aggiungere 8 μL di adenosina difosfato (ADP) 500 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (d) nella Figura 2.
- Aggiungere 20 μL di succinato 1 M attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (e) nella Figura 2.
- Titolare 1 M cianuro di carbonile p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP) gradualmente a 0,5 μL fino al punto in cui non si verifica alcun ulteriore aumento. Attendere 2-4 minuti fino a quando il segnale si stabilizza (f) nella Figura 2. Quando non c'è un ulteriore aumento della respirazione, continuare con il passaggio successivo.
ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia FCCP in quanto presenta rischi per la salute umana. - Aggiungere 5 μL di rotenone 0,1 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (g) nella Figura 2.
ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia il rotenone in quanto presenta rischi per la salute umana. - Aggiungere 1 μL di oligomicina 4 mg/mL attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (h) nella Figura 2.
ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia l'oligomicina in quanto è un veleno che comporta rischi per la salute umana. - Aggiungere 1 μL di antimicina A 5 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a quando non viene raggiunto un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (i) nella Figura 2.
ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia l'antimicina A in quanto è un veleno che comporta rischi per la salute umana. - Quando si valuta la corsa per escludere il consumo di ossigeno degli enzimi non coinvolti nella fosforilazione ossidativa, sottrarre i valori di antimicina A da tutti gli altri valori misurati.
- Aggiungere 200 mM DI N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiammina dicloridrato (TMPD; donatore di elettroni) e 800 mM di ascorbato per mantenere il TMPD in uno stato ridotto. Iniettare i substrati attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a quando non viene raggiunto un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti (j) nella Figura 2.
- Il TMPD è soggetto ad autoossidazione, quindi sottrarre il consumo di ossigeno risultante dal valore misurato al Complesso IV.
- Aggiungere NaN3 ≥ 100 mM attraverso la porta di iniezione del tappo della camera e registrare la respirazione fino a ottenere un segnale stabile. Il segnale si stabilizza dopo 2-4 minuti per inibire l'attività del complesso IV, rimane solo l'autoossidazione TMPD.
ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggia l'azide di sodio in quanto è un veleno che comporta rischi per la salute umana.
Figura 2: Andamento schematico del flusso di O2 . Viene mostrato l'andamento schematico del flusso di ossigeno. La curva è suddivisa nelle diverse fasi dopo l'aggiunta di inibitori e substrati da a-k. a: respirazione endogena; b: cellule permeabilizzate; c: respirazione disaccoppiata del complesso I; d: respirazione accoppiata al complesso I; e: OXPHOS ; f: massima attività disaccoppiata di CI e CII; g: respirazione disaccoppiata del complesso II; h: perdita di respirazione; i: respirazione residua; j: CIV(U) respirazione disaccoppiata e autoossidazione di TMPD; k: autoossidazione di TMPD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
8. Attività della citrato sintasi
- Misurare l'attività della citrato sintasi come parametro separato e utilizzarla per normalizzare le misurazioni dell'ossigrafo ad alta risoluzione.
- Risospendere la PBMC isolata in 1 mL di terreno di respirazione mitocondriale (MIR05) e diluire a 8 x 106 cellule/mL.
- Congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C fino a quando non vengono condotti esperimenti o per misurare cellule fresche.
- Preparare tutte le soluzioni necessarie: tampone HCl trietanolammina 0,1 M pH 8,0, tampone Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, Tritone X-100 al 10%, ossalato 10 mM in tampone HCl trietanolammina 0,1 M pH 8,0, DTNB 1,01 mM in tampone Tris-HCl 1,0 M pH = 8,1, Acetil CoA 12,2 mM in H2O bidistillato.
- Preparare il terreno di reazione (tabella 1) contenente 5,5'-ditio-bis-(acido 2-nitrobezoico) (DTNB; 0,1 mM), acetil coenzima A (0,31 mM), EDTA (50 μM), trietanolammina HCl (5 mM) e Tris HCl (0,1 M).
- Preparare il reagente di partenza (Tabella 1) con ossalacetato 0,5 mM disciolto in H2O bidistillato.
- Scongelare i campioni sul ghiaccio poiché la citrato sintasi è instabile se scongelata troppo rapidamente.
- Aggiungere 40 μL dei campioni a una piastra da 96 pozzetti su ghiaccio prima di aggiungere 110 μL di mezzo di reazione con una multipipetta.
- Terreno di reazione caldo e campione in un incubatore a 30 °C per 5 minuti. Reagente di avviamento a caldo a bagnomaria a 30 °C per 5 min.
