Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den Transport von Monocarboxylaten, Glukose und ATP in Gliazellen und Neuronen unter Verwendung genetisch kodierter Förster-Resonanzenergietransfer-basierter Sensoren in einer ex-vivo-Drosophila-Larvenhirnpräparation zu visualisieren.
Abstract
Der hohe Energiebedarf des Gehirns aufgrund der elektrischen Aktivität ist eines seiner charakteristischsten Merkmale. Dieser Bedarf wird durch die Herstellung von ATP aus Glukose und ihren Metaboliten, wie den Monocarboxylaten Lactat und Pyruvat, gedeckt. Es ist noch unklar, wie dieser Prozess reguliert wird oder wer die Hauptakteure sind, insbesondere bei Drosophila.
Mit Hilfe genetisch kodierter Förster-Resonanzenergietransfer-basierter Sensoren stellen wir eine einfache Methode zur Messung des Transports von Monocarboxylaten und Glukose in Gliazellen und Neuronen in einer ex-vivo Drosophila-Larvenhirnpräparation vor. Das Protokoll beschreibt, wie ein Larvengehirn, das einen der Sensoren exprimiert, auf einem Glasdeckglas seziert und befestigt wird.
Wir präsentieren die Ergebnisse eines ganzen Experiments, in dem der Laktattransport in Larvengehirnen gemessen wurde, indem zuvor identifizierte Monocarboxylattransporter in Gliazellen ausgeschaltet wurden. Darüber hinaus zeigen wir, wie die neuronale Aktivität schnell erhöht und Metabolitenveränderungen im aktiven Gehirn verfolgt werden können. Die beschriebene Methode, die alle notwendigen Informationen liefert, kann zur Analyse anderer lebender Gewebe von Drosophila verwendet werden.
Introduction
Das Gehirn hat einen hohen Energiebedarf aufgrund der hohen Kosten für die Wiederherstellung von Ionengradienten in Neuronen, die durch neuronale elektrische Signalerzeugung und -übertragung sowie synaptische Übertragung verursachtwerden 1,2. Lange Zeit wurde angenommen, dass dieser hohe Energiebedarf durch die kontinuierliche Oxidation von Glukose zur Herstellung von ATP3 gedeckt wird. Spezifische Transporter an der Blut-Hirn-Schranke übertragen die Glukose im Blut ins Gehirn. Konstante glykämische Werte sorgen dafür, dass das Gehirn eine stetige Versorgung mit Glukoseerhält 4. Interessanterweise deuten wachsende experimentelle Beweise darauf hin, dass Moleküle, die aus dem Glukosestoffwechsel stammen, wie Laktat und Pyruvat, eine wichtige Rolle bei der Energieproduktion der Gehirnzellen spielen 5,6. Es gibt jedoch immer noch einige Diskussionen darüber, wie wichtig diese Moleküle für die Energiegewinnung sind und welche Zellen im Gehirn sie produzieren oder verwenden 7,8. Der Mangel an geeigneten molekularen Werkzeugen mit der für diese Aufgabe erforderlichen hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung ist ein wichtiges Problem, das eine vollständige Lösung dieser Kontroverse verhindert hat.
Die Entwicklung und Anwendung mehrerer technisch hergestellter fluoreszierender Stoffwechselsensoren hat zu einem bemerkenswerten Verständnis unseres Verständnisses geführt, wo und wie Metaboliten produziert und verwendet werden und wie die Stoffwechselflüsse während der basalen und hohen neuronalen Aktivität auftreten9. Genetisch kodierte Stoffwechselsensoren, die auf der Förster-Resonanzenergietransfer-Mikroskopie (FRET) basieren, wie ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (Glukose), Lakonisch (Laktat) und Pyronisch (Pyruvat), haben zu unserem Verständnis des Energiestoffwechsels im Gehirn beigetragen 10,11,12,13. Aufgrund der hohen Kosten und der ausgeklügelten Geräte, die für die Durchführung von Experimenten an lebenden Tieren oder Geweben erforderlich sind, beschränken sich die Ergebnisse in Wirbeltiermodellen jedoch immer noch hauptsächlich auf Zellkulturen (Gliazellen und Neuronen).
Die aufkommende Verwendung des Drosophila-Modells zur Expression dieser Sensoren hat gezeigt, dass wichtige Stoffwechselmerkmale artenübergreifend erhalten sind und ihre Funktion mit diesem Werkzeug leicht angegangen werden kann. Noch wichtiger ist, dass das Drosophila-Modell Aufschluss darüber gegeben hat, wie Glukose und Laktat/Pyruvat im Fliegengehirn transportiert und metabolisiert werden, den Zusammenhang zwischen Monocarboxylatkonsum und Gedächtnisbildung und die bemerkenswerte Demonstration, wie sich Steigerungen der neuronalen Aktivität und des Stoffwechselflusses überlappen 14,15,16,17. Die hier vorgestellte Methode zur Messung des Monocarboxylat-, Glukose- und ATP-Spiegels mit genetisch kodierten FRET-Sensoren, die im Larvengehirn exprimiert werden, ermöglicht es den Forschern, mehr darüber zu erfahren, wie das Gehirn von Drosophila Energie verbraucht, die auf die Gehirne anderer Tiere angewendet werden kann.
