Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتصور انتقال أحادي الكربوكسيل والجلوكوز و ATP في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية باستخدام مستشعرات نقل طاقة الرنين Förster المشفرة وراثيا في تحضير دماغ يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي .
Abstract
تعد متطلبات الطاقة العالية للأدمغة بسبب النشاط الكهربائي واحدة من أكثر سماتها المميزة. يتم تلبية هذه المتطلبات من خلال إنتاج ATP من الجلوكوز ومستقلباته ، مثل أحادي الكربوكسيل اللاكتات والبيروفات. لا يزال من غير الواضح كيف يتم تنظيم هذه العملية أو من هم اللاعبون الرئيسيون ، لا سيما في ذبابة الفاكهة.
باستخدام مستشعرات نقل طاقة الرنين Förster المشفرة وراثيا ، نقدم طريقة بسيطة لقياس انتقال أحادي الكربوكسيلات والجلوكوز في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية في تحضير يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي . يصف البروتوكول كيفية تشريح ولصق دماغ اليرقات الذي يعبر عن أحد المستشعرات إلى غطاء زجاجي.
نقدم نتائج تجربة كاملة تم فيها قياس نقل اللاكتات في أدمغة اليرقات عن طريق هدم ناقلات الكربوكسيل أحادية الكربوكسيل التي تم تحديدها سابقا في الخلايا الدبقية. علاوة على ذلك ، نوضح كيفية زيادة النشاط العصبي بسرعة وتتبع تغيرات الأيض في الدماغ النشط. يمكن استخدام الطريقة الموصوفة ، والتي توفر جميع المعلومات اللازمة ، لتحليل الأنسجة الحية الأخرى في ذبابة الفاكهة .
Introduction
الدماغ لديه متطلبات طاقة عالية بسبب التكلفة العالية لاستعادة التدرجات الأيونية في الخلايا العصبية الناتجة عن توليد الإشارات الكهربائية العصبية ونقلها ، وكذلك النقل المشبكي 1,2. يعتقد منذ فترة طويلة أن هذا الطلب المرتفع على الطاقة يتم تلبيته من خلال الأكسدة المستمرة للجلوكوز لإنتاج ATP3. تنقل ناقلات محددة عند الحاجز الدموي الدماغي الجلوكوز في الدم إلى الدماغ. تضمن مستويات نسبة السكر في الدم الثابتة أن يتلقى الدماغ إمدادات ثابتة من الجلوكوز4. ومن المثير للاهتمام ، أن الأدلة التجريبية المتزايدة تشير إلى أن الجزيئات المشتقة من استقلاب الجلوكوز ، مثل اللاكتات والبيروفات ، تلعب دورا مهما في إنتاج طاقة خلايا الدماغ 5,6. ومع ذلك ، لا يزال هناك بعض الجدل حول مدى أهمية هذه الجزيئات لإنتاج الطاقة والخلايا في الدماغ التي تنتجها أو تستخدمها 7,8. إن الافتقار إلى الأدوات الجزيئية المناسبة ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية المطلوبة لهذه المهمة هو قضية مهمة حالت دون حل هذا الجدل تماما.
أدى تطوير وتطبيق العديد من أجهزة الاستشعار الأيضية الفلورية المهندسة إلى زيادة ملحوظة في فهمنا لمكان وكيفية إنتاج المستقلبات واستخدامها ، وكذلك كيفية حدوث التدفقات الأيضية أثناء النشاط العصبي القاعديوالعالي 9. ساهمت المستشعرات الأيضية المشفرة وراثيا القائمة على الفحص المجهري لنقل طاقة الرنين Förster (FRET) ، مثل ATeam (ATP) و FLII12Pglu700μδ6 (الجلوكوز) و Laconic (اللاكتات) و Pyronic (البيروفات) ، في فهمنا لعملية التمثيل الغذائي لطاقة الدماغ10،11،12،13. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع التكاليف والمعدات المتطورة اللازمة لإجراء التجارب على أو الأنسجة الحية ، لا تزال النتائج في نماذج الفقاريات تقتصر في المقام الأول على مزارع الخلايا (الخلايا الدبقية والخلايا العصبية).
كشف الاستخدام الناشئ لنموذج ذبابة الفاكهة للتعبير عن هذه المستشعرات أن السمات الأيضية الرئيسية محفوظة عبر الأنواع ويمكن معالجة وظيفتها بسهولة باستخدام هذه الأداة. والأهم من ذلك ، أن نموذج ذبابة الفاكهة قد ألقى الضوء على كيفية نقل الجلوكوز واللاكتات / البيروفات واستقلابهما في دماغ الذبابة ، والعلاقة بين استهلاك أحادي الكربوكسيل وتكوين الذاكرة ، والعرض التوضيحي الرائع لكيفية تداخل الزيادات في النشاط العصبي والتدفق الأيضي14،15،16،17. الطريقة المعروضة هنا لقياس مستويات الكربوكسيل الأحادي والجلوكوز و ATP باستخدام مستشعرات FRET المشفرة وراثيا المعبر عنها في دماغ اليرقات تسمح للباحثين بمعرفة المزيد حول كيفية استخدام دماغ ذبابة الفاكهة للطاقة ، والتي يمكن تطبيقها على أدمغة الأخرى.
