Summary
Nous présentons ici un protocole pour visualiser le transport des monocarboxylates, du glucose et de l’ATP dans les cellules gliales et les neurones à l’aide de capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Förster génétiquement codés dans une préparation cérébrale ex-vivo de larves de drosophile .
Abstract
Les besoins énergétiques élevés du cerveau dus à l’activité électrique sont l’une de leurs caractéristiques les plus distinctives. Ces besoins sont satisfaits par la production d’ATP à partir du glucose et de ses métabolites, tels que les monocarboxylates lactate et pyruvate. On ne sait toujours pas comment ce processus est réglementé ni qui en sont les principaux acteurs, en particulier chez la drosophile.
En utilisant des capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Förster génétiquement codés, nous présentons une méthode simple pour mesurer le transport des monocarboxylates et du glucose dans les cellules gliales et les neurones dans une préparation ex-vivo du cerveau larvaire de la drosophile . Le protocole décrit comment disséquer et coller un cerveau larvaire exprimant l’un des capteurs à une lamelle en verre.
Nous présentons les résultats d’une expérience complète dans laquelle le transport du lactate a été mesuré dans le cerveau des larves en neutralisant des transporteurs de monocarboxylate précédemment identifiés dans les cellules gliales. De plus, nous démontrons comment augmenter rapidement l’activité neuronale et suivre les changements de métabolites dans le cerveau actif. La méthode décrite, qui fournit toutes les informations nécessaires, peut être utilisée pour analyser d’autres tissus vivants de la drosophile .
Introduction
Le cerveau a des besoins énergétiques élevés en raison du coût élevé de la restauration des gradients ioniques dans les neurones causés par la génération et la transmission du signal électrique neuronal, ainsi que par la transmission synaptique 1,2. On a longtemps pensé que cette forte demande énergétique était satisfaite par l’oxydation continue du glucose pour produire de l’ATP3. Des transporteurs spécifiques à la barrière hémato-encéphalique transfèrent le glucose dans le sang vers le cerveau. Des niveaux glycémiques constants garantissent que le cerveau reçoit un apport constant de glucose4. Il est intéressant de noter que de plus en plus de preuves expérimentales suggèrent que les molécules dérivées du métabolisme du glucose, telles que le lactate et le pyruvate, jouent un rôle important dans la production d’énergie des cellules cérébrales 5,6. Cependant, il y a encore un débat sur l’importance de ces molécules pour la production d’énergie et sur les cellules du cerveau qui les produisent ou les utilisent 7,8. Le manque d’outils moléculaires appropriés avec la haute résolution temporelle et spatiale requise pour cette tâche est un problème important qui a empêché cette controverse d’être complètement résolue.
Le développement et l’application de plusieurs capteurs métaboliques fluorescents ont permis d’améliorer considérablement notre compréhension de l’endroit et de la manière dont les métabolites sont produits et utilisés, ainsi que de la façon dont les flux métaboliques se produisent pendant l’activité neuronale basale et élevée9. Des capteurs métaboliques génétiquement codés basés sur la microscopie à transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET), tels que ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glucose), Laconic (lactate) et Pyronic (pyruvate), ont contribué à notre compréhension du métabolisme énergétique cérébral 10,11,12,13. Cependant, en raison des coûts élevés et de l’équipement sophistiqué requis pour mener des expériences sur des animaux vivants ou des tissus, les résultats des modèles de vertébrés sont encore principalement limités aux cultures cellulaires (cellules gliales et neurones).
L’utilisation émergente du modèle de la drosophile pour exprimer ces capteurs a révélé que les caractéristiques métaboliques clés sont conservées à travers les espèces et que leur fonction peut être facilement traitée avec cet outil. Plus important encore, le modèle de la drosophile a mis en lumière la façon dont le glucose et le lactate/pyruvate sont transportés et métabolisés dans le cerveau de la mouche, le lien entre la consommation de monocarboxylate et la formation de la mémoire, et la démonstration remarquable de la façon dont les augmentations de l’activité neuronale et du flux métabolique se chevauchent 14,15,16,17. La méthode présentée ici pour mesurer les niveaux de monocarboxylate, de glucose et d’ATP à l’aide de capteurs FRET génétiquement codés exprimés dans le cerveau larvaire permet aux chercheurs d’en savoir plus sur la façon dont le cerveau de la drosophile utilise l’énergie, qui peut être appliquée au cerveau d’autres animaux.
