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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Multiome अनुक्रमण के लिए ताजा और जमे हुए ठोस ट्यूमर नमूनों से अनुकूलित नाभिक अलगाव

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65831
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Stanford University

Summary

प्रोटोकॉल 10x जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म का उपयोग करके मल्टीओम अनुक्रमण के लिए ठोस ट्यूमर नमूनों से नाभिक के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय और अनुकूलित दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिसमें ऊतक पृथक्करण की स्थिति, एकल-कोशिका निलंबन के क्रायोप्रिजर्वेशन और पृथक नाभिक के मूल्यांकन के लिए सिफारिशें शामिल हैं।

Abstract

मल्टीओम अनुक्रमण, जो समान-सेल / युग्मित एकल-सेल आरएनए- प्रदान करता है- और अनुक्रमण (एटीएसी-अनुक्रमण) डेटा के साथ ट्रांसपोसेज़-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख प्रदान करता है, ट्यूमर सेल विषमता को समझने की हमारी क्षमता में एक सफलता का प्रतिनिधित्व करता है-इस समय ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान का प्राथमिक फोकस। हालांकि, इस उन्नत साधन का उपयोग करके प्राप्त अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता इनपुट सामग्री की गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर है।

गुणवत्ता का त्याग किए बिना सेल उपज को अधिकतम करने के लिए पाचन की स्थिति को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। यह घने desmoplastic matrices है कि धीरे सेल रिलीज के लिए नीचे टूट जाना चाहिए के साथ ठोस ट्यूमर के संदर्भ में चुनौतीपूर्ण है. ठोस ट्यूमर ऊतक से ताजा पृथक कोशिकाएं सेल लाइनों से अलग लोगों की तुलना में अधिक नाजुक होती हैं। इसके अतिरिक्त, चूंकि पृथक सेल प्रकार विषम हैं, इसलिए कुल सेल आबादी का समर्थन करने के लिए स्थितियों का चयन किया जाना चाहिए।

अंत में, परमाणु अलगाव की स्थिति को इन गुणों के आधार पर लाइसिस समय और अभिकर्मक प्रकार / अनुपात के संदर्भ में अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस लेख में, हम ठोस ट्यूमर नमूनों से 10x जीनोमिक्स मल्टीओम अनुक्रमण मंच के लिए परमाणु अलगाव के साथ अपने अनुभव का वर्णन करते हैं। हम ऊतक पाचन, एकल-कोशिका निलंबन के भंडारण (यदि वांछित हो), और परमाणु अलगाव और मूल्यांकन के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं।

Introduction

जैसे-जैसे ट्यूमर जीव विज्ञान के बारे में हमारा ज्ञान बढ़ता है, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में विषम कोशिकाओं का विश्लेषण करने का महत्व भी 1,2 बढ़ गया है। एकल-सेल आरएनए प्राप्त करने की क्षमता और एक युग्मित-सेल फैशन (मल्टीओम अनुक्रमण) में एक ही सेल से अनुक्रमण (एटीएसी-अनुक्रमण) डेटा के साथ ट्रांसपोसेज़-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख इस अंत 3,4 की ओर एक महत्वपूर्ण अग्रिम प्रदान करता है। ये प्रयोग महंगे और समय लेने वाले हैं, हालांकि, और अधिग्रहित डेटा की गुणवत्ता और प्रभाव प्रयोगात्मक स्थितियों और सामग्रियों की गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर हैं। नाभिक अलगाव के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल 5,6 प्रकाशित किया गया है. ताजा और विषम ऊतकों को प्रोटोकॉल अनुकूलन की आवश्यकता होती है क्योंकि ठोस ट्यूमर नमूनों से ताजा पृथक कोशिकाएं सेल लाइनों से अलग लोगों की तुलना में अधिक नाजुक होती हैं।