نظهر أن هذه الطريقة فعالة للكشف عن اللاكتات والجلوكوز في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية ، وأن ناقل أحادي الكربوكسيلات (Chaski) يشارك في استيراد اللاكتات إلى الخلايا الدبقية. نوضح أيضا طريقة بسيطة لدراسة تغيرات الأيض أثناء زيادة النشاط العصبي ، والتي يمكن أن تحدث بسهولة عن طريق تطبيق حمام لمضادات مستقبلات GABAA . وأخيرا، نوضح أنه يمكن استخدام هذه المنهجية لقياس انتقال الكربوكسيل الأحادي والجلوكوز في الأنسجة الأخرى ذات الأهمية الأيضية، مثل الأجسام الدهنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. صيانة سلالة الذباب وتزامن اليرقات
- لإجراء هذه التجارب ، استخدم مزارع الذباب التي يتم تربيتها عند 25 درجة مئوية على طعام ذبابة الفاكهة القياسي المكون من 10٪ خميرة ، 8٪ جلوكوز ، 5٪ دقيق قمح ، 1.1٪ أجار ، 0.6٪ حمض البروبيونيك ، و 1.5٪ ميثيل بارابين.
- لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم الأسطر التالية: w1118 (خلفية التحكم التجريبي) ، OK6-GAL4 (برنامج تشغيل الخلايا العصبية الحركية) ، repo-GAL4 (برنامج تشغيل لجميع الخلايا الدبقية) ، CG-GAL4 (سائق الأجسام الدهنية) ، UAS-Pyronic (مستشعر البيروفات) ، UAS-FLII12Pglu700μδ6 (مستشعر الجلوكوز) ، UAS-Laconic (مستشعر اللاكتات) ، UAS-GCaMP6f (مستشعر الكالسيوم) ، UAS-AT1.03NL (مستشعر ATP) و UAS-Chk RNAi GD1829. جميع الخطوط التي تعبر عن أجهزة الاستشعار أو RNAi موجودة في الخلفية الجينية w1118 .
- للحصول على يرقات متجولة ثالثة متزامنة ، ضع 300 ذبابة (3-5 أيام ، 100 ذكر ، 200 أنثى عذراء) من التهجين الجيني المطلوب في غرفة وضع البيض ، والتي تحتوي على طبق بتري 60 مم مغطى بأغاروز 1٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). ضع قطرة من الخميرة السائلة / الكريمية (قطرها 1.5 سم) في وسط اللويحة لتشجيع الذباب على وضع البيض (الشكل 1).
- احتفظ بالذباب عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام مع استبدال طبق بتري الأغاروز بآخر طازج وخميرة مذابة طازجة مرتين يوميا.
- اسمح للذباب بوضع البيض لمدة 4 ساعات في اليوم الرابع قبل تغيير طبق بتري. قم بإزالة هذه اللوحة. ثم ، لمدة 3 ساعات ، اسمح للذباب بوضع البيض في لوحة أغاروز جديدة مع خميرة مذابة حديثا. استخدم هذه اليرقات في التجارب.
- بعد 3 ساعات ، قم بإزالة اللويحة التي تحتوي على البيض وضعها في حاضنة 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- اجمع 50 إلى 100 يرقة حديثة الفقس من هذه اللوحة (0 ساعة بعد فقس اليرقات) وضعها في قنينة بلاستيكية تحتوي على طعام قياسي. للسماح لليرقات بالتغذية بشكل صحيح ، تأكد من أن الطعام مطحون وناعم. استخدم اليرقات بعد 96 ساعة من النقل.
2. جعل أغطية الزجاج مع بولي L- ليسين
- نفذ هذه الخطوة 1 ساعة قبل تشريح اليرقات. في لوحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار ، ضع أغطية زجاجية مقاس 25 مم (يعتمد قطر الأغطية المستخدمة على غرفة التسجيل المتوفرة في المجهر).
- ضع قطرة (300 ميكرولتر) من بولي-إل-ليسين في وسط كل غطاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل كل غطاء 3x بالماء المقطر ، ثم 2x بمحلول ملحي خال من Ca2+ (نفس المحلول المستخدم لتشريح اليرقات ، انظر الخطوة 3.2). قم بتثبيت الأغطية في غرفة التسجيل واملأها بمحلول ملحي خال من الكالسيوم2+.
ملاحظة: على الرغم من أن دماغ اليرقات يمكن أن يلتصق مباشرة بأغطية الزجاج ، إلا أن الالتصاق ضعيف ، ويتحرك الدماغ أحيانا أو يزيح أثناء التجربة بسبب التدفق المستمر للمحلول الملحي. تقلل إضافة خطوة poly-L-lysine من خطر الحركات أو حتى فقدان الدماغ نتيجة للغسل.
3. تشريح الحبل العصبي البطني (VNC) والأجسام الدهنية (FBs)
- اجمع اليرقات الثالثة المتجولة من التهجين الجيني المطلوب (من الخطوة 1.7) واغسلها جيدا 3 مرات بالماء المقطر.
- ضع اليرقات في طبق تشريح زجاجي يحتوي على 750 ميكرولتر من محلول ملحي مثلج بارد صفري اسميا يتكون من 128 mM NaCl و 2 mM KCl و 4 mM MgCl2 و 5 mM trehalose و 5 mM HEPES و 35 mM سكروز (الرقم الهيدروجيني = 6.7 ، يقاس بمقياس الأس الهيدروجيني ويتم تعديله باستخدام 1 M NaOH و HCl 37٪ v / v).
