Summary
Hier presenteren we een protocol om het transport van monocarboxylaten, glucose en ATP in gliacellen en neuronen te visualiseren met behulp van genetisch gecodeerde Förster-resonantie-energieoverdracht-gebaseerde sensoren in een ex-vivo Drosophila-larvale hersenpreparaat.
Abstract
De hoge energiebehoefte van de hersenen als gevolg van elektrische activiteit is een van hun meest onderscheidende kenmerken. Aan deze eisen wordt voldaan door de productie van ATP uit glucose en zijn metabolieten, zoals de monocarboxylaten, lactaat en pyruvaat. Het is nog onduidelijk hoe dit proces wordt gereguleerd of wie de belangrijkste spelers zijn, met name in Drosophila.
Met behulp van genetisch gecodeerde Förster-resonantie-energieoverdrachtssensoren presenteren we een eenvoudige methode voor het meten van het transport van monocarboxylaten en glucose in gliacellen en neuronen in een ex-vivo Drosophila-larvale hersenpreparaat. Het protocol beschrijft hoe een larvale hersenen die een van de sensoren tot expressie brengen, kunnen worden ontleed en op een glazen dekglaasje kunnen worden geplakt.
We presenteren de resultaten van een heel experiment waarin lactaattransport werd gemeten in larvale hersenen door eerder geïdentificeerde monocarboxylaattransporters in gliacellen uit te schakelen. Verder laten we zien hoe we de neuronale activiteit snel kunnen verhogen en metabolietveranderingen in het actieve brein kunnen volgen. De beschreven methode, die alle nodige informatie biedt, kan worden gebruikt om andere levende weefsels van Drosophila te analyseren.
Introduction
De hersenen hebben een hoge energiebehoefte vanwege de hoge kosten van het herstellen van ionengradiënten in neuronen veroorzaakt door het genereren en verzenden van neuronale elektrische signalen, evenals synaptische transmissie 1,2. Lang werd gedacht dat aan deze hoge energievraag werd voldaan door de continue oxidatie van glucose om ATP3 te produceren. Specifieke transporters bij de bloed-hersenbarrière brengen de glucose in het bloed over naar de hersenen. Constante glykemische niveaus zorgen ervoor dat de hersenen een constante toevoer van glucose krijgen4. Interessant is dat er steeds meer experimenteel bewijs is dat moleculen die zijn afgeleid van het glucosemetabolisme, zoals lactaat en pyruvaat, een belangrijke rol spelen in de energieproductie van dehersencellen5,6. Er is echter nog steeds enige discussie over hoe belangrijk deze moleculen zijn voor de energieproductie en welke cellen in de hersenen ze produceren of gebruiken 7,8. Het gebrek aan geschikte moleculaire instrumenten met de hoge temporele en ruimtelijke resolutie die nodig is voor deze taak is een belangrijk probleem dat heeft verhinderd dat deze controverse volledig werd opgelost.
De ontwikkeling en toepassing van verschillende gemanipuleerde fluorescerende metabole sensoren hebben geresulteerd in een opmerkelijke toename van ons begrip van waar en hoe metabolieten worden geproduceerd en gebruikt, evenals hoe de metabole fluxen optreden tijdens basale en hoge neuronale activiteit9. Genetisch gecodeerde metabole sensoren op basis van Förster-resonantie-energieoverdracht (FRET)-microscopie, zoals ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glucose), Laconic (lactaat) en Pyronic (pyruvaat), hebben bijgedragen aan ons begrip van het energiemetabolisme van de hersenen 10,11,12,13. Vanwege de hoge kosten en geavanceerde apparatuur die nodig is om experimenten uit te voeren op levende dieren of weefsels, zijn de resultaten in gewervelde modellen echter nog steeds voornamelijk beperkt tot celculturen (gliacellen en neuronen).
Het opkomende gebruik van het Drosophila-model om deze sensoren tot uitdrukking te brengen, heeft aangetoond dat belangrijke metabolische kenmerken bij verschillende soorten behouden blijven en dat hun functie gemakkelijk kan worden aangepakt met deze tool. Wat nog belangrijker is, het Drosophila-model heeft licht geworpen op hoe glucose en lactaat/pyruvaat worden getransporteerd en gemetaboliseerd in de hersenen van vliegen, het verband tussen monocarboxylaatconsumptie en geheugenvorming, en de opmerkelijke demonstratie van hoe toename van neurale activiteit en metabole flux elkaar overlappen 14,15,16,17. De hier gepresenteerde methode voor het meten van monocarboxylaat-, glucose- en ATP-niveaus met behulp van genetisch gecodeerde FRET-sensoren die tot expressie worden gebracht in het larvale brein, stelt onderzoekers in staat meer te weten te komen over hoe de hersenen van Drosophila energie gebruiken, die kan worden toegepast op de hersenen van andere dieren.
