Summary
Her præsenterer vi en protokol til visualisering af transporten af monocarboxylater, glucose og ATP i gliaceller og neuroner ved hjælp af genetisk kodede Förster-resonansenergioverførselsbaserede sensorer i et ex-vivo Drosophila-larvehjernepræparat .
Abstract
De høje energibehov i hjerner på grund af elektrisk aktivitet er et af deres mest karakteristiske træk. Disse krav opfyldes ved produktion af ATP fra glucose og dets metabolitter, såsom monocarboxylaterne lactat og pyruvat. Det er stadig uklart, hvordan denne proces er reguleret, eller hvem nøgleaktørerne er, især i Drosophila.
Ved hjælp af genetisk kodede Förster-resonansenergioverførselsbaserede sensorer præsenterer vi en enkel metode til måling af transporten af monocarboxylater og glukose i gliaceller og neuroner i et ex-vivo Drosophila-larvehjernepræparat . Protokollen beskriver, hvordan man dissekerer og klæber en larvehjerne, der udtrykker en af sensorerne, til en glasdæksel.
Vi præsenterer resultaterne af et helt eksperiment, hvor laktattransport blev målt i larvehjerner ved at slå tidligere identificerede monocarboxylattransportører ned i gliaceller. Desuden demonstrerer vi, hvordan man hurtigt kan øge neuronal aktivitet og spore metabolitændringer i den aktive hjerne. Den beskrevne metode, som giver alle nødvendige oplysninger, kan bruges til at analysere andre Drosophila levende væv.
Introduction
Hjernen har høje energibehov på grund af de høje omkostninger ved gendannelse af iongradienter i neuroner forårsaget af neuronal elektrisk signalgenerering og transmission samt synaptisk transmission 1,2. Dette høje energibehov har længe været antaget at blive opfyldt ved kontinuerlig oxidation af glukose til fremstilling af ATP3. Specifikke transportører ved blod-hjerne-barrieren overfører glukosen i blodet til hjernen. Konstante glykæmiske niveauer sikrer, at hjernen får en stabil forsyning af glukose4. Interessant nok tyder voksende eksperimentelle beviser på, at molekyler afledt af glukosemetabolisme, såsom lactat og pyruvat, spiller en vigtig rolle i hjernecellernes energiproduktion 5,6. Der er dog stadig en vis debat om, hvor vigtige disse molekyler er for energiproduktion, og hvilke celler i hjernen der producerer eller bruger dem 7,8. Manglen på passende molekylære værktøjer med den høje tidsmæssige og rumlige opløsning, der kræves til denne opgave, er et væsentligt problem, der har forhindret denne kontrovers i at blive fuldstændigt løst.
Udviklingen og anvendelsen af flere konstruerede fluorescerende metaboliske sensorer har resulteret i en bemærkelsesværdig stigning i vores forståelse af, hvor og hvordan metabolitter produceres og anvendes, samt hvordan de metaboliske fluxer opstår under basal og høj neuronal aktivitet9. Genetisk kodede metaboliske sensorer baseret på Förster resonans energy transfer (FRET) mikroskopi, såsom ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glucose), lakonisk (lactat) og pyronisk (pyruvat), har bidraget til vores forståelse af hjernens energimetabolisme 10,11,12,13. På grund af de høje omkostninger og det sofistikerede udstyr, der kræves for at udføre forsøg på levende dyr eller væv, er resultaterne i hvirveldyrmodeller stadig primært begrænset til cellekulturer (gliaceller og neuroner).
Den nye brug af Drosophila-modellen til at udtrykke disse sensorer har afsløret, at vigtige metaboliske egenskaber bevares på tværs af arter, og deres funktion kan let løses med dette værktøj. Endnu vigtigere er det, at Drosophila-modellen har kastet lys over, hvordan glukose og lactat / pyruvat transporteres og metaboliseres i fluehjernen, forbindelsen mellem monocarboxylatforbrug og hukommelsesdannelse og den bemærkelsesværdige demonstration af, hvordan stigninger i neural aktivitet og metabolisk flux overlapper 14,15,16,17. Metoden, der præsenteres her til måling af monocarboxylat-, glukose- og ATP-niveauer ved hjælp af genetisk kodede FRET-sensorer udtrykt i larvehjernen, giver forskere mulighed for at lære mere om, hvordan hjernen i Drosophila bruger energi, som kan anvendes på hjernen hos andre dyr.
