Summary
在这里，我们提出了一种方案，在 离体果蝇 幼虫脑制剂中使用基于基因编码的 Förster 共振能量转移传感器来可视化神经胶质细胞和神经元中单羧酸盐、葡萄糖和 ATP 的转运。
Abstract
由于电活动导致的大脑的高能量需求是它们最显着的特征之一。通过从葡萄糖及其代谢物（如乳酸单羧酸盐和丙酮酸）生产ATP来满足这些要求。目前尚不清楚这一过程是如何被监管的，或者谁是关键参与者，特别是在 果蝇中。
使用基因编码的基于Förster共振能量转移的传感器，我们提出了一种简单的方法，用于测量离 体果蝇 幼虫脑制剂中神经胶质细胞和神经元中单羧酸盐和葡萄糖的转运。该协议描述了如何解剖并粘附在玻璃盖玻片上表达其中一个传感器的幼虫大脑。
我们展示了整个实验的结果，其中通过敲除神经胶质细胞中先前鉴定的单羧酸转运蛋白来测量幼虫大脑中的乳酸转运。此外，我们还演示了如何快速增加神经元活动并跟踪活跃大脑中的代谢物变化。所描述的方法提供了所有必要的信息，可用于分析其他 果蝇 活组织。
Introduction
由于神经元电信号的产生和传输以及突触传递引起的神经元中恢复离子梯度的成本很高，因此大脑具有很高的能量需求 1,2。长期以来，人们一直认为葡萄糖的持续氧化以产生ATP3可以满足这种高能量需求。血脑屏障处的特异性转运蛋白将血液中的葡萄糖转移到大脑。恒定的血糖水平确保大脑获得稳定的葡萄糖供应 4.有趣的是，越来越多的实验证据表明，源自葡萄糖代谢的分子，如乳酸和丙酮酸，在脑细胞的能量产生中起着重要作用5,6。然而，关于这些分子对能量产生的重要性以及大脑中的哪些细胞产生或使用它们仍然存在一些争论 7,8。缺乏这项任务所需的具有高时间和空间分辨率的适当分子工具是一个重要问题，阻碍了这一争议的完全解决。
几种工程荧光代谢传感器的开发和应用使我们对代谢物的产生和使用地点和方式以及代谢通量在基础和高神经元活动期间如何发生的理解显着增加9。基于Förster共振能量转移（FRET）显微镜的基因编码代谢传感器，如ATeam（ATP）、FLII12Pglu700μδ6（葡萄糖）、Laconic（乳酸）和Pyronac（丙酮酸），有助于我们对脑能量代谢的理解10,11,12,13。然而，由于在活体动物或组织上进行实验所需的高成本和复杂设备，脊椎动物模型的结果仍然主要局限于细胞培养物（神经胶质细胞和神经元）。
果蝇模型表达这些传感器的新兴使用表明，关键的代谢特征在物种之间是保守的，并且可以使用该工具轻松解决其功能。更重要的是，果蝇模型揭示了葡萄糖和乳酸/丙酮酸如何在果蝇大脑中运输和代谢，单羧酸盐消耗与记忆形成之间的联系，以及神经活动和代谢通量的增加如何重叠的显着证明14,15,16,17.这里介绍的方法是使用幼虫大脑中表达的基因编码的FRET传感器来测量单羧酸盐，葡萄糖和ATP水平，使研究人员能够更多地了解果蝇的大脑如何使用能量，这些能量可以应用于其他动物的大脑。
我们发现该方法可有效检测神经胶质细胞和神经元中的乳酸和葡萄糖，并且单羧酸转运蛋白（Chaski）参与乳酸输入神经胶质细胞。我们还展示了一种简单的方法，用于研究神经元活动增加期间代谢物的变化，这可以通过GABAA 受体拮抗剂的沐浴应用轻松诱导。最后，我们表明该方法可用于测量其他代谢重要组织（如脂肪体）中的单羧酸盐和葡萄糖转运。
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Protocol
1.苍蝇菌株维护和幼虫同步
- 为了进行这些实验，在由10%酵母，8%葡萄糖，5%小麦粉，1.1%琼脂，0.6%丙酸和1.5%尼泊金甲酯组成的标准 果蝇 食品上使用在25°C下培养的苍蝇培养物。