Wir zeigen, dass diese Methode für den Nachweis von Laktat und Glukose in Gliazellen und Neuronen wirksam ist und dass ein Monocarboxylattransporter (Chaski) am Laktatimport in Gliazellen beteiligt ist. Wir demonstrieren auch eine einfache Methode zur Untersuchung von Metabolitenveränderungen bei erhöhter neuronaler Aktivität, die leicht durch Badapplikation eines GABA-A-Rezeptor-Antagonisten induziert werden kann. Schließlich zeigen wir, dass diese Methodik verwendet werden kann, um den Monocarboxylat- und Glukosetransport in anderen metabolisch bedeutsamen Geweben, wie z.B. Fettkörpern, zu messen.
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Protocol
1. Aufrechterhaltung des Fliegenstamms und Larvensynchronisation
- Um diese Experimente durchzuführen, verwenden Sie Fliegenkulturen, die bei 25 °C auf Standard-Drosophila-Futter aufgezogen wurden, das aus 10 % Hefe, 8 % Glukose, 5 % Weizenmehl, 1,1 % Agar, 0,6 % Propionsäure und 1,5 % Methylparaben besteht.
- Um diesem Protokoll zu folgen, verwenden Sie die folgenden Zeilen: w1118 (experimenteller Kontrollhintergrund), OK6-GAL4 (Treiber für Motoneuronen), repo-GAL4 (Treiber für alle Gliazellen), CG-GAL4 (Treiber für Fettkörper), UAS-Pyronic (Pyruvatsensor), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (Glukosesensor), UAS-Laconic (Laktatsensor), UAS-GCaMP6f (Kalziumsensor), UAS-AT1.03NL (ATP-Sensor) und UAS-Chk RNAi GD1829. Alle Linien, die Sensoren oder RNAi exprimieren, befinden sich im genetischen Hintergrund von w1118 .
- Um synchronisierte wandernde Larven des dritten Stadiums zu erhalten, legen Sie 300 Fliegen (3-5 Tage alt, 100 Männchen, 200 jungfräuliche Weibchen) der gewünschten genetischen Kreuzung in die Eiablagekammer, die eine 60-mm-Petrischale enthält, die mit 1% Agarose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bedeckt ist. Geben Sie einen Tropfen flüssige/cremige Hefe (1,5 cm Durchmesser) in die Mitte der Plaque, um die Fliegen zur Eiablage zu ermutigen (Abbildung 1).
- Halten Sie die Fliegen 3 Tage lang bei 25 °C und ersetzen Sie die Agarose-Petrischale zweimal täglich durch eine frische und frisch aufgelöste Hefe.
- Lassen Sie die Fliegen am vierten Tag 4 Stunden Eier legen, bevor Sie die Petrischale wechseln. Entfernen Sie diese Plakette. Lassen Sie die Fliegen dann 3 Stunden lang Eier in eine neue Agarose-Plaque mit frisch aufgelöster Hefe legen. Verwenden Sie diese Larven in den Experimenten.
- Entfernen Sie nach 3 Stunden die Plaque mit den Eiern und legen Sie sie für 24 Stunden in einen 25 °C heißen Inkubator.
- Sammeln Sie 50 bis 100 frisch geschlüpfte Larven aus dieser Plaque (0 h nach dem Schlüpfen der Larven) und legen Sie sie in ein Plastikfläschchen mit Standardfutter. Damit sich die Larven richtig ernähren können, stellen Sie sicher, dass das Futter gemahlen und weich ist. Verwenden Sie die Larven 96 h nach dem Transfer.
2. Glasdeckgläser mit Poly-L-Lysin herstellen
- Führen Sie diesen Schritt 1 h vor der Larvendissektion durch. Legen Sie in eine 6-Well-Zellkulturplatte 25 mm Glasdeckgläser (der Durchmesser der zu verwendenden Abdeckungen hängt von der im Mikroskop verfügbaren Aufnahmekammer ab).
- Geben Sie einen Tropfen (300 μl) Poly-L-Lysin für 30 Minuten bei Raumtemperatur in die Mitte jedes Deckglases.
- Waschen Sie jedes Deckglas 3x mit destilliertem Wasser, dann 2x mit einer Kochsalzlösung ohne Ca2+ (die gleiche Lösung, die zum Sezieren der Larven verwendet wird, siehe Schritt 3.2). Installieren Sie die Abdeckungen in der Aufnahmekammer und füllen Sie sie mit Ca2+-freier Kochsalzlösung.
HINWEIS: Obwohl das Larvengehirn direkt an den Glasdeckgläsern haften kann, ist die Haftung schwach und das Gehirn bewegt oder verschiebt sich während des Experiments gelegentlich aufgrund des kontinuierlichen Flusses von Kochsalzlösung. Die Zugabe der Poly-L-Lysin-Stufe reduziert das Risiko von Bewegungen oder sogar Hirnverlust als Folge der Wäschen.
3. Präparieren Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) und die Fettkörper (FBs)
- Sammeln Sie die wandernden Larven des dritten Stadiums aus der gewünschten genetischen Kreuzung (aus Schritt 1.7) und waschen Sie sie 3x gründlich mit destilliertem Wasser.