Vi viser, at denne metode er effektiv til påvisning af laktat og glukose i gliaceller og neuroner, og at en monocarboxylattransportør (Chaski) er involveret i laktatimport til gliaceller. Vi demonstrerer også en simpel metode til at studere metabolitændringer under øget neuronal aktivitet, som let kan induceres ved badapplikation af en GABA A-receptorantagonist. Endelig viser vi, at denne metode kan bruges til at måle monocarboxylat og glukosetransport i andre metabolisk signifikante væv, såsom fedtlegemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedligeholdelse af fluestamme og larvesynkronisering
- For at udføre disse eksperimenter skal du bruge fluekulturer hævet ved 25 ° C på standard Drosophila-mad sammensat af 10% gær, 8% glucose, 5% hvedemel, 1,1% agar, 0,6% propionsyre og 1,5% methylparaben.
- For at følge denne protokol skal du bruge følgende linjer: w1118 (eksperimentel kontrolbaggrund), OK6-GAL4 (driver til motorneuroner), repo-GAL4 (driver til alle gliaceller), CG-GAL4 (driver til fedtlegemer), UAS-pyronisk (pyruvatsensor), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glukosesensor), UAS-lakonisk (laktatsensor), UAS-GCaMP6f (calciumsensor), UAS-AT1.03NL (ATP-sensor) og UAS-Chk RNAi GD1829. Alle linjer, der udtrykker sensorer eller RNAi, er i w1118 genetisk baggrund.
- For at opnå synkroniserede tredje instar vandrende larver placeres 300 fluer (3-5 dage gamle, 100 hanner, 200 jomfruhunner) af det ønskede genetiske kryds i æglægningskammeret, som indeholder en 60 mm petriskål dækket med 1% agarose i fosfatbufret saltopløsning (PBS). Placer en dråbe flydende / cremet gær (1,5 cm diameter) i midten af pladen for at tilskynde fluer til at lægge æg (figur 1).
- Opbevar fluerne ved 25 °C i 3 dage, erstat agarosepetriskålen med en frisk og friskopløst gær to gange dagligt.
- Lad fluerne lægge æg i 4 timer på den fjerde dag, før du skifter petriskål. Fjern denne plak. Lad derefter fluerne lægge æg i en ny agaroseplak med frisk opløst gær i 3 timer. Brug disse larver i eksperimenterne.
- Efter 3 timer fjernes plaketten med æggene, og den anbringes i en 25 °C inkubator i 24 timer.
- Saml 50 til 100 nyklækkede larver fra denne plak (0 timer efter larveudklækning) og læg dem i et plastikhætteglas indeholdende standardfoder. For at give larverne mulighed for at fodre ordentligt skal du sørge for, at maden er malet og blød. Brug larverne 96 timer efter overførslen.
2. Lav glasdækslerne med poly-L-lysin
- Udfør dette trin 1 time før larvedissektionen. I en 6-brønds cellekulturplade anbringes 25 mm glasdæksler (diameteren på de dæksler, der skal bruges, afhænger af det optagekammer, der er tilgængeligt i mikroskopet).
- Anbring en dråbe (300 μL) poly-L-lysin i midten af hvert dæksel i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Hvert dæksel vaskes 3x med destilleret vand og derefter 2x med en saltopløsning uden Ca2+ (den samme opløsning, der bruges til at dissekere larverne, se trin 3.2). Installer dækslerne i optagekammeret, og fyld det med Ca2+-fri saltopløsning.
BEMÆRK: Selvom larvehjernen kan klæbe direkte til glasdækslerne, er vedhæftningen svag, og hjernen bevæger sig lejlighedsvis eller forskydes under eksperimentet på grund af den kontinuerlige strøm af saltopløsning. Tilsætningen af poly-L-lysintrinnet reducerer risikoen for bevægelser eller endda hjernetab som følge af vaskerne.
3. Dissekere den ventrale nerveledning (VNC) og fedtlegemer (FB'er)
- Saml de vandrende tredjestjernelarver fra det ønskede genetiske kryds (fra trin 1.7) og vask dem grundigt 3x med destilleret vand.