ملاحظة: يعد ضبط الأس الهيدروجيني على 6.7 أمرا بالغ الأهمية لأنه ، كما لوحظ سابقا ، يعتمد النقل أحادي الكربوكسيل بشكل كبير على الرقم الهيدروجيني للمحلول. بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق 6.7 مع الرقم الهيدروجيني في الدملمف ليرقة ثالثة17,18. - ضع اليرقة تحت المجهر المجسم وقم بعمل قطع عرضي عبر الجزء الخلفي من البطن باستخدام زوج من الملقط.
- ادفع الفك بالملقط أثناء قلب اليرقات من الداخل للخارج.
- راقب الحبل العصبي البطني (VNC) بجوار الفك. قم بإزالة الأقراص الوهمية والأنسجة الذيلية المتبقية في الدماغ بعناية.
- افصل VNC مع الدماغ المركزي والفصوص البصرية عن بقية الأنسجة عن طريق قطع الأعصاب. انقل VNC ، والتقاطه بالملقط من الأعصاب المتبقية ، ووضعه في غرفة التسجيل التي تحتوي على محلول التسجيل الخالي من الكالسيوم2+ (نفس الحل من الخطوة 3.2). سوف تلتزم VNCs على الفور بأغطية الغطاء.
- لتجنب التداخل من الأعصاب المتبقية ، قم بتثبيتها في الجزء السفلي من غطاء الغطاء باستخدام ملقط (ستكون الأعصاب أيضا فلورية اعتمادا على خط السائق المستخدم) (الشكل 2).
- لإجراء تجارب على الأجسام الدهنية (FBs) لقياس نقل الجلوكوز أو أحادي الكربوكسيل في مجموعة أخرى من التجارب ، تابع عزل الأنسجة باتباع الخطوات 3.1-3.4. بمجرد قلب اليرقات من الداخل إلى الخارج ، لاحظ أن FB عبارة عن نسيج أبيض ثنائي مسطح.
- ضع FBs المعزولة التي تعبر عن مستشعرات FRET (التي تم الحصول عليها من تقاطع جيني باستخدام برامج التشغيل المناسبة) في غرفة التسجيل التي تحتوي على محلول التسجيل بدون Ca2+.
ملاحظة: FB كاره للماء للغاية (يميل إلى الطفو على سطح المحلول) وعرضة للغاية للتلاعب بالملقط ، ويجب التعامل معه بحذر. أي معالجة تقريبية لهذا النسيج ستؤدي إلى خلايا ميتة في وقت لاحق (مع انخفاض مضان أجهزة الاستشعار). - ضع حجرة التسجيل التي تحتوي على VNCs / FBs على مرحلة المجهر.
4. تصوير الخلايا الحية
- للحصول على صور لأجهزة استشعار التعبير عن الأنسجة ، استخدم مجهرا مضانا مستقيما مقترنا بنظام تقسيم الانبعاثات وكاميرا CCD. قم بتشغيل نظام الإضاءة للمجهر قبل 30 دقيقة من بدء أي تجربة.
ملاحظة: هنا نستخدم مجهر مضان القرص الدوار المجهز بهدف غمر الماء 20x / 0.5 لمراقبة كل من VNCs و FBs. يوضح الشكل 2 أيضا استخدام هدف الغمر في الماء 40x / 0.8. - لتصور مضان GCaMP6f ، اضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث عند 488 نانومتر و 540 نانومتر على التوالي. بالنسبة لأجهزة استشعار مقتضبة / بيرونيك / ATP / الجلوكوز ، اضبط الطول الموجي للإثارة على 440 نانومتر والأطوال الموجية للانبعاث عند 488 نانومتر (mTFP ، CFP) و 540 نانومتر (كوكب الزهرة ، YFP).
- احصل على صور بحجم 512 × 512 بكسل كل 2 ثانية ل GCaMP6f وكل 10-30 ثانية لأجهزة استشعار مقتضبة / بيرونيك / ATP / جلوكوز. تحديد التعرض الأمثل لمصدر الضوء مع مراعاة جودة الصورة التي تم الحصول عليها. لاتباع هذا البروتوكول ، تأكد من أن الصور من التعرض 300 مللي ثانية لأجهزة الاستشعار Laconic و Pyronic و 100-150 مللي ثانية لأجهزة استشعار الجلوكوز و ATP .
ملاحظة: يمكن أن يختلف التعرض اعتمادا على استخدام مجهر مضان متحد البؤر أو عادي. - بمجرد تثبيت غرفة التسجيل في مرحلة المجهر ، ضع هدف الغمر في الماء بعناية وتأكد من أن الهدف يظل مغمورا طوال التجربة. حافظ على درجة حرارة الغرفة عند 25 درجة مئوية.
- قم بتوصيل غرفة التسجيل بنظام التروية وحافظ على الأنسجة مغمورة في محلول التسجيل الذي يحتوي على 128 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2 مللي مول KCl ، 1.5 مللي متر CaCl2 ، 4 mM MgCl2 ، 5 mM trehalose ، 5 mM HEPES ، و 35 mM السكروز ، الرقم الهيدروجيني 6.7 (يقاس بمقياس الأس الهيدروجيني ويتم تعديله باستخدام NaOH و HCl).