Nous montrons que cette méthode est efficace pour détecter le lactate et le glucose dans les cellules gliales et les neurones, et qu’un transporteur de monocarboxylate (Chaski) est impliqué dans l’importation du lactate dans les cellules gliales. Nous démontrons également une méthode simple pour étudier les changements de métabolites lors d’une activité neuronale accrue, qui peut être facilement induite par l’application d’un antagoniste du récepteur GABAA . Enfin, nous montrons que cette méthodologie peut être utilisée pour mesurer le transport du monocarboxylate et du glucose dans d’autres tissus métaboliquement significatifs, tels que les corps adipeux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Entretien de la souche de mouche et synchronisation larvaire
- Pour réaliser ces expériences, utilisez des cultures de mouches élevées à 25 °C sur des aliments standard pour drosophiles composés de 10 % de levure, 8 % de glucose, 5 % de farine de blé, 1,1 % de gélose, 0,6 % d’acide propionique et 1,5 % de méthylparabène.
- Pour suivre ce protocole, utilisez les lignes suivantes : w1118 (fond de contrôle expérimental), OK6-GAL4 (pilote pour les motoneurones), repo-GAL4 (pilote pour toutes les cellules gliales), CG-GAL4 (pilote pour les corps adipeux), UAS-Pyronic (capteur de pyruvate), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (capteur de glucose), UAS-Laconic (capteur de lactate), UAS-GCaMP6f (capteur de calcium), UAS-AT1.03NL (capteur d’ATP) et UAS-Chk RNAi GD1829. Toutes les lignées exprimant des capteurs ou ARNi sont dans le fond génétique w1118 .
- Pour obtenir des larves errantes synchronisées au troisième stade, placez 300 mouches (âgées de 3 à 5 jours, 100 mâles, 200 femelles vierges) du croisement génétique souhaité dans la chambre de ponte, qui contient une boîte de Pétri de 60 mm recouverte d’agarose à 1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Placez une goutte de levure liquide/crémeuse (1,5 cm de diamètre) au centre de la plaque pour encourager les mouches à pondre des œufs (Figure 1).
- Maintenez les mouches à 25 °C pendant 3 jours en remplaçant la boîte de Pétri d’agarose par une fraîche et de la levure fraîchement dissoute deux fois par jour.
- Laissez les mouches pondre pendant 4 h le quatrième jour avant de changer la boîte de Pétri. Retirez cette plaque. Ensuite, pendant 3 h, laissez les mouches pondre dans une nouvelle plaque d’agarose avec de la levure fraîchement dissoute. Utilisez ces larves dans les expériences.
- Après 3 h, retirez la plaque contenant les œufs et placez-la dans un incubateur à 25 °C pendant 24 h.
- Prélevez 50 à 100 larves nouvellement écloses de cette plaque (0 h après l’éclosion des larves) et placez-les dans un flacon en plastique contenant de la nourriture standard. Pour permettre aux larves de se nourrir correctement, assurez-vous que la nourriture est moulue et molle. Utiliser les larves 96 h après le transfert.
2. Fabriquer les lamelles en verre avec de la poly-L-lysine
- Effectuez cette étape 1 h avant la dissection larvaire. Dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits, placer des lamelles en verre de 25 mm (le diamètre des couvercles à utiliser dépend de la chambre d’enregistrement disponible au microscope).
- Placer une goutte (300 μL) de poly-L-lysine au centre de chaque lamelle pendant 30 min à température ambiante.
- Lavez chaque lamelle 3x avec de l’eau distillée, puis 2x avec une solution saline dépourvue de Ca2+ (la même solution utilisée pour disséquer les larves, voir étape 3.2). Installez les couvercles dans la chambre d’enregistrement et remplissez-la de solution saline sans Ca2+.
REMARQUE : Bien que le cerveau larvaire puisse adhérer directement aux lamelles de verre, l’adhérence est faible et le cerveau bouge ou se déplace occasionnellement pendant l’expérience en raison du flux continu de solution saline. L’ajout de l’étape poly-L-lysine réduit le risque de mouvements ou même de perte de cerveau à la suite des lavages.
3. Disséquer le cordon nerveux ventral (VNC) et les corps adipeux (FB)
- Rassemblez les larves errantes du troisième stade du croisement génétique souhaité (à partir de l’étape 1.7) et lavez-les soigneusement 3 fois avec de l’eau distillée.