- Larverne anbringes i en glasdissektionsskål indeholdende 750 μL nominelt nul Ca2+ iskold saltopløsning bestående af 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES og 35 mM saccharose (pH = 6,7, målt med et pH-meter og justeret med 1 M NaOH og HCl 37% v/v).
BEMÆRK: Indstilling af pH til 6,7 er kritisk, fordi monocarboxylattransport, som tidligere observeret, er stærkt afhængig af opløsningens pH. Derudover svarer 6,7 til pH i hæmolympen af en tredje stjernelarve17,18. - Placer larven under et stereomikroskop og lav et tværgående snit over bagsiden af maven med et par tang.
- Skub kæben med tangen, mens du vender larverne indvendigt ud.
- Overhold den ventrale nerveledning (VNC) ved siden af kæben. Fjern forsigtigt de imaginære diske og resterende hjernekaudale væv.
- Adskil VNC med den centrale hjerne og optiske lobes fra resten af vævet ved at skære nerverne. VNC overføres, opfanges med pincet fra de resterende nerver, og det anbringes i optagekammeret, der indeholder Ca2+-fri optageopløsning (samme opløsning fra trin 3.2). VNC'erne klæber straks til dæksedlerne.
- For at undgå interferens fra de resterende nerver skal du fastgøre dem i bunden af dækslet ved hjælp af tang (nerverne vil også være fluorescerende afhængigt af den anvendte førerlinje) (figur 2).
- For at udføre forsøg i fedtlegemer (FB'er), der måler glukose- eller monocarboxylattransport i et andet sæt eksperimenter, fortsæt med at isolere vævene ved at følge trin 3.1-3.4. Når larverne er vendt indvendigt ud, skal du observere, at FB er et hvidt, bilateralt, fladt væv.
- De isolerede FB'er, der udtrykker FRET-sensorerne (opnået ved hjælp af en genetisk krydsning ved hjælp af de relevante drivere), anbringes i registreringskammeret, der indeholder optageopløsningen uden Ca2+.
BEMÆRK: FB er meget hydrofob (det har tendens til at flyde på overfladen af opløsningen) og ekstremt sårbart over for manipulation med tang, det skal håndteres med forsigtighed. Enhver grov håndtering af dette væv vil resultere i døde celler senere (med nedsat fluorescens af sensorerne). - Placer optagelseskammeret med VNC'er/FB'er på mikroskopstadiet.
4. Levende cellebilleddannelse
- For at tage billeder af vævsekspressekspresssensorerne skal du bruge et opretstående fluorescensmikroskop koblet til et emissionsopdelingssystem og et CCD-kamera. Tænd mikroskopets belysningssystem 30 minutter, før du starter et eksperiment.
BEMÆRK: Her bruger vi et spindeskivefluorescensmikroskop udstyret med et 20x/0,5 vandnedsænkningsmål til at observere både VNC'er og FB'er. Figur 2 viser også brugen af et 40x/0,8 vandnedsænkningsmål. - For at visualisere GCaMP6f-fluorescens skal du indstille excitations- og emissionsbølgelængderne til henholdsvis 488 nm og 540 nm. For lakoniske/pyroniske/ATP/glukosesensorer indstilles excitationsbølgelængden til 440 nm og emissionsbølgelængderne til 488 nm (mTFP, CFP) og 540 nm (Venus, YFP).
- Få billeder med en størrelse på 512 x 512 pixels hver 2. sek . for GCaMP6f og hver 10-30 sek . for lakoniske/pyroniske/ATP/glukosesensorer. Bestem den optimale eksponering for lyskilden under overholdelse af kvaliteten af det opnåede billede. For at følge denne protokol skal du sikre dig, at billederne har 300 ms eksponering for lakoniske og pyroniske sensorer og 100-150 ms for glukose - og ATP-sensorerne .
BEMÆRK: Eksponeringen kan variere afhængigt af brugen af et konfokal eller normalt fluorescensmikroskop. - Når optagelseskammeret er installeret i mikroskopets fase, skal du forsigtigt placere vandnedsænkningsmålet og være sikker på, at målet forbliver nedsænket under hele eksperimentet. Hold rumtemperaturen på 25 °C.