- حافظ على تدفق مستمر قدره 3 مل / دقيقة من محلول التسجيل عبر الأنسجة باستخدام الجاذبية ، مقترنا بمضخة تمعجية منخفضة التدفق لاستخراج السائل من الغرفة مع الحفاظ على الحجم ثابتا. لتحقيق التدفق المطلوب ، ضع الأنابيب المحتوية على المحلول (أنابيب بلاستيكية سعة 50 مل) على ارتفاع 25 سم فوق مرحلة المجهر.
ملاحظة: يستخدم هذا التدفق المدفوع بالجاذبية لمنع حركة الأنسجة الناتجة عن المضخات التمعجية ، مما يسمح بتحليل أكثر دقة للصور لاحقا. - قبل أي تحفيز ، حافظ على تدفق محلول التسجيل لمدة 5-10 دقائق للحصول على خط أساس ثابت من التألق من المستشعرات. قم بتغيير المدة حسب الضرورة للحصول على خط الأساس هذا.
- استبدل المحلول المتدفق بمحلول التحفيز لمدة 5 دقائق لتحفيز VNC / FBs (مع الجلوكوز أو البيروفات أو اللاكتات بالتركيز الموصوف لكل تجربة مذابة في محلول ملحي ؛ انظر كل شكل).
ملاحظة: يمكن أن تختلف مدة التحفيز وفقا لاحتياجات التجربة (على سبيل المثال ، يمكن زيادة نبضات الجلوكوز إلى 10 دقائق للوصول إلى هضبة في الخلايا العصبية ، كما ورد سابقا16). - للحفاظ على الأسمولية في محلول التحفيز ، قم بتصحيح تركيز السكروز (كربوهيدرات غير قابلة للاستقلاب بواسطة دماغ ذبابة الفاكهة ) وفقا لتركيز أحادي الكربوكسيل أو الجلوكوز المضاف.
- قم بتغيير الحلول باستخدام نظام بسيط من الصمامات. احرص على عدم تحريك مرحلة المجهر.
- تعريض VNC إلى 80 ميكرومتر بيكروتوكسين (PTX ، يتدفق باستمرار) لتحفيز النشاط العصبي. يزيد هذا الإجراء من تواتر تذبذبات الكالسيوم2+ ، مما يجعل من الممكن ملاحظة التغيرات في الجزيئات ذات الصلة بالتمثيل الغذائي (على سبيل المثال ، ATP داخل الخلايا).
- في نهاية أي تجربة ، اغسل نظام التدفق الكامل جيدا ، بما في ذلك الأنابيب وغرفة التسجيل ، لمدة 10 دقائق على الأقل بالمحلول الملحي و 10 دقائق أخرى بالماء المقطر للتخلص من أي أثر للحلول المستخدمة.
5. معالجة الصور وتحليل البيانات
- لمعالجة الصور التي تم الحصول عليها ، تابع الخطوات الموضحة في الشكل 3.
- استيراد الصورة (مقتضب) إلى برنامج ImageJ. تحتوي الصورة على عرضين للعينة: الصورة اليسرى هي إشارة mTFP والأخرى الموجودة على اليمين هي إشارة الزهرة. حدد منطقة تتضمن الخلايا المراد تحليلها وافصل هذه الصور (mTFP والزهرة) في نافذة جديدة. تأكد من أن هذه الصور تحتوي على نفس المنطقة بالضبط.
- افتح المكون الإضافي للتسجيل وقم بتصحيح الانجراف الصغير للأنسجة الذي يتم ملاحظته عادة في التجربة مع وظيفة الجسم الصلب. قم بإجراء ذلك في كلتا الصورتين (mTFP والزهرة).
- حدد ما لا يقل عن 10 مناطق ذات أهمية (ROIs) في السيتوسول للخلايا العشر المقابلة في إشارة mTFP (488 نانومتر) وانقل التحديدات إلى صورة كوكب الزهرة (540 نانومتر).
- حدد اثنين أو ثلاثة من عائد الاستثمار بالقرب من الخلايا التي يتم تحليلها ولكن بدون إشارة واضحة (دائما داخل VNC أو الأنسجة التي تم تحليلها ، انظر الشكل 3). هذه هي عائد الاستثمار في الخلفية.
- مع تحديد عائد الاستثمار في كلتا الصورتين ، احصل على متوسط القيمة الرمادية لكل إشارة باستخدام مقياس الوظيفة. انقل البيانات إلى ورقة بيانات واطرح متوسط قيمة الخلفية لكل إشارة.
- تحديد نسبة مضان mTFP على كوكب الزهرة (للمقتضب والبيرونيك). يتم حساب هذه القيمة بشكل مختلف عن مستشعرات FRET الأخرى الموصوفة هنا (حيث تكون النسبة عادة YFP / CFP) لأنه عند ربطها بالركائز الخاصة بكل منها ، يقلل كل من Laconic و Pyronic من كفاءة FRET الخاصة بهما.
- تطبيع البيانات بقسمة كل قيمة مسجلة على خط الأساس. في ورقة بيانات منفصلة ، احسب خط الأساس بأخذ القيمة المتوسطة لنسبة mTFP / Venus خلال 2 دقيقة قبل التحفيز.