एक और विचार यह है कि ठोस ट्यूमर के लिए, सर्जिकल नमूने अक्सर ऑपरेटिंग कमरे से दिन में देर तक उपलब्ध नहीं होते हैं। जैसे, क्रायोप्रिजर्वेशन कदम के बिना नमूना अधिग्रहण से नाभिक कैप्चर तक सीधे आगे बढ़ना आम तौर पर संभव नहीं है। हमारे अनुभव में, एकल-कोशिका निलंबन को फ्रीज करने से उच्चतम गुणवत्ता वाले नाभिक (फ्लैश-जमे हुए पूरे ऊतक या संरक्षण के अन्य तौर-तरीकों के बजाय) उत्पन्न होता है। यह विशेष रूप से उच्च RNase सामग्री जैसे अग्न्याशय के साथ एंजाइमी ऊतक प्रकारों के लिए सच है।

ऊतक पाचन की स्थिति भी गुणवत्ता7 त्याग के बिना सेल उपज को अधिकतम करने के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए. घने desmoplastic matrices8 के साथ ठोस ट्यूमर प्रकार के संदर्भ में, बाह्य मैट्रिक्स धीरे सेल रिलीज के लिए नीचे टूट जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, क्योंकि पृथक सेल प्रकार विषम हैं, कुल सेल आबादी का समर्थन करने के लिए शर्तों को समायोजित किया जाना चाहिए। मानव अग्नाशय के कैंसर (अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा) के नमूने वर्णित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाते हैं। अग्नाशयी कैंसर एक अत्यधिक डेस्मोप्लास्टिक ट्यूमर प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है, जो अपेक्षाकृत चिपचिपा ऊतक और कोशिकाओं को चित्रित करता है। इसके अलावा, चूंकि अनुसंधान के लिए उपलब्ध अग्नाशयी ट्यूमर के नमूने भी अपेक्षाकृत छोटे होते हैं, इसलिए कैप्चर की गई कोशिकाओं की मात्रा को अधिकतम करने के प्रयास किए जाते हैं।

नाभिक के अलगाव के लिए सेल लसीका की स्थिति और समय के साथ-साथ अभिकर्मक प्रकार और अनुपात के संदर्भ में सबसे अधिक अनुकूलन की आवश्यकता होती है। अलगाव के दौरान नाभिक को संभालने के लिए भी बहुत सावधानी की आवश्यकता होती है। इस लेख में, हम ठोस ट्यूमर ऊतक (चित्रा 1) से 10x जीनोमिक्स मल्टीओम अनुक्रमण मंच के लिए परमाणु अलगाव के अनुकूलन के हमारे अनुभव का वर्णन करते हैं। हम ऊतक पाचन, एकल-कोशिका निलंबन (यदि वांछित हो) के क्रायोप्रिजर्वेशन और परमाणु अलगाव के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं।

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Protocol

मानव अग्नाशय के कैंसर (अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा) के नमूने हमारी प्रयोगशाला में आईआरबी-अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त किए गए थे। ऊतक संग्रह के लिए रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। ऊतक को ऑपरेटिंग कमरे से प्रयोगशाला में ले जाया गया और फिर निम्नानुसार संसाधित किया गया।

1. ऊतक पृथक्करण (पाचन)