- 要遵循此协议，请使用以下行： w1118 （实验控制背景），OK6-GAL4（运动神经元的驱动程序），repo-GAL4（所有神经胶质细胞的驱动程序），CG-GAL4（脂肪体的驱动程序），UAS-Pyronic（丙酮酸传感器），UAS-FLII12Pglu700μδ6（葡萄糖传感器），UAS-Laconic（乳酸传感器），UAS-GCaMP6f（钙传感器），UAS-AT1.03NL（ATP传感器）和UAS-Chk RNAi GD1829。所有表达传感器或 RNAi 的品系都处于 w1118 遗传背景中。
- 为了获得同步的三龄流浪幼虫，将300只所需遗传杂交的苍蝇（3-5天龄，100只雄性，200只处女雌性）放入产卵室中，该产卵室包含一个60毫米的培养皿，上面覆盖着1%琼脂糖在磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）中。在斑块中心放置一滴液体/奶油酵母（直径1.5厘米），以鼓励苍蝇产卵（图1）。
- 将果蝇保持在25°C下3天，用新鲜的培养皿和新鲜溶解的酵母代替琼脂糖培养皿，每天两次。
- 在更换培养皿之前，让苍蝇在第四天产卵4小时。去除此斑块。然后，3小时，让苍蝇在新的琼脂糖斑块中产卵，并带有新鲜溶解的酵母。在实验中使用这些幼虫。
- 3小时后，除去含有鸡蛋的斑块，并将其置于25°C培养箱中24小时。
- 从该斑块中收集50至100只新孵化的幼虫（幼虫孵化后0小时），并将它们放入装有标准食物的塑料瓶中。为了让幼虫正常进食，请确保食物磨碎且柔软。转移后96小时使用幼虫。
2.用聚-L-赖氨酸制作玻璃盖玻片
- 在幼虫解剖前1小时执行此步骤。在6孔细胞培养板中，放置25mm玻璃盖玻片（要使用的盖子的直径取决于显微镜中可用的记录室）。
- 在室温下将一滴（300μL）聚-L-赖氨酸放在每个盖玻片的中心30分钟。
- 用蒸馏水洗涤每个盖玻片3次，然后用不含Ca2+ 的盐水溶液洗涤2次（与用于解剖幼虫的溶液相同，参见步骤3.2）。将盖子安装在记录室中，并用不含 Ca2+ 的盐水溶液填充。
注意：虽然幼虫脑可以直接粘附在玻璃盖玻片上，但粘附性较弱，并且由于盐水溶液的连续流动，在实验过程中大脑偶尔会移动或移位。添加聚-L-赖氨酸步骤可降低因洗涤而导致的运动甚至脑损失的风险。
3. 解剖腹侧神经索 （VNC） 和脂肪体 （FB）
- 从所需的遗传杂交（从步骤1.7开始）收集游荡的三龄幼虫，并用蒸馏水彻底清洗它们3次。
- 将幼虫置于含有750μL标称零Ca2+冰冷盐水溶液的玻璃解剖皿孔中，该溶液由128mM NaCl，2mM KCl，4mM MgCl 2,5mM海藻糖，5mM HEPES和35mM蔗糖组成（pH = 6.7，用pH计测量并用1M NaOH和HCl 37% v / v调节）。
注意：将pH值设置为6.7至关重要，因为如前所述，单羧酸盐转运高度依赖于溶液的pH值。此外，6.7对应于三龄幼虫17,18的血淋巴中的pH值。 - 将幼虫置于立体显微镜下，并用一把镊子在腹部后部横切。
- 用镊子推动下颚，同时将幼虫翻过来。
- 观察下颌旁边的腹侧神经索 （VNC）。小心地取出假想的椎间盘和剩余的脑尾部组织。
- 通过切断神经，将具有中枢脑和视叶的VNC与其他组织分开。转移VNC，用镊子从剩余的神经中取出它，并将其放入含有无Ca2+记录溶液的记录室中（与步骤3.2相同的溶液）。VNC 将立即粘附在盖玻片上。
- 为避免来自其余神经的干扰，请使用镊子将它们连接到盖玻片的底部（神经也将根据所使用的驱动线发出荧光）（图2）。
- 要在另一组实验中测量葡萄糖或单羧酸盐转运的脂肪体（FBs）进行实验，请按照步骤3.1-3.4继续分离组织。一旦幼虫被翻过来，观察FB是一个白色的、双侧的、扁平的组织。
- 将表达FRET传感器的分离FB（使用适当的驱动器从遗传杂交中获得）放入含有不含Ca2+的记录溶液的记录室中。