- Placer les larves dans un puits de dissection en verre contenant 750 μL de solution saline glacée Ca2+ nominalement nulle composée de 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 4 mM de MgCl2, 5 mM de tréhalose, 5 mM HEPES et 35 mM de saccharose (pH = 6,7, mesuré avec un pH-mètre et ajusté avec 1 M de NaOH et HCl 37 % v/v).
REMARQUE : Il est essentiel de régler le pH à 6,7 car, comme nous l’avons déjà observé, le transport des monocarboxylates dépend fortement du pH de la solution. De plus, 6,7 correspond au pH dans l’hémolymphe d’une larve du troisième stade 17,18. - Placez la larve sous un stéréomicroscope et faites une coupe transversale à l’arrière de l’abdomen avec une paire de pinces.
- Poussez la mâchoire avec la pince tout en retournant les larves.
- Observez le cordon nerveux ventral (VNC) à côté de la mâchoire. Retirez soigneusement les disques imaginaux et les tissus caudaux restants.
- Séparez le VNC avec le cerveau central et les lobes optiques du reste du tissu en coupant les nerfs. Transférez le VNC, en le prenant avec une pince sur les nerfs restants, et en le plaçant dans la chambre d’enregistrement contenant la solution d’enregistrement sans Ca2+ (même solution que l’étape 3.2). Les VNC adhéreront immédiatement aux lamelles.
- Pour éviter toute interférence avec les nerfs restants, fixez-les au bas de la lamelle à l’aide d’une pince (les nerfs seront également fluorescents selon la ligne de pilote utilisée) (Figure 2).
- Pour effectuer des expériences sur des corps adipeux mesurant le transport du glucose ou du monocarboxylate dans une autre série d’expériences, procédez à l’isolement des tissus en suivant les étapes 3.1-3.4. Une fois les larves retournées, observez que le FB est un tissu blanc, bilatéral et plat.
- Placer les FB isolés exprimant les capteurs FRET (obtenus à partir d’un croisement génétique à l’aide des pilotes appropriés) dans la chambre d’enregistrement contenant la solution d’enregistrement sans Ca2+.
REMARQUE : Le FB est très hydrophobe (il a tendance à flotter à la surface de la solution) et extrêmement vulnérable à la manipulation avec des pinces, il doit être manipulé avec précaution. Toute manipulation brutale de ce tissu entraînera des cellules mortes plus tard (avec une diminution de la fluorescence des capteurs). - Placez la chambre d’enregistrement contenant les VNC/FB sur la platine du microscope.
4. Imagerie de cellules vivantes
- Pour acquérir des images des capteurs d’expression tissulaire, utilisez un microscope à fluorescence vertical couplé à un système de division d’émission et à une caméra CCD. Allumez le système d’éclairage du microscope 30 minutes avant de commencer toute expérience.
REMARQUE : Ici, nous utilisons un microscope à fluorescence à disque rotatif équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 20x/0,5 pour observer à la fois les VNC et les FB. La figure 2 montre également l’utilisation d’un objectif d’immersion dans l’eau 40x/0,8. - Pour visualiser la fluorescence GCaMP6f, réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 488 nm et 540 nm, respectivement. Pour les capteurs laconiques/pyroniques/ATP/glucose, réglez la longueur d’onde d’excitation à 440 nm et les longueurs d’onde d’émission à 488 nm (mTFP, CFP) et 540 nm (Venus, YFP).
- Acquérez des images de 512 x 512 pixels toutes les 2 s pour GCaMP6f et toutes les 10-30 s pour les capteurs laconiques/pyroniques/ATP/glucose. Déterminer l’exposition optimale à la source lumineuse en observant la qualité de l’image obtenue. Pour suivre ce protocole, assurez-vous que les images sont de 300 ms d’exposition pour les capteurs laconiques et pyroniques et de 100-150 ms pour les capteurs de glucose et d’ATP .
REMARQUE : L’exposition peut varier en fonction de l’utilisation d’un microscope confocal ou à fluorescence normale. - Une fois la chambre d’enregistrement installée dans la platine du microscope, placez soigneusement l’objectif d’immersion dans l’eau et assurez-vous que l’objectif reste immergé tout au long de l’expérience. Maintenez la température ambiante à 25 °C.