- Tilslut optagekammeret til et perfusionssystem, og hold vævene badet i optageopløsningen indeholdende 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES og 35 mM saccharose, pH 6,7 (målt med et pH-meter og justeret med NaOH og HCl).
- Oprethold en konstant strøm på 3 ml / min optageopløsning gennem vævet ved hjælp af tyngdekraften, koblet til en peristaltisk pumpe med lav flux for at ekstrahere væsken fra kammeret, samtidig med at volumenet holdes konstant. For at opnå det krævede flow skal de opløsningsholdige rør (50 ml plastrør) placeres 25 cm over mikroskoptrinnet.
BEMÆRK: Denne tyngdekraftsdrevne strømning bruges til at forhindre vævsbevægelse forårsaget af peristaltiske pumper, hvilket giver mulighed for mere nøjagtig billedanalyse senere. - Før enhver stimulering skal optageopløsningen flyde i 5-10 minutter for at opnå en stabil baseline af fluorescens fra sensorerne. Rediger varigheden efter behov for at opnå denne basislinje.
- Udskift den flydende opløsning med stimuleringsopløsningen i 5 minutter for at stimulere VNC/FB'erne (med glucose, pyruvat eller lactat i den koncentration, der er beskrevet for hvert eksperiment opløst i saltopløsning; se hver figur).
BEMÆRK: Varigheden af stimulering kan varieres alt efter eksperimentets behov (for eksempel kan glukoseimpulser øges til 10 minutter for at nå et plateau i neuroner, som tidligere rapporteret16). - For at opretholde osmolaritet i stimuleringsopløsningen korrigeres saccharosekoncentrationen (et kulhydrat, der ikke kan metaboliseres af Drosophila-hjernen ) i henhold til koncentrationen af monocarboxylat eller tilsat glucose.
- Skift løsningerne ved hjælp af et simpelt ventilsystem. Pas på ikke at flytte mikroskopstadiet.
- Udsæt VNC for 80 μM picrotoxin (PTX, kontinuerligt flydende) for at stimulere neuronal aktivitet. Denne procedure øger hyppigheden af Ca2+ svingninger, hvilket gør det muligt at observere ændringer i metabolisk relevante molekyler (fx intracellulær ATP).
- Ved afslutningen af ethvert forsøg vaskes hele flowsystemet, herunder rørene og registreringskammeret, grundigt i mindst 10 minutter med saltopløsningen og yderligere 10 minutter med destilleret vand for at fjerne ethvert spor af de anvendte opløsninger.
5. Billedbehandling og dataanalyse
- For at behandle de opnåede billeder skal du fortsætte med trinene vist i figur 3.
- Importer billedet (lakonisk) til ImageJ-softwaren. Billedet har to visninger af prøven: den venstre er mTFP-signalet, og den til højre er Venus-signalet. Vælg et område, der indeholder de celler, der skal analyseres, og adskil disse billeder (mTFP og Venus) i et nyt vindue. Sørg for, at disse billeder indeholder nøjagtigt det samme område.
- Åbn registreringspluginet, og korriger den lille drift af vævet, der normalt observeres i eksperimentet med funktionen stiv krop. Udfør dette i begge billeder (mTFP og Venus).
- Vælg mindst 10 interesseområder (ROI'er) i cytosolen for de tilsvarende 10 celler i mTFP-signalet (488 nm), og overfør markeringerne til Venus (540 nm) billedet.
- Vælg to eller tre ROI'er tæt på de celler, der analyseres, men uden mærkbart signal (altid inden for VNC eller analyseret væv, se figur 3). Dette er baggrundsafkastet.
- Når ROI'erne er valgt i begge billeder, skal du opnå den gennemsnitlige grå værdi af hvert signal ved hjælp af funktionsmåleren. Overfør dataene til et datablad, og træk den gennemsnitlige baggrundsværdi for hvert signal fra.
- Bestem mTFP-fluorescensforholdet over Venus (for lakonisk og pyronisk). Denne værdi beregnes anderledes end de andre FRET-sensorer, der er beskrevet her (hvor forholdet normalt er YFP/CFP), fordi både lakoniske og pyroniske reducerer deres FRET-effektivitet, når de er bundet til deres respektive substrater.