注意：FB具有高度疏水性（它倾向于漂浮在溶液表面），并且极易被镊子操作，必须小心处理。对这种组织的任何粗暴处理都会导致以后的死细胞（传感器的荧光降低）。 - 将含有VNC / FB的记录室放在显微镜载物台上。
4. 活细胞成像
- 要获取表达组织的传感器的图像，请使用与发射分流系统和 CCD 相机耦合的正置荧光显微镜。在开始任何实验前30分钟打开显微镜的照明系统。
注意：在这里，我们使用配备20x/0.5水浸物镜的转盘荧光显微镜来观察VNC和FB。 图 2 还显示了40x/0.8水浸物镜的使用。 - 要可视化 GCaMP6f 荧光，请将 激发 和 发射 波长分别设置为 488 nm 和 540 nm。对于Laconic/Pyronic/ATP/葡萄糖传感器，将 激发 波长设置为 440 nm ， 将发射 波长设置为 488 nm （mTFP，CFP）和 540 nm （Venus，YFP）。
- GCaMP6f 每 2 秒采集 512 x 512 像素大小的图像，Laconic/Pyronic/ATP/葡萄糖传感器每 10-30 秒采集一次图像。通过观察所获得的图像质量，确定对光源的最佳曝光。要遵循此协议，请确保 Laconic 和 Pyronic 传感器的图像曝光时间为 300 ms，葡萄糖和 ATP 传感器的图像曝光为 100-150 ms。
注意：曝光可能因共聚焦或普通荧光显微镜的使用而异。 - 将记录室安装在显微镜载物台中后，小心放置水浸物镜，并确保物镜在整个实验过程中保持浸没状态。将室温保持在25°C。
- 将记录室连接到灌注系统，并将组织浸泡在含有128mM NaCl，2mM KCl，1.5mM CaCl 2,4mM MgCl 2,5mM海藻糖，5mM HEPES和35mM蔗糖的记录溶液中，pH 6.7（用pH计测量并用NaOH和HCl调节）。
- 使用重力保持 3 mL/min 的记录溶液通过组织的恒定流量，与低通量蠕动泵耦合，以在保持体积恒定的同时从腔室中提取液体。为了达到所需的流量，将含溶液的试管（50 mL 塑料管）放置在显微镜载物台上方 25 cm 处。
注意：这种重力驱动的流动用于防止蠕动泵引起的组织运动，以便以后进行更准确的图像分析。 - 在进行任何刺激之前，保持记录溶液流动5-10分钟，以从传感器获得稳定的荧光基线。根据需要更改持续时间以获取此基线。
- 用刺激溶液代替流动溶液5分钟以刺激VNC / FBs（用葡萄糖，丙酮酸或乳酸，其浓度溶解在盐水溶液中，每个实验所述的浓度;见每个图）。
注意：刺激的持续时间可以根据实验的需要而改变（例如，葡萄糖脉冲可以增加到10分钟以达到神经元的平台，如先前报道的16）。 - 为了保持刺激溶液中的渗透压，根据添加的单羧酸盐或葡萄糖的浓度，纠正蔗糖浓度（ 果蝇 大脑不可代谢的碳水化合物）。
- 使用简单的阀门系统改变解决方案。注意不要移动显微镜载物台。
- 将VNC暴露于80μMpicrotoxin（PTX，连续流动）以刺激神经元活动。该过程增加了 Ca2+ 振荡的频率，从而可以观察到代谢相关分子（例如细胞内 ATP）的变化。
- 在任何实验结束时，用盐水彻底清洗整个流动系统，包括试管和记录室至少10分钟，再用蒸馏水清洗10分钟，以消除所用溶液的任何痕迹。
5. 图像处理和数据分析
- 要处理获得的图像，请继续执行 图 3 中所示的步骤。
- 将图像（简洁）导入 ImageJ 软件。该图像有两个样本视图：左边是 mTFP 信号，右边是金星信号。选择包含要分析的细胞的区域，并在新窗口中分离这些图像（mTFP 和 Venus）。确保这些图像包含完全相同的区域。
- 打开配准插件，校正通常在实验中观察到的组织的小漂移，使用函数刚体。在两个图像（mTFP 和 Venus）中执行此操作。