- Raccorder la chambre d’enregistrement à un système de perfusion et maintenir les tissus baignés dans la solution d’enregistrement contenant 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl2, 4 mM de MgCl2, 5 mM de tréhalose, 5 mM d’HEPES et 35 mM de saccharose, pH 6,7 (mesuré avec un pH-mètre et ajusté avec du NaOH et du HCl).
- Maintenir un débit constant de 3 mL/min de solution d’enregistrement à travers le tissu en utilisant la gravité, couplée à une pompe péristaltique à faible flux pour extraire le liquide de la chambre tout en maintenant le volume constant. Pour obtenir le débit requis, placez les tubes contenant la solution (tubes en plastique de 50 ml) à 25 cm au-dessus de la platine du microscope.
REMARQUE : Cet écoulement par gravité est utilisé pour empêcher le mouvement des tissus causé par les pompes péristaltiques, permettant une analyse d’image plus précise par la suite. - Avant toute stimulation, maintenez la solution d’enregistrement en circulation pendant 5 à 10 minutes pour obtenir une base stable de fluorescence des capteurs. Modifiez la durée si nécessaire pour obtenir cette référence.
- Remplacer la solution fluide par la solution de stimulation pendant 5 minutes pour stimuler les VNC/FB (avec du glucose, du pyruvate ou du lactate à la concentration décrite pour chaque expérience dissoute dans une solution saline ; voir chaque figure).
REMARQUE : La durée de la stimulation peut varier en fonction des besoins de l’expérience (par exemple, les impulsions de glucose peuvent être augmentées à 10 min pour atteindre un plateau dans les neurones, comme indiqué précédemment16). - Pour maintenir l’osmolarité dans la solution de stimulation, rectifier la concentration de saccharose (un glucide non métabolisable par le cerveau de la drosophile ) en fonction de la concentration du monocarboxylate ou du glucose ajouté.
- Changez les solutions à l’aide d’un simple système de vannes. Veillez à ne pas déplacer la platine du microscope.
- Exposer le VNC à 80 μM de picrotoxine (PTX, flux continu) pour stimuler l’activité neuronale. Cette procédure augmente la fréquence des oscillations de Ca2+ , ce qui permet d’observer des changements dans les molécules métaboliquement pertinentes (par exemple, l’ATP intracellulaire).
- À la fin de toute expérience, laver soigneusement l’ensemble du système d’écoulement, y compris les tubes et la chambre d’enregistrement, pendant au moins 10 minutes avec la solution saline et encore 10 minutes avec de l’eau distillée pour éliminer toute trace des solutions utilisées.
5. Traitement d’images et analyse de données
- Pour traiter les images obtenues, suivez les étapes indiquées à la figure 3.
- Importez l’image (Laconic) dans le logiciel ImageJ. L’image présente deux vues de l’échantillon : celle de gauche est le signal mTFP et celle de droite est le signal de Vénus. Sélectionnez une région qui comprend les cellules à analyser et séparez ces images (mTFP et Vénus) dans une nouvelle fenêtre. Assurez-vous que ces images contiennent exactement la même zone.
- Ouvrez le plugin d’enregistrement et corrigez la petite dérive du tissu qui est normalement observée dans l’expérience avec la fonction corps rigide. Effectuez cette opération dans les deux images (mTFP et Vénus).
- Sélectionnez au moins 10 régions d’intérêt (ROI) dans le cytosol des 10 cellules correspondantes dans le signal mTFP (488 nm) et transférez les sélections sur l’image de Vénus (540 nm).
- Sélectionnez deux ou trois zones d’intérêt proches des cellules analysées mais sans signal discernable (toujours dans le VNC ou le tissu analysé, voir Figure 3). Voici les retours sur investissement de fond.
- Avec les ROI sélectionnés dans les deux images, obtenez la valeur de gris moyenne de chaque signal à l’aide de la mesure de fonction. Transférez les données dans une feuille de données et soustrayez la valeur de fond moyenne pour chaque signal.
- Déterminez le rapport de fluorescence mTFP sur Vénus (pour Laconic et Pyronique). Cette valeur est calculée différemment des autres capteurs FRET décrits ici (où le rapport est généralement YFP/CFP) car lorsqu’ils sont liés à leurs substrats respectifs, le Laconic et le Pyronic réduisent leur efficacité FRET.
- Normalisez les données en divisant chaque valeur enregistrée par la ligne de base. Dans une fiche technique séparée, calculez la base de référence en prenant la valeur moyenne du rapport mTFP/Vénus pendant les 2 minutes précédant le stimulus.