- Normaliser dataene ved at dividere hver registreret værdi med grundlinjen. I et separat datablad beregnes basislinjen ved at tage middelværdien af mTFP/Venus-forholdet i løbet af de 2 minutter, der går forud for stimulus.
- For glukose- og ATP-målingerne ved hjælp af FRET-baserede sensorer beregnes YFP/CFP-forholdet, og dataene normaliseres som beskrevet i trin 5.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I op til 1 time muliggør denne procedure nem måling af intracellulære ændringer i fluorescensen af monocarboxylat og glucosesensorer. Som vist i figur 4 reagerer lakoniske sensorer i både gliaceller og motorneuroner på 1 mM lactat med en lignende hastighed i starten af pulsen, men motorneuroner når en højere stigning over baseline under 5 minutters pulsen, som tidligere demonstreret17. Denne laktatkoncentration blev valgt, fordi den er sammenlignelig med de niveauer, der findes i hæmolympen hos tredjestjernelarver. Tilsvarende, når VNC-ekspressive glukosesensorer blev udsat for 5 mM glukose (en værdi svarende til den, der blev målt i hæmoolympen af os og andre19), steg sensorens signal med en lignende hastighed i gliaceller og neuroner. Under glukosepulsen øges signalet i neuroner imidlertid mere end i gliaceller. Dette er i overensstemmelse med tidligere observationer af lignende FRET-sensorekspressionspræparater16.
Dette præparat kan anvendes til at udføre forsøg på ubeskrevne monocarboxylat og glucosetransportører udtrykt i Drosophila gliaceller eller neuroner20. Her eksemplificerer vi brugen af RNA-interferens for at vise, at Chaski (Chk), som tidligere var kendt for at transportere monocarboxylater i heterologe celler, transporterer laktat i gliaceller (figur 5). Under ernæringsmæssige begrænsningsbetingelser blev denne transportør beskrevet som at spille en vigtig rolle i dyrefysiologi og adfærd21. Vi fandt, at i gliaceller reducerede knocking af Chk laktattransport sammenlignet med kontrol-VNC'er udsat for 1 mM lactat (figur 5). Andre formodede transportører kan testes for at se, om de kan transportere metabolitter under fysiologiske og patologiske tilstande.
For at løse undersøgelsen af metaboliske ændringer forbundet med neuronal aktivitet udviklede vi en simpel metode til at øge neuronal aktivitet uden at bruge teknisk komplekse procedurer såsom optogenetik, som kan forstyrre FRET-sensormålinger (figur 6). Den isolerede VNC blev eksponeret for picrotoxin (PTX), en kendt GABA A-receptorantagonist, der tidligere blev brugt af os og andre 17,22. Den anvendte koncentration øger hyppigheden af calciumsvingninger i neuroner (målt ved ændringer i GCaMP6f-fluorescens) samt signifikante ændringer i metabolisk relevante molekyler som glucose, lactat og pyruvat17. Desuden resulterer PTX-inducerede stigninger i neuronal aktivitet i et forbigående fald i ATP-niveauer i soma af motorneuroner. Dette fænomen er tidligere blevet beskrevet i hvirveldyrmodeller, hvor neuronal aktivitet blev øget via elektrisk stimulering eller ved anvendelse af GABA A-receptorantagonister23,24. Som et resultat kan denne model bruges til at spore metaboliske ændringer i specifikke undergrupper af neuroner og gliaceller, hvilket imødekommer behovet for energirelaterede transportører, der bidrager til ATP-produktion under høj neuronal aktivitet.
Glukose og monocarboxylat transport er også vigtige i væv eller celler andre end hjernen. Vi viser her visualiseringen af monocarboxylat (laktat/pyruvat) og glukoseoptagelse i fedtlegemer, et metabolisk relevant væv til stede i larverne og den voksne flue, der har flere nøglefunktioner såsom lipidlagring og metabolisering25. Den lakoniske sensor er godt udtrykt i FB, som vist i figur 7, hvor lipiddråberne kan ses som små sorte kugler i cellen. Dette isolerede væv klæber godt til de poly-L-lysinbelagte dæksedler, hvilket giver mulighed for en langsigtet cellebilleddannelsesprocedure, der også er let at analysere. Vi observerede en signifikant stigning i glukosesensorens fluorescens, når FB blev udsat for stigende glukosekoncentrationer (ca. 5 mM), hvilket er tæt på glukosekoncentrationen, der findes i hæmolymfen. Yderligere eksponering for højere koncentrationer af glukose (10 mM) resulterer ikke i den forventede stigning i sensorfluorescens. Endelig var vi i FB i stand til at måle importen af laktat og pyruvat (figur 7C, D). I dette tilfælde forårsager forøgelse af lactat- og pyruvatkoncentrationerne en proportional stigning i lakonisk og pyronisk fluorescens (fra 0,1 til 1 mM). Højere monocarboxylatkoncentrationer resulterer i signalmætning inde i cellerne.