- Aggiungere 50 μL del reagente di partenza con una multipipetta a ciascun pozzetto. Misurare l'assorbanza a 30 °C a una lunghezza d'onda di 412 nm per 20 minuti tramite lettore di piastre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vitalità e numero di cellule
Per ottenere il successo dell'isolamento e della crioconservazione, il numero di cellule e la vitalità devono essere i più alti possibile. Prima e dopo la crioconservazione, le cellule vengono contate e la loro vitalità viene determinata per garantire la salute e la qualità delle cellule. La Figura 3 è un'illustrazione rappresentativa delle PBMC prima e dopo la crioconservazione, la conta cellulare e la vitalità non differiscono molto. Ciò indica che l'isolamento e la conservazione delle PBMC sono riusciti.
Figura 3: Effetto della crioconservazione sul numero di cellule e sulla vitalità. I gruppi di test sono divisi nel gruppo di controllo con PBMC appena isolati e PBMC dopo 1 mese di crioconservazione. Il conteggio delle cellule e la determinazione della loro vitalità sono stati effettuati con un contatore di cellule automatizzato. Il blu di trypan è stato utilizzato per determinare la vitalità. Ogni misurazione è stata effettuata come una triplice copia del valore medio è stata calcolata dai risultati delle singole misurazioni. (A) Determinazione della vitalità cellulare delle PBMC dopo un nuovo isolamento e dopo 1 mese di crioconservazione. I valori sono espressi come media ± SEM. Le significanze sono state determinate con un test t accoppiato. (B) Determinazione del numero di cellule delle PBMC dopo un nuovo isolamento e dopo 1 mese di crioconservazione. I valori sono indicati come medie ± SEM. Le significanze sono state determinate con un test t accoppiato. La stessa forma e lo stesso colore mostrano lo stesso campione prima e dopo un mese di crioconservazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'ATP rappresenta la principale fonte di energia per le cellule eucariotiche. L'ATP viene determinato tramite un sistema di dosaggio della luminescenza. Se la crioconservazione ha successo, l'ATP tra le cellule appena isolate e le cellule crioconservate non dovrebbe differire. La Figura 4 è un'illustrazione rappresentativa delle PBMC prima e dopo la crioconservazione; I livelli di ATP sono simili. Ciò indica che l'isolamento e la conservazione delle PBMC sono riusciti.
Figura 4: Confronto della concentrazione di ATP di diversi periodi di crioconservazione. Concentrazione di ATP (μM / 100.000 cellule) nelle PBMC. I gruppi di test sono divisi nel gruppo di controllo con PBMC appena isolati e PBMC dopo 1 mese di crioconservazione. I campioni sono stati raccolti contemporaneamente e poi crioconservati o misurati dopo l'isolamento. È stato eseguito un test t accoppiato per testare le differenze significative; Il risultato ha mostrato che le differenze non erano significative. I valori sono indicati come valori medi ± SEM (N = 13). La stessa forma e lo stesso colore mostrano lo stesso campione prima e dopo un mese di crioconservazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La citrato sintasi (CS) è un enzima chiave del ciclo del citrato, situato nei mitocondri. Pertanto, l'attività CS rappresenta un robusto marcatore per la massa mitocondriale. L'attività di CS è determinata sulla base della conversione da DTNB a TNB. La Figura 5 mostra che prima e dopo la crioconservazione, i valori di CS non differiscono nelle PBMC. Ancora una volta, questo indica un riuscito isolamento e conservazione delle PBMC.