- Pour les mesures de glucose et d’ATP à l’aide de capteurs FRET, calculez le rapport YFP/CFP et normalisez les données comme décrit à l’étape 5.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jusqu’à 1 h, cette procédure permet de mesurer facilement les changements intracellulaires dans la fluorescence des capteurs de monocarboxylate et de glucose. Comme le montre la figure 4, les capteurs laconiques dans les cellules gliales et les motoneurones répondent à 1 mM de lactate à un rythme similaire au début de l’impulsion, mais les motoneurones atteignent une augmentation plus élevée par rapport à la ligne de base pendant l’impulsion de 5 minutes, comme démontré précédemment17. Cette concentration de lactate a été choisie parce qu’elle est comparable aux niveaux trouvés dans l’hémolymphe des larves du troisième stade. De même, lorsque les capteurs de glucose exprimant VNC ont été exposés à 5 mM de glucose (une valeur similaire à celle mesurée dans l’hémolymphe par nous et d’autres19), le signal du capteur a augmenté à un rythme similaire dans les cellules gliales et les neurones. Pendant l’impulsion de glucose, cependant, le signal dans les neurones augmente plus que dans les cellules gliales. Ceci est cohérent avec les observations précédentes de préparations similaires exprimant des capteurs FRET16.
Cette préparation peut être utilisée pour mener des expériences sur des monocarboxylates et des transporteurs de glucose non décrits exprimés dans les cellules gliales ou les neurones de la drosophile 20. Ici, nous illustrons l’utilisation de l’interférence ARN pour montrer que Chaski (Chk), qui était auparavant connu pour transporter des monocarboxylates dans des cellules hétérologues, transporte du lactate dans les cellules gliales (Figure 5). Dans des conditions de restriction nutritionnelle, ce transporteur a été décrit comme jouant un rôle important dans la physiologie et le comportement des animaux21. Nous avons constaté que dans les cellules gliales, l’élimination de Chk réduisait le transport du lactate par rapport aux VNC témoins exposés à 1 mM de lactate (Figure 5). D’autres transporteurs présumés peuvent être testés pour voir s’ils peuvent transporter des métabolites dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Pour étudier les changements métaboliques associés à l’activité neuronale, nous avons développé une méthode simple pour augmenter l’activité neuronale sans utiliser de procédures techniquement complexes telles que l’optogénétique, qui peuvent interférer avec les mesures des capteurs FRET (Figure 6). Le VNC isolé a été exposé à la picrotoxine (PTX), un antagoniste connu des récepteurs GABAA précédemment utilisé par nous et d’autres17,22. La concentration utilisée augmente la fréquence des oscillations calciques dans les neurones (mesurée par les changements de fluorescence de GCaMP6f) ainsi que des changements significatifs dans des molécules métaboliquement pertinentes comme le glucose, le lactate et le pyruvate17. De plus, l’augmentation de l’activité neuronale induite par PTX entraîne une baisse transitoire des niveaux d’ATP dans le soma des motoneurones. Ce phénomène a déjà été décrit dans des modèles de vertébrés dans lesquels l’activité neuronale a été augmentée par stimulation électrique ou en utilisant des antagonistes des récepteurs GABAA 23,24. Par conséquent, ce modèle peut être utilisé pour suivre les changements métaboliques dans des sous-ensembles spécifiques de neurones et de cellules gliales, répondant ainsi au besoin de transporteurs liés à l’énergie qui contribuent à la production d’ATP lors d’une activité neuronale élevée.
Le transport du glucose et du monocarboxylate est également important dans les tissus ou les cellules autres que le cerveau. Nous montrons ici la visualisation de l’absorption du monocarboxylate (lactate/pyruvate) et du glucose dans les corps adipeux, un tissu métaboliquement pertinent présent chez les larves et la mouche adulte qui a plusieurs fonctions clés telles que le stockage et la métabolisation des lipides25. Le capteur laconique est bien exprimé en FB, comme le montre la figure 7, où les gouttelettes lipidiques peuvent être vues comme de minuscules sphères noires à l’intérieur de la cellule. Ce tissu isolé adhère bien aux lamelles recouvertes de poly-L-lysine, ce qui permet une procédure d’imagerie cellulaire à long terme et facile à analyser. Nous avons observé une augmentation significative de la fluorescence du capteur de glucose lorsque FB était exposé à des concentrations de glucose croissantes (environ 5 mM), ce qui est proche de la concentration de glucose trouvée dans l’hémolymphe. Une exposition supplémentaire à des concentrations plus élevées de glucose (10 mM) n’entraîne pas l’augmentation attendue de la fluorescence du capteur. Enfin, en FB, nous avons pu mesurer l’importation de lactate et de pyruvate (Figure 7C,D). Dans ce cas, l’augmentation des concentrations de lactate et de pyruvate provoque une augmentation proportionnelle de la fluorescence laconique et pyronique (allant de 0,1 à 1 mM). Des concentrations plus élevées de monocarboxylate entraînent une saturation du signal à l’intérieur des cellules.