- Legen Sie die Larven in eine gläserne Sezierschale mit 750 μl nominell null Ca2+ eiskalter Kochsalzlösung, bestehend aus 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES und 35 mM Saccharose (pH = 6,7, gemessen mit einem pH-Messgerät und eingestellt mit 1 M NaOH und HCl 37% v/v).
HINWEIS: Die Einstellung des pH-Werts auf 6,7 ist von entscheidender Bedeutung, da der Monocarboxylattransport, wie bereits erwähnt, stark vom pH-Wert der Lösung abhängt. Darüber hinaus entspricht 6,7 dem pH-Wert in der Hämolymphe einer Larve im dritten Stadium17,18. - Legen Sie die Larve unter ein Stereomikroskop und machen Sie mit einer Pinzette einen Querschnitt über die Rückseite des Bauches.
- Drücken Sie mit der Pinzette auf den Kiefer, während Sie die Larven von innen nach außen drehen.
- Beobachten Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) neben dem Kiefer. Entfernen Sie vorsichtig die Imaginalscheiben und das verbleibende Gehirn-Schwanzgewebe.
- Trennen Sie das VNC mit dem Zentralhirn und den Sehlappen vom Rest des Gewebes, indem Sie die Nerven durchtrennen. Übertragen Sie das VNC, nehmen Sie es mit einer Pinzette von den verbleibenden Nerven auf und legen Sie es in die Aufnahmekammer, in der sich die Ca2+-freie Aufnahmelösung befindet (gleiche Lösung aus Schritt 3.2). Die VNCs haften sofort auf den Deckgläsern.
- Um Störungen durch die verbleibenden Nerven zu vermeiden, befestigen Sie sie mit einer Pinzette am unteren Rand des Deckglases (die Nerven werden je nach verwendeter Treiberleine auch fluoreszieren) (Abbildung 2).
- Um Experimente an Fettkörpern (FBs) durchzuführen, die den Glukose- oder Monocarboxylattransport in einer anderen Versuchsreihe messen, isolieren Sie die Gewebe gemäß den Schritten 3.1-3.4. Sobald die Larven von innen nach außen gedreht sind, beachten Sie, dass das FB ein weißes, beidseitiges, flaches Gewebe ist.
- Platzieren Sie die isolierten FBs, die die FRET-Sensoren exprimieren (aus einer genetischen Kreuzung mit den entsprechenden Treibern) in der Aufnahmekammer, die die Aufzeichnungslösung ohne Ca2+ enthält.
HINWEIS: Der FB ist stark hydrophob (er neigt dazu, auf der Oberfläche der Lösung zu schwimmen) und extrem anfällig für Manipulationen mit Pinzetten, er muss mit Vorsicht behandelt werden. Jede grobe Behandlung dieses Gewebes führt später zu abgestorbenen Zellen (mit einer verminderten Fluoreszenz der Sensoren). - Stellen Sie die Aufnahmekammer mit VNCs/FBs auf den Mikroskoptisch.
4. Lebendzell-Bildgebung
- Um Bilder der gewebeexprimierenden Sensoren aufzunehmen, verwenden Sie ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Emissionsspaltungssystem und einer CCD-Kamera gekoppelt ist. Schalten Sie das Beleuchtungssystem des Mikroskops 30 Minuten vor Beginn eines Experiments ein.
HINWEIS: Hier verwenden wir ein Spinning-Disk-Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20x/0,5-Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist, um sowohl VNCs als auch FBs zu beobachten. Abbildung 2 zeigt auch die Verwendung eines 40x/0,8-Wasserimmersionsobjektivs. - Um die GCaMP6f-Fluoreszenz zu visualisieren, stellen Sie die Anregungs - und Emissionswellenlängen auf 488 nm bzw. 540 nm ein. Stellen Sie für lakonische/pyronische/ATP/Glukosesensoren die Anregungswellenlänge auf 440 nm und die Emissionswellenlängen auf 488 nm (mTFP, CFP) und 540 nm (Venus, YFP) ein.
- Erfassen Sie alle 2 s Bilder mit einer Größe von 512 x 512 Pixeln für GCaMP6f und alle 10-30 s für lakonische/pyronische/ATP/Glukosesensoren. Bestimmen Sie die optimale Belichtung der Lichtquelle unter Beobachtung der Qualität des erhaltenen Bildes. Um dieses Protokoll zu befolgen, stellen Sie sicher, dass die Bilder eine Belichtungszeit von 300 ms für lakonische und pyronische Sensoren und 100-150 ms für die Glukose- und ATP-Sensoren haben.
HINWEIS: Die Belichtung kann je nach Verwendung eines konfokalen oder normalen Fluoreszenzmikroskops variieren. - Sobald die Aufnahmekammer in der Bühne des Mikroskops installiert ist, setzen Sie das Wasserimmersionsobjektiv vorsichtig ein und stellen Sie sicher, dass das Objektiv während des gesamten Experiments untergetaucht bleibt. Halten Sie die Raumtemperatur bei 25 °C.