- 在 mTFP 信号 （488 nm） 中相应 10 个细胞的胞质溶胶中选择至少 10 个感兴趣区域 （ROI），并将选择转移到 Venus （540 nm） 图像中。
- 选择两个或三个靠近被分析细胞但没有可辨别信号的ROI（始终在VNC或分析的组织内，见 图3）。这些是背景投资回报率。
- 在两个图像中都选择了 ROI 后，使用函数度量获得每个信号的平均灰度值。将数据传输到数据手册中，并减去每个信号的平均背景值。
- 确定 Venus 的 mTFP 荧光比（对于 Laconic 和 Pyronic）。该值的计算方式与此处描述的其他FRET传感器（其比率通常为YFP/CFP）不同，因为当与各自的基板结合时，Laconic和Pyronic都会降低其FRET效率。
- 规范化数据，将每个记录值除以基线。在单独的数据表中，通过取刺激前 2 分钟内 mTFP/Venus 比率的平均值来计算基线。
- 对于使用基于FRET的传感器进行葡萄糖和ATP测量，计算YFP / CFP比率，并按照步骤5.8中所述对数据进行归一化。
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Representative Results
在长达1小时的时间内，该过程可以很容易地测量单羧酸盐和葡萄糖传感器荧光的细胞内变化。如 图 4 所示，神经胶质细胞和运动神经元中的简洁传感器在脉冲开始时以相似的速率响应 1 mM 乳酸，但在 5 分钟脉冲期间运动神经元比基线达到更高的增加，如前所述17。之所以选择这种乳酸浓度，是因为它与三龄幼虫血淋巴中发现的水平相当。同样，当表达 VNC 的葡萄糖传感器暴露于 5 mM 葡萄糖（该值类似于我们和其他人在血淋巴中测量的值19）时，传感器的信号在神经胶质细胞和神经元中以相似的速率增加。然而，在葡萄糖脉冲期间，神经元中的信号比神经胶质细胞中的信号增加得更多。这与先前对类似的FRET传感器表达制剂的观察结果一致16。
该制剂可用于对 果蝇 神经胶质细胞或神经元中表达的未描述的单羧酸盐和葡萄糖转运蛋白进行实验20。在这里，我们举例说明使用RNA干扰来表明，以前已知在异源细胞中转运单羧酸盐的Chaski（Chk）在神经胶质细胞中转运乳酸（图5）。在营养限制条件下，这种转运蛋白被描述为在动物生理学和行为学中起重要作用21。我们发现，在神经胶质细胞中，与暴露于1mM乳酸的对照VNC相比，敲除Chk减少了乳酸转运（图5）。可以测试其他推定的转运蛋白，看看它们是否可以在生理和病理条件下转运代谢物。
为了解决与神经元活动相关的代谢变化的研究，我们开发了一种简单的方法来增加神经元活动，而无需使用技术复杂的程序，例如光遗传学，这可能会干扰FRET传感器的测量（图6）。分离的 VNC 暴露于 Picrotoxin （PTX），这是一种已知的 GABAA 受体拮抗剂，以前被我们和其他人使用过 17,22。使用的浓度增加了神经元中钙振荡的频率（通过GCaMP6f荧光的变化来测量）以及代谢相关分子（如葡萄糖，乳酸和丙酮酸）的显着变化17。此外，PTX诱导的神经元活动增加导致运动神经元胞体中ATP水平的短暂下降。这种现象以前已经在脊椎动物模型中被描述过，其中神经元活性通过电刺激或使用GABAA受体拮抗剂增加23,24。因此，该模型可用于跟踪神经元和神经胶质细胞特定亚群的代谢变化，满足在高神经元活动期间有助于 ATP 产生的能量相关转运蛋白的需求。