  1. डाइजेस्ट बफर तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. ट्यूमर छांटना के बाद जितनी जल्दी हो सके ब्याज के ऊतक प्राप्त करें और बुझाने बफर (DMEM एफ -12 ~ 5% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ) या बर्फ पर 1x पीबीएस में नमूना परिवहन.
  3. एक 90 मिमी पेट्री डिश (चित्रा 2 ए) में डाइजेस्ट बफर के 3-5 एमएल में साफ संदंश और कैंची का उपयोग कर ऊतक कीमा।
  4. कीमा बनाया हुआ ऊतक को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और मिलाते हुए समारोह या सूखे आंदोलनकारी के साथ पानी के स्नान का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए डाइजेस्ट बफर के ~ 10 एमएल में अलग करें।
  5. आंदोलनकारी से निकालें और बुझाने के माध्यम के ~ 20 एमएल के साथ बुझाना. एक साफ शंक्वाकार ट्यूब में एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से समाधान फ़िल्टर.
  6. छलनी से किसी भी शेष ठोस ऊतक को इकट्ठा करें (यदि आवश्यक हो तो शेष ऊतक टुकड़ों को फिर से कम करें), और आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 30 मिनट के लिए ताजा डाइजेस्ट बफर के ~ 10 एमएल में रखें। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी ट्यूमर ऊतक अलग न हो जाएं।
  7. पूल सेल निलंबन aliquots और बर्फ पर एक साफ शंक्वाकार ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के बाद एक 70 माइक्रोन के माध्यम से फिल्टर.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 × ग्राम पर गोली कोशिकाओं के लिए अपकेंद्रित्र और फिर सतह पर तैरनेवाला छानना।

2. क्रायोप्रिजर्वेशन

  1. 1x पीबीएस के 1 एमएल में गोली को निलंबित करके कोशिकाओं को कुल्ला।
  2. सेल निलंबन (~ इष्टतम ठंड के लिए 1-10 मिलियन कोशिकाओं / ट्यूब) बर्फ पर एक 1.5 एमएल क्रायोवियल के लिए स्थानांतरण.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 × ग्राम पर गोली कोशिकाओं के लिए अपकेंद्रित्र और फिर सतह पर तैरनेवाला छानना।
  4. बामबैंकर समाधान के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, 1.5 या 2 एमएल क्रायोवियल (चित्रा 2बी) में स्थानांतरित करें, और -1 डिग्री सेल्सियस/मिनट शीतलन दर फ्रीजिंग कंटेनर (100% आइसोप्रोपिल अल्कोहल युक्त) का उपयोग करके फ्रीज करें -80 डिग्री सेल्सियस, या तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें यदि नमूना के दीर्घकालिक भंडारण का अनुमान है।