Figure 1 : Synchronisation des larves de drosophile. La procédure de synchronisation larvaire est représentée graphiquement. Deux heures avant le début du processus, des plaques d’agarose à 1 % doivent être préparées et changées deux fois par jour jusqu’au jour 4. Les larves qui éclosent doivent être collectées avec soin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Cerveau larvaire de drosophile isolé exprimant le capteur de lactate Laconic. (A) Une image représentative d’une VNC séparée d’une larve isolée de troisième stade de drosophile adhérait à une lamelle recouverte de poly-L-lysine et exprimant le capteur de lactate laconique dans les motoneurones (OK6-GAL4). Les images montrent une image en fond clair du VNC (à gauche) et la fluorescence mTFP du capteur (panneau du milieu) capturée avec un objectif à immersion dans l’eau 20x. Les images du panneau inférieur sont du même VNC prises avec un objectif d’immersion dans l’eau 40x. (B) Motoneurones d’un VNC exprimant le capteur de lactate laconique (OK6>Laconic) placé dans une solution saline de zéro lactate. L’image représente la fluorescence mTFP (à gauche), la fluorescence de Vénus (au centre) et le rapport entre les deux fluorescences (à droite, produit à l’aide du plugin Ratio Plus du logiciel ImageJ). Barres d’échelle = 50 μm (A, panneau supérieur), 10 μm (A panneau inférieur, B). Abréviations : VNC = cordon nerveux ventral ; mTFP = protéine fluorescente sarcelle monomère. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyses étape par étape des images. Illustration schématique du protocole logiciel ImageJ pour l’analyse d’images, affichant le processus (première colonne), les commandes ImageJ (deuxième colonne) et les résultats du traitement d’image (troisième colonne). L’exemple commence par une image brute tirée d’un VNC exprimant le capteur de lactate laconique dans les motoneurones (OK6-GAL4). Abréviations : VNC = cordon nerveux ventral ; mTFP = protéine fluorescente sarcelle monomère. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Transport du monocarboxylate et du glucose dans les neurones et les cellules gliales du cerveau larvaire de la drosophile. (A) Images représentatives de VNC exprimant le capteur de lactate Laconic dans les motoneurones (OK6-Gal4>Laconique). La fluorescence laconique dans les motoneurones est observée avant, pendant et après une impulsion de 5 minutes de 1 mM de lactate. Le plugin Ratio Plus d’ImageJ a été utilisé pour créer des images de ratio (mTFP/Venus). Barre d’échelle = 10 μm. (B) Enregistrements représentatifs des signaux FRET de VNC isolés exprimant le capteur de lactate laconique dans les motoneurones (OK6-GAL4, lignes grises) ou les cellules gliales (REPO-GAL4, lignes noires) exposées à 1 mM de lactate pendant 5 min. Les traces représentent les signaux FRET ajustés à la valeur moyenne collectée 2 min avant l’exposition au lactate. (C) Enregistrements représentatifs des signaux FRET de VNC isolés exprimant le capteur de glucose FLII12Pglu700μδ6 dans des motoneurones (OK6-GAL4, lignes grises) ou des cellules gliales (REPO-GAL4, lignes noires) exposées à 5 mM de glucose pendant 5 min. Les traces représentent les signaux FRET ajustés à la valeur moyenne collectée deux minutes avant l’exposition au glucose. Abréviations : VNC = cordon nerveux ventral ; mTFP = protéine fluorescente sarcelle monomère ; FRET = Transfert d’énergie de résonance de Föster. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Transport du lactate dans les cellules gliales du cerveau larvaire de la drosophile exprimant l’ARNi de Chaski. (A) Des VNC isolés exprimant le capteur de lactate Laconic seul (contrôle génétique, w1118, ligne noire) ou co-exprimant un ARNi pour inhiber l’expression de Chaski (Chk) (chk-RNAi, magenta) ont été exposés à 1 mM de lactate pendant 5 min. Pour chaque condition, les traces représentent la valeur FRET moyenne obtenue à partir de sept VNC distincts (70 cellules par condition, normalisées à l’aide de la valeur moyenne obtenue 2 min avant d’être exposées au lactate). (B) L’aire sous la courbe en A est utilisée pour calculer l’accumulation intracellulaire de lactate. Pour chaque condition, les valeurs sont le SE moyen de 70 cellules et de sept expériences indépendantes (contrôle ou chk-RNAi). Le test t de Student non apparié a été utilisé pour l’analyse statistique (*p < 0,05). Abréviations : VNC = cordon nerveux ventral ; FRET = Transfert d’énergie de résonance de Föster. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Changements dans les niveaux d’ATP neuronals induits par l’exposition aux picrotoxines. Enregistrements de la fluorescence capturée à partir de VNC exprimant le capteur de calcium génétiquement codé (A) GCaMP6f ou (B, un autre ensemble d’expériences) le capteur ATP AT1.03NL dans des motoneurones (OK6-GAL4) qui ont été exposés à l’antagoniste du récepteur GABAA, la picrotoxine (80 μM), pendant le temps indiqué par la ligne. L’enregistrement représentatif provient d’un seul motoneurone d’un VNC (en A) ou de la moyenne ± SE de 10 cellules d’un seul VNC (en B) normalisée aux valeurs moyennes obtenues 2 min avant l’exposition au PTX. Abréviations : VNC = cordon nerveux ventral ; PTX = picrotoxine ; ET = erreur-type ; CFP = protéine fluorescente cyan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Transport du monocarboxylate et du glucose dans les corps adipeux de la drosophile. (A) Image du corps adipeux isolé des larves du troisième stade exprimant le capteur de lactate laconique (fluorescence mTFP). Barre d’échelle = 10 μm. (B) Traces représentatives du signal normalisé capturé dans FB exprimant le capteur de glucose (FLII12Pglu700μδ6) exposé au glucose (1, 5 et 10 mM de glucose). Les données ont été normalisées aux 2 premières minutes avant l’exposition au glucose. (C, D) Traces représentatives du signal normalisé obtenu à partir de FB exprimant le capteur de lactate (C) ou le capteur de pyruvate (D) exposé à 0,1-0,5-1 mM de lactate ou de pyruvate. Les données ont été normalisées aux 2 premières minutes avant l’exposition au lactate ou au pyruvate. Abréviations : FB = corps gras ; mTFP = protéine fluorescente sarcelle monomère ; YFP = protéine fluorescente jaune ; CFP = protéine fluorescente cyan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’utilisation du modèle de la drosophile pour l’étude du métabolisme cérébral est relativement nouvelle26, et il a été démontré qu’il partage plus de caractéristiques que prévu avec le métabolisme des mammifères, qui a été principalement étudié in vitro dans des cultures de neurones primaires ou des tranches de cerveau. La drosophile excelle dans les expériences in vivo grâce à la batterie d’outils génétiques et de capteurs génétiquement codés disponibles qui permet aux chercheurs de visualiser en temps réel les changements métaboliques causés par l’activité induite ou même en réponse à un stimulus sensoriel.
Le protocole décrit ici montre comment mesurer le transport du monocarboxylate et du glucose dans les cellules gliales et les neurones VNC de la drosophile dans une préparation ex-vivo qui permet l’utilisation de capteurs métaboliques fluorescents génétiquement codés basés sur la microscopie FRET pour réaliser des vidéos en accéléré des changements métaboliques dans les neurones au repos et actifs. Ce protocole peut être facilement monté et réalisé dans n’importe quel laboratoire en utilisant le modèle de la drosophile sans l’utilisation de machines complexes, à l’aide d’un microscope épifluorescent équipé d’un système de séparation des émissions. Il peut également être mis à l’échelle à des équipements plus avancés comme un disque rotatif, un laser confocal ou des microscopes à deux photons (mais un séparateur pour diviser l’émission de lumière est nécessaire) pour enregistrer des cellules spécifiques plus profondément situées dans le cerveau, comme c’est le cas dans le cerveau de la drosophile adulte. Comme ces types de signaux métaboliques sont relativement lents, une caméra vidéo rapide ou coûteuse n’est pas nécessaire.