- Schließen Sie die Aufnahmekammer an ein Perfusionssystem an und halten Sie das Gewebe in der Aufnahmelösung gebadet, die 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES und 35 mM Saccharose, pH 6,7 (gemessen mit einem pH-Messgerät und eingestellt mit NaOH und HCl) enthält.
- Halten Sie einen konstanten Fluss von 3 ml/min Aufnahmelösung durch das Gewebe unter Verwendung der Schwerkraft aufrecht, gekoppelt an eine Peristaltikpumpe mit geringem Fluss, um die Flüssigkeit aus der Kammer zu extrahieren und gleichzeitig das Volumen konstant zu halten. Um den erforderlichen Durchfluss zu erreichen, positionieren Sie die lösungshaltigen Röhrchen (50 ml-Kunststoffröhrchen) 25 cm über dem Mikroskoptisch.
HINWEIS: Diese schwerkraftgetriebene Strömung wird verwendet, um Gewebebewegungen zu verhindern, die durch Peristaltikpumpen verursacht werden, was später eine genauere Bildanalyse ermöglicht. - Lassen Sie die Aufnahmelösung vor jeder Stimulation 5-10 Minuten lang fließen, um eine stabile Basislinie der Fluoreszenz von den Sensoren zu erhalten. Ändern Sie die Dauer nach Bedarf, um diese Baseline zu erhalten.
- Ersetzen Sie die fließende Lösung 5 Minuten lang durch die Stimulationslösung, um die VNC/FBs zu stimulieren (mit Glukose, Pyruvat oder Laktat in der für jedes Experiment beschriebenen Konzentration, gelöst in Kochsalzlösung; siehe jede Abbildung).
HINWEIS: Die Dauer der Stimulation kann je nach den Anforderungen des Experiments variiert werden (z. B. können Glukoseimpulse auf 10 Minuten erhöht werden, um ein Plateau in Neuronen zu erreichen, wie zuvor berichtet16). - Um die Osmolarität in der Stimulationslösung aufrechtzuerhalten, korrigieren Sie die Saccharosekonzentration (ein Kohlenhydrat, das vom Drosophila-Gehirn nicht metabolisiert werden kann) entsprechend der Konzentration des zugesetzten Monocarbonylats oder der Glukose.
- Ändern Sie die Lösungen mit einem einfachen Ventilsystem. Achten Sie darauf, den Mikroskoptisch nicht zu bewegen.
- Setzen Sie den VNC 80 μM Picrotoxin (PTX, kontinuierlich fließend) aus, um die neuronale Aktivität zu stimulieren. Dieses Verfahren erhöht die Frequenz von Ca2+ -Oszillationen, wodurch Veränderungen in metabolisch relevanten Molekülen (z.B. intrazelluläres ATP) beobachtet werden können.
- Am Ende eines jeden Versuchs wird das gesamte Durchflusssystem, einschließlich der Röhrchen und der Aufnahmekammer, mindestens 10 Minuten lang mit der Kochsalzlösung und weitere 10 Minuten mit destilliertem Wasser gründlich gewaschen, um alle Spuren der verwendeten Lösungen zu entfernen.
5. Bildverarbeitung und Datenanalyse
- Um die erhaltenen Bilder zu verarbeiten, fahren Sie mit den in Abbildung 3 gezeigten Schritten fort.
- Importieren Sie das Bild (Lakonisch) in die ImageJ-Software. Das Bild zeigt zwei Ansichten der Probe: Die linke ist das mTFP-Signal und die rechte ist das Venussignal. Wählen Sie eine Region aus, die die zu analysierenden Zellen enthält, und trennen Sie diese Bilder (mTFP und Venus) in einem neuen Fenster. Stellen Sie sicher, dass diese Bilder genau den gleichen Bereich enthalten.
- Öffnen Sie das Registrierungs-Plugin und korrigieren Sie die kleine Drift des Gewebes, die normalerweise im Experiment mit der Funktion starrer Körper beobachtet wird. Führen Sie dies in beiden Bildern (mTFP und Venus) durch.
- Wählen Sie mindestens 10 Regionen von Interesse (ROIs) im Zytosol der entsprechenden 10 Zellen im mTFP-Signal (488 nm) aus und übertragen Sie die Selektionen auf das Venusbild (540 nm).
- Wählen Sie zwei oder drei ROIs in der Nähe der zu analysierenden Zellen, aber ohne erkennbares Signal (immer innerhalb des VNC oder des analysierten Gewebes, siehe Abbildung 3). Dies sind die Hintergrund-ROIs.
- Wenn die ROIs in beiden Bildern ausgewählt sind, erhalten Sie den mittleren Grauwert jedes Signals mit der Funktion measure. Übertragen Sie die Daten in ein Datenblatt und subtrahieren Sie den durchschnittlichen Hintergrundwert für jedes Signal.
- Bestimmen Sie das mTFP-Fluoreszenzverhältnis über Venus (für Lakonisch und Pyronisch). Dieser Wert wird anders berechnet als bei den anderen hier beschriebenen FRET-Sensoren (bei denen das Verhältnis normalerweise YFP/CFP ist), da sowohl Laconic als auch Pyronic ihre FRET-Effizienz reduzieren, wenn sie an ihre jeweiligen Substrate gebunden sind.