We laten zien dat deze methode effectief is voor het detecteren van lactaat en glucose in gliacellen en neuronen, en dat een monocarboxylaattransporter (Chaski) betrokken is bij de import van lactaat in gliacellen. We demonstreren ook een eenvoudige methode voor het bestuderen van metabolietveranderingen tijdens verhoogde neuronale activiteit, die gemakkelijk kan worden geïnduceerd door badtoepassing van een GABA A-receptorantagonist. Ten slotte laten we zien dat deze methodologie kan worden gebruikt om monocarboxylaat- en glucosetransport te meten in andere metabolisch significante weefsels, zoals vetlichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Behoud van vliegenstam en larvale synchronisatie
- Om deze experimenten uit te voeren, gebruikt u vliegenculturen die bij 25 °C zijn gekweekt op standaard Drosophila-voedsel dat bestaat uit 10% gist, 8% glucose, 5% tarwebloem, 1,1% agar, 0,6% propionzuur en 1,5% methylparabenen.
- Gebruik de volgende lijnen om dit protocol te volgen: w1118 (experimentele controleachtergrond), OK6-GAL4 (driver voor motorneuronen), repo-GAL4 (driver voor alle gliacellen), CG-GAL4 (driver voor vetlichamen), UAS-Pyronic (pyruvaatsensor), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glucosesensor), UAS-Laconic (lactaatsensor), UAS-GCaMP6f (calciumsensor), UAS-AT1.03NL (ATP-sensor) en UAS-Chk RNAi GD1829. Alle lijnen die sensoren of RNAi tot expressie brengen, bevinden zich in de w1118 genetische achtergrond.
- Om gesynchroniseerde zwervende larven van de derde instar te verkrijgen, plaatst u 300 vliegen (3-5 dagen oud, 100 mannetjes, 200 maagdelijke vrouwtjes) van het gewenste genetische kruis in de legkamer, die een petrischaal van 60 mm bevat bedekt met 1% agarose in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Plaats een druppel vloeibare/romige gist (1,5 cm diameter) in het midden van de plaque om vliegen aan te moedigen eieren te leggen (Figuur 1).
- Houd de vliegen 3 dagen op 25 °C en vervang de agarose petrischaal tweemaal daags door een verse en vers opgeloste gist.
- Laat de vliegen op de vierde dag 4 uur eieren leggen voordat u de petrischaal vervangt. Verwijder deze tandplak. Laat de vliegen vervolgens gedurende 3 uur eieren leggen in een nieuwe agaroseplaquette met vers opgeloste gist. Gebruik deze larven in de experimenten.
- Verwijder na 3 uur de plaque met de eieren en plaats deze gedurende 24 uur in een broedmachine van 25 °C.
- Verzamel 50 tot 100 pas uitgekomen larven van deze plaque (0 uur na het uitkomen van de larven) en plaats ze in een plastic flacon met standaardvoer. Om de larven goed te laten eten, moet u ervoor zorgen dat het voedsel gemalen en zacht is. Gebruik de larven 96 uur na de overdracht.
2. Maak de glazen dekglaasjes met poly-L-lysine
- Voer deze stap 1 uur voor de larvale dissectie uit. Plaats in een celkweekplaat met 6 putjes glazen dekglaasjes van 25 mm (de diameter van de te gebruiken deksels is afhankelijk van de opnamekamer die in de microscoop beschikbaar is).
- Plaats een druppel (300 μL) poly-L-lysine in het midden van elk dekglaasje gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was elk dekglaasje 3x met gedestilleerd water en vervolgens 2x met een zoutoplossing zonder Ca2+ (dezelfde oplossing die wordt gebruikt om de larven te ontleden, zie stap 3.2). Installeer de deksels in de opnamekamer en vul deze met Ca2+-vrije zoutoplossing.
OPMERKING: Hoewel de hersenen van de larven zich rechtstreeks aan de glazen dekglaasjes kunnen hechten, is de hechting zwak en bewegen of verplaatsen de hersenen af en toe tijdens het experiment vanwege de continue stroom van zoutoplossing. De toevoeging van de poly-L-lysinestap vermindert het risico op bewegingen of zelfs hersenverlies als gevolg van de wasbeurten.
3. Ontleed het ventrale zenuwkoord (VNC) en de vetlichamen (FB's)
- Verzamel de zwervende larven van de derde instar uit de gewenste genetische kruising (uit stap 1.7) en was ze 3x grondig met gedestilleerd water.
