Summary
El protocolo proporciona un enfoque fiable y optimizado para el aislamiento de núcleos de muestras de tumores sólidos para la secuenciación multioma utilizando la plataforma 10x Genomics, que incluye recomendaciones para las condiciones de disociación de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares y la evaluación de núcleos aislados.
Abstract
La secuenciación multioma, que proporciona ARN unicelular emparejado o de la misma célula, y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa con datos de secuenciación (secuenciación ATAC), representa un gran avance en nuestra capacidad para discernir la heterogeneidad de las células tumorales, un enfoque principal de la investigación traslacional del cáncer en este momento. Sin embargo, la calidad de los datos de secuenciación adquiridos con esta modalidad avanzada depende en gran medida de la calidad del material de entrada.
Las condiciones de digestión deben optimizarse para maximizar el rendimiento celular sin sacrificar la calidad. Esto es particularmente difícil en el contexto de tumores sólidos con matrices desmoplásicas densas que deben descomponerse suavemente para su liberación celular. Las células recién aisladas del tejido tumoral sólido son más frágiles que las aisladas de líneas celulares. Además, dado que los tipos celulares aislados son heterogéneos, se deben seleccionar las condiciones para soportar la población celular total.
Por último, las condiciones de aislamiento nuclear deben optimizarse en función de estas cualidades en términos de tiempos de lisis y tipos/ratios de reactivos. En este artículo, describimos nuestra experiencia con el aislamiento nuclear para la plataforma de secuenciación multioma 10x Genomics a partir de muestras de tumores sólidos. Proporcionamos recomendaciones para la digestión de tejidos, el almacenamiento de suspensiones unicelulares (si se desea) y el aislamiento y evaluación nuclear.
Introduction
A medida que aumenta nuestro conocimiento de la biología tumoral, también ha aumentado la importancia de analizar células heterogéneas en el microambiente tumoral 1,2. La capacidad de adquirir ARN unicelular y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa con datos de secuenciación (secuenciación ATAC) de la misma célula en forma de célula emparejada (secuenciación multioma) proporciona un avance significativo hacia este fin 3,4. Sin embargo, estos experimentos son costosos y requieren mucho tiempo, y la calidad y el impacto de los datos adquiridos dependen en gran medida de la calidad de las condiciones experimentales y los materiales. Se han publicado protocolos estandarizados para el aislamiento de núcleos 5,6. Los tejidos frescos y heterogéneos requieren la optimización del protocolo, ya que las células recién aisladas de muestras tumorales sólidas son más frágiles que las aisladas de líneas celulares.
Otra consideración es que para los tumores sólidos, las muestras quirúrgicas a menudo no están disponibles en el quirófano hasta el final del día. Como tal, generalmente no es factible proceder directamente de la adquisición de la muestra a la captura de núcleos sin un paso de criopreservación. En nuestra experiencia, la congelación de una suspensión unicelular produce núcleos de la más alta calidad (en lugar de tejido entero ultracongelado u otras modalidades de conservación). Esto es particularmente cierto para los tipos de tejido enzimático con alto contenido de RNasa, como el páncreas.
Las condiciones de digestión de los tejidos también deben diseñarse para maximizar el rendimiento celular sin sacrificar la calidad7. En el contexto de los tipos de tumores sólidos con matrices desmoplásicas densas8, la matriz extracelular debe descomponerse suavemente para su liberación celular. Además, debido a que los tipos de células aisladas son heterogéneas, las condiciones deben ajustarse para soportar la población total de células. En el protocolo descrito se utilizan muestras de cáncer de páncreas humano (adenocarcinoma ductal de páncreas). El cáncer de páncreas representa un tipo de tumor altamente desmoplásico, que presagia tejidos y células relativamente pegajosos. Además, dado que los especímenes de tumores pancreáticos disponibles para la investigación también tienden a ser relativamente pequeños, se realizan esfuerzos para maximizar la cantidad de células capturadas.
El aislamiento de núcleos requiere la mayor optimización en términos de condiciones y tiempos de lisis celular, así como de tipos y proporciones de reactivos. La manipulación de los núcleos durante el aislamiento también requiere mucho cuidado. En este artículo, describimos nuestra experiencia en la optimización del aislamiento nuclear para la plataforma de secuenciación multioma 10x Genomics a partir de tejido tumoral sólido (Figura 1). Proporcionamos recomendaciones para la digestión de tejidos, la criopreservación de suspensiones unicelulares (si se desea) y el aislamiento nuclear.