- Normalisieren Sie die Daten, indem Sie jeden aufgezeichneten Wert durch die Baseline dividieren. Berechnen Sie in einem separaten Datenblatt die Baseline, indem Sie den Mittelwert des mTFP/Venus-Verhältnisses während der 2 Minuten vor dem Stimulus nehmen.
- Berechnen Sie für die Glukose- und ATP-Messungen mit FRET-basierten Sensoren das YFP/CFP-Verhältnis und normalisieren Sie die Daten wie in Schritt 5.8 beschrieben.
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Representative Results
Dieses Verfahren ermöglicht eine einfache Messung intrazellulärer Veränderungen in der Fluoreszenz von Monocarboxylat- und Glukosesensoren. Wie in Abbildung 4 gezeigt, reagieren lakonische Sensoren sowohl in Gliazellen als auch in Motoneuronen zu Beginn des Pulses mit einer ähnlichen Rate auf 1 mM Laktat, aber Motoneuronen erreichen während des 5-Minuten-Pulses einen höheren Anstieg gegenüber der Grundlinie, wie zuvor gezeigt17. Diese Laktatkonzentration wurde gewählt, weil sie mit den Werten in der Hämolymphe von Larven des dritten Stadiums vergleichbar ist. Wenn VNC-exprimierende Glukosesensoren 5 mM Glukose ausgesetzt wurden (ein Wert, der dem von uns und anderen in der Hämolymphe gemessenen Wert19 ähnelt), stieg das Signal des Sensors in Gliazellen und Neuronen mit einer ähnlichen Rate an. Während des Glukosepulses steigt das Signal in Neuronen jedoch stärker an als in Gliazellen. Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen ähnlicher FRET-Sensor-exprimierenden Präparate16.
Dieses Präparat kann verwendet werden, um Experimente mit unbeschriebenen Monocarboxylat- und Glukosetransportern durchzuführen, die in Drosophila-Gliazellen oder -Neuronen exprimiert werden20. Hier zeigen wir beispielhaft die Verwendung von RNA-Interferenz, um zu zeigen, dass Chaski (Chk), von dem bisher bekannt war, dass es Monocarboxylate in heterologen Zellen transportiert, Laktat in Gliazellen transportiert (Abbildung 5). Unter Bedingungen der Ernährungseinschränkung wurde beschrieben, dass dieser Transporter eine wichtige Rolle in der Physiologie und dem Verhalten von Tieren spielt21. Wir fanden heraus, dass in Gliazellen das Ausschalten von Chk den Laktattransport im Vergleich zu Kontroll-VNCs reduzierte, die 1 mM Laktat ausgesetzt waren (Abbildung 5). Andere mutmaßliche Transporter können getestet werden, um zu sehen, ob sie Metaboliten unter physiologischen und pathologischen Bedingungen transportieren können.
Um metabolische Veränderungen im Zusammenhang mit neuronaler Aktivität zu untersuchen, haben wir eine einfache Methode entwickelt, um die neuronale Aktivität zu erhöhen, ohne technisch komplexe Verfahren wie die Optogenetik zu verwenden, die die FRET-Sensormessungen stören können (Abbildung 6). Das isolierte VNC wurde Picrotoxin (PTX) ausgesetzt, einem bekannten GABA-A-Rezeptor-Antagonisten, der zuvor von uns und anderen verwendet wurde 17,22. Die verwendete Konzentration erhöht die Häufigkeit von Kalziumschwingungen in Neuronen (gemessen an Änderungen der GCaMP6f-Fluoreszenz) sowie signifikante Veränderungen metabolisch relevanter Moleküle wie Glukose, Laktat und Pyruvat17. Darüber hinaus führt ein PTX-induzierter Anstieg der neuronalen Aktivität zu einem vorübergehenden Abfall des ATP-Spiegels im Soma von Motoneuronen. Dieses Phänomen wurde zuvor in Wirbeltiermodellen beschrieben, in denen die neuronale Aktivität durch elektrische Stimulation oder durch Verwendung von GABA-A-Rezeptor-Antagonisten erhöht wurde23,24. Infolgedessen kann dieses Modell verwendet werden, um metabolische Veränderungen in bestimmten Untergruppen von Neuronen und Gliazellen zu verfolgen und den Bedarf an energiebezogenen Transportern zu decken, die bei hoher neuronaler Aktivität zur ATP-Produktion beitragen.