- Plaats de larven in een glazen dissectieschaal met 750 μL nominaal nul Ca2+ ijskoude zoutoplossing bestaande uit 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES en 35 mM sucrose (pH = 6,7, gemeten met een pH-meter en aangepast met 1 M NaOH en HCl 37% v/v).
OPMERKING: Het instellen van de pH op 6.7 is van cruciaal belang omdat, zoals eerder opgemerkt, het transport van monocarboxylaat sterk afhankelijk is van de pH van de oplossing. Bovendien komt 6,7 overeen met de pH in de hemolymfe van een derde instar-larve17,18. - Plaats de larve onder een stereomicroscoop en maak met een tang een dwarse snede over de achterkant van het achterlijf.
- Duw met de pincet tegen de kaak terwijl je de larven binnenstebuiten keert.
- Observeer het ventrale zenuwkoord (VNC) naast de kaak. Verwijder voorzichtig de denkbeeldige schijven en de resterende hersen-caudale weefsels.
- Scheid de VNC met de centrale hersenen en oogkwabben van de rest van het weefsel door de zenuwen door te snijden. Breng de VNC over, pak het met een pincet op van de resterende zenuwen en plaats het in de opnamekamer met de Ca2+-vrije opnameoplossing (dezelfde oplossing uit stap 3.2). De VNC's hechten zich onmiddellijk aan de dekglaasjes.
- Om interferentie van de resterende zenuwen te voorkomen, bevestigt u ze met een pincet aan de onderkant van het dekglaasje (de zenuwen zullen ook fluorescerend zijn, afhankelijk van de gebruikte aandrijflijn) (Figuur 2).
- Om experimenten uit te voeren in vetlichamen (FB's) die het transport van glucose of monocarboxylaat meten in een andere reeks experimenten, gaat u verder met het isoleren van de weefsels volgens de stappen 3.1-3.4. Zodra de larven binnenstebuiten zijn gekeerd, observeer dan dat de FB een wit, bilateraal, plat weefsel is.
- Plaats de geïsoleerde FB's die de FRET-sensoren tot expressie brengen (verkregen uit een genetische kruising met behulp van de juiste drivers) in de registratiekamer met de registratieoplossing zonder Ca2+.
OPMERKING: De FB is zeer hydrofoob (het heeft de neiging om op het oppervlak van de oplossing te drijven) en uiterst kwetsbaar voor manipulatie met een pincet, het moet met zorg worden behandeld. Elke ruwe behandeling van dit weefsel zal later resulteren in dode cellen (met een verminderde fluorescentie van de sensoren). - Plaats de opnamekamer met VNC's/FB's op de microscooptafel.
4. Beeldvorming van levende cellen
- Om beelden te verkrijgen van de weefselexpressiesensoren, gebruikt u een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop die is gekoppeld aan een emissiesplitsingssysteem en een CCD-camera. Schakel het verlichtingssysteem van de microscoop 30 minuten voor aanvang van een experiment in.
OPMERKING: Hier gebruiken we een Spinning Disk-fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 20x/0.5 wateronderdompelingsobjectief om zowel VNC's als FB's te observeren. Figuur 2 toont ook het gebruik van een 40x/0.8 wateronderdompelingsobjectief. - Om GCaMP6f-fluorescentie te visualiseren, stelt u de excitatie - en emissiegolflengten in op respectievelijk 488 nm en 540 nm. Stel voor laconieke/pyronische/ATP/glucosesensoren de excitatiegolflengte in op 440 nm en de emissiegolflengten op 488 nm (mTFP, CFP) en 540 nm (Venus, YFP).
- Verkrijg elke 2 s afbeeldingen van 512 x 512 pixels voor GCaMP6f en elke 10-30 s voor laconieke/pyronische/ATP/glucosesensoren. Bepaal de optimale belichting tot de lichtbron en observeer de kwaliteit van het verkregen beeld. Om dit protocol te volgen, moet u ervoor zorgen dat de beelden een belichting van 300 ms hebben voor laconieke en pyronale sensoren en 100-150 ms voor de glucose- en ATP-sensoren.
OPMERKING: De blootstelling kan variëren, afhankelijk van het gebruik van een confocale of normale fluorescentiemicroscoop. - Zodra de opnamekamer in de tafel van de microscoop is geïnstalleerd, plaatst u het onderdompelingsobjectief in water voorzichtig en zorgt u ervoor dat het objectief tijdens het experiment ondergedompeld blijft. Houd de kamertemperatuur op 25 °C.
- Sluit de registratiekamer aan op een perfusiesysteem en houd de weefsels badend in de opnameoplossing die 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES en 35 mM sucrose, pH 6,7 bevat (gemeten met een pH-meter en afgesteld met NaOH en HCl).