- بالنسبة لقياسات الجلوكوز و ATP باستخدام أجهزة الاستشعار المستندة إلى FRET ، احسب نسبة YFP / CFP ، وقم بتطبيع البيانات كما هو موضح في الخطوة 5.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لمدة تصل إلى 1 ساعة ، يسمح هذا الإجراء بقياس سهل للتغيرات داخل الخلايا في مضان مستشعرات أحادي الكربوكسيل والجلوكوز. كما هو موضح في الشكل 4 ، تستجيب المستشعرات المقتضبة في كل من الخلايا الدبقية والخلايا العصبية الحركية لاكتات 1 mM بمعدل مماثل في بداية النبضة ، لكن الخلايا العصبية الحركية تصل إلى زيادة أعلى عن خط الأساس خلال نبضة 5 دقائق ، كما هو موضح سابقا17. تم اختيار تركيز اللاكتات هذا لأنه يمكن مقارنته بالمستويات الموجودة في الدملمف من يرقات الطور الثالث. وبالمثل ، عندما تعرضت مستشعرات الجلوكوز التي تعبر عن VNC للجلوكوز 5 مللي متر (قيمة مماثلة لتلك التي تم قياسها في الدمليمف من قبلنا وآخرين19) ، زادت إشارة المستشعر بمعدل مماثل في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية. ومع ذلك ، أثناء نبض الجلوكوز ، تزداد الإشارة في الخلايا العصبية أكثر من الخلايا الدبقية. وهذا يتفق مع الملاحظات السابقة لاستعدادات مماثلة للتعبير عن مستشعر FRET16.
يمكن استخدام هذا المستحضر لإجراء تجارب على ناقلات أحادية الكربوكسيل والجلوكوز غير الموصوفة المعبر عنها في الخلايا الدبقية لذبابة الفاكهة أو الخلايا العصبية20. هنا نمثل استخدام تداخل الحمض النووي الريبي لإظهار أن Chaski (Chk) ، الذي كان معروفا سابقا بنقل أحادي الكربوكسيلات في الخلايا غير المتجانسة ، ينقل اللاكتات في الخلايا الدبقية (الشكل 5). في ظل ظروف تقييد التغذية ، تم وصف هذا الناقل بأنه يلعب دورا مهما في فسيولوجيا وسلوكه21. وجدنا أنه في الخلايا الدبقية ، أدى التخلص من Chk إلى تقليل نقل اللاكتات مقارنة بالتحكم في VNCs المعرضة ل 1 mM lactate (الشكل 5). يمكن اختبار الناقلات المفترضة الأخرى لمعرفة ما إذا كان بإمكانها نقل المستقلبات في الظروف الفسيولوجية والمرضية.
لمعالجة دراسة التغيرات الأيضية المرتبطة بالنشاط العصبي ، قمنا بتطوير طريقة بسيطة لزيادة النشاط العصبي دون استخدام إجراءات معقدة تقنيا مثل علم البصريات الوراثي ، والتي يمكن أن تتداخل مع قياسات مستشعر FRET (الشكل 6). تعرض VNC المعزول إلى Picrotoxin (PTX) ، وهو مضاد معروف لمستقبلات GABAA استخدمناه سابقا نحن وآخرون17,22. يزيد التركيز المستخدم من تواتر تذبذبات الكالسيوم في الخلايا العصبية (كما تم قياسها من خلال التغيرات في مضان GCaMP6f) بالإضافة إلى التغيرات الكبيرة في الجزيئات ذات الصلة بالتمثيل الغذائي مثل الجلوكوز واللاكتاتوالبيروفات 17. علاوة على ذلك ، تؤدي الزيادات التي يسببها PTX في النشاط العصبي إلى انخفاض مؤقت في مستويات ATP في سوما الخلايا العصبية الحركية. سبق وصف هذه الظاهرة في نماذج الفقاريات التي زاد فيها النشاط العصبي عن طريق التحفيز الكهربائي أو باستخدام مضادات مستقبلات GABAA 23,24. نتيجة لذلك ، يمكن استخدام هذا النموذج لتتبع التغيرات الأيضية في مجموعات فرعية محددة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، مما يلبي الحاجة إلى الناقلات المرتبطة بالطاقة التي تساهم في إنتاج ATP أثناء النشاط العصبي العالي.
نقل الجلوكوز وأحادي الكربوكسيلات مهمان أيضا في الأنسجة أو الخلايا الأخرى غير الدماغ. نعرض هنا تصور أحادي الكربوكسيلات (اللاكتات / البيروفات) وامتصاص الجلوكوز في الأجسام الدهنية ، وهو نسيج ذي صلة بالتمثيل الغذائي موجود في اليرقات والذبابة البالغة التي لها العديد من الوظائف الرئيسية مثل تخزين الدهون والتمثيل الغذائي25. يتم التعبير عن مستشعر Laconic بشكل جيد في FB ، كما هو موضح في الشكل 7 ، حيث يمكن رؤية قطرات الدهون على أنها كرات سوداء صغيرة داخل الخلية. يلتصق هذا النسيج المعزول جيدا بأغطية الغلاف المطلية بالبولي L-lysine ، مما يسمح بإجراء تصوير خلوي طويل الأمد يسهل تحليله أيضا. لاحظنا زيادة كبيرة في مضان مستشعر الجلوكوز عندما تعرض FB لزيادة تركيزات الجلوكوز (حوالي 5 مللي مول) ، وهو قريب من تركيز الجلوكوز الموجود في الدملمف. لا يؤدي التعرض الإضافي لتركيزات أعلى من الجلوكوز (10 مللي مول) إلى الزيادة المتوقعة في مضان المستشعر. أخيرا ، في FB ، تمكنا من قياس استيراد اللاكتات والبيروفات (الشكل 7C ، D). في هذه الحالة ، تؤدي زيادة تركيزات اللاكتات والبيروفات إلى زيادة نسبية في مضان لاكوني وبيرونيك (يتراوح من 0.1 إلى 1 مللي مول). تؤدي تركيزات الكربوكسيل الأعلى إلى تشبع الإشارة داخل الخلايا.