Glukose- und Monocarboxylattransport sind auch in anderen Geweben oder Zellen als dem Gehirn wichtig. Wir zeigen hier die Visualisierung der Monocarboxylat- (Laktat/Pyruvat) und Glukoseaufnahme in Fettkörpern, einem metabolisch relevanten Gewebe, das in den Larven und der erwachsenen Fliege vorhanden ist und mehrere Schlüsselfunktionen wie Lipidspeicherung und Metabolisierung hat25. Der lakonische Sensor ist in FB gut exprimiert, wie in Abbildung 7 gezeigt, wo die Lipidtröpfchen als winzige schwarze Kügelchen innerhalb der Zelle zu sehen sind. Dieses isolierte Gewebe haftet gut auf den Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläsern und ermöglicht so ein Langzeit-Zellbildgebungsverfahren, das auch leicht zu analysieren ist. Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg der Fluoreszenz des Glukosesensors, wenn FB steigenden Glukosekonzentrationen (ca. 5 mM) ausgesetzt war, was nahe an der Glukosekonzentration in der Hämolymphe liegt. Eine weitere Exposition gegenüber höheren Glukosekonzentrationen (10 mM) führt nicht zu der erwarteten Erhöhung der Sensorfluoreszenz. Schließlich konnten wir in FB den Laktat- und Pyruvatimport messen (Abbildung 7C,D). In diesem Fall führt eine Erhöhung der Laktat- und Pyruvatkonzentrationen zu einem proportionalen Anstieg der lakonischen und pyronischen Fluoreszenz (im Bereich von 0,1 bis 1 mM). Höhere Monocarboxylatkonzentrationen führen zu einer Signalsättigung in den Zellen.
Abbildung 1: Synchronisation von Drosophila-Larven . Der Ablauf der Larvensynchronisation wird grafisch dargestellt. Zwei Stunden vor Beginn des Prozesses müssen 1%ige Agaroseplatten vorbereitet und bis zum 4. Tag zweimal täglich gewechselt werden. Die schlüpfenden Larven müssen sorgfältig gesammelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Isoliertes Drosophila-Larvengehirn , das den Laktatsensor Lakonisch exprimiert. (A) Ein repräsentatives Bild des abgetrennten VNC einer isolierten Drosophila-Larve im dritten Instar, das an einem Poly-L-Lysin-beschichteten Deckglas haftete und den Laktatsensor lakonisch in Motoneuronen exprimierte (OK6-GAL4). Die Bilder zeigen ein Hellfeldbild des VNC (links) und der mTFP-Fluoreszenz des Sensors (mittleres Bild), aufgenommen mit einem 20-fachen Wasserimmersionsobjektiv. Die Bilder im unteren Bereich sind von der gleichen VNC, die mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv aufgenommen wurde. (B) Motoneuronen aus einem VNC, das den lakonischen Laktatsensor (OK6>Lakonisch) exprimiert, in einer laktatfreien Kochsalzlösung. Das Bild zeigt die mTFP-Fluoreszenz (links), die Venus-Fluoreszenz (Mitte) und das Verhältnis zwischen den beiden Fluoreszenzen (rechts, erzeugt mit dem Ratio Plus-Plugin der ImageJ-Software). Maßstabsleisten = 50 μm (A, obere Platte), 10 μm (A untere Platte, B). Abkürzungen: VNC = ventraler Nervenstrang; mTFP = monomeres blaugrünes fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Schritt-für-Schritt-Analysen der Bilder. Eine schematische Darstellung des ImageJ-Softwareprotokolls für die Bildanalyse, die den Prozess (erste Spalte), die ImageJ-Befehle (zweite Spalte) und die Bildverarbeitungsergebnisse (dritte Spalte) anzeigt. Das Beispiel beginnt mit einem Rohbild, das von einem VNC aufgenommen wurde, das den lakonischen Laktatsensor in Motoneuronen exprimiert (OK6-GAL4). Abkürzungen: VNC = ventraler Nervenstrang; mTFP = monomeres blaugrünes fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Monocarboxylat- und Glukosetransport in Neuronen und Gliazellen des Drosophila-Larvengehirns . (A) Repräsentative Bilder von VNC, das den Laktatsensor lakonisch in Motoneuronen exprimiert (OK6-Gal4>Lakonisch). Lakonische Fluoreszenz in Motoneuronen wird vor, während und nach einem 5-minütigen Puls von 1 mM Laktat beobachtet. Das Ratio Plus-Plugin von ImageJ wurde verwendet, um Verhältnisbilder (mTFP/Venus) zu erstellen. Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Repräsentative Aufzeichnungen von FRET-Signalen von isolierten VNCs, die den lakonischen Laktatsensor exprimieren, in Motoneuronen (OK6-GAL4, graue Linien) oder Gliazellen (REPO-GAL4, schwarze Linien), die 5 Minuten lang 1 mM Laktat ausgesetzt waren. Die Kurven bilden die eingestellten FRET-Signale auf den Mittelwert ab, der 2 min vor der Laktatexposition erhoben wurde. (C) Repräsentative Aufzeichnungen von FRET-Signalen von isolierten VNCs, die den Glukosesensor FLII12Pglu700μδ6 exprimieren, in Motoneuronen (OK6-GAL4, graue Linien) oder Gliazellen (REPO-GAL4, schwarze Linien), die 5 Minuten lang 5 mM Glukose ausgesetzt waren. Die Kurven bilden die angepassten FRET-Signale auf den Mittelwert ab, der zwei Minuten vor der Glukoseexposition erfasst wurde. Abkürzungen: VNC = ventraler Nervenstrang; mTFP = monomeres blaugrünes fluoreszierendes Protein; FRET = Föster-Resonanzenergieübertragung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Laktattransport in Gliazellen des Drosophila-Larvengehirns , die Chaski-RNAi exprimieren. (A) Isolierte VNC, die den Laktatsensor Lakonisch allein exprimieren (genetische Kontrolle, w1118, schwarze Linie) oder eine RNAi zur Knockdown-Chaski-Expression (Chk-RNAi, Magenta) koexprimieren, wurden 5 Minuten lang 1 mM Laktat ausgesetzt. Für jede Bedingung stellen die Spuren den mittleren FRET-Wert dar, der von sieben separaten VNCs erhalten wurde (70 Zellen pro Bedingung, normalisiert mit dem Mittelwert, der 2 Minuten vor der Laktatexposition erhalten wurde). (B) Die Fläche unter der Kurve in A wird verwendet, um die intrazelluläre Laktatakkumulation zu berechnen. Für jede Bedingung sind die Werte der mittlere SE von 70 Zellen und sieben unabhängigen Experimenten (Kontrolle oder chk-RNAi). Der ungepaarte Student's t-Test wurde für die statistische Analyse verwendet (*p < 0,05). Abkürzungen: VNC = ventraler Nervenstrang; FRET = Föster-Resonanzenergieübertragung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Veränderungen des neuronalen ATP-Spiegels, die durch Picrotoxin-Exposition induziert werden. Aufzeichnungen der Fluoreszenz, die von VNCs erfasst wurden, die den genetisch kodierten (A) Kalziumsensor GCaMP6f oder (B, eine andere Reihe von Experimenten) den ATP-Sensor AT1.03NL in Motoneuronen (OK6-GAL4) exprimieren, die während der durch die Linie angegebenen Zeit dem GABA-A-Rezeptor-Antagonisten Picrotoxin (80 μM) ausgesetzt waren. Die repräsentative Aufzeichnung stammt von einem einzelnen Motoneuron aus einem VNC (in A) oder dem Mittelwert ± SE aus 10 Zellen aus einem einzelnen VNC (in B), normalisiert auf die Mittelwerte, die 2 min vor der PTX-Exposition erhalten wurden. Abkürzungen: VNC = ventraler Nervenstrang; PTX = Picrotoxin; SE = Standardfehler; CFP = cyan fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Transport von Monocarboxylat und Glukose in Drosophila-Fettkörpern . (A) Bild des isolierten Fettkörpers von Larven des dritten Stadiums, die den Laktatsensor lakonisch exprimieren (mTFP-Fluoreszenz). Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Repräsentative Spuren des normalisierten Signals, das in FB erfasst wurde und den Glukosesensor (FLII12Pglu700μδ6) ausdrückt, der Glukose (1, 5 und 10 mM Glukose) ausgesetzt ist. Die Daten wurden auf die ersten 2 Minuten vor der Glukoseexposition normalisiert. (C,D) Repräsentative Spuren des normalisierten Signals, das von FB erhalten wird, das den Laktatsensor (C) oder den Pyruvatsensor (D) exprimiert, der 0,1-0,5-1 mM Laktat oder Pyruvat ausgesetzt ist. Die Daten wurden auf die ersten 2 Minuten vor der Laktat- oder Pyruvatexposition normalisiert. Abkürzungen: FB = Fettkörper; mTFP = monomeres blaugrünes fluoreszierendes Protein; YFP = gelb fluoreszierendes Protein; CFP = cyan fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Verwendung des Drosophila-Modells zur Untersuchung des Gehirnstoffwechsels ist relativ neu26, und es hat sich gezeigt, dass es mehr Eigenschaften mit dem Stoffwechsel von Säugetieren teilt als erwartet, was hauptsächlich in vitro in primären Neuronenkulturen oder Hirnschnitten untersucht wurde. Drosophila zeichnet sich bei In-vivo-Experimenten dank der verfügbaren genetischen Werkzeuge und genetisch kodierten Sensoren aus, die es den Forschern ermöglichen, die Stoffwechselveränderungen, die durch induzierte Aktivität oder sogar als Reaktion auf einen sensorischen Reiz verursacht werden, in Echtzeit zu visualisieren.
Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie der Monocarboxylat- und Glukosetransport in Drosophila-VNC-Gliazellen und -Neuronen in einem Ex-vivo-Präparat gemessen werden kann, das die Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Stoffwechselsensoren auf der Grundlage der FRET-Mikroskopie ermöglicht, um Zeitraffervideos von Stoffwechselveränderungen in ruhenden und aktiven Neuronen zu erstellen. Dieses Protokoll kann in jedem Labor mit dem Drosophila-Modell ohne den Einsatz komplexer Maschinen mit einem Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Emissionsspaltungssystem ausgestattet ist, leicht montiert und durchgeführt werden. Es kann auch auf fortschrittlichere Geräte wie eine rotierende Scheibe, ein Laserkonfokalmikroskop oder ein Zwei-Photonen-Mikroskop skaliert werden (aber ein Splitter zur Aufteilung der Lichtemission ist erforderlich), um bestimmte Zellen aufzuzeichnen, die tiefer im Gehirn des Gehirns von Drosophila liegen, wie es im erwachsenen Drosophila-Gehirn der Fall ist. Da diese Art von Stoffwechselsignalen relativ langsam sind, wird keine schnelle oder teure Videokamera benötigt.