- Handhaaf een constante stroom van 3 ml/min opnameoplossing door het weefsel met behulp van de zwaartekracht, gekoppeld aan een peristaltische pomp met lage flux om de vloeistof uit de kamer te extraheren terwijl het volume constant blijft. Om de vereiste stroom te bereiken, plaatst u de oplossingshoudende buisjes (plastic buisjes van 50 ml) 25 cm boven de microscooptafel.
OPMERKING: Deze door zwaartekracht aangedreven stroming wordt gebruikt om weefselbeweging veroorzaakt door peristaltische pompen te voorkomen, waardoor later een nauwkeurigere beeldanalyse mogelijk is. - Laat de opnameoplossing vóór elke stimulatie 5-10 minuten stromen om een stabiele basislijn van fluorescentie van de sensoren te verkrijgen. Wijzig de duur indien nodig om deze basislijn te verkrijgen.
- Vervang de stromende oplossing gedurende 5 minuten door de stimulatieoplossing om de VNC/FB's te stimuleren (met glucose, pyruvaat of lactaat in de concentratie beschreven voor elk experiment opgelost in zoutoplossing; zie elke afbeelding).
OPMERKING: De duur van de stimulatie kan worden gevarieerd afhankelijk van de behoeften van het experiment (glucosepulsen kunnen bijvoorbeeld worden verhoogd tot 10 minuten om een plateau in neuronen te bereiken, zoals eerder gemeld16). - Om de osmolariteit in de stimulatieoplossing te behouden, corrigeert u de sucroseconcentratie (een koolhydraat dat niet kan worden gemetaboliseerd door de Drosophila-hersenen ) volgens de concentratie van het toegevoegde monocarboxylaat of glucose.
- Vervang de oplossingen met behulp van een eenvoudig systeem van kleppen. Pas op dat u de microscooptafel niet verplaatst.
- Stel de VNC bloot aan 80 μM picrotoxine (PTX, continu stromend) om neuronale activiteit te stimuleren. Deze procedure verhoogt de frequentie van Ca2+ oscillaties, waardoor het mogelijk wordt om veranderingen in metabolisch relevante moleculen (bijv. intracellulair ATP) waar te nemen.
- Was aan het einde van elk experiment het volledige stroomsysteem, inclusief de buizen en de opnamekamer, grondig gedurende ten minste 10 minuten met de zoutoplossing en nog eens 10 minuten met gedestilleerd water om elk spoor van de gebruikte oplossingen te verwijderen.
5. Beeldverwerking en data-analyse
- Om de verkregen beelden te verwerken, gaat u verder met de stappen die worden weergegeven in afbeelding 3.
- Importeer de afbeelding (Laconic) in de ImageJ-software. De afbeelding heeft twee weergaven van het monster: de linker is het mTFP-signaal en de rechter is het Venus-signaal. Selecteer een gebied met de cellen die moeten worden geanalyseerd en scheid deze afbeeldingen (mTFP en Venus) in een nieuw venster. Zorg ervoor dat deze afbeeldingen exact hetzelfde gebied bevatten.
- Open de registratieplug-in en corrigeer de kleine drift van het weefsel die normaal wordt waargenomen in het experiment met het functiestijve lichaam. Voer dit uit in beide afbeeldingen (mTFP en Venus).
- Selecteer ten minste 10 interessegebieden (ROI's) in het cytosol van de corresponderende 10 cellen in het mTFP-signaal (488 nm) en breng de selecties over naar het Venusbeeld (540 nm).
- Selecteer twee of drie ROI's in de buurt van de cellen die worden geanalyseerd, maar zonder waarneembaar signaal (altijd binnen de VNC of het geanalyseerde weefsel, zie figuur 3). Dit zijn de ROI's op de achtergrond.
- Met de ROI's geselecteerd in beide afbeeldingen, verkrijgt u de gemiddelde grijswaarde van elk signaal met behulp van de functiemeting. Breng de gegevens over naar een gegevensblad en trek de gemiddelde achtergrondwaarde voor elk signaal af.
- Bepaal de mTFP-fluorescentieverhouding over Venus (voor laconiek en pyronic). Deze waarde wordt anders berekend dan de andere FRET-sensoren die hier worden beschreven (waar de verhouding meestal YFP/CFP is), omdat zowel Laconic als Pyronic hun FRET-efficiëntie verminderen wanneer ze aan hun respectievelijke substraten worden gebonden.
- Normaliseer de gegevens door elke geregistreerde waarde te delen door de basislijn. Bereken in een apart gegevensblad de basislijn door de gemiddelde waarde van de mTFP/Venus-ratio gedurende de 2 minuten voorafgaand aan de stimulus te nemen.