葡萄糖和一羧酸转运在大脑以外的组织或细胞中也很重要。我们在这里展示了单羧酸盐（乳酸/丙酮酸）和脂肪体中葡萄糖摄取的可视化，脂肪体是幼虫和成年果蝇中存在的代谢相关组织，具有几个关键功能，例如脂质储存和代谢25。如图7所示，Laconic传感器在FB中表达良好，其中脂滴可以看作是细胞内微小的黑色球体。这种分离的组织可以很好地粘附在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，从而实现长期的细胞成像过程，并且也易于分析。我们观察到，当FB暴露于增加的葡萄糖浓度（约5mM）时，葡萄糖传感器的荧光显着增加，这接近血淋巴中的葡萄糖浓度。进一步暴露于更高浓度的葡萄糖（10mM）不会导致传感器荧光的预期增加。最后，在FB中，我们能够测量乳酸和丙酮酸的输入（图7C，D）。在这种情况下，增加乳酸和丙酮酸浓度会导致简洁和丙酮酸荧光成比例增加（范围从0.1到1mM）。较高的单羧酸盐浓度导致细胞内的信号饱和。
图1： 果蝇 幼虫的同步。 幼虫同步过程以图形方式描述。在该过程开始前两小时，必须制备 1% 琼脂糖板，每天更换两次，直到第 4 天。孵化的幼虫必须小心收集。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：分离的 果蝇 幼虫大脑表达乳酸传感器 Laconic。 （A） 分离的 果蝇 三龄幼虫分离的 VNC 粘附在聚 L-赖氨酸包被的盖玻片上并在运动神经元中表达乳酸传感器 Laconic 的代表性图像 （OK6-GAL4）。这些图像显示了用 20 倍水浸物镜捕获的 VNC（左）和传感器的 mTFP 荧光（中间面板）的明场图像。底板中的图像是使用 40 倍水浸物镜拍摄的相同 VNC。（B） 来自 VNC 的运动神经元，表达 Laconic 乳酸传感器 （OK6>Laconic） 放置在零乳酸盐水溶液中。该图像描绘了 mTFP 荧光（左）、Venus 荧光（中）以及两种荧光之间的比率（右图，使用 ImageJ 软件的 Ratio Plus 插件生成）。比例尺 = 50 μm（A，上面板），10 μm（A 底面板， B）。缩写：VNC = 腹侧神经索;mTFP = 单体蓝绿色荧光蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：图像的分步分析。 用于图像分析的 ImageJ 软件协议的示意图，显示过程（第一列）、ImageJ 命令（第二列）和图像处理结果（第三列）。该示例从表达运动神经元 （OK6-GAL4） 中 Laconic 乳酸传感器的 VNC 获取的原始图像开始。缩写：VNC = 腹侧神经索;mTFP = 单体蓝绿色荧光蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4： 果蝇 幼虫大脑神经元和神经胶质细胞中的单羧酸盐和葡萄糖转运。 （A） 在运动神经元 （OK6-Gal4>Laconic） 中表达乳酸传感器 Laconic 的 VNC 的代表性图像。在1mM乳酸脉冲5分钟之前，期间和之后，运动神经元中的简洁荧光可见。ImageJ 的 Ratio Plus 插件用于创建比率图像 （mTFP/Venus）。比例尺 = 10 μm。 （B） 来自运动神经元（OK6-GAL4，灰线）或神经胶质细胞（REPO-GAL4，黑线）中表达 Laconic 乳酸传感器的分离 VNC 的 FRET 信号的代表性记录，暴露于 1 mM 乳酸 5 分钟。迹线将调整后的FRET信号描述为乳酸暴露前2分钟收集的平均值。（C） 在运动神经元（OK6-GAL4，灰线）或神经胶质细胞（REPO-GAL4，黑线）中表达葡萄糖传感器 FLII12Pglu700μδ6 的分离 VNC 的 FRET 信号的代表性记录暴露于 5 mM 葡萄糖 5 分钟。迹线将调整后的FRET信号描述为葡萄糖暴露前两分钟收集的平均值。缩写：VNC = 腹侧神经索;mTFP = 单体蓝绿色荧光蛋白;FRET=Föster共振能量转移。