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Protocol
Las muestras de cáncer de páncreas humano (adenocarcinoma ductal de páncreas) se adquirieron de acuerdo con un protocolo aprobado por el IRB en nuestro laboratorio. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes para la recolección de tejidos. El tejido se transportó desde el quirófano hasta el laboratorio y luego se procesó de la siguiente manera.
1. Disociación tisular (digestión)
- Prepare el tampón de resumen (consulte la tabla de materiales).
- Obtener el tejido de interés tan pronto como sea posible después de la escisión del tumor y transportar la muestra en tampón de enfriamiento (DMEM F-12 con ~5% de suero fetal bovino) o 1x PBS en hielo.
- Picar el tejido con pinzas y tijeras limpias en 3-5 ml de tampón digestivo en una placa de Petri de 90 mm (Figura 2A).
- Transfiera el tejido picado a un tubo cónico de 50 ml y disocie en ~ 10 ml de tampón digestivo durante 30 min a 37 ° C usando un baño de agua con función de agitación o un agitador seco.
- Retirar del agitador y enfriar con ~20 mL de medio de enfriamiento. Filtre la solución a través de un filtro de células de 100 μm en un tubo cónico limpio.
- Recoja el tejido sólido restante del colador (vuelva a picar los trozos de tejido restantes si es necesario) y colóquelo en ~ 10 ml de tampón de digestión fresco durante otros 30 minutos a 37 ° C con agitación. Repita hasta que todo el tejido tumoral se haya disociado.
- La suspensión de la célula de la piscina se alícuota y se filtra a través de un filtro de células de 70 μm seguido de un filtro de células de 40 μm en un tubo cónico limpio sobre hielo.
- Centrifugar a las células de pellets a 500 × g durante 5 min a 4 °C y luego decantar el sobrenadante.
2. Criopreservación
- Enjuague las células resuspendiendo el gránulo en 1 ml de 1x PBS.
- Transfiera la suspensión celular (~ 1-10 millones de células / tubo para una congelación óptima) a un criovial de 1,5 ml en hielo.
- Centrifugar a las células de pellets a 500 × g durante 5 min a 4 °C y luego decantar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células en 1 mL de solución Bambanker, transfiéralas a un criovial de 1,5 o 2 mL (Figura 2B) y congele utilizando un recipiente de congelación con una velocidad de enfriamiento de -1 °C/min (que contenga alcohol isopropílico al 100 %) a -80 °C, o transfiéralas a nitrógeno líquido si se prevé un almacenamiento a largo plazo de la muestra.
3. Aislamiento de núcleos
- Descongele rápidamente el criovial de la suspensión celular y colóquelo sobre hielo húmedo.
- Transfiera la suspensión celular descongelada a un tubo de microcentrífuga de 2 ml y rellene el vial a una solución de 2 ml con 1x PBS para enjuagar las células.
- Obtener un recuento manual de células utilizando un hemocitómetro para evaluar tanto la cantidad como la calidad de las células (Figura 2C).
- Centrifugar a las células de gránulos a 500 × g durante 5 min a 4 °C y, a continuación, decantar suavemente el sobrenadante utilizando puntas de pipeta progresivamente más pequeñas para dejar un gránulo seco y mantenerlo en hielo.
- Utilice un rotor de cubeta oscilante para todos los pasos de centrifugación. Para obtener el máximo rendimiento celular, coloque los tubos en la centrífuga con la bisagra hacia afuera y luego decante con la punta de la pipeta dirigida hacia el lado opuesto del tubo (Figura 2D).
NOTA: Para decantar el sobrenadante, utilice puntas de pipeta progresivamente más pequeñas para eliminar el líquido y limitar la interrupción del gránulo y maximizar el volumen de líquido decantado. Esta estrategia es particularmente útil más adelante en el protocolo después de la extracción de núcleos, ya que la bolita de núcleos generalmente no es visible.
- Utilice un rotor de cubeta oscilante para todos los pasos de centrifugación. Para obtener el máximo rendimiento celular, coloque los tubos en la centrífuga con la bisagra hacia afuera y luego decante con la punta de la pipeta dirigida hacia el lado opuesto del tubo (Figura 2D).