Figur 1: Synkronisering af Drosophila larver. Larvesynkroniseringsproceduren er afbildet grafisk. To timer før processen starter, skal 1% agaroseplader fremstilles og skiftes to gange dagligt indtil dag 4. Rugelarverne skal indsamles med omhu. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Isoleret Drosophila-larvehjerne , der udtrykker laktatsensoren. (A) Et repræsentativt billede af en isoleret Drosophila tredjestjernelarves separerede VNC klæbet til et poly-L-lysinbelagt dæksel og udtrykker laktatsensoren lakonisk i motorneuroner (OK6-GAL4). Billederne viser et brightfield-billede af VNC (venstre) og sensorens mTFP-fluorescens (midterpanel) fanget med et 20x vandnedsænkningsmål. Billederne i bundpanelet er af samme VNC taget med et 40x vandnedsænkningsmål. (B) Motorneuroner fra en VNC, der udtrykker den lakoniske laktatsensor (OK6>lakonisk) anbragt i en nullaktatsaltopløsning. Billedet viser mTFP-fluorescens (venstre), Venus-fluorescens (i midten) og forholdet mellem de to fluorescens (højre, produceret ved hjælp af Ratio Plus-pluginet i ImageJ-softwaren). Skalastænger = 50 μm (A, toppanel), 10 μm (A bundpanel, B). Forkortelser: VNC = ventral nerveledning; mTFP = monomere blågrøn fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Trin for trin analyser af billederne. En skematisk illustration af ImageJ-softwareprotokollen til billedanalyse, der viser processen (første kolonne), ImageJ-kommandoer (anden kolonne) og billedbehandlingsresultater (tredje kolonne). Eksemplet starter med et råbillede taget fra en VNC, der udtrykker lakonisk laktatsensor i motorneuroner (OK6-GAL4). Forkortelser: VNC = ventral nerveledning; mTFP = monomere blågrøn fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Monocarboxylat og glukosetransport i neuroner og gliaceller i Drosophila-larvehjernen . (A) Repræsentative billeder af VNC, der udtrykker laktatsensoren lakonisk i motorneuroner (OK6-Gal4>lakonisk). Lakonisk fluorescens i motorneuroner ses før, under og efter en 5 minutters puls på 1 mM laktat. ImageJ's Ratio Plus-plugin blev brugt til at oprette forholdsbilleder (mTFP / Venus). Skalabjælke = 10 μm. (B) Repræsentative optagelser af FRET-signaler fra isolerede VNC'er, der udtrykker lakonisk laktatsensor i motorneuroner (OK6-GAL4, grå linjer) eller gliaceller (REPO-GAL4, sorte linjer) udsat for 1 mM laktat i 5 min. Sporene viser de justerede FRET-signaler til middelværdien indsamlet 2 minutter før laktateksponeringen. (C) Repræsentative optagelser af FRET-signaler fra isolerede VNC'er, der udtrykker glukosesensoren FLII12Pglu700μδ6 i motorneuroner (OK6-GAL4, grå linjer) eller gliaceller (REPO-GAL4, sorte linjer) udsat for 5 mM glucose i 5 min. Sporene viser de justerede FRET-signaler til middelværdien indsamlet to minutter før glukoseeksponeringen. Forkortelser: VNC = ventral nerveledning; mTFP = monomere blågrøn fluorescerende protein; FRET = Föster resonans energioverførsel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Laktattransport i gliaceller i Drosophila-larvehjernen , der udtrykker Chaski RNAi. (A) Isoleret VNC, der udtrykker laktatsensoren lakonisk alene (genetisk kontrol, w1118, sort linje) eller co-udtrykker et RNAi til knockdown Chaski (Chk) ekspression (chk-RNAi, magenta) blev udsat for 1 mM lactat i 5 min. For hver tilstand repræsenterer sporene den gennemsnitlige FRET-værdi opnået fra syv separate VNC'er (70 celler pr. tilstand, normaliseret ved hjælp af middelværdien opnået 2 minutter, før den udsættes for laktat). (B) Arealet under kurven i A