3. नाभिक अलगाव

  1. तेजी से सेल निलंबन के क्रायोवियल पिघलना और गीला बर्फ पर जगह है.
  2. पिघले हुए सेल निलंबन को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को कुल्ला करने के लिए 1x पीबीएस के साथ शीशी को 2 एमएल समाधान तक ऊपर रखें।
  3. कोशिकाओं की मात्रा और गुणवत्ता दोनों का आकलन करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके एक मैनुअल सेल गिनती प्राप्त करें (चित्र 2C)।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 × ग्राम पर गोली कोशिकाओं के लिए अपकेंद्रित्र और फिर धीरे-धीरे एक सूखी गोली के पीछे छोड़ने और बर्फ पर बनाए रखने के लिए उत्तरोत्तर छोटे विंदुक युक्तियों का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला छानना।
    1. सभी सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों के लिए स्विंग-बाल्टी रोटर का उपयोग करें। अधिकतम सेल उपज के लिए, बाहर की ओर का सामना करना पड़ काज के साथ अपकेंद्रित्र में ट्यूबों जगह और फिर विंदुक टिप ट्यूब (चित्रा 2 डी) के विपरीत दिशा में निर्देशित के साथ छानना.
      नोट: सतह पर तैरनेवाला decanting के लिए, तरल पदार्थ decanted की मात्रा को अधिकतम करते हुए गोली के व्यवधान को सीमित करने के लिए तरल पदार्थ को हटाने के लिए उत्तरोत्तर छोटे विंदुक सुझावों का उपयोग करें. यह रणनीति नाभिक निष्कर्षण के बाद प्रोटोकॉल में बाद में विशेष रूप से सहायक होती है क्योंकि नाभिक गोली आमतौर पर दिखाई नहीं देती है।
  5. निम्नलिखित संशोधनों के साथ प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार 1x सेल लाइसिस बफर, सेल लाइसिस कमजोर पड़ने वाला बफर, और वॉश बफर(चित्रा 3ए)तैयार करें ( तालिका 1, सामग्री की तालिका देखें):
    नोट: अवक्षेप(चित्रा 3बी)को भंग करने के लिए उपयोग करने से पहले 65 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर डिजिटोनिन रखें। यह आमतौर पर लगभग 10 मिनट लगते हैं।
  6. 1x सेल लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन और सेल लाइसिस कमजोर पड़ने वाले बफर, पिपेट के 900 माइक्रोन को धीरे से मिश्रण करने के लिए संयोजन करके 0.1x सेल लाइसिस बफर तैयार करें, और इसे बर्फ पर रखें।
  7. ठंडा 0.1x सेल लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और 5x मिश्रण करने के लिए धीरे से विंदुक करें।
  8. 3 मिनट (चित्रा 3 सी) के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  9. ठंडा वॉश बफर के 1 एमएल जोड़ें और धीरे से 5x मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे विंदुक जोड़ें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 × ग्राम पर नाभिक को गोली मारने के लिए अपकेंद्रित्र, धीरे से एक सूखी गोली के लिए सतह पर तैरनेवाला को छानना, और बर्फ पर बनाए रखना।
    नोट: यदि शुरुआती सेल नंबर कम है (100,000-200,000 सेल), सेल लाइसिस करें और ट्यूब सतह क्षेत्र को कम करने और नुकसान को कम करने के लिए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के बजाय 200 माइक्रोन पीसीआर ट्यूब में कदम धोएं। इस मामले में, छोटे ट्यूब वॉल्यूम को समायोजित करने के लिए वॉश बफर वॉल्यूम को समायोजित करें।
  11. दोहराएँ कदम 3.9-3.10 2x तीन washes की कुल के लिए.
  12. मैन्युअल रूप से माइक्रोस्कोप के नीचे एक हेमोसाइटोमीटर स्लाइड का उपयोग करके नाभिक की गणना करें। नाभिक को देखने के लिए कंट्रास्ट प्रदान करने और अनलिस्ड कोशिकाओं से नाभिक को समझने में मदद करने के लिए वांछित होने पर ट्रिपैन ब्लू डाई का उपयोग करें।
  13. प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार 1x नाभिक बफर तैयार करें: न्यूक्लियस मुक्त पानी में 20x नाभिक बफर स्टॉक, 1 मिमी डीटीटी, 1 यू/μL आरएनएसई अवरोधक और बर्फ पर रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  14. लक्ष्य-लक्षित नाभिक वसूली के आधार पर 1x नाभिक बफर में नाभिक गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: यदि एकाग्रता काफी अधिक है, तो इस चरण (3,230-8,060 नाभिक/μL) पर 10,000 या थोड़ा अधिक की लक्षित वसूली का लक्ष्य रखें, जब शुरुआती निलंबन मात्रा का निर्धारण किया जाता है, 25 माइक्रोन की अनुमानित मात्रा हानि और फ़िल्टरिंग (चरण 3.15) के साथ एकाग्रता में 20% की कमी।
  15. धीरे एक 40 माइक्रोन पिपेट टिप सेल झरनी के माध्यम से resuspended नाभिक मात्रा पास और बर्फ (चित्रा 3 डी) पर नाभिक जगह.
  16. नाभिक (चित्रा 4 ए-सी) का वर्णन करें। यदि आवश्यक हो तो नाभिक बफर के साथ अंतिम समाधान को और पतला करें।
  17. बर्फ पर नाभिक परिवहन और तुरंत प्रकाशित प्रोटोकॉल प्रति नाभिक कब्जा के साथ आगे बढ़ना.