- Prepare 1x tampón de lisis celular, tampón de dilución de lisis celular y tampón de lavado (Figura 3A) de acuerdo con el protocolo publicado con las siguientes modificaciones (consulte la Tabla 1, Tabla de materiales):
NOTA: Coloque la digitonina en un bloque calefactor a 65 °C antes de usarla para disolver el precipitado (Figura 3B). Esto suele tardar unos 10 minutos. - Prepare el tampón de lisis celular 0,1x combinando 100 μl de tampón de lisis celular 1x y 900 μl de tampón de dilución de lisis celular, pipetee suavemente para mezclar y colóquelo en hielo.
- Vuelva a suspender el gránulo celular en 100 μL de tampón de lisis celular 0,1x refrigerado y pipetee suavemente para mezclar 5x.
- Incubar en hielo durante 3 minutos (Figura 3C).
- Agregue 1 ml de tampón de lavado frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar suavemente 5 veces.
- Centrifugar para granular los núcleos a 500 × g durante 5 min a 4 °C, decantar suavemente el sobrenadante a un gránulo seco y mantener en hielo.
NOTA: Si el número de células iniciales es bajo (100.000-200.000 células), realice los pasos de lisis celular y lavado en un tubo de PCR de 200 μL en lugar de un tubo de microcentrífuga de 2 ml para disminuir el área de superficie del tubo y minimizar las pérdidas. En este caso, ajuste el volumen del tampón de lavado hacia abajo para acomodar el volumen del tubo más pequeño. - Repita los pasos 3.9-3.10 2 veces para un total de tres lavados.
- Cuente manualmente los núcleos usando un portaobjetos de hemocitómetro bajo el microscopio. Use tinte azul de tripano si lo desea para proporcionar contraste para ver los núcleos y para ayudar a discernir los núcleos de las células no lisadas.
- Prepare el tampón de 1x núcleos según el protocolo publicado: 20 existencias de tampón de núcleos, 1 mM de TDT, 1 U/μL de inhibidor de ARNasa en agua libre de nucleasas y manténgalo en hielo (consulte la Tabla de materiales).
- Vuelva a suspender el gránulo de núcleos en 1x Nuclei Buffer en función de la recuperación de núcleos objetivo objetivo.
NOTA: Si la concentración es lo suficientemente alta, apunte a una recuperación objetivo de 10.000 o ligeramente superior en este paso (3.230-8.060 núcleos/μL) al determinar el volumen de resuspensión inicial, dada la pérdida de volumen prevista de 25 μL y la disminución del 20% en la concentración con el filtrado (Paso 3.15). - Pase suavemente el volumen de los núcleos resuspendidos a través de un filtro de células con punta de pipeta de 40 μm y coloque los núcleos en hielo (Figura 3D).
- Vuelva a contar los núcleos (Figura 4A-C). Diluya aún más la solución final con Nuclei Buffer si es necesario.
- Transporta los núcleos en hielo y procede inmediatamente a la captura de núcleos según los protocolos publicados.
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Representative Results
Para aislar núcleos de alta calidad de muestras tumorales sólidas de pacientes para la secuenciación multioma (Figura 1), se disoció el tejido tumoral y se criopreservaba una suspensión unicelular (Figura 2A-D). A continuación, la suspensión celular se descongeló en el momento de la captura planificada del multioma. La captura de núcleos se llevó a cabo con reactivos tampón de lisis optimizados y sincronización para maximizar tanto la calidad como el rendimiento (Figura 3A-D). Las imágenes representativas de los núcleos muestran el tamaño y la forma apropiados (Figura 4A-C). Los núcleos encerrados en un círculo gris pálido muestran un leve punteado de la envoltura.