Figura 5: Effetto della crioconservazione sull'attività della citrato sintasi. Attività della citrato sintasi nelle PBMC dopo 1 mese di crioconservazione rispetto al controllo appena misurato. I campioni sono stati raccolti contemporaneamente e poi crioconservati o misurati dopo l'isolamento. I valori sono espressi come media ± SEM (N = 8). Le significanze sono state determinate con un test t accoppiato. La stessa forma e lo stesso colore mostrano lo stesso campione prima e dopo un mese di crioconservazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I profili bioenergetici delle PBMC possono essere determinati utilizzando sensori di ossigeno polarografici, ad esempio in ossigrafo ad alta risoluzione. Il consumo di ossigeno cellulare viene misurato in un sistema a camera chiusa con risoluzione e sensibilità molto elevate in campioni biologici, ad esempio cellule, tessuti intatti e permeabilizzati o mitocondri isolati. Il dispositivo ossigrafo ad alta risoluzione è dotato di due camere e utilizza sensori di ossigeno polarografici per misurare la concentrazione di ossigeno e calcolare il consumo di ossigeno all'interno di ciascuna camera. I tassi di consumo di ossigeno sono calcolati utilizzando un software ed espressi come picomoli per s per numero di cellule24. All'interno di ogni camera ossigrafica, gli elettrodi di ossigeno polarografici misurano la concentrazione di ossigeno e calcolano il consumo di ossigeno (flusso) all'interno di ciascuna camera. Il consumo e la concentrazione di ossigeno nella camera vengono visualizzati in tempo reale (Figura 6). Con l'aggiunta di inibitori e substrati specifici, i singoli complessi della catena respiratoria vengono presi di mira per misurarne l'attività. Dopo il test, i dati vengono analizzati con il software. I valori di flusso sono stati normalizzati all'attività della citrato sintasi. L'ossigrafia ha fornito valori più bassi per il complesso IV a causa del TMPD parzialmente ossidato. In una serie di test, abbiamo scoperto che il TMPD utilizzato si è discostato di un fattore di 1,8. Questo fattore è stato utilizzato per normalizzare i valori nella Figura 6.
Figura 6: Respirazione mitocondriale in PBMCS dopo crioconservazione rispetto al controllo appena misurato. Una soluzione contenente 1,6 x 107 cellule/mL è stata utilizzata per misurare il consumo di ossigeno delle cellule in un ossigrafo. La respirazione è stata misurata 1 mese dopo la crioconservazione. Per studiare l'attività dei complessi nella catena respiratoria sono stati aggiunti diversi inibitori, substrati e disaccoppiatori. L'aggiunta di una sostanza è stata effettuata come segue: CI(L) = respirazione a perdita del complesso I; CI(P) = respirazione accoppiata del complesso I; CI&CII(P) = respirazione fisiologica; CI&CII(U) = respirazione disaccoppiata che mostra la massima attività dei complessi I e II; CII(U) = respirazione disaccoppiata del complesso II; CII(L) = respirazione a perdita del complesso II; CIV(U) = respirazione disaccoppiata. Per normalizzare i valori è stato utilizzato un fattore di 1,8. Questo fattore è stato determinato sperimentalmente per l'attuale configurazione. I dati vengono visualizzati come media ± SEM (N = 10). La significatività statistica è stata testata tramite il test t di Student (*p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La respirazione endogena viene determinata aggiungendo 2 mL di sospensione cellulare nelle camere. Viene misurato il flusso con substrati endogeni. Per distinguere ulteriormente tra i complessi viene aggiunta la digitonina. La digitonina permeabilizza la membrana plasmatica mentre le membrane mitocondriali rimangono intatte. Per compensare la perdita di protoni attraverso la membrana, vengono aggiunti substrati di glutammato e malato. Le frequenze respiratorie a questo punto illustrano la complessa respirazione guidata dall'I in assenza di respirazione accoppiata. Per rilevare la capacità di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) del complesso I ADP viene aggiunto, la respirazione è ora in uno stato accoppiato. La respirazione accoppiata di CI e CII si ottiene con l'aggiunta di succinato. Ora la catena respiratoria lavora alla massima capacità. Con la titolazione del cianuro di carbonile p-trifluorometossi fenilidrazone (FCCP) la catena di trasporto degli elettroni (ETC) è disaccoppiata. Con questo disaccoppiamento si determina l'attività massima disaccoppiata di CI e CII. Per differenziare tra CI e CII viene aggiunto l'inibitore specifico del complesso I rotenone. Con l'aggiunta di oligomicina, viene determinata la respirazione di perdita di CII. Per escludere il consumo di ossigeno da parte di fonti non coinvolte nella fosforilazione ossidativa, viene aggiunto l'antibiotico antimicina A e questo consumo di ossigeno residuo viene sottratto da tutte le letture ottenute nell'esperimento. Il donatore di elettroni N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiammina dicloridrato (TMPD; 0,5 mM) è un substrato artificiale per CIV. Per mantenere il TMPD in uno stato ridotto, viene utilizzato l'ascorbato. L'ascorbato e il TMPD sono utilizzati per misurare la respirazione massima disaccoppiata della CIV. Poiché il TMPD è soggetto ad auto-ossidazione, NaN3 viene aggiunto dopo la stabilizzazione del flusso per inibire il CIV. Il consumo di ossigeno rimanente viene sottratto dai valori grezzi di CIV. La Figura 2 mostra una curva di misurazione tipica.