الشكل 1: تزامن يرقات ذبابة الفاكهة . يتم تصوير إجراء تزامن اليرقات بيانيا. قبل ساعتين من بدء العملية ، يجب تحضير ألواح الأغاروز بنسبة 1٪ وتغييرها مرتين يوميا حتى اليوم 4. يجب جمع يرقات الفقس بعناية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: دماغ يرقات ذبابة الفاكهة المعزولة يعبر عن مستشعر اللاكتات مقتضب. (أ) صورة تمثيلية ليرقة ذبابة الفاكهة المعزولة من الدرجة الثالثة VNC ملتصقة بغطاء مغلف ببولي-L-lysine وتعبر عن مستشعر اللاكتات Laconic في الخلايا العصبية الحركية (OK6-GAL4). تظهر الصور صورة برايت فيلد ل VNC (يسار) ومضان mTFP للمستشعر (اللوحة الوسطى) تم التقاطه بهدف غمر الماء 20x. الصور الموجودة في اللوحة السفلية هي من نفس VNC التي تم التقاطها بهدف غمر الماء 40x. (ب) الخلايا العصبية الحركية من VNC التي تعبر عن مستشعر اللاكتات المقتضب (OK6>Laconic) الموضوعة في محلول ملحي خال من اللاكتات. تصور الصورة مضان mTFP (يسار) ، ومضان الزهرة (في الوسط) ، والنسبة بين التألقين (على اليمين ، تم إنتاجه باستخدام المكون الإضافي Ratio Plus لبرنامج ImageJ). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر (أ ، اللوحة العلوية) ، 10 ميكرومتر (اللوحة السفلية ، ب). الاختصارات: VNC = الحبل العصبي البطني. mTFP = بروتين فلوري أحادي البط البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليلات خطوة بخطوة للصور. رسم تخطيطي لبروتوكول برنامج ImageJ لتحليل الصور ، وعرض العملية (العمود الأول) ، وأوامر ImageJ (العمود الثاني) ، ونتائج معالجة الصور (العمود الثالث). يبدأ المثال بصورة خام مأخوذة من VNC تعبر عن مستشعر اللاكتات اللاكوني في الخلايا العصبية الحركية (OK6-GAL4). الاختصارات: VNC = الحبل العصبي البطني. mTFP = بروتين فلوري أحادي البط البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نقل الكربوكسيل الأحادي والجلوكوز في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في دماغ يرقات ذبابة الفاكهة . (أ) صور تمثيلية ل VNC تعبر عن مستشعر اللاكتات مقتضب في الخلايا العصبية الحركية (OK6-Gal4> مقتضب). يظهر مضان مقتضب في الخلايا العصبية الحركية قبل وأثناء وبعد نبضة 5 دقائق من 1 مللي متر من اللاكتات. تم استخدام المكون الإضافي Ratio Plus الخاص ب ImageJ لإنشاء صور نسبة (mTFP / Venus). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (B) تسجيلات تمثيلية لإشارات FRET من VNCs المعزولة التي تعبر عن مستشعر اللاكتات اللاكوني في الخلايا العصبية الحركية (OK6-GAL4 ، الخطوط الرمادية) أو الخلايا الدبقية (REPO-GAL4 ، الخطوط السوداء) المعرضة ل 1 mM lactate لمدة 5 دقائق. تصور الآثار إشارات FRET المعدلة إلى متوسط القيمة التي تم جمعها قبل 2 دقيقة من التعرض للاكتات. (C) تسجيلات تمثيلية لإشارات FRET من VNCs المعزولة التي تعبر عن مستشعر الجلوكوز FLII12Pglu700μδ6 في الخلايا العصبية الحركية (OK6-GAL4 ، الخطوط الرمادية) أو الخلايا الدبقية (REPO-GAL4 ، الخطوط السوداء) المعرضة للجلوكوز 5 مللي متر لمدة 5 دقائق. تصور الآثار إشارات FRET المعدلة إلى القيمة المتوسطة التي تم جمعها قبل دقيقتين من التعرض للجلوكوز. الاختصارات: VNC = الحبل العصبي البطني. mTFP = بروتين فلوري أحادي البط البري ؛ الحنق = نقل طاقة الرنين Föster. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: انتقال اللاكتات في الخلايا الدبقية في دماغ يرقات ذبابة الفاكهة معبرا عن Chaski RNAi. (أ) تم تعريض VNC المعزول الذي يعبر عن مستشعر اللاكتات Laconic وحده (التحكم الجيني ، w1118 ، الخط الأسود) أو المشاركة في التعبير عن RNAi إلى تعبير Chaski (Chk) (chk-RNAi ، أرجواني) إلى 1 mM Lactate لمدة 5 دقائق. لكل حالة ، تمثل الآثار متوسط قيمة FRET التي تم الحصول عليها من سبعة VNCs منفصلة (70 خلية لكل حالة ، تم تطبيعها باستخدام القيمة المتوسطة التي تم الحصول عليها قبل 2 دقيقة من التعرض للاكتات). (ب) تستخدم المساحة أسفل المنحنى في A لحساب تراكم اللاكتات داخل الخلايا. لكل حالة ، القيم هي متوسط SE من 70 خلية وسبع تجارب مستقلة (التحكم أو chk-RNAi). تم استخدام اختبار t للطالب غير المزاوج للتحليل الإحصائي (* p < 0.05). الاختصارات: VNC = الحبل العصبي البطني. الحنق = نقل طاقة الرنين Föster. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التغيرات في مستويات ATP العصبية الناتجة عن التعرض للبيكروتوكسين. تسجيلات التألق التي تم التقاطها من VNCs معبرة عن مستشعر الكالسيوم المشفر وراثيا (A) GCaMP6f أو (B ، مجموعة مختلفة من التجارب) مستشعر ATP AT1.03NL في الخلايا العصبية الحركية (OK6-GAL4) التي تعرضت لمضادات مستقبلات GABAA Picrotoxin (80 ميكرومتر) خلال الوقت المشار إليه بالخط. يأتي التسجيل التمثيلي من خلية عصبية حركية واحدة من VNC (في A) أو متوسط ± SE من 10 خلايا من VNC واحد (في B) تم تطبيعه إلى القيم المتوسطة التي تم الحصول عليها قبل 2 دقيقة من التعرض ل PTX. الاختصارات: VNC = الحبل العصبي البطني. PTX = بيكروتوكسين. SE = خطأ قياسي ؛ CFP = بروتين الفلورسنت السماوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: نقل أحادي الكربوكسيل والجلوكوز في الأجسام الدهنية لذبابة الفاكهة . (أ) صورة للجسم الدهني المعزول من يرقات الطور الثالث معبرا عن مستشعر اللاكتات Laconic (مضان mTFP). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (B) آثار تمثيلية للإشارة الطبيعية التي تم التقاطها في FB والتي تعبر عن مستشعر الجلوكوز (FLII12Pglu700μδ6) المعرض للجلوكوز (1 و 5 و 10 mM من الجلوكوز). تم تطبيع البيانات إلى أول 2 دقيقة قبل التعرض للجلوكوز. (ج، د) آثار تمثيلية للإشارة الطبيعية التي تم الحصول عليها من FB معبرة عن مستشعر اللاكتات (C) أو مستشعر البيروفات (D) المعرض ل 0.1-0.5-1 mM من اللاكتات أو البيروفات. تم تطبيع البيانات إلى أول 2 دقيقة قبل التعرض للاكتات أو البيروفات. الاختصارات: FB = الجسم الدهني. mTFP = بروتين فلوري أحادي البط البري ؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر ؛ CFP = بروتين الفلورسنت السماوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد استخدام نموذج ذبابة الفاكهة لدراسة استقلاب الدماغ جديدا نسبيا26 ، وقد ثبت أنه يشترك في خصائص أكثر مع استقلاب الثدييات مما كان متوقعا ، والذي تمت دراسته بشكل أساسي في المختبر في مزارع الخلايا العصبية الأولية أو شرائح الدماغ. تتفوق ذبابة الفاكهة في التجارب في الجسم الحي بفضل بطارية الأدوات الوراثية وأجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا المتاحة التي تسمح للباحثين بتصور التغيرات الأيضية الناجمة عن النشاط المستحث أو حتى استجابة لمحفز حسي في الوقت الفعلي.
يوضح البروتوكول الموصوف هنا كيفية قياس نقل أحادي الكربوكسيل والجلوكوز في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية في ذبابة الفاكهة VNC في إعداد خارج الجسم الحي يسمح باستخدام مستشعرات التمثيل الغذائي الفلورية المشفرة وراثيا بناء على الفحص المجهري FRET لعمل مقاطع فيديو بفاصل زمني للتغيرات الأيضية في الخلايا العصبية النشطة والراحة. يمكن تركيب هذا البروتوكول وتنفيذه بسهولة في أي مختبر باستخدام نموذج ذبابة الفاكهة دون استخدام آلات معقدة ، باستخدام مجهر فوق فلوري مجهز بنظام تقسيم الانبعاثات. يمكن أيضا تحجيمه إلى معدات أكثر تقدما مثل القرص الدوار أو الليزر البؤري أو المجاهر ثنائية الفوتون (ولكن يلزم وجود مقسم لتقسيم انبعاث الضوء) لتسجيل خلايا معينة تقع بعمق أكبر في الدماغ كما يحدث في دماغ ذبابة الفاكهة البالغة. نظرا لأن هذه الأنواع من الإشارات الأيضية بطيئة نسبيا ، فليست هناك حاجة إلى كاميرا فيديو سريعة أو باهظة الثمن.