Figura 1: Esquema del flujo de trabajo de aislamiento de núcleos. Esquema que muestra el flujo de trabajo básico desde una muestra completa de tejido tumoral hasta una suspensión de un solo núcleo lista para su envío para la captura de núcleos, la preparación de bibliotecas multiomas y, en última instancia, la secuenciación de scRNA y ATAC. Abreviaturas: scRNA = ARN unicelular; ATAC-seq = ensayo de cromatina accesible a la transposasa con secuenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pasos de digestión de tejidos, criopreservación, evaluación celular y centrifugación. (A) Configuración del equipo para picar muestras de tejido tumoral; (B) criopreservación de células en suspensión; (C) evaluación microscópica de la suspensión celular; (D) enfoque de centrifugación para este protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación de reactivos, extracción de núcleos y filtrado. (A) Preparación de reactivos de extracción de núcleos; B) disolución de la digitonina a 65 °C antes de su uso; (C) incubación de muestras para lisis celular en hielo; (D) filtrado de núcleos extraídos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes microscópicas representativas de núcleos extraídos de muestras complejas de tejido tumoral. (A-C) Imágenes representativas de núcleos extraídos con y sin tinción con azul de tripano. (B,C) Los núcleos rodeados con un círculo gris pálido muestran un leve punteado de la envoltura nuclear. Objetivos de 10x y 40x utilizados. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de la solución | Componentes | ||
| Búfer de resumen | 0,5-1 mg/ml de colagenasa tipo IV | ||
| 100 U/mL de DNasa I | |||
| 0.1% Poloxámero 188 | |||
| HEPES de 20 mM | |||
| 1 mM CaCl2 | |||
| 3-5% de suero fetal bovino (FBS) en Medio 199 | |||
| 1X Tampón de lisis celular | 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM de NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA (en lugar de 1%) | |||
| 0.10% Preadolescente-20 | |||
| 0.1% Sustituto P40 no idente | |||
| 0.01% Digitonina | |||
| TDT de 1 mM | |||
| 1 U/μL de inhibidor de ARNasa en agua libre de nucleasa | |||
| Tampón de dilución de lisis celular | 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM de NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| TDT de 1 mM | |||
| 1 U/μL de inhibidor de ARNasa en agua libre de nucleasa | |||
| Tampón de lavado | 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4) | ||
| 10 mM de NaCl | |||
| 3 mM MgCl2 | |||
| 2% BSA | |||
| 0.10% Preadolescente-20 | |||
| TDT de 1 mM | |||
| 1 U/μL de inhibidor de ARNasa en agua libre de nucleasa | |||
Tabla 1: Soluciones utilizadas en este protocolo.
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Discussion
Desenredar las poblaciones celulares heterogéneas presentes en el microambiente tumoral es un área de enfoque activo en la biología del cáncer. Del mismo modo, existen tejidos complejos en patologías benignas como la cicatrización de heridas y la fibrosis. La secuenciación multioma se ha convertido en una poderosa herramienta que permite la adquisición de datos de secuenciación de ARNc y ATAC emparejados en la misma célula. Este protocolo describe el aislamiento de núcleos, lo que exige optimización en el entorno de procesamiento de muestras tumorales frescas, frágiles y pequeñas. Aquí proporcionamos un protocolo para el aislamiento de núcleos a partir de muestras de tejido tumoral sólido desmoplásico. Hemos descubierto que este enfoque produce datos fiables y de alta calidad incluso cuando las suspensiones celulares se congelan antes del aislamiento y la captura de los núcleos.
El aumento de la concentración de albúmina a lo largo del ensayo es útil para limitar la aglomeración de células y núcleos posteriores, lo que puede ser un problema cuando se trabaja con muestras tumorales. En cuanto a la digestión de los tejidos, los reactivos del kit de digestión también se pueden utilizar con este protocolo si se desea (ver Tabla de materiales). Si se utiliza, seguiríamos recomendando seguir los intercambios de digestión/enfriamiento y tampón cada 30 minutos para maximizar el rendimiento de las células viables. Después de la disociación del tejido, se puede realizar la lisis de glóbulos rojos según el protocolo del fabricante. También se puede realizar un protocolo de separación celular en gradiente a discreción del investigador (ver Tabla de Materiales). No realizamos estos protocolos de forma rutinaria, pero hemos aplicado dichos protocolos a muestras similares sin diferencias notables en los resultados. Si se observan pequeños residuos significativos después del filtrado de núcleos, se puede considerar la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS) para una mayor purificación. Se dispone de un análisis detallado de los FANS, incluidas las recomendaciones del protocolo, pero está fuera del alcance de este protocolo. Cabe destacar que existen protocolos en la literatura que consideran un paso de fijación previo a la lisis celular. Sin embargo, preferimos proceder con tejido y núcleos no fijados, ya que scATAC-seq funciona mejor en tejido no fijado9.
Para la lisis celular, dado que el inhibidor de la ARNasa es bastante costoso, es razonable reducir el volumen preparado del tampón de lisis celular (y el tampón de dilución de lisis celular) en comparación con los volúmenes proporcionados en el protocolo publicado, si se desea, siempre que las proporciones de reactivos permanezcan proporcionales. Al evaluar y contar los núcleos recolectados, se puede aplicar un kit de viabilidad/citotoxicidad VIVO/MUERTO a discreción del investigador. El tinte azul de tripano también se puede usar para proporcionar contraste para ver los núcleos y para ayudar a discernir los núcleos de las células no lisadas si es necesario. Por último, cabe destacar que hemos aplicado las mismas condiciones de lisis celular con reactivos ajustados por protocolo para ATAC-seq de célula única con excelentes resultados10.