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Representative Results

मल्टीओम अनुक्रमण(चित्रा 1)के लिए रोगी ठोस ट्यूमर नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए, ट्यूमर ऊतक को अलग कर दिया गया था और एक एकल कोशिका निलंबन क्रायोप्रेक्ष्य(चित्रा 2ए-डी)था। सेल निलंबन तो नियोजित multiome कब्जा के समय में thawed था. नाभिक कब्जा अनुकूलित lysis बफर अभिकर्मकों और गुणवत्ता और उपज (चित्रा 3 ए-डी) दोनों को अधिकतम करने के लिए समय के साथ आयोजित किया गया था. प्रतिनिधि नाभिक छवियों उचित आकार और आकार (चित्रा 4 ए-सी) दिखा. हल्के भूरे रंग में परिक्रमा करने वाले नाभिक लिफाफे की हल्की स्टिपलिंग दिखाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: नाभिक अलगाव वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। योजनाबद्ध नाभिक कैप्चर, मल्टीओम लाइब्रेरी तैयारी, और अंततः स्आरएनए- और एटीएसी-अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत करने के लिए तैयार एकल-नाभिक निलंबन के लिए एक पूरे ट्यूमर ऊतक नमूने से मूल वर्कफ़्लो दिखा रहा है। संक्षिप्ताक्षर: scRNA = एकल-कोशिका RNA; ATAC-seq = अनुक्रमण के साथ transposase-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ऊतक पाचन, क्रायोप्रिजर्वेशन, सेल मूल्यांकन, और सेंट्रीफ्यूजेशन कदम। (ए) ट्यूमर ऊतक नमूनों कीमा बनाने के लिए उपकरण सेटअप; (बी) सेल निलंबन क्रायोप्रिजर्वेशन; (सी) सेल निलंबन का सूक्ष्म मूल्यांकन; (डी) इस प्रोटोकॉल के लिए अपकेंद्रित्र करने के लिए दृष्टिकोण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अभिकर्मकों, नाभिक निष्कर्षण, और फ़िल्टरिंग की तैयारी। (ए) नाभिक निष्कर्षण अभिकर्मकों की तैयारी; (बी) उपयोग करने से पहले 65 डिग्री सेल्सियस पर डिजिटोनिन का विघटन; (सी) बर्फ पर सेल लसीका के लिए नमूनों की इनक्यूबेशन; (डी) निकाले गए नाभिक का फ़िल्टरिंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: जटिल ट्यूमर ऊतक नमूनों से काटा नाभिक के प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों. (ए-सी) नाभिक के प्रतिनिधि छवियों के साथ और trypan ब्लू धुंधला हो जाना के बिना काटा. (बी, सी) हल्के भूरे रंग में परिक्रमा करने वाले नाभिक परमाणु लिफाफे की हल्की स्टिपलिंग दिखाते हैं। 10x और 40x उद्देश्यों का उपयोग किया गया। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समाधान का नाम घटक
डाइजेस्ट बफर 0.5-1 मिलीग्राम/एमएल कोलेजनेज प्रकार IV
100 यू/एमएल डीएनसे I
0.1% पोलोक्सामेर 188
20 मिमी HEPES
1 एमएम सीएसीएल2
मध्यम 199 में 3-5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस)
1X सेल लाइसिस बफर 10 मिमी Tris-HCl (पीएच 7.4)
10 मिमी NaCl
3 एमएम एमजीसीएल2
2% बीएसए (1% के बजाय)
0.10% ट्वीन-20
0.1% नोनिडेंट P40 विकल्प
0.01% डिजिटोनिन
1 मिमी डीटीटी
न्यूक्लियस मुक्त पानी में 1 U/μL RNAse अवरोधक
सेल Lysis कमजोर पड़ने बफर 10 मिमी Tris-HCl (पीएच 7.4)
10 मिमी NaCl
3 एमएम एमजीसीएल2
2% बीएसए
1 मिमी डीटीटी
न्यूक्लियस मुक्त पानी में 1 U/μL RNAse अवरोधक
वॉश बफर 10 मिमी Tris-HCl (पीएच 7.4)
10 मिमी NaCl
3 एमएम एमजीसीएल2
2% बीएसए
0.10% ट्वीन-20
1 मिमी डीटीटी
न्यूक्लियस मुक्त पानी में 1 U/μL RNAse अवरोधक