بالإضافة إلى ذلك ، لا يحتاج إعداد VNC أو FB المعزول إلى طريقة متطورة لتصحيح الحركة اللازمة أحيانا للتسجيلات في الجسم الحي . يمكن لمكونات ImageJ الإضافية تصحيح معظم حركات VNCs التي يتم إنتاجها أثناء التجربة بشكل مرض. نتيجة لذلك ، يمكن إجراء الزيادة في النشاط العصبي عن طريق إضافة PTX أو إضافة المستقلبات ذات الصلة بشكل متزامن دون المشاكل الناجمة عن تقلص عضلات الجسم الطبيعي ، كما هو موضح في بروتوكولات أخرى (مثل تحضير فيليه)27.
نعرض تجارب تمثيلية يتم فيها ملاحظة نقل اللاكتات والجلوكوز بوضوح عند تركيزات هذه المستقلبات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (1 و 5 mM ، على التوالي). من هنا ، من المتوقع أن يتم اختبار أي جين غير مميز أو بروتين تم الإبلاغ عنه مسبقا لقدرة النقل في ظروف مختلفة ، مثل استخدام نماذج مختلفة من الأمراض التنكسية العصبية أو الإهانات الأيضية (الوجبات الغذائية عالية السعرات الحرارية أو تقييد المغذيات). في هذا الصدد ، نظهر أن ضربة قاضية بوساطة RNAi لناقل أحادي الكربوكسيلات معروف تقلل من نقل اللاكتات في الخلايا الدبقية بشكل كبير. ومن المثير للاهتمام ، أن الإشارات التي تم الحصول عليها من أجهزة الاستشعار Laconic و Pyronic حساسة للغاية للتغيرات في اللاكتات أو البيروفات في الوسائط ، مما يسمح بقياس دقيق للتغيرات داخل الخلايا في هذه الأيضات. يبدو أن هذا النطاق الديناميكي الواسع للإشارة مختلف في خلايا الثدييات حيث لوحظت علاقة غير خطية بين إشارة المستشعر وتركيز اللاكتات داخل الخلايا28.
يمكن أن يوفر هذا النهج إجابات لجوانب مهمة حول مكان وزمان معالجة أحادي الكربوكسيل والجلوكوز أو استخدامها لتوليد الطاقة في الدماغ أثناء النشاط العصبي القاعدي والعالي. يمكن أن تسبب الزيادة في النشاط العصبي الناجم عن PTX تغيرات كبيرة في المستقلبات المرتبطة بالطاقة ، بطريقة مماثلة لما شوهد في مزارع الخلايا وشرائح الدماغ والكائنات الحية23,24. على وجه التحديد ، تحدث زيادة في إنتاج ATP بعد دقائق من زيادة النشاط العصبي ، على الأرجح بسبب استقلاب الجلوكوز وتبادل اللاكتات والبيروفات بين الخلايا الدبقية والخلايا العصبية ، كما ورد سابقا17. يمكن دراسة احتياجات خلايا معينة لتوريد الجلوكوز والكربوكسيل الأحادي ، وكذلك الآليات الكامنة وراء نقلها أو توليدها ، من خلال التلاعب بالتعبير عن جينات معينة بالتزامن مع استخدام أجهزة استشعار مشفرة وراثيا.
يمكن للأنسجة الأخرى المهمة من الناحية الأيضية أن ترتبط بسهولة بأغطية مغلفة ببولي-L-lysine ويتم تصوير تغييرات الأيض لعدة دقائق. يمكن دراسة الناقلات الجديدة التي تتوسط نقل الجلوكوز أو اللاكتات في الأنسجة المختلفة. يتم نقل الجلوكوز المتداول لإنتاج ثلاثي السكاريد ثنائي السكاريد في أجسام الدهون اليرقية عبر آليات غير مفهومة تماما ، ويمكن أن تساعد هذه الطرق في فهم هذا المسار بشكل أفضل. علاوة على ذلك ، في ظل القيود الغذائية ، يمكن استقلاب الأحماض الدهنية لإنتاج أجسام الكيتون في FB ولا تزال الناقلات اللازمة لإخراجها إلى الدملمف غير معروفة.
من المهم ملاحظة أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقدير تراكم المستقلب بمرور الوقت أو لتحديد معدلات الزيادة في مضان جهاز استشعار معين بين الظروف ، ولكن ليس للنظر رسميا في التغييرات في "التركيز" لأن هذا يتطلب معايرة مستشعر في الموقع. تحد طبقات الخلايا العديدة التي تشكل VNC في هذه الحالة من انتشار الجزيئات ، مثل الأيونوفورات ، اللازمة لهذه المعايرة. ومع ذلك ، فإننا ننصح باتباع إرشادات معالجة الصور التي تسمح بمستويات اللاكتات المتناقضة بين الأعضاء أو الخلايا المختلفة داخل29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يعلن المؤلفون عن أي مصالح منافسة أو مالية.
Acknowledgments
نشكر جميع أعضاء مختبر سييرالتا. وحظي هذا العمل بدعم من 11200477 المؤسسة الوطنية للإحصاء (إلى AGG) و FONDECYT 1210586 العادية (إلى JS). تم التبرع ب UAS-FLII12Pglu700μδ6 (مستشعر الجلوكوز) من قبل بيير إيف بلاسايس وتوماس بريات ، CNRS-Paris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