- Bereken voor de glucose- en ATP-metingen met behulp van FRET-gebaseerde sensoren de YFP/CFP-verhouding en normaliseer de gegevens zoals beschreven in stap 5.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gedurende maximaal 1 uur maakt deze procedure het mogelijk om gemakkelijk intracellulaire veranderingen in de fluorescentie van monocarboxylaat- en glucosesensoren te meten. Zoals te zien is in figuur 4, reageren laconieke sensoren in zowel gliacellen als motorneuronen aan het begin van de puls met een vergelijkbare snelheid op 1 mM-lactaat, maar motorneuronen bereiken een hogere toename ten opzichte van de basislijn tijdens de puls van 5 minuten, zoals eerder aangetoond17. Deze lactaatconcentratie is gekozen omdat deze vergelijkbaar is met de niveaus die worden aangetroffen in de hemolymfe van larven van de derde instar. Evenzo, wanneer VNC-expressieve glucosesensoren werden blootgesteld aan 5 mM glucose (een waarde die vergelijkbaar is met die gemeten in de hemolymfe door ons en anderen19), nam het signaal van de sensor met een vergelijkbare snelheid toe in gliacellen en neuronen. Tijdens de glucosepuls neemt het signaal in neuronen echter meer toe dan in gliacellen. Dit komt overeen met eerdere waarnemingen van soortgelijke FRET-sensorexpressiepreparaten16.
Dit preparaat kan worden gebruikt om experimenten uit te voeren op onbeschreven monocarboxylaat- en glucosetransporters die tot expressie worden gebracht in Drosophila-gliacellen of neuronen20. Hier illustreren we het gebruik van RNA-interferentie om aan te tonen dat Chaski (Chk), waarvan eerder bekend was dat het monocarboxylaten in heterologe cellen transporteerde, lactaat transporteert in gliacellen (Figuur 5). Onder voedingsbeperkende omstandigheden werd beschreven dat deze transporter een belangrijke rol speelt in de fysiologie en het gedrag van dieren21. We ontdekten dat in gliacellen het uitschakelen van Chk het lactaattransport verminderde in vergelijking met controle-VNC's die werden blootgesteld aan 1 mM-lactaat (Figuur 5). Andere vermeende transporters kunnen worden getest om te zien of ze metabolieten kunnen transporteren in fysiologische en pathologische omstandigheden.
Om de studie van metabole veranderingen geassocieerd met neuronale activiteit aan te pakken, hebben we een eenvoudige methode ontwikkeld om neuronale activiteit te verhogen zonder gebruik te maken van technisch complexe procedures zoals optogenetica, die de FRET-sensormetingen kunnen verstoren (Figuur 6). De geïsoleerde VNC werd blootgesteld aan picrotoxine (PTX), een bekende GABA A-receptorantagonist die eerder door ons en anderen werd gebruikt17,22. De gebruikte concentratie verhoogt de frequentie van calciumoscillaties in neuronen (zoals gemeten aan de hand van veranderingen in GCaMP6f-fluorescentie) en significante veranderingen in metabolisch relevante moleculen zoals glucose, lactaat en pyruvaat17. Bovendien resulteren PTX-geïnduceerde verhogingen van neuronale activiteit in een tijdelijke daling van ATP-niveaus in de soma van motorneuronen. Dit fenomeen is eerder beschreven in gewervelde modellen waarin de neuronale activiteit werd verhoogd via elektrische stimulatie of door gebruik te maken van GABA A-receptorantagonisten23,24. Als gevolg hiervan kan dit model worden gebruikt om metabole veranderingen in specifieke subsets van neuronen en gliacellen te volgen, waarbij wordt ingespeeld op de behoefte aan energiegerelateerde transporters die bijdragen aan de ATP-productie tijdens hoge neuronale activiteit.
Het transport van glucose en monocarboxylaat is ook belangrijk in andere weefsels of cellen dan de hersenen. We tonen hier de visualisatie van monocarboxylaat (lactaat/pyruvaat) en glucoseopname in vetlichamen, een metabolisch relevant weefsel dat aanwezig is in de larven en de volwassen vlieg en dat verschillende sleutelfuncties heeft, zoals lipidenopslag en metabolisatie25. De Laconic-sensor wordt goed uitgedrukt in FB, zoals weergegeven in figuur 7, waar de lipidedruppeltjes kunnen worden gezien als kleine zwarte bolletjes in de cel. Dit geïsoleerde weefsel hecht goed aan de met poly-L-lysine gecoate dekglaasjes, waardoor een langdurige celbeeldvormingsprocedure mogelijk is die ook gemakkelijk te analyseren is. We zagen een significante toename van de fluorescentie van de glucosesensor wanneer FB werd blootgesteld aan toenemende glucoseconcentraties (ongeveer 5 mM), wat dicht bij de glucoseconcentratie in de hemolymfe ligt. Verdere blootstelling aan hogere glucoseconcentraties (10 mM) leidt niet tot de verwachte toename van sensorfluorescentie. Ten slotte konden we in FB de import van lactaat en pyruvaat meten (Figuur 7C,D). In dit geval veroorzaakt het verhogen van de lactaat- en pyruvaatconcentraties een evenredige toename van laconieke en pyronale fluorescentie (variërend van 0,1 tot 1 mM). Hogere monocarboxylaatconcentraties resulteren in signaalverzadiging in de cellen.