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त समाधान।

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Discussion

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में मौजूद विषम कोशिका आबादी को खोलना कैंसर जीव विज्ञान में फोकस का एक सक्रिय क्षेत्र है। इसी तरह, घाव भरने और फाइब्रोसिस जैसे सौम्य विकृति में जटिल ऊतक मौजूद होते हैं। मल्टीओम अनुक्रमण एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है जो समान-सेल युग्मित स्आरएनए- और एटीएसी-सीक्यू डेटा के अधिग्रहण की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल नाभिक के अलगाव का वर्णन करता है, जो ताजा, नाजुक, छोटे ट्यूमर नमूनों के प्रसंस्करण की सेटिंग में अनुकूलन की मांग करता है। यहां हम डेस्मोप्लास्टिक ठोस ट्यूमर ऊतक नमूनों से नाभिक अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हमने इस दृष्टिकोण को विश्वसनीय और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए पाया है, भले ही सेल निलंबन नाभिक अलगाव और कैप्चर से पहले जमे हुए हों।

परख भर में एल्बुमिन एकाग्रता में वृद्धि सेल और बहाव नाभिक क्लंपिंग को सीमित करने में सहायक है, जो ट्यूमर के नमूनों के साथ काम करते समय एक समस्या हो सकती है। ऊतक पाचन के संदर्भ में, पाचन किट अभिकर्मकों भी वांछित ( सामग्री की तालिकादेखें) इस प्रोटोकॉल के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि उपयोग किया जाता है, तो हम अभी भी व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज को अधिकतम करने के लिए हर-30 मिनट के डाइजेस्ट/शमन और बफर एक्सचेंजों का पालन करने की सलाह देंगे। ऊतक पृथक्करण के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार लाल रक्त कोशिका लसीका किया जा सकता है। एक ढाल सेल जुदाई प्रोटोकॉल भी शोधकर्ता के विवेक पर किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें). हम इन प्रोटोकॉल को नियमित रूप से नहीं करते हैं, लेकिन हमने परिणामों में उल्लेखनीय अंतर के बिना समान नमूनों के लिए ऐसे प्रोटोकॉल लागू किए हैं। यदि महत्वपूर्ण है, तो नाभिक फ़िल्टरिंग के बाद छोटे मलबे का उल्लेख किया जाता है, प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छँटाई (FANS) को आगे शुद्धि के लिए माना जा सकता है। प्रोटोकॉल सिफारिशों सहित प्रशंसकों की एक विस्तृत चर्चा उपलब्ध है, लेकिन इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है। ध्यान दें, साहित्य में प्रोटोकॉल हैं जो सेल लाइसिस से पहले एक निर्धारण कदम पर विचार करते हैं। हालांकि, हम गैर-निश्चित ऊतक और नाभिक के साथ आगे बढ़ना पसंद करते हैं क्योंकि स्कैटैक-सीक अनफिक्स्ड ऊतक9 पर सबसे अच्छा काम करता है।

सेल lysis के लिए, RNase अवरोध करनेवाला काफी महंगा है के रूप में, यह प्रकाशित प्रोटोकॉल में प्रदान की मात्रा के साथ तुलना सेल Lysis बफर (और सेल Lysis कमजोर पड़ने बफर) की तैयार मात्रा नीचे पैमाने के लिए उचित है, अगर वांछित, के रूप में लंबे समय के रूप में अभिकर्मकों के अनुपात आनुपातिक रहते हैं. काटे गए नाभिक का आकलन और गणना करते समय, शोधकर्ता के विवेक पर एक लाइव/डेड वायबिलिटी/साइटोटॉक्सिसिटी किट लागू की जा सकती है। ट्रिपैन ब्लू डाई का उपयोग नाभिक को देखने के लिए कंट्रास्ट प्रदान करने और जरूरत पड़ने पर अनलिस्ड कोशिकाओं से नाभिक को समझने में मदद करने के लिए भी किया जा सकता है। अंत में, यह ध्यान देने योग्य है कि हम उत्कृष्ट परिणाम10 के साथ एकल सेल ATAC-seq के लिए प्रोटोकॉल प्रति समायोजित अभिकर्मकों के साथ एक ही सेल lysis शर्तों लागू किया है.