I parametri mostrati mostrano il successo della tecnica. La tecnica è stata sviluppata per eseguire misurazioni bioenergetiche dopo la crioconservazione. I risultati mostrati confrontano le cellule prima e dopo la misurazione, poiché non si notano differenze statisticamente significative, si può presumere che questo metodo di conservazione sia adatto per la conservazione per oltre 1 mese.
Tabella 1: Soluzioni, tamponi e materiali di consumo. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo fornisce un mezzo per isolare e crioconservare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue umano in modo adatto alle analisi bioenergetiche. Il metodo descritto offre la possibilità di isolare le PBMC in modo delicato e in grandi quantità, con un'elevata vitalità e un numero sufficiente di cellule per le misurazioni bioenergetiche. Ha lo svantaggio che anche con interruzioni minime, si verificano lunghi isolamenti, ma la successiva crioconservazione consente una misurazione della bioenergetica indipendente dal tempo. Con questo metodo, i campioni possono essere raccolti e misurati in momenti successivi. È anche adatto per raccogliere campioni in prove multicentriche e misurare i parametri allo stesso tempo in una posizione centrale.
La crioconservazione offre la possibilità di conservare le cellule per un lungo periodo di tempo e di misurarle in seguito. L'isolamento delle PBMC è un processo che richiede molto tempo, circa 2-3 ore, e consente di prelevare solo un numero limitato di campioni contemporaneamente. Non è possibile per un singolo sperimentatore isolare PBMC fresche da più di 2 individui contemporaneamente senza perdita di qualità. La necessità di eseguire esperimenti di follow-up con cellule fresche complica la procedura ed è quindi associata a ulteriore stress e problemi di tempo. Separare l'isolamento dalle prestazioni degli esperimenti può semplificare gli studi e rendere i test più standardizzati. Nello specifico, la raccolta del sangue, l'isolamento, la crioconservazione di un campione collettivo, seguita dall'esecuzione di specifici esperimenti. I campioni possono essere raccolti da luoghi diversi e in momenti diversi e quindi misurati contemporaneamente nello stesso luogo.
La bioenergetica svolge un ruolo essenziale nel metabolismo cellulare, è probabile che la bioenergetica disturbata che porta alla disfunzione mitocondriale svolga un ruolo importante nell'invecchiamento e successivamente nella neurodegenerazione e in altre malattie25,26. I metodi sopra descritti possono essere utilizzati in PBMC appena isolate e crioconservate per monitorare i cambiamenti. Queste misurazioni bioenergetiche possono essere utilizzate come base per studi clinici e ricerche.
Ci sono diversi fattori limitanti per questa tecnica e i vantaggi e gli svantaggi della misurazione a fresco rispetto alla misurazione dopo la crioconservazione devono essere valutati. La crioconservazione è generalmente molto impegnativa per le PBMC; Pertanto, è importante mantenere il numero di fattori di stress il più basso possibile. Il tempo è essenziale in quanto le cellule dovrebbero trascorrere il minor tempo possibile nel DMSO che è tossico per le PBMC, ogni passaggio dovrebbe essere preparato prima di scongelare o congelare le cellule con DMSO. Inoltre, per le misurazioni bioenergetiche, la conservazione in un congelatore a -80 °C si è rivelata inefficace: i campioni devono essere trasferiti in azoto liquido dopo 24 ore. Una velocità di congelamento controllata è obbligatoria se il raffreddamento è troppo veloce, l'acqua che rimane nelle cellule si congela e forma cristalli danneggiando le membrane cellulari e i compartimenti. Una velocità di raffreddamento troppo lenta porta a un contatto prolungato con il DMSO tossico. I congelatori cellulari che utilizzano isopropanolo possono raggiungere una velocità di congelamento di 1 °C/min in un congelatore a -80 °C. Lo scongelamento e il ricongelamento delle PBMC devono essere evitati.
Questo protocollo descrive l'isolamento e la crioconservazione delle PBMC. Al fine di confermare la funzionalità delle PBMC dopo la conservazione per le misurazioni bioenergetiche, sono state effettuate misurazioni esemplari di bioenergetica. Questo protocollo è stato ottimizzato per la misurazione dei fattori bioenergetici. I fattori bioenergetici possono essere determinati dopo la crioconservazione, ma si può anche determinare per altri protocolli se le misurazioni sono possibili dopo la crioconservazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo l'équipe clinica dell'Ospedale Universitario di Giessen-Marburg per la raccolta del sangue. Questo lavoro è stato finanziato dall'università Justus Liebig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | - | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. , Springer International Publishing AG. Cham. (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al.
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer's disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M.