De plus, la préparation VNC ou FB isolée ne nécessite pas de méthode sophistiquée de correction de mouvement parfois nécessaire pour les enregistrements in vivo . Les plugins ImageJ peuvent corriger de manière satisfaisante la plupart des mouvements des VNC qui sont produits pendant l’expérience. Par conséquent, l’augmentation de l’activité neuronale par l’ajout de PTX ou l’ajout de métabolites pertinents peut être effectuée simultanément sans les problèmes causés par la contraction musculaire naturelle du corps, comme on le voit dans d’autres protocoles (tels que la préparation de filets)27.
Nous montrons des expériences représentatives dans lesquelles le transport du lactate et du glucose est clairement observé à des concentrations physiologiquement pertinentes de ces métabolites (1 et 5 mM, respectivement). À partir de là, on s’attend à ce que la capacité de transport de tout gène non caractérisé ou protéine précédemment signalée puisse être testée dans diverses conditions, telles que l’utilisation de différents modèles de maladies neurodégénératives ou d’agressions métaboliques (régimes riches en calories ou restriction nutritionnelle). À cet égard, nous montrons que l’inhibition médiée par l’ARNi d’un transporteur de monocarboxylate connu réduit considérablement le transport du lactate dans les cellules gliales. Il est intéressant de noter que les signaux obtenus par les capteurs laconiques et pyroniques sont très sensibles aux changements de lactate ou de pyruvate dans les milieux, ce qui permet une mesure précise des changements intracellulaires de ces métabolites. Cette large plage dynamique du signal semble être différente dans les cellules de mammifères où une relation non linéaire entre le signal du capteur et la concentration intracellulaire de lactate a été observée28.
Cette approche peut fournir des réponses à des aspects importants sur le lieu et le moment où les monocarboxylates et le glucose sont traités ou utilisés pour générer de l’énergie dans le cerveau pendant l’activité neuronale basale et élevée. L’augmentation de l’activité neuronale causée par PTX peut provoquer des altérations considérables des métabolites liés à l’énergie, de la même manière que ce qui a été observé dans les cultures cellulaires, les lames cérébrales et les organismes vivants23,24. Plus précisément, une augmentation de la production d’ATP se produit quelques minutes après une augmentation de l’activité neuronale, très probablement due à la métabolisation du glucose et à l’échange de lactate et de pyruvate entre les cellules gliales et les neurones, comme indiqué précédemment17. L’étude des besoins de cellules spécifiques pour l’approvisionnement en glucose et en monocarboxylates, ainsi que des mécanismes sous-jacents à leur transport ou à leur génération, peut être rendue possible en manipulant l’expression de certains gènes en conjonction avec l’utilisation de capteurs génétiquement codés.
D’autres tissus métaboliquement importants peuvent facilement se lier à des lamelles recouvertes de poly-L-lysine et les changements de métabolites peuvent être imagés pendant plusieurs minutes. De nouveaux transporteurs médiant le transport du glucose ou du lactate dans différents tissus peuvent être étudiés. Le glucose circulant est transporté pour produire le disaccharide tréhalose dans les corps adipeux larvaires via des mécanismes qui ne sont pas entièrement compris, ces méthodes pourraient aider à mieux comprendre cette voie. De plus, en cas de restriction nutritionnelle, les acides gras peuvent être métabolisés pour produire des corps cétoniques dans le FB et les transporteurs nécessaires pour les expulser vers l’hémolymphe sont encore inconnus.
Il est important de noter que ce protocole peut être utilisé pour estimer l’accumulation d’un métabolite au fil du temps ou pour déterminer les taux d’augmentation de la fluorescence d’un capteur spécifique entre les conditions, mais pas pour considérer formellement les changements de « concentration » car cela nécessiterait un étalonnage in situ du capteur. Les différentes couches cellulaires qui composent le VNC limitent dans ce cas la diffusion des molécules, comme les ionophores, nécessaires à cet étalonnage. Cependant, nous conseillons de suivre les directives de traitement d’image qui permettent des niveaux de lactate contrastés entre divers organes ou cellules d’un animal29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent ou financier.
Acknowledgments
Nous remercions tous les membres du Sierralta Lab. Ce travail a été soutenu par FONDECYT-Iniciación 11200477 (à AGG) et FONDECYT Regular 1210586 (à JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (capteur de glucose) a été gracieusement offert par Pierre-Yves Plaçais et Thomas Préat, CNRS-Paris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