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम लसीका का सटीक समय और नाभिक की कोमल लेकिन समीचीन हैंडलिंग हैं। अंडरमिक्सिंग अधूरे या असंगत सेल लसीका को जन्म देगा; हालांकि, ओवरमिक्सिंग क्रोमैटिन को कतरनी देगा। जैसा कि अन्य नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, नाभिक मिश्रण को नमूना के भंवर के बजाय पाइपिंग द्वारा पूरा किया जाना चाहिए क्योंकि कतरनी बल नाजुक नाभिक11को नुकसान पहुंचा सकते हैं। इस संबंध में, यह महत्वपूर्ण है कि सेल Lysis बफर बस प्रत्येक अवसर पर उपयोग करने से पहले ताजा तैयार किया जा. पिपेट टिप सेल तनाव (फ़िल्टरिंग) अंतिम centrifugation कदम के बाद नाभिक clumping कब्जा करने से पहले रोकने के लिए हमारे अनुभव में महत्वपूर्ण है. इस फ़िल्टरिंग को लोडिंग से पहले दोहराया जा सकता है यदि क्लंप अभी भी अंतिम गिनती पर पाए जाते हैं या लोडिंग से पहले नमूने के परिवहन के दौरान विकसित होते हैं, प्रत्येक फ़िल्टरिंग चरण के साथ मात्रा और एकाग्रता में अतिरिक्त नुकसान को ध्यान में रखते हुए। ध्यान दें, नाभिक अलगाव और कैप्चर के बीच कोई महत्वपूर्ण समय विराम नहीं होना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं कि ऊतक पृथक्करण और विशेष रूप से, सेल लसीका इनक्यूबेशन समय और शर्तों को विभिन्न ठोस ट्यूमर प्रकार12 के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है. इस प्रोटोकॉल को स्तन कार्सिनोमा और अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा जैसे डेस्मोप्लास्टिक ठोस ट्यूमर के लिए अनुकूलित किया गया है और इसे पैरेन्काइमल फाइब्रोसिस जैसे गैर-ट्यूमर डेस्मोप्लास्टिक ऊतकों पर भी सफलतापूर्वक लागू किया गया है, लेकिन अन्य ट्यूमर प्रकारों को अतिरिक्त समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। यह दोनों ताजा सेल निलंबन के साथ-साथ इन दोनों से उत्कृष्ट नाभिक उपज के साथ जमे हुए सेल निलंबन के लिए अनुकूलित है। हम इस तरह के अनुकूलन क्रमिक ऊतक पृथक्करण के साथ शुरू करने की सलाह देते हैं, और एक बार एक इष्टतम एकल सेल निलंबन हासिल किया गया है, एक इष्टतम एकल नाभिक निलंबन उपज के लिए सेल lysis शर्तों के अनुकूलन पर आगे बढ़ना.