Los pasos críticos en el protocolo son el momento preciso de la lisis y el manejo suave pero oportuno de los núcleos. La mezcla insuficiente conducirá a una lisis celular incompleta o inconsistente; sin embargo, la mezcla excesiva cortará la cromatina. Como se ha señalado en otros protocolos de aislamiento de núcleos, la mezcla de núcleos debe lograrse mediante pipeteo en lugar de vórtice de la muestra, ya que las fuerzas de cizallamiento pueden dañar los frágiles núcleos11. En este sentido, es importante que el tampón de lisis celular se prepare fresco justo antes de su uso en cada ocasión. La tensión de la célula de la punta de pipeta (filtrado) después del paso final de centrifugación es clave en nuestra experiencia para evitar la aglomeración de núcleos antes de la captura. Este filtrado se puede repetir antes de la carga si aún se detectan grumos en el recuento final o se desarrollan durante el transporte de la muestra antes de la carga, teniendo en cuenta la pérdida adicional de volumen y concentración con cada paso de filtrado agregado. Cabe destacar que no debe haber una pausa de tiempo significativa entre el aislamiento y la captura de los núcleos.
Las limitaciones de este protocolo son que la disociación tisular y, en particular, el tiempo y las condiciones de incubación de la lisis celular pueden necesitar ser optimizados para diferentes tipos de tumores sólidos12. Este protocolo se ha optimizado para tumores sólidos desmoplásicos, como el carcinoma de mama y el adenocarcinoma de páncreas, y también se ha aplicado con éxito a tejidos desmoplásicos no tumorales, como la fibrosis parenquimatosa, pero otros tipos de tumores pueden requerir ajustes adicionales. Está optimizado tanto para suspensiones celulares frescas como para suspensiones celulares congeladas con un excelente rendimiento de núcleos de ambas. Recomendamos perseguir dicha optimización secuencialmente comenzando con la disociación de tejidos, y una vez que se ha logrado una suspensión unicelular óptima, pasar a la optimización de las condiciones de lisis celular para producir una suspensión óptima de un solo núcleo.
La secuenciación de ATAC de una sola célula y, más recientemente, la secuenciación multioma presentan una herramienta de gran avance para desenredar la heterogeneidad celular de tumores sólidos. Los subtipos celulares se pueden delinear en función de su accesibilidad a la cromatina y sus características de expresión génica, y la influencia de la accesibilidad y la expresión del factor de transcripción en el comportamiento tumoral se puede examinar directamente. Estos avances metodológicos se están aplicando ampliamente dado su enorme potencial para descubrir nuevas dianas terapéuticas. Por ello, el desarrollo de protocolos optimizados para la obtención de estos datos es de suma importancia. Aquí compartimos este protocolo para el aislamiento de núcleos en el contexto del tejido de cáncer de páncreas, un tipo de cáncer para el que existen pocas terapias y todas con una eficacia limitada hasta la fecha.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al Centro de Genómica Funcional de Stanford (SFGF), en particular a Dhananjay Wagh y John Coller, y a 10x Genomics por su ayuda en la optimización de nuestros experimentos. También nos gustaría agradecer a los Dres. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser y Byrne Lee por su ayuda en la adquisición de muestras de pacientes. Nos gustaría agradecer a Art y Elaine Taylor, a la Fundación Rantz y a Warren y Judy Kaplan por su generoso apoyo a nuestros esfuerzos de investigación. Las fuentes de financiamiento incluyen las subvenciones de los NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), la Fundación Damon Runyon para la Investigación del Cáncer (D.D., M.T.L.), el Fondo Gunn/Olivier, el Instituto de Medicina Regenerativa de California, la Fundación Stinehart/Reed y el Laboratorio Hagey de Medicina Regenerativa Pediátrica. La secuenciación se obtuvo utilizando máquinas compradas con fondos de los NIH (S10OD025212, S10OD018220 y 1S10OD01058001A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
| 10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
| Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
| Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
| Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
| DNase I | Worthington | LS006330 | |
| DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
| Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
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