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：表达Chaski RNAi的 果蝇 幼虫脑神经胶质细胞中的乳酸转运。 （A） 分离的 VNC 单独表达乳酸传感器 Laconic（遗传对照， w1118，黑线）或共表达 RNAi 以敲低 Chaski （Chk） 表达（chk-RNAi，品红色）暴露于 1 mM 乳酸 5 分钟。对于每种情况，迹线表示从七个单独的 VNC（每个条件 70 个细胞，使用暴露于乳酸前 2 分钟获得的平均值进行归一化）获得的平均 FRET值。（B） A 中曲线下面积用于计算细胞内乳酸积累。对于每种情况，这些值是来自 70 个细胞和 7 个独立实验（对照或 chk-RNAi）的平均 SE。未配对学生 的t检验用于统计分析（*p < 0.05）。缩写：VNC = 腹侧神经索;FRET=Föster共振能量转移。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：苦毒素暴露诱导的神经元 ATP 水平的变化。 从表达遗传编码的 （A） 钙传感器 GCaMP6f 或（B，一组不同的实验）运动神经元 （OK6-GAL4） 中表达遗传编码的 （A） 钙传感器 GCaMP6f 或（B，一组不同的实验）ATP 传感器 AT1.03NL 捕获的荧光记录，这些神经元在行指示的时间内暴露于 GABAA 受体拮抗剂 Picrotoxin （80 μM）。代表性记录来自来自 VNC（ 在 A 中）的单个运动神经元或来自来自单个 VNC（ 在 B 中）的 10 个细胞的平均 ± SE，归一化为 PTX 暴露前 2 分钟获得的平均值。缩写：VNC = 腹侧神经索;PTX = 苦毒素;SE = 标准误差;CFP = 青色荧光蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.
图7： 果蝇 脂肪体中单羧酸盐和葡萄糖的转运。 （A）表达乳酸传感器Laconic（mTFP荧光）的三龄幼虫分离的脂肪体的图像。比例尺 = 10 μm。 （B） 在 FB 中捕获的归一化信号的代表性迹线，表达暴露于葡萄糖（1、5 和 10 mM 葡萄糖）的葡萄糖传感器 （FLII12Pglu700μδ6）。将数据归一化至葡萄糖暴露前的前 2 分钟。 （C，D）从FB获得的标准化信号的代表性痕迹，表达暴露于0.1-0.5-1mM乳酸或丙酮酸的乳酸传感器（C）或丙酮酸传感器（D）。将数据归一化至乳酸或丙酮酸暴露前的前 2 分钟。缩写：FB = 胖体;mTFP = 单体蓝绿色荧光蛋白;YFP = 黄色荧光蛋白;CFP = 青色荧光蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
使用 果蝇 模型研究脑代谢相对较新26，并且已被证明与哺乳动物代谢共享的特征比预期的要多，这主要是在体 外 的原代神经元培养物或脑切片中研究的。 果蝇 擅长 体内 实验，这要归功于一系列可用的遗传工具和基因编码传感器，使研究人员能够实时可视化由诱导活动甚至对感官刺激的反应引起的代谢变化。
此处描述的方案显示了如何在离体制剂中测量果蝇VNC神经胶质细胞和神经元中的单羧酸盐和葡萄糖转运，该制剂允许使用基于FRET显微镜的基因编码荧光代谢传感器来制作静息和活动神经元代谢变化的延时视频。该协议可以使用果蝇模型在任何实验室中轻松安装和执行，而无需使用复杂的机械，使用配备发射分流系统的落射荧光显微镜。它也可以缩放到更先进的设备，如转盘、激光共聚焦或双光子显微镜（但需要一个分光器来分割光发射），以记录位于大脑更深处的特定细胞，就像在成年果蝇大脑中发生的那样。由于这些类型的代谢信号相对较慢，因此不需要快速或昂贵的摄像机。