एकल-कोशिका एटीएसी-अनुक्रमण और हाल ही में, मल्टीओम अनुक्रमण ठोस ट्यूमर सेलुलर विषमता को सुलझाने के लिए एक जबरदस्त सफलता उपकरण प्रस्तुत करता है। सेल उपप्रकारों को उनकी क्रोमैटिन पहुंच और जीन अभिव्यक्ति विशेषताओं दोनों के आधार पर चित्रित किया जा सकता है, और ट्यूमर व्यवहार पर प्रतिलेखन कारक पहुंच और अभिव्यक्ति के प्रभाव की सीधे जांच की जा सकती है। इन पद्धतिगत अग्रिमों को मोटे तौर पर उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों को उजागर करने की उनकी जबरदस्त क्षमता को देखते हुए लागू किया जा रहा है। जैसे, इन आंकड़ों को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का विकास अत्यंत महत्वपूर्ण है। यहां हम अग्नाशय के कैंसर ऊतक के संदर्भ में नाभिक अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल को साझा करते हैं-एक कैंसर प्रकार जिसके लिए कुछ उपचार मौजूद हैं और सभी आज तक सीमित प्रभावकारिता के साथ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम अपने प्रयोगों को अनुकूलित करने में उनकी सहायता के लिए स्टैनफोर्ड फंक्शनल जीनोमिक्स फैसिलिटी (एसएफजीएफ), विशेष रूप से धनंजय वाघ और जॉन कॉलर, और 10x जीनोमिक्स को स्वीकार करना चाहते हैं। हम रोगी नमूने प्राप्त करने में उनकी सहायता के लिए डॉ. जॉर्ज पोल्टसाइड्स, मोनिका दुआ, ब्रेंडन विसर और बायरन ली को भी धन्यवाद देना चाहेंगे। हम अपने शोध प्रयासों के उदार समर्थन के लिए आर्ट और ऐलेन टेलर, रैंट्ज़ फाउंडेशन, और वॉरेन और जूडी कपलान को स्वीकार करना चाहते हैं। फंडिंग स्रोतों में एनआईएच अनुदान 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), GOLDMAN Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), डेमन रनयन कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (D.D., M.T.L.), GUNN/ओलिवियर फंड, कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट फॉर रीजेनरेटिव मेडिसिन, स्टिनेहार्ट/रीड फाउंडेशन, और बाल चिकित्सा पुनर्योजी चिकित्सा के लिए हेगी प्रयोगशाला शामिल हैं। अनुक्रमण एनआईएच फंड (S10OD025212, S10OD018220, और 1S10OD01058001A1) के साथ खरीदी गई मशीनों का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers   ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x) 10x Genomics 2000153/2000207
Bambanker  Wako, Fisher Scientitic NC9582225 
BSA Miltenyi Biotec 130-091-376
Calcium Chloride Sigma Aldrich 499609
Collagenase (Collagenase Type IV) ThermoFisher 17104019
Digitonin Thermo Fisher BN2006
DNase I Worthington LS006330
DTT Sigma Aldrich 646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 Thermo Fisher 11320082
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer  Sigma Aldrich BAH136800040
HEPES Sigma Aldrich H3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution Sigma Aldrich 11191
Medium 199 Sigma Aldrich M2520
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit 
NaCl Sigma Aldrich 59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container  ThermoFisher 5100-0001
Nonident P40 Substitute Sigma Aldrich 74385
Poloxamer 188 Sigma P5556
Rnase inhibitor  Sigma Aldrich 3335399001
Tris-HCl Sigma Aldrich T2194
Tween-20 Thermo Fisher 85113

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References

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अनुकूलित नाभिक अलगाव ताजा ट्यूमर नमूने जमे हुए ट्यूमर नमूने मल्टीओम अनुक्रमण एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण एटीएसी-अनुक्रमण ट्यूमर सेल विषमता ट्रांसलेशनल कैंसर अनुसंधान अनुक्रमण डेटा गुणवत्ता पाचन की स्थिति अनुकूलन सेल यील्ड अधिकतमकरण ठोस ट्यूमर डेस्मोप्लास्टिक मैट्रिस सेल रिलीज नाजुक कोशिकाएं विषम सेल प्रकार कुल सेल जनसंख्या समर्थन परमाणु अलगाव की स्थिति अनुकूलन लाइसिस टाइम्स अभिकर्मक प्रकार / अनुपात 10x जीनोमिक्स Multiome अनुक्रमण मंच
Multiome अनुक्रमण के लिए ताजा और जमे हुए ठोस ट्यूमर नमूनों से अनुकूलित नाभिक अलगाव
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Foster, D. S., Griffin, M., Januszyk, M., Delitto, D., Norton, J. A., Longaker, M. T. Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing. J. Vis. Exp. (200), e65831, doi:10.3791/65831 (2023).

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