Figuur 1: Synchronisatie van Drosophila-larven . De larvale synchronisatieprocedure wordt grafisch weergegeven. Twee uur voordat het proces begint, moeten 1% agaroseplaten worden bereid en tweemaal daags worden vervangen tot dag 4. De uitbroedende larven moeten met zorg worden verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Geïsoleerd larvale brein van Drosophila dat de lactaatsensor Laconic tot expressie brengt. (A) Een representatief beeld van een geïsoleerde Drosophila derde-instar larve's gescheiden VNC gehecht aan een poly-L-lysine-gecoate dekglaasje en het tot expressie brengen van de lactaatsensor Laconic in motorneuronen (OK6-GAL4). De afbeeldingen tonen een helderveldbeeld van de VNC (links) en de mTFP-fluorescentie van de sensor (middenpaneel), vastgelegd met een 20x onderdompelingsobjectief in water. De afbeeldingen in het onderste paneel zijn van dezelfde VNC genomen met een 40x onderdompelingsobjectief in water. (B) Motorneuronen van een VNC die de laconieke lactaatsensor (OK6>laconiek) tot expressie brengen, geplaatst in een zoutoplossing zonder lactaat. De afbeelding toont mTFP-fluorescentie (links), Venus-fluorescentie (midden) en de verhouding tussen de twee fluorescentie (rechts, geproduceerd met behulp van de Ratio Plus-plug-in van ImageJ-software). Schaalbalken = 50 μm (A, bovenste paneel), 10 μm (A onderste paneel, B). Afkortingen: VNC = ventrale zenuwstreng; mTFP = monomeer groenblauw fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stap-voor-stap analyses van de beelden. Een schematische illustratie van het ImageJ-softwareprotocol voor beeldanalyse, met weergave van het proces (eerste kolom), ImageJ-opdrachten (tweede kolom) en beeldverwerkingsresultaten (derde kolom). Het voorbeeld begint met een onbewerkte afbeelding van een VNC die de laconieke lactaatsensor tot expressie brengt in motorneuronen (OK6-GAL4). Afkortingen: VNC = ventrale zenuwstreng; mTFP = monomeer groenblauw fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Monocarboxylaat- en glucosetransport in neuronen en gliacellen van de larvale hersenen van Drosophila . (A) Representatieve beelden van VNC die de lactaatsensor Laconic tot expressie brengt in motorneuronen (OK6-Gal4>Laconic). Laconieke fluorescentie in motorneuronen wordt gezien vóór, tijdens en na een puls van 5 minuten van 1 mM lactaat. De Ratio Plus-plug-in van ImageJ werd gebruikt om ratio-afbeeldingen (mTFP/Venus) te maken. Schaalbalk = 10 μm. (B) Representatieve opnames van FRET-signalen van geïsoleerde VNC's die de laconieke lactaatsensor tot expressie brengen in motorneuronen (OK6-GAL4, grijze lijnen) of gliacellen (REPO-GAL4, zwarte lijnen) die gedurende 5 minuten zijn blootgesteld aan 1 mM-lactaat. De sporen geven de aangepaste FRET-signalen weer tot de gemiddelde waarde die 2 minuten voor de lactaatblootstelling werd verzameld. (C) Representatieve opnames van FRET-signalen van geïsoleerde VNC's die de glucosesensor FLII12Pglu700μδ6 tot expressie brengen in motorneuronen (OK6-GAL4, grijze lijnen) of gliacellen (REPO-GAL4, zwarte lijnen) blootgesteld aan 5 mM glucose gedurende 5 minuten. De sporen geven de aangepaste FRET-signalen weer tot de gemiddelde waarde die twee minuten voor de blootstelling aan glucose is verzameld. Afkortingen: VNC = ventrale zenuwstreng; mTFP = monomeer groenblauw fluorescerend eiwit; FRET = Föster resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Lactaattransport in gliacellen van de Drosophila larvale hersenen die Chaski RNAi tot expressie brengen. (A) Geïsoleerde VNC die alleen de lactaatsensor Laconic tot expressie brengt (genetische controle, w1118, zwarte lijn) of die een RNAi co-expressie tot knock-out brengt om Chaski (Chk)-expressie (chk-RNAi, magenta) uit te schakelen, werden gedurende 5 minuten blootgesteld aan 1 mM lactaat. Voor elke aandoening vertegenwoordigen de sporen de gemiddelde FRET-waarde verkregen uit zeven afzonderlijke VNC's (70 cellen per aandoening, genormaliseerd met behulp van de gemiddelde waarde verkregen 