anvendes til beregning af akkumulering af intracellulær laktat. For hver tilstand er værdierne den gennemsnitlige SE fra 70 celler og syv uafhængige eksperimenter (kontrol eller chk-RNAi). Den uparrede elevs t-test blev brugt til statistisk analyse (*p < 0,05). Forkortelser: VNC = ventral nerveledning; FRET = Föster resonans energioverførsel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Ændringer i neuronale ATP-niveauer induceret af picrotoxineksponering. Optagelser af fluorescensen fanget fra VNC'er, der udtrykker den genetisk kodede (A) calciumsensor GCaMP6f eller (B, et andet sæt eksperimenter) ATP-sensoren AT1.03NL i motorneuroner (OK6-GAL4), der blev udsat for GABA A-receptorantagonisten Picrotoxin (80 μM) i løbet af den tid, der er angivet af linjen. Den repræsentative optagelse kommer fra en enkelt motorneuron fra en VNC (i A) eller den gennemsnitlige ± SE fra 10 celler fra en enkelt VNC (i B) normaliseret til middelværdierne opnået 2 min før PTX-eksponering. Forkortelser: VNC = ventral nerveledning; PTX = picrotoxin; SE = standardfejl; CFP = cyanfluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Transport af monocarboxylat og glucose i Drosophila fedtlegemer. (A) Billede af det isolerede fedtlegeme fra tredje stjernelarver, der udtrykker laktatsensoren lakonisk (mTFP-fluorescens). Skalabjælke = 10 μm. (B) Repræsentative spor af det normaliserede signal fanget i FB, der udtrykker glukosesensoren (FLII12Pglu700μδ6) udsat for glucose (1, 5 og 10 mM glucose). Data blev normaliseret til de første 2 minutter før glukoseeksponering. (C,D) Repræsentative spor af det normaliserede signal opnået fra FB, der udtrykker laktatsensoren (C) eller pyruvatsensoren (D) udsat for 0,1-0,5-1 mM lactat eller pyruvat. Data blev normaliseret til de første 2 minutter før eksponering for laktat eller pyruvat. Forkortelser: FB = fed krop; mTFP = monomere blågrøn fluorescerende protein; YFP = gult fluorescerende protein; CFP = cyanfluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af Drosophila-modellen til undersøgelse af hjernens metabolisme er relativt ny26, og det har vist sig at dele flere karakteristika med pattedyrs metabolisme end forventet, hvilket primært er blevet undersøgt in vitro i primære neuronkulturer eller hjerneskiver. Drosophila udmærker sig ved in vivo-eksperimenter takket være batteriet af genetiske værktøjer og genetisk kodede sensorer til rådighed, der gør det muligt for forskere at visualisere i realtid de metaboliske ændringer forårsaget af induceret aktivitet eller endda som reaktion på en sensorisk stimulus.
Protokollen beskrevet her viser, hvordan man måler monocarboxylat og glukosetransport i Drosophila VNC glialceller og neuroner i et ex-vivo-præparat , der tillader anvendelse af genetisk kodede fluorescerende metaboliske sensorer baseret på FRET-mikroskopi til at lave time-lapse-videoer af metaboliske ændringer i hvilende og aktive neuroner. Denne protokol kan let monteres og udføres i ethvert laboratorium ved hjælp af Drosophila-modellen uden brug af komplekse maskiner ved hjælp af et epifluorescerende mikroskop udstyret med et emissionsopdelingssystem. Det kan også skaleres til mere avanceret udstyr som en roterende disk, laser confocal, eller to-foton mikroskoper (men en splitter til at opdele lysudsendelsen er påkrævet) for at registrere specifikke celler dybere placeret i hjernen, som forekommer i voksen Drosophila hjerne. Da disse typer metaboliske signaler er relativt langsomme, er et hurtigt eller dyrt videokamera ikke nødvendigt.