此外，分离的VNC或FB制备不需要复杂的运动校正方法，有时需要 进行体内 记录。ImageJ 插件可以令人满意地校正实验过程中产生的 VNC 的大部分运动。因此，通过添加PTX或添加相关代谢物来增加神经元活动可以同时进行，而不会出现由自然身体肌肉收缩引起的问题，如其他方案（例如鱼片制备）27所示。
我们展示了具有代表性的实验，在这些实验中，在这些代谢物的生理相关浓度（分别为1和5mM）下可以清楚地观察到乳酸和葡萄糖转运。从这里开始，预计任何未表征的基因或先前报道的蛋白质都可以在各种条件下测试运输能力，例如使用不同模型的神经退行性疾病或代谢损伤（高热量饮食或营养限制）。在这方面，我们发现RNAi介导的已知单羧酸转运蛋白的敲低显着降低了神经胶质细胞中的乳酸转运。有趣的是，从 Laconic 和 Pyronic 传感器获得的信号对培养基中乳酸或丙酮酸的变化高度敏感，可以准确测量这些代谢物的细胞内变化。在哺乳动物细胞中，信号的这种充足的动态范围似乎是不同的，在哺乳动物细胞中，传感器的信号与细胞内乳酸浓度之间存在非线性关系28。
这种方法可以为有关在基础和高神经元活动期间处理或利用单羧酸盐和葡萄糖在大脑中产生能量的地点和时间的重要方面提供答案。PTX 引起的神经元活动增加可导致能量相关代谢物发生相当大的改变，其方式类似于在细胞培养物、脑载玻片和活生物体中看到的情况23,24。具体来说，ATP产生的激增发生在神经元活动增加后几分钟，很可能是由于葡萄糖代谢以及神经胶质细胞和神经元之间乳酸和丙酮酸的交换，如先前报道的那样17。通过结合使用基因编码的传感器操纵某些基因的表达，可以研究特定细胞供应葡萄糖和单羧酸盐的需求，以及它们运输或产生的机制。
其他具有重要代谢意义的组织可以很容易地与聚-L-赖氨酸包被的盖玻片结合，并且代谢物变化可以成像几分钟。可以研究介导不同组织中葡萄糖或乳酸转运的新型转运蛋白。循环葡萄糖通过尚未完全了解的机制运输到幼虫脂肪体中产生二糖海藻糖，这些方法可能有助于更好地了解这一途径。此外，在营养限制下，脂肪酸可以代谢以在FB中产生酮体，并且将它们挤压到血淋巴所需的转运蛋白仍然未知。
需要注意的是，该协议可用于估计代谢物随时间推移的积累或确定特定传感器在条件之间的荧光增加率，但不能正式考虑“浓度”的变化，因为这需要原位传感器校准。在这种情况下，构成VNC的几个细胞层限制了这种校准所必需的分子（如电离载体）的扩散。但是，我们建议遵循图像处理指南，该指南允许对比动物体内各种器官或细胞之间的乳酸水平29,30。
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Disclosures
作者声明没有竞争或经济利益。
Acknowledgments
我们感谢Sierralta实验室的所有成员。这项工作得到了 FONDECYT-Iniciación 11200477（对 AGG）和 FONDECYT Regular 1210586（对 JS）的支持。UAS-FLII12Pglu700μδ6（葡萄糖传感器）由巴黎国家科学研究中心的Pierre-Yves Plaçais和Thomas Preat慷慨捐赠。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
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- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
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