2 minuten voordat ze werden blootgesteld aan lactaat). (B) Het gebied onder de curve in A wordt gebruikt voor de berekening van de intracellulaire lactaataccumulatie. Voor elke aandoening zijn de waarden de gemiddelde SE van 70 cellen en zeven onafhankelijke experimenten (controle of chk-RNAi). De ongepaarde t-toets van de student werd gebruikt voor statistische analyse (*p < 0,05). Afkortingen: VNC = ventrale zenuwstreng; FRET = Föster resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Veranderingen in neuronale ATP-niveaus geïnduceerd door blootstelling aan picrotoxine. Opnames van de fluorescentie die zijn vastgelegd van VNC's die de genetisch gecodeerde (A) calciumsensor GCaMP6f of (B, een andere reeks experimenten) de ATP-sensor AT1.03NL tot expressie brengen in motorneuronen (OK6-GAL4) die werden blootgesteld aan de GABA A-receptorantagonist Picrotoxine (80 μM) gedurende de tijd die door de lijn wordt aangegeven. De representatieve opname is afkomstig van een enkel motorneuron van een VNC (in A) of de gemiddelde ± SE van 10 cellen van een enkele VNC (in B) genormaliseerd naar de gemiddelde waarden die 2 minuten voorafgaand aan PTX-blootstelling zijn verkregen. Afkortingen: VNC = ventrale zenuwstreng; PTX = picrotoxine; SE = standaardfout; CFP = cyaan fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Transport van monocarboxylaat en glucose in Drosophila-vetlichamen . (A) Afbeelding van het geïsoleerde vetlichaam van larven van de derde instar die de lactaatsensor Laconic tot expressie brengen (mTFP-fluorescentie). Schaalbalk = 10 μm. (B) Representatieve sporen van het genormaliseerde signaal vastgelegd in FB dat de glucosesensor (FLII12Pglu700μδ6) uitdrukt die is blootgesteld aan glucose (1, 5 en 10 mM glucose). De gegevens werden genormaliseerd naar de eerste 2 minuten vóór blootstelling aan glucose. (C,D) Representatieve sporen van het genormaliseerde signaal verkregen van FB dat de lactaatsensor (C) of de pyruvaatsensor (D) tot expressie brengt die is blootgesteld aan 0,1-0,5-1 mM lactaat of pyruvaat. De gegevens werden genormaliseerd naar de eerste 2 minuten vóór blootstelling aan lactaat of pyruvaat. Afkortingen: FB = fat body; mTFP = monomeer groenblauw fluorescerend eiwit; YFP = geel fluorescerend eiwit; CFP = cyaan fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van het Drosophila-model voor de studie van het hersenmetabolisme is relatief nieuw26, en het is aangetoond dat het meer kenmerken deelt met het metabolisme van zoogdieren dan verwacht, dat voornamelijk in vitro is bestudeerd in primaire neuronculturen of hersenplakjes. Drosophila blinkt uit in in vivo experimenten dankzij de batterij van genetische hulpmiddelen en genetisch gecodeerde sensoren die beschikbaar zijn en waarmee onderzoekers in realtime de metabole veranderingen kunnen visualiseren die worden veroorzaakt door geïnduceerde activiteit of zelfs als reactie op een sensorische stimulus.
Het hier beschreven protocol laat zien hoe monocarboxylaat- en glucosetransport in Drosophila VNC-gliacellen en neuronen kan worden gemeten in een ex-vivo-preparaat dat het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende metabole sensoren op basis van FRET-microscopie mogelijk maakt om time-lapse-video's te maken van metabole veranderingen in rustende en actieve neuronen. Dit protocol kan eenvoudig worden gemonteerd en uitgevoerd in elk laboratorium met behulp van het Drosophila-model zonder het gebruik van complexe machines, met behulp van een epifluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een emissiesplitsingssysteem. Het kan ook worden geschaald naar meer geavanceerde apparatuur zoals een draaiende schijf, laser confocale of twee-fotonmicroscopen (maar een splitter om de lichtemissie te verdelen is vereist) om specifieke cellen op te nemen die zich dieper in de hersenen bevinden, zoals gebeurt in volwassen Drosophila-hersenen . Omdat dit soort metabolische signalen relatief traag zijn, is een snelle of dure videocamera niet nodig.