Darüber hinaus erfordert die isolierte VNC- oder FB-Vorbereitung keine ausgeklügelte Methode zur Bewegungskorrektur, die manchmal für In-vivo-Aufnahmen erforderlich ist. ImageJ-Plugins können die meisten Bewegungen der VNCs, die während des Experiments erzeugt werden, zufriedenstellend korrigieren. Infolgedessen kann die Erhöhung der neuronalen Aktivität durch die Zugabe von PTX oder die Zugabe relevanter Metaboliten gleichzeitig durchgeführt werden, ohne die Probleme, die durch die natürliche Körpermuskelkontraktion verursacht werden, wie sie in anderen Protokollen (wie der Filetzubereitung) zu sehen sind27.
Wir zeigen repräsentative Experimente, in denen der Laktat- und Glukosetransport bei physiologisch relevanten Konzentrationen dieser Metaboliten (1 bzw. 5 mM) deutlich beobachtet wird. Von hier aus wird erwartet, dass jedes nicht charakterisierte Gen oder zuvor berichtete Protein unter verschiedenen Bedingungen auf Transportkapazität getestet werden kann, z. B. unter Verwendung verschiedener Modelle neurodegenerativer Erkrankungen oder metabolischer Beleidigungen (kalorienreiche Diäten oder Nährstoffrestriktion). In diesem Zusammenhang zeigen wir, dass der RNAi-vermittelte Knockdown eines bekannten Monocarboxylattransporters den Laktattransport in Gliazellen signifikant reduziert. Interessanterweise sind die von Laconic- und Pyronic-Sensoren erhaltenen Signale sehr empfindlich gegenüber den Veränderungen von Laktat oder Pyruvat in den Medien, was eine genaue Messung der intrazellulären Veränderungen dieser Metaboliten ermöglicht. Dieser große dynamische Bereich des Signals scheint in Säugetierzellen anders zu sein, wo eine nichtlineare Beziehung zwischen dem Signal des Sensors und der intrazellulären Laktatkonzentration beobachtet wurde28.
Dieser Ansatz kann Antworten auf wichtige Aspekte geben, wo und wann Monocarboxylate und Glukose verarbeitet oder verwendet werden, um Energie im Gehirn während basaler und hoher neuronaler Aktivität zu erzeugen. Die durch PTX verursachte Zunahme der neuronalen Aktivität kann zu erheblichen Veränderungen der energiebezogenen Metaboliten führen, ähnlich wie in Zellkulturen, Gehirnobjektträgern und lebenden Organismen23,24. Insbesondere tritt ein Anstieg der ATP-Produktion Minuten nach einem Anstieg der neuronalen Aktivität auf, höchstwahrscheinlich aufgrund der Glukosemetabolisierung und des Austauschs von Laktat und Pyruvat zwischen Gliazellen und Neuronen, wie bereits berichtet17. Die Untersuchung des Bedarfs spezifischer Zellen an der Versorgung mit Glukose und Monocarboxylaten sowie der Mechanismen, die ihrem Transport oder ihrer Erzeugung zugrunde liegen, kann durch die Manipulation der Expression bestimmter Gene in Verbindung mit dem Einsatz genetisch kodierter Sensoren ermöglicht werden.
Andere metabolisch wichtige Gewebe können leicht an Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser binden und Metabolitenveränderungen für mehrere Minuten abbilden. Neue Transporter, die den Glukose- oder Laktattransport in verschiedenen Geweben vermitteln, können untersucht werden. Zirkulierende Glukose wird transportiert, um das Disaccharid Trehalose in Larvenfettkörpern über Mechanismen zu produzieren, die nicht vollständig verstanden sind, diese Methoden könnten helfen, diesen Weg besser zu verstehen. Darüber hinaus können Fettsäuren unter Nahrungseinschränkung metabolisiert werden, um Ketonkörper im FB zu produzieren, und die Transporter, die notwendig sind, um sie in die Hämolymphe zu extrudieren, sind noch unbekannt.
Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Akkumulation eines Metaboliten im Laufe der Zeit abzuschätzen oder um die Anstiegsraten der Fluoreszenz eines bestimmten Sensors zwischen den Bedingungen zu bestimmen, aber nicht, um Änderungen der "Konzentration" formell zu berücksichtigen, da dies eine In-situ-Sensorkalibrierung erfordern würde. Die verschiedenen Zellschichten, aus denen der VNC besteht, begrenzen in diesem Fall die Diffusion von Molekülen, wie z. B. Ionophoren, die für diese Kalibrierung erforderlich sind. Wir empfehlen jedoch, die Bildverarbeitungsrichtlinien zu befolgen, die es ermöglichen, den Laktatspiegel zwischen verschiedenen Organen oder Zellen innerhalb eines Tieres zu kontrastieren29,30.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern des Sierralta Lab. Diese Arbeit wurde von FONDECYT-Iniciación 11200477 (zu AGG) und FONDECYT Regular 1210586 (zu JS) unterstützt. UAS-FLII12Pglu700μδ6 (Glukosesensor) wurde freundlicherweise von Pierre-Yves Plaçais und Thomas Preat, CNRS-Paris, gespendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