Derudover behøver det isolerede VNC- eller FB-præparat ikke en sofistikeret metode til bevægelseskorrektion, der undertiden er nødvendig til in vivo-optagelser . ImageJ-plugins kan tilfredsstillende korrigere de fleste bevægelser af VNC'erne, der produceres under eksperimentet. Som følge heraf kan stigningen i neuronal aktivitet ved tilsætning af PTX eller tilsætning af relevante metabolitter udføres samtidigt uden problemer forårsaget af naturlig kropsmuskelkontraktion, som det ses i andre protokoller (såsom filetpræparatet)27.
Vi viser repræsentative forsøg, hvor laktat- og glukosetransport observeres tydeligt ved fysiologisk relevante koncentrationer af disse metabolitter (henholdsvis 1 og 5 mM). Herfra forventes det, at ethvert ukarakteriseret gen eller tidligere rapporteret protein kan testes for transportkapacitet under forskellige forhold, såsom ved hjælp af forskellige modeller af neurodegenerative sygdomme eller metaboliske fornærmelser (diæt med højt kalorieindhold eller næringsstofbegrænsning). I den forbindelse viser vi, at RNAi-medieret knockdown af en kendt monocarboxylattransportør reducerer laktattransporten i gliaceller betydeligt. Interessant nok er signalerne opnået fra lakoniske og pyroniske sensorer meget følsomme over for ændringerne i lactat eller pyruvat i medierne, hvilket muliggør en nøjagtig måling af de intracellulære ændringer i disse metabolitter. Dette rigelige dynamiske område af signalet synes at være anderledes i pattedyrceller, hvor der er observeret et ikke-lineært forhold mellem sensorens signal og den intracellulære laktatkoncentration28.
Denne tilgang kan give svar på vigtige aspekter om, hvor og hvornår monocarboxylater og glukose behandles eller udnyttes til at generere energi i hjernen under basal og høj neuronal aktivitet. Stigningen i neuronal aktivitet forårsaget af PTX kan forårsage betydelige ændringer i energirelaterede metabolitter på samme måde som det, der er set i cellekulturer, hjerneskred og levende organismer23,24. Specifikt forekommer en stigning i ATP-produktionen minutter efter en stigning i neuronal aktivitet, sandsynligvis på grund af glukosemetabolisering og udveksling af lactat og pyruvat mellem gliaceller og neuroner, som tidligere rapporteret17. Undersøgelsen af specifikke cellers behov for tilførsel af glucose og monocarboxylater samt de mekanismer, der ligger til grund for deres transport eller generering, kan muliggøres ved at manipulere ekspressionen af visse gener i forbindelse med brugen af genetisk kodede sensorer.
Andre metabolisk vigtige væv kan let binde til poly-L-lysin-coatede coverslips og metabolitændringer afbildes i flere minutter. Nye transportører, der medierer glukose- eller laktattransport i forskellige væv, kan undersøges. Cirkulerende glukose transporteres for at producere disaccharidet trehalose i larvefedtlegemer via mekanismer, der ikke forstås fuldt ud, disse metoder kan bidrage til bedre at forstå denne vej. Desuden kan fedtsyrer under ernæringsmæssig begrænsning metaboliseres til at producere ketonlegemer i FB, og de transportører, der er nødvendige for at ekstrudere dem til hæmolympen, er stadig ukendte.
Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol kan bruges til at estimere akkumuleringen af en metabolit over tid eller til at bestemme stigningshastigheder i fluorescensen af en specifik sensor mellem betingelser, men ikke til formelt at overveje ændringer i "koncentration", fordi dette ville kræve en in situ-sensorkalibrering. De flere cellelag, der omfatter VNC, begrænser i dette tilfælde diffusionen af molekyler, såsom ionoforer, der er nødvendige for denne kalibrering. Vi anbefaler dog at følge retningslinjer for billedbehandling, der tillader kontrasterende laktatniveauer mellem forskellige organer eller celler i et dyr29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af Sierralta Lab. Dette arbejde blev støttet af FONDECYT-Iniciación 11200477 (til AGG) og FONDECYT Regular 1210586 (til JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glukosesensor) blev venligst doneret af Pierre-Yves Plaçais og Thomas Preat, CNRS-Paris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