Bovendien heeft het geïsoleerde VNC- of FB-preparaat geen geavanceerde methode nodig voor bewegingscorrectie die soms nodig is voor in vivo opnames. ImageJ-plug-ins kunnen de meeste bewegingen van de VNC's die tijdens het experiment worden geproduceerd, naar tevredenheid corrigeren. Als gevolg hiervan kan de toename van neuronale activiteit door de toevoeging van PTX of de toevoeging van relevante metabolieten gelijktijdig worden uitgevoerd zonder de problemen die worden veroorzaakt door natuurlijke samentrekking van lichaamsspieren, zoals te zien is in andere protocollen (zoals de filetbereiding)27.
We tonen representatieve experimenten waarin lactaat- en glucosetransport duidelijk wordt waargenomen bij fysiologisch relevante concentraties van deze metabolieten (respectievelijk 1 en 5 mM). Van hieruit wordt verwacht dat elk niet-gekarakteriseerd gen of eerder gerapporteerd eiwit kan worden getest op transportcapaciteit in verschillende omstandigheden, zoals het gebruik van verschillende modellen van neurodegeneratieve ziekten of metabole beledigingen (hoogcalorische diëten of beperking van voedingsstoffen). In dit verband tonen we aan dat RNAi-gemedieerde knockdown van een bekende monocarboxylaattransporter het lactaattransport in gliacellen aanzienlijk vermindert. Interessant is dat de signalen die worden verkregen van laconieke en pyronale sensoren zeer gevoelig zijn voor de veranderingen in lactaat of pyruvaat in de media, waardoor een nauwkeurige meting van de intracellulaire veranderingen in deze metabolieten mogelijk is. Dit ruime dynamische bereik van het signaal lijkt anders te zijn in zoogdiercellen waar een niet-lineaire relatie tussen het signaal van de sensor en de intracellulaire lactaatconcentratie is waargenomen28.
Deze benadering kan antwoorden geven op belangrijke aspecten over waar en wanneer monocarbonylaten en glucose worden verwerkt of gebruikt om energie in de hersenen op te wekken tijdens basale en hoge neuronale activiteit. De toename van neuronale activiteit veroorzaakt door PTX kan aanzienlijke veranderingen in energiegerelateerde metabolieten veroorzaken, op een vergelijkbare manier als wat is gezien in celculturen, hersenglijbanen en levende organismen. In het bijzonder treedt een toename van de ATP-productie op enkele minuten na een toename van neuronale activiteit, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van glucosemetabolisatie en de uitwisseling van lactaat en pyruvaat tussen gliacellen en neuronen, zoals eerder gemeld17. De studie van de behoeften van specifieke cellen voor de toevoer van glucose en monocarboxylaten, evenals de mechanismen die ten grondslag liggen aan hun transport of generatie, kan mogelijk worden gemaakt door de expressie van bepaalde genen te manipuleren in combinatie met het gebruik van genetisch gecodeerde sensoren.
Andere metabolisch belangrijke weefsels kunnen zich gemakkelijk binden aan met poly-L-lysine gecoate dekglaasjes en metabolietveranderingen kunnen gedurende enkele minuten in beeld worden gebracht. Nieuwe transporters die het transport van glucose of lactaat in verschillende weefsels mediëren, kunnen worden bestudeerd. Circulerende glucose wordt getransporteerd om de disacharide trehalose in larvale vetlichamen te produceren via mechanismen die niet volledig worden begrepen, deze methoden kunnen helpen om deze route beter te begrijpen. Bovendien kunnen vetzuren onder voedingsbeperking worden gemetaboliseerd om ketonlichamen in de FB te produceren en de transporters die nodig zijn om ze naar de hemolymfe te extruderen, zijn nog onbekend.
Het is belangrijk op te merken dat dit protocol kan worden gebruikt om de accumulatie van een metaboliet in de loop van de tijd te schatten of om de mate van toename van de fluorescentie van een specifieke sensor tussen omstandigheden te bepalen, maar niet om formeel rekening te houden met veranderingen in "concentratie" omdat dit een in-situ sensorkalibratie zou vereisen. De verschillende cellagen waaruit de VNC bestaat, beperken in dit geval de diffusie van moleculen, zoals ionoforen, die nodig zijn voor deze kalibratie. We raden echter aan om richtlijnen voor beeldverwerking te volgen die contrasterende lactaatniveaus tussen verschillende organen of cellen in een dier mogelijk maken29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende of financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Wij danken alle leden van het Sierralta Lab. Dit werk werd ondersteund door FONDECYT-Iniciación 11200477 (naar AGG) en FONDECYT Regular 1210586 (naar JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glucosesensor) werd vriendelijk geschonken door Pierre-Yves Plaçais en Thomas Preat, CNRS-